سلول و بافت

فصلنامه

شماره جاری

بر اساس شماره‌های نشریه

بر اساس نویسندگان

بر اساس موضوعات

نمایه نویسندگان

نمایه کلیدواژه ها

درباره نشریه

اهداف و چشم انداز

اعضای هیات تحریریه

اصول اخلاقی انتشار مقاله

بانک ها و نمایه نامه ها

پیوندهای مفید

فرایند پذیرش مقالات

بیانیه حریم خصوصی

بیانیه حق مولف

پرسش‌های متداول

اخبار و اعلانات

اطلاعات آماری نشریه

خط مشی داوری

راهنمای داوران

فهرست داوران

بررسی پتانسیل القای آپوپتوزیس ترکیبات سنتزی مشتق از سورافنیب در سلول‌های سرطانی پستان

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجو، زیست شناسی، علوم پایه، گیلان، رشت، ایران

2 استادیار، زیست شناسی، علوم پایه، گیلان، رشت، ایران

چکیده

هدف: سرطان از جمله مهمترین بیماری­های قرن حاضر است که افراد بسیاری در سراسر جهان به آن مبتلا می­باشند و ضمن افزایش شیوع این بیماری، هنوز درمان مناسبی برای آن پیدا نشده است. در این بین سرطان پستان شایع­ترین سرطان و همچنین علت اصلی مرگ و میر ناشی از سرطان در زنان در سراسر جهان است. محققان بدنبال یافتن راهکارهای درمانی سرطان، ترکیبات دارویی بسیاری را علیه سرطان­های مختلف سنتز کرده و اثرات آ­نها را مورد مطالعه قرار می­دهند. سورافنیب یک مهار کننده­ی اوره مولتی­کیناز است که موجب القای آپوپتوزیس و مهار آنژیوژنز و تکثیر سلول­های سرطانی می­گردد. همچنین آزمایشاتی جهت بررسی عملکرد آن در درمان سایر سرطان­ها نیز انجام شده است. مشتقاتی از سورافنیب نیز سنتز شده و مورد بررسی قرار گرفته­اند. در تحقیق حاضر اثر ضد سرطانی یکی از مشتقات سورافنیب به نام (2E,2´E)-2,2´-(1,4-فنیلن­بیس (متانیلیدن)بیس(N-(4-کلرو-3-(تری­فلوروم اتیل)فنیل)هیدرازین کربوکسامید) که به اختصار SO-D-3 نامیده شد، علیه سه رده­ی سلولی سرطان پستان مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش­ها: سه رده­ی سلولی سرطان پستان شامل MCF7، 4T1 و MDA تهیه شده و در محیط کشت RMPI کشت داده شدند. سلول­ها با غلظت­های 25/31، 5/62، 125، 250، 500، 1000 و 2000 میکرومولار از SO-D-3 تیمار شدند و میزان زنده­مانی آن­ها با استفاده از تست MTT طی زمان­های 24، 48 و 72 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. القای آپوپتوز توسط SO-D-3 در سلول­های سرطانی مورد مطالعه، از طریق فلوسایتومتری بررسی گردید. همچنین سطح پروتئین­های Hsp70 و Casp8 به‫عنوان پروتئین­های دخیل در آپوپتوز با استفاده از روش وسترن بلات مطالعه شد. نتایج حاصل با استفاده از نرم افزار SPSS از نظر آماری تجزیه و تحلیل شدند.
نتایج: نتایج حاصل از تست MTT نشان داد که تیمار سلول­های سرطانی به‫طور معنی‫داری موجب کاهش زنده­مانی این سلول­ها نسبت به شاهد می‫شود. میزان IC50 برای سلول­های MDA-MB-231 به‫طور قابل توجهی کمتر از سلول­های MCF7 و 4T1 در 24 ساعت بود (4/157 میکرومولار برای MDA-MB-231 در مقایسه با 8/843 میکرومولار برای MCF7 و 1212 میکرومولار برای 4T1). با این حال، تفاوت با افزایش زمان تیمار کاهش یافت (47/77 میکرومولار و 38/23 میکرومولار برای MDA-MB-231، 3/107 میکرومولار و 69/36 میکرومولار برای MCF7، و 63/83 میکرومولار و 58/16 میکرومولار برای 4T1 به‫ترتیب در 48 ساعت و 72 ساعت). آنالیز فلوسایتومتری نشان داد که در سلول­های تیمار شده با SO-D-3، سلول­های آپوپتوتیک افزایش معناداری پیدا کرده بودند. بررسی سطح پروتئین­ها با استفاده از تکنیک وسترن بلات نیز نشان داد که پروتئین HSP70 در سلول­های MCF7 و 4T1 کاهش معناداری داشته است. از طرفی در سلول­های 4T1 و MDA سطح پروتئین Casp8 به طور معناداری افزایش یافته بود.
نتیجه­گیری: نتایج تحقیق حاضر نشان داد که SO-D-3 می­تواند به‫طور وابسته به‫زمان موجب مرگ سلول‫های سرطانی پستان شود. آزمایش‫های بعدی نیز نشان داد که SO-D-3 این عمل را از طریق القای آپوپتوز اعمال می­کند. بنابراین با توجه به نتایج حاصل از تحقیق حاضر، می­توان SO-D-3 را به‫عنوان یک ترکیب دارای خاصیت ضد سرطانی بالقوه معرفی نمود که قادر است با کاهش Hsp70 و تغییر بیان Casp8 دخیل در مسیر خارجی آپوپتوزیس، موجب مرگ سلول­های سرطانی پستان شود.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Investigation of the apoptosis induction potential of synthetic sorafenib-derived compounds in breast cancer cells

نویسندگان [English]

  • N Soltani 1
  • H Ghafouri 2

1 Department of Biology, Faculty of Science, University Campus 2, University of Guilan, Rasht, Iran

2 Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran

چکیده [English]

Aim: Cancer is one of the most important diseases of this century, which affects many people all over the world, and while the prevalence of this disease is increasing, no suitable treatment has been found yet. In the meantime, breast cancer is the most common cancer and the leading cause of cancer-related death in women worldwide. In the search for cancer treatment solutions, researchers synthesize numerous medicinal compounds for various cancers and study their effects. Sorafenib is a urea multikinase inhibitor which causes apoptosis and inhibits angiogenesis and cancer cell proliferation. This compound is currently used as a treatment for hepatocellular cancer, and tests have also been carried out to verify its performance in treating other cancers. Sorafenib derivatives were also synthesized and analyzed. In this research, the anticancer effect of one of the derivatives of sorafenib named (2E,2´E)-2,2´-(1,4-phenylene bis(methanylidene)bis(N-(4-chloro-3-(tri) Fluoroethyl (phenyl) hydrazine carboxamide, abbreviated as SO-D-3, was evaluated against three breast cancer cell lines.
Materials and methods: Three breast cancer cell lines including MCF7, 4T1 and MDA were prepared and cultured in RMPI culture medium. Cells were treated with concentrations of 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 and 2000 μM of SO-D-3, and their survival rates were measured using the MTT test during 24, 48 and 72 hours. The induction of apoptosis by SO-D-3 in the studied cancer cells was investigated by flow cytometry. In addition, the level of Hsp70 and Casp8 proteins as implicated in apoptosis were investigated using the western blot method. The results were statistically analyzed using SPSS software.
Results: The results of the MTT test showed that the treatment of cancer cells significantly decreases the survival of these cells compared to the control. The IC50 for MDA-MB-231 cells was significantly lower than MCF7 and 4T1 cells at 24 hours (157.4 µM for MDA-MB-231 compared to 843.8 µM for MCF7 and 1212 µM for 4T1). However, the difference decreased with increasing treatment time (77.47 μM and 23.38 μM for MDA-MB-231, 107.3 μM and 36.69 μM for MCF7, and 83.63 μM and 16.58 μM for 4T1 at 48 hours and 72 hours respectively). Flow cytometry analysis revealed that in cells treated with SO-D-3, apoptotic cells increased significantly. Examination of the protein level using the western blot technique also showed that the HSP70 protein was significantly decreased in MCF7 and 4T1 cells. On the other hand, the level of Casp8 protein was significantly increased in 4T1 and MDA cells.
Conclusion: The results of the present study showed that SO-D-3 can cause the death of breast cancer cells in a time-dependent manner. Subsequent experiments showed that SO-D-3 exerts this action through the induction of apoptosis. Therefore, according to the results of the present research, SO-D-3 can be introduced as a compound with potential anti-cancer properties that can cause cell death by reducing Hsp70 and changing the expression of Casp8 involved in the external pathway of apoptosis.

کلیدواژه‌ها [English]

  • HSP70protein
  • Sorafenib
  • Caspase8
  • Extrinsicpathwayof apoptosis
اصل مقاله
  • مقدمه

سرطان پس از بیماری­های قلبی-عروقی، دومین عامل شایع مرگ و میر در کشورهای توسعه یافته و سومین عامل مرگ در کشورهای در حال توسعه می­باشد. این بیماری به تنهایی بیش از بیماری­های سل، ایدز و مالاریا، افراد را به کام مرگ می‫کشاند. طبق آمار سرطان در حال حاضر عامل حدود 12 درصد از مرگ ­و میرها در سراسر جهان است. پیش­بینی­ها نشان می­دهد که تا سال 2030، 13 میلیون مرگ ناشی از سرطان در سال گزارش خواهد شد (1). امروزه برای درمان سرطان از روش­های مختلفی همچون شیمی­درمانی و رادیوتراپی استفاده می­شود. در طی سال­های اخیر اگرچه پیشرفت عمده­ای در راه‫کارهای درمانی سرطان ایجاد شده است اما تاکنون درمان قطعی برای این بیماری معرفی نشده است. لذا تلاش برای یافتن راه‫کارهای درمانی و نیز ترکیبات دارویی جدید برای درمان سرطان همچنان ادامه دارد. طراحی و سنتز داروهای جدید ضد سرطان با کارآیی بالا و اختصاصیت کافی الزامی به‫نظر می­رسد (2).

علائم سرطان در تمام سلول­های سرطانی صرف نظر از علت یا نوع آن وجود دارد که شامل رشد کنترل نشده، رگ­زایی و فرار از آپوپتوزیس است (3, 4). یکی از عملکردهای اصلی آپوپتوزیس، پیشگیری از سرطان است (5). به‫طور معمول، این یک مسیر ذاتی است که در سرطان مهار می­شود. از دست دادن کنترل آپوپتوزیس به سلول‌های سرطانی اجازه می‌دهد بیشتر زنده بمانند و زمان بیشتری را برای تجمع جهش‌ها می‌دهد که می‌تواند تهاجم را در طول پیشرفت تومور افزایش دهد، رگ‌زایی را تحریک کند، تکثیر سلولی را تنظیم و در تمایز اختلال ایجاد نماید (6). یکی از راه های درمان سرطان، کنترل یا احتمالا پایان دادن به رشد کنترل نشده سلول­های سرطانی است. استفاده از مکانیسم خود سلول برای مرگ یک روش بسیار موثر است. علاوه بر این، هدف قرار دادن آپوپتوزیس موفق­ترین درمان غیر جراحی است. هدف قرار دادن آپوپتوزیس همچنین برای همه انواع سرطان موثر است، زیرا فرار از آپوپتوزیس نشانه بارز سرطان است و به‫علت یا نوع سرطان ارتباطی ندارد. داروهای ضد سرطان زیادی وجود دارند که مراحل مختلف را در مسیرهای داخلی و خارجی آپوپتوزیس هدف قرار می دهند (7-9). دو استراتژی متداول برای هدف‌گیری درمانی، تحریک مولکول‌های پیش آپوپتوزیسی و مهار مولکول‌های ضدآپوپتوزیس است (10). HSP70 یک پروتئین محافظت شده تکاملی است که بیان آن توانایی سلول را برای زنده ماندن در یک سری از شرایط کشنده افزایش می­دهد. این پروتئین نقش مهمی در آپوپتوزیس دارد و افزایش سطح HSP70 مسیر آپوپتوتیک را در سطوح مختلف، مسدود می­کند (11). بنابراین القای آپوپتوزیس از طریق مهار HSP70 می­تواند یک رویکرد درمانی مناسب برای انواع سرطان­ها باشد (12).

سرطان پستان شایع­ترین سرطان در میان زنان است که شیوع آن در دهه­های اخیر رو به افزایش است. به‫دلیل نقش اساسی آپوپتوزیس و مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی در کنترل تقسیم سلول‌ها، داروهای ارائه شده­ی جدید ترجیحا باید بتوانند آپوپتوزیس را در سلول‌های سرطانی القا نمایند (13). امروزه یکی از مهم­ترین چالش­های محققان، طراحی داروهای جدید با خواص بهبود یافته و اثرات جانبی کمتر برای درمان بیماری­هایی همچون سرطان است (14). در نظر گرفتن اهداف درمانی  بر اساس مطالعات قبلی و ساختار داروهایی که تا کنون معرفی شده­ و در بدن دارای فعالیت بیولوژیک هستند، روند مرسوم کشف، طراحی و کاندید شدن یک دارو می­باشد. (15). سورافنیب یک مهار کننده­ی تیروزین کینازی است که به‫طور رایج جهت درمان کارسینوم هپاتوسلولار استفاده می­شود و اثربخشی آن در درمان چندین سرطان دیگر تایید شده است (16-18). ترکیب جدیدی به‫نام (2E,2´E)-2,2´-(1,4-فنیلن­بیس (متانیلیدن) بیس (N-(4-کلرو-3-(تری­فلوروم اتیل)فنیل) هیدرازین کربوکسامید) که به اختصار SO-D-3 نامیده می‫شود،  بر اساس تغییرات در ساختار سورافنیب در دانشگاه گیلان طراحی و سنتز شده است که در تحقیق حاضر اثر آن بر القای آپوپتوزیس در سلول‌های سرطان پستان مورد بررسی قرار گرفت (19).

  • مواد و روش­ها

تهیه و کشت رده­های سلولی: رده­های سلولی سرطانی 4T1، MCF-7 ، MDA-MB-231 و همچنین رده­ی سلولی نرمالWI-38  از انستیتو پاستور تهران خریداری شدند. رده سلولی MCF-7 دارای گیرنده­های استروژن و EGF عملکردی است، برای رشد به استروژن و EGF وابسته است و غیر تهاجمی است، در حالی‫که سلول­های MDA-MB-231 مدلی برای سرطان سینه تهاجمی­تر و مستقل از هورمون هستند (20). از طرفی 4T1 یک رده سلولی تومور قابل پیوند است که بسیار تومورزا و تهاجمی بوده و برخلاف اکثر مدل­های تومور، می­تواند به‫طور خود به‫خود از تومور اولیه در غده پستانی به چندین مکان دور متاستاز دهد (21). WI-38 نیز یک رده سلولی دیپلوئید انسانی است که از فیبروبلاست های مشتق شده از بافت ریه یک جنین دختر سه ماهه تشکیل شده و به‫عنوان کنترل در آزمایش استفاده می­شود (22). سلول­ها در محیط کشت DMEM همراه با پنی­سیلین/استرپتومایسین کشت داده شده و در انکوباتور با 5 درصد CO2 در دمای 37 درجه سانتی‫گراد انکوبه شدند. ارزیابی زنده­مانی سلول­ها: به‫منظور بررسی اثر ترکیب SO-D-3 بر روی رده­های سلولی مورد مطالعه، سلول­ها با غلظت­های مورد نظر از  SO-D-3 (µM 25/31، 5/62، 125، 250، 500، 1000 و 2000) در محیط کشت حاوی 2 درصد FBS تیمار شدند. یک گروه بدون تیمار نیز به‫عنوان گروه کنترل جهت مقایسه در نظر گرفته شد. سپس پلیت­ها به‫مدت 24، 48 و 72 ساعت انکوبه شده و میزان زنده ماندن سلول­ها پس از هر زمان به‫روش MTT assay مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از هر زمان انکوباسیون، محیط داخل هر چاهک دور ریخته شده و با 10 میکرولیتر از محلول MTT (5 میلی‫گرم بر میلی­لیتر در PBS) به‫مدت 4 ساعت در داخل انکوباتور، قرار گرفت. سپس محلول رویی به آرامی برداشته شده به‫طوری‫که بلورهای تشکیل شده از کف پلیت جدا نشود و مقدار 200 میکرولیتر DMSO به‫هر چاهک اضافه گردید و پلیت­ها به‫مدت 15 دقیقه روی دستگاه شیکر با دور پائین قرار داده شدند تا رسوب­های فورمازان کاملا حل شوند. در نهایت، جذب نوری (OD) هر چاهک با استفاده از دستگاه الایزا ریدر در طول موج 570 نانومتر خوانده شد. زیست­پذیری سلولی نسبی در هر غلظت و زمان با استفاده از رابطه زیر تعیین شد.     

                                                  درصد سلول‌های زنده = )OD test/OD control(×100        

بررسی القای آپوپتوزیس: در تحقیق حاضر جهت بررسی آپوپتوزیس از روش فلوسایتومتری با رنگ­آمیزی آکریدین اورنج و اتیدیوم بروماید استفاده شد. برای این منظور ابتدا سلول­ها دفریز شده و حدود 15 هزار سلول (µM 500) در یک پلیت 24 چاهکی به‫مدت 24 ساعت کشت داده شدند. پس از رسیدن سلول­ها به فاز لگاریتمی، با غلظت معادل 75 درصد IC50  از ترکیب SO-D-3 به‫مدت 72 ساعت تیمار شدند. پس از 72 ساعت انکوباسیون، پس از تخلیه­ی کامل محیط کشت و سانتریفیوژ، لایه­ی سلولی تریپسینه شد. مایع رویی حذف شد و سلول­ها در محیط کشت کامل حل شدند. سپس 15 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی با 20 میکرولیتر محلول آکریدین اورنج و اتیدیوم بروماید با نسبت 1:1 مخلوط شد. 10 میکرولیتر از محلول نهایی بر روی لام قرار داده شد و پس از پوشانده شدن با لامل، با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مشاهده و تصویربرداری شد.

آنالیز وسترن بلات: بیان دو پروتئین HSP70 و Casp8 تحت تاثیر SO-D-3 با استفاده از آنالیز وسترن بلات ارزیابی شد. سلول‫ها در پلیت‫های 6 چاهکی کشت داده شدند و با ترکیب SO-D-3 با غلظت معادل 75 درصد  IC50تیمار شدند. پس از 48 ساعت، با 5/12 درصد تریپسین در دمای 37 درجه سانتی­گراد به‫مدت 35 ثانیه هضم شدند و در دمای 4 درجه سانتی­گراد و دور g 12000 به‫مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. علاوه بر این، آن‫ها در بافر RIPA (50 میلی مولار pH 7.5 Tris-HCl، 150 میلی‫مولار NaCl، 1 درصد NP-40، 5/0 درصد سدیم دی اکسی کولات، 1/0 درصد SDS) حل شده و  غلظت پروتئین کل بر اساس پروتکل‫های سازنده کیت سنجش BCA شناسایی شد و 50 میکروگرم از هر نمونه در حضور 10 درصد SDS-PAGE تعیین وزن مولکولی شد و به یک غشای نیتروسلولزی منتقل شد. به‫علاوه، غشا با استفاده از 5 درصد اسکیم میلک در طول 1 ساعت در دمای اتاق بلاک شد، با آنتی بادی‫های اولیه (شامل Anti-Caspase-8 ab138485 و HSP70 (C92F3A-5): sc-66048) در طول شب در دمای 4 درجه سانتی‫گراد انکوبه شده و پس از انکوباسیون با آنتی بادی ثانویه نشاندار HRP (Horseradish Peroxidase) در دمای 37 درجه سانتی­گراد شستشو شدند. نوارهای پروتئینی با استفاده از کیت سوبسترای وسترن بلات کمی‌لومینسانس پیشرفته (Biovision، آمریکا) و اسکن مشاهده شدند. نرم­افزار Quantity-One v4.6.6 برای تجزیه و تحلیل بیان پروتئین نسبی پس از اصلاح با رفرنس داخلی β-اکتین (رقت 1:1000، Abcam ab8227) استفاده شد.

  • آنالیز آماری

داده­ها با استفاده از نرم­افزار SPSS ورژن V.25 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. با توجه به نرمال بودن توزیع داده­ها، مقایسه گروه تیمار و گروه کنترل با استفاده از روش One Way Anova آنالیز شد و p-value محاسبه شد. حداقل سطح معنی‫داری 05/0­p< در نظر گرفته شد. از روش Tukey به‫عنوان آزمون تعقیبی استفاده شد.

  • نتایج

نتایج تست زنده­مانی سلولی­ها

نتایج حاصل نشان داد که تیمار سلول­های MCF7، 4T1 و MDA-MB-231 به‫طور معنی‫داری موجب کاهش زنده­مانی سلول­ها می­شود. سمیت سلولی SO-D-3 برای این سلول­ها وابسته به زمان بوده و با گذشت زمان زنده­مانی سلول­ها به‫طور معنی‫داری کاهش یافته است (شکل 1، الف). آنالیز آماری نشان داد که همه غلظت­ها نسبت به گروه کنترل (غلظت صفر) با مقدار 0001/0p< اختلاف معنی­داری دارند (شکل 1). علاوه بر این، IC50 برای سلول­های MDA-MB-231 به‫طور قابل توجهی کمتر از سلول­های MCF7 و 4T1 در 24 ساعت بود (4/157 میکرومولار برای MDA-MB-231 در مقایسه با 8/843 میکرومولار برای MCF7 و 1212 میکرومولار برای 4T1). با‫این‫حال، تفاوت با افزایش زمان تیمار کاهش یافت (47/77 میکرومولار و 38/23 میکرومولار برای MDA-MB-231، 3/107 میکرومولار و 69/36 میکرومولار برای MCF7، و 63/83 میکرومولار و 58/16 میکرومولار برای 4T1 به‫ترتیب در 48 ساعت و 72 ساعت).

 شکل 1: زنده­مانی سلول­های MCF7 (الف)، 4T1 (ب) و MDA-MB-231 (ج) تیمار شده با غلظت­های مختلف SO-D-3 در زمان‫های 24، 48 و 72 ساعت (نمودار فوق بر اساس میانگین ± انحراف معیار ترسیم شده است)

                                    

     

 

                   

 

                     

                                                           

نتایج ارزیابی القای آپوپتوزیس

جهت بررسی آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی تحت تیمار با SO-D-3 از تکنیک فلوسایتومتری استفاده شد که نتایج آن در شکل 2 نشان داده شده است. در سلول­های MCF7 تیمار شده با SO-D-3، تعداد سلول­های زنده نسبت به گروه شاهد به‫طور معنی‫داری کاهش داشته و در مقابل تعداد سلول­های آپوپتوتیک تاخیری و نکروتیک، به‫طور معنی‫داری افزایش یافته بود. بررسی آپوپتوزیس در سلول­های 4T1 نشان داد که تعداد سلول­های زنده تحت اثر SO-D-3 کاهش معنی‫داری می­یابد و در مقابل تعداد سلول­های آپوپتوتیک اولیه و تاخیری افزایش معنی‫داری پیدا کرده بود. از سوی دیگر ترکیب SO-D-3 موجب کاهش معنی‫داری سلول­های زنده­ی MDA-MB-231 و افزایش معنی‫دار سلول­های آپوپتوتیک اولیه و تاخیری و همچنین سلول­های نکروتیک نسبت به گروه کنترل شده بود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: سیتوگرام فلوسایتومتری و وضعیت آپوپتوزیسی سلول­های  4T1(ردیف اول)، MCF7 (ردیف دوم) و MDA-MB-231 (ردیف سوم) تیمار شده با SO-D-3، با استفاده از نرم افزار FlowJo  درصد سلول‫ها محاسبه شده ­است.

 

نتایج آنالیز وسترن بلات

بررسی سطح پروتئین­ها با استفاده از تکنیک وسترن بلات نشان داد که پروتئین HSP70 در سلول­های MCF7 و 4T1 تیمار شده با SO-D-3 نسبت به سلول­های کنترل کاهش معنی‫داری داشته است )01/0 .(p<در سلول­های MDA-MB-231 تیمار شده نیز سطح این پروتئین کاهش نشان داد با این‫حال از نظر آماری معنی‫دار نبود. سطح پروتئین Casp8 نیز در هر سه رده­ی سلولی مورد مطالعه تحت اثر SO-D-3 افزایش یافته بود که در دو رده­ی 4T1 و MDA-MB-231 این افزایش از نظر آماری معنادار بود )05/0 (p< (شکل 3).

 

*

*

**

**

 

ج

الف

  

ب

  

شکل :3 نتایج حاصل از وسترن بلات برای پروتئین­های Hsp70 (الف) و Casp8 (ب) در سلول­های تیمار شده با SO-D-3 و سطح پروتئین­های مذکور (ج) (باندها از سمت چپ به‫ترتیب مربوط به لدر، سلول 4T1 کنترل، سلول 4T1 تیمار شده، سلول MCF7 کنترل، سلول MCF7 تیمار شده، سلول MDA-MB-231 کنترل و سلول MDA-MB-231 تیمار شده می­باشند) (*05/0p<، **01/0p<)

 

  • بحث

در تحقیق حاضر تلاش شده تغییر بیان دو پروتئین مهم و تاثیرگذار مسیر آپوپتوزیس در سه رده سلولی سرطان پستان در نتیجه القای آپوپتوزیس توسط یک مشتق سورافنیب به نام SO-D-3 که تاکنون گزارشی مبنی بر بررسی اثر این مشتق، بر رده‫های سرطانی گزارش نشده، صورت بگیرد و نتایج حاصل نشان داد که این ترکیب احتمالا از طریق کاهش بیان HSP70 و افزایش سطح پروتئین Casp8، موجب القای آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی پستان می­شود. طبق نتایج، SO-D-3 موجب کاهش معنی‫دار زنده­مانی سلول­های سرطانی در یک حالت وابسته به زمان می­شود. بررسی روند آپوپتوزیس نشان دهنده­ی افزایش آپوپتوزیس اولیه و تاخیری در سلول­های تحت تیمار با SO-D-3 بود که با تغییر بیان پروتئین­های HSP70 و Casp8 همخوانی داشته و تایید کننده­ی القای مسیر خارجی آپوپتوزیس در SO-D-3 می­باشد. در واقع کاهش بیان HSP70 را می­توان به‫عنوان یکی از مکانیسم­های عمل احتمالی SO-D-3 جهت القای آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی معرفی نمود.

Wang و همکاران (23) مشتقات سورافنیب سنتز و فعالیت‌های سیتوتوکسیک آنها در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار دادند و اذعان داشتند که سورافنیب باعث اختلال اولیه در عملکرد میتوکندری و دپلاریزاسیون عمیق غشای میتوکندری می شود که با کاهش سطح ATP داخل سلولی و افزایش تولید ROS همراه است. Wang و همکاران (24) اثرات سمی چندین مشتق سورافنیب را بر روی رده­های سلولی A549، ACHN و MDA-MB-231 گزارش کردند. همچنین چهار مشتق سورافنیب که دارای داربست پیرازولی بودند سنتز شده و اثر آن­ها بر روی چند رده­ی سلولی سنجیده شد. نتایج آن­ها نشان داد که این مشتقات از طریق اثر بر کینازهای VEGFR2/KDR، EGFR، Flt-3، c-Met، CRAF و BRAF موجب مرگ سلول­های سرطانی مورد مطالعه از جمله MCF-7 می­شوند. Yao و همکاران (25) تعدادی مشتقات سورافنیب را طراحی و سنتز کرده و اثرات آن­ها را بر تکثیر سلول­های HCT116، PC-3 و MDA-MB-231 ارزیابی کردند. نتایج حاصل نشان داد که همه­ی ترکیبات سنتز شده قادر به مهار تکثیر سلول­های مورد مطالعه بودند. در پژوهش Cheng و همکاران (26) نشان داده شد که برخی مشتقات سورافنیب با مهار STAT3 مستقل از Raf، موجب القای آپوپتوزیس در سلول­های هپاتوسلولار می­شوند. سورافنیب به‫عنوان مهار کننده­های Rafکیناز، STAT3 را کاهش داده و مرگ سلولی را القا می­کند. در حالی‫که برخی از مشتقات سورافنیب از طریق مسیرهای مستقل از Raf می­توانند STAT3 را مهار کنند. در تحقیق آن­ها نشان داده شد که بیان Raf تغییر نکرده است. مکانیسم احتمالی درگیر در مهار STAT3 بهبود فعالیت SHP-1 فسفاتاز توسط مشتقات سورافنیب گزارش شد (27).

امروزه یکی از استراتژی های جالب توجه که در شیمی درمانی سرطان مورد توجه قرار گرفته است، مداخلات دارویی است که بتوانند مرگ سلول‫های بدخیم را از طریق القای آپوپتوزیس وساطت کنند (28). همان­طور که اشاره شد در تحقیقات بسیاری به سنتز ترکیبات مشتق از سورافنیب پرداخته شده و نشان داده شده است که برخی از این ترکیبات قابلیت القای آپوپتوزیس را دارند. در تحقیق حاضر نیز هم­راستا با گزارش‫ها مذکور، نشان داده شد که SO-D-3 با القای آپوپتوزیس موجب مرگ سلول­های سرطانی پستان می­شود.

HSP70 یک چاپرون است که در پی تنش­های مختلف در سلول­ها تجمع می­یابد و در پاسخ به شرایط نامطلوب، بقای سلول را تقویت می­کند. در طول درمان ضد سرطان، سلول‌های سرطانی برخلاف سلول‌های طبیعی، به‌وفور HSP70 را برای مقاومت در برابر تهدید‌های مختلف در مراحل مختلف تومورزایی بیان می‌کنند. تلاش زیادی در سال‌های گذشته برای جستجوی مهارکننده‌های HSP70 انجام شده است (12). یکی از مهم­ترین عملکرد­های HSP70 در بقای سلول­های سرطانی، مهار آپوپتوزیس می­باشد (29). در مسیر خارجی آپوپتوزیس، سیگنال­های مرگ سلولی که به‫عنوان لیگاندهای مرگ نیز شناخته می­شوند، به گیرنده های مرگ خانواده فاکتور نکروز تومور (TNF) متصل می­شوند (30). برخی از لیگاندهای مرگ عبارت از لیگاند Fas (Fas-L)، لیگاند القاکننده آپوپتوزیس مرتبط با TNF (TRAIL) و فاکتور نکروز تومور (TNF) می­باشند. از طرفی پروتئین‌های آداپتور شامل دومین مرگ مرتبط با Fas (FADD) و دومین مرگ مرتبط با گیرنده TNF (TRADD) هستند (31). پروکاسپازهای آغازگر 8 و 10 به پروتئین آداپتور متصل شده و کمپلکس سیگنال‫دهی القا کننده مرگ (DISC) را تشکیل می­دهند (32). پروکاسپازها یک دومین عامل مرگ (DED) دارند که از طریق آن به پروتئین آداپتور متصل می­شوند (31). پروکاسپازهای 8 و 10 توسط DISC فعال می­شوند. سپس کاسپازهای 3، 6 و 7 فعال شده و جداسازی پروتئین­ها و اسکلت سلولی را آغاز می­کنند که نهایتا منجر به مرگ سلولی می­شود. DISC توسط بازدارنده C-FLIP تنظیم می­شود که با کاسپاز-8 همولوگ است اما فاقد فعالیت کاسپازی است (10).

مسیر خارجی آپوپتوزیس (مسیر گیرنده مرگ) توسط پروتئین‫های مرتبط با غشای پلاسمایی خانواده گیرنده های TNF ایجاد می شود که منجر به فعال شدن کاسپاز 8/10 در کمپلکس سیگنال دهی مرگ (DISC) می­شوند (33). کاسپاز-8 یا مستقیما کاسپازهای 3/6/7 را فعال می‌کند یا Bid را به t-Bid می‌شکند که مسیرهای آپوپتوزیس بیرونی و درونی را به‫هم متصل می‌نماید (34). در سیگنال­دهی آپوپتوزیس، Hsp70 با بیان بسیار بالا در چندین نقطه، از جمله آزادسازی سیتوکروم c، فعال شدن کاسپازها، تجمع پروتئین­های اشتباه تا شده، تولید گونه­های اکسیژن فعال و تکه تکه شدن DNA دخالت می­کند (35). علاوه‫بر‫این، مهار HSP70 حساسیت سلول­ها را به آپوپتوزیس افزایش می­دهد (36, 37). HSP70 به‫طور مستقیم یا غیرمستقیم فعالیت کاسپاز8 را مهار می­کند، در نتیجه مسیرهای آپوپتوزیس درونی و بیرونی را از طریق تعامل با پروتئین­های آپوپتوزی کلیدی مسدود می­کند. یافته­های تحقیق حاضر نیز نشان داد که ترکیب SO-D-3 علاوه بر کاهش سطح HSP70، منجر به افزایش کاسپاز 8 در سلول­های سرطانی پستان می­شود. از طرفی میزان آپوپتوز تحت تاثیر SO-D-3 در سلول­های مذکور افزایش یافته بود. این نتایج نشان می­دهد که SO-D-3 قادر به القای مسیر خارجی آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی پستان می­باشد.

کاهش سطح بیان HSP70 می­تواند با القای آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی تیمار شده با داروهای ضد سرطان در ارتباط باشد (38, 39). Kong و همکاران (40) اثر داروهای ضد سرطانی را بر بیان HSP70 در سلول­های سرطان انسانی بررسی کرده و مشاهده کردند که در سلول­های آپوپتوتیک بیان این سلول­ها کاهش می­یابد. در مطالعه­ی حاضر مشاهده شد که SO-D-3 موجب کاهش معنی‫دار بیان HSP70 در سلول­های MCF7 و 4T1 می­شود. بر همین اساس می­توان نتیجه گرفت که SO-D-3 با مهار بیان HSP70 اثر ضد سرطانی خود را علیه سلول­های سرطان پستان اعمال می­کند. نشان داده شده است که داروهایی همچون دوکسوروبیسین (41)، دوستاکسل (42)، اتوپوزید (43)، بورتزومیب (44) و میتوکسانترون (45) نیز موجب کاهش بیان HSP70 در سلول­های سرطانی می­شوند.

  • نتیجه­گیری

در تحقیق حاضر اثر SO-D-3 بر سلول­های سرطانی پستان رده­ی MCF7، 4T1 و MDA-MB-231 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج تست MTT نشان دهنده­ی تفاوت معنی‫دار سیتوتوکسیته غلظت­های مختلف SO-D-3 نسبت به کنترل بود. بر اساس نتایج آنالیز فلوسایتومتری سلول­های سرطانی آپوپتوتیک در گروه تیمار افزایش معنی‫داری داشتند. علاوه بر این آنالیز وسترن بلات نیز نشان داد که SO-D-3 از بیان HSP70 در سلول­های سرطانی جلوگیری می­نماید و سطح کاسپاز 8 را افزایش می­دهد. با توجه به نتایج به‫دست آمده می­توان بیان کرد که SO-D-3 از طریق مهار HSP70 بر روی مسیر خارجی آپوپتوزیس تاثیر می­گذارد. با توجه به نتایج حاصل می­توان SO-D-3 را به‫عنوان یک ترکیب دارای خاصیت ضد سرطانی بالقوه معرفی نمود که استفاده از آن در درمان سرطان نیازمند بررسی­های بیشتر می­باشد. امید است که با انجام آزمایشات همه جانبه بر روی این ترکیب، بتوان از آن در درمان سرطان پستان و سایر سرطان­ها استفاده نمود.

  • تشکر و قدردانی

نویسندگان از شورای پژوهشی دانشگاه گیلان برای حمایت مالی از این مطالعه تشکر می­نمایند.

مراجع
  1. Mattiuzzi C, Lippi G. Current cancer epidemiology. Journal of epidemiology and global health. 2019;9(4):217.
  2. Sun Y-S, Zhao Z, Yang Z-N, Xu F, Lu H-J, Zhu Z-Y, et al. Risk factors and preventions of breast cancer. International journal of biological sciences. 2017;13(11):1387.
  3. Xu W, Jing L, Wang Q, Lin C-C, Chen X, Diao J, et al. Bax-PGAM5L-Drp1 complex is required for intrinsic apoptosis execution. Oncotarget. 2015;6(30):30017.
  4. Arbiser JL, Bonner MY, Gilbert LC. Targeting the duality of cancer. NPJ precision oncology. 2017;1(1):1-7.
  5. Lopez J, Tait S. Mitochondrial apoptosis: killing cancer using the enemy within. British journal of cancer. 2015;112(6):957-62.
  6. Hassan M, Watari H, AbuAlmaaty A, Ohba Y, Sakuragi N. Apoptosis and molecular targeting therapy in cancer. BioMed research international. 2014;2014.
  7. Bao H, Zhang Q, Zhu Z, Xu H, Ding F, Wang M, et al. BHX, a novel pyrazoline derivative, inhibits breast cancer cell invasion by reversing the epithelial-mesenchymal transition and down-regulating Wnt/β-catenin signalling. Scientific reports. 2017;7(1):1-10.
  8. Villa-Pulgarín JA, Gajate C, Botet J, Jimenez A, Justies N, Varela-M RE, et al. Mitochondria and lipid raft-located FOF1-ATP synthase as major therapeutic targets in the antileishmanial and anticancer activities of ether lipid edelfosine. PLoS neglected tropical diseases. 2017;11(8):e0005805.
  9. Liu Y, Zhu X. Endoplasmic reticulum-mitochondria tethering in neurodegenerative diseases. Translational neurodegeneration. 2017;6(1):1-8.
  10. Pfeffer CM, Singh AT. Apoptosis: a target for anticancer therapy. International journal of molecular sciences. 2018;19(2):448.
  11. Roufayel R, Kadry S. Molecular chaperone HSP70 and key regulators of apoptosis-a review. Current molecular medicine. 2019;19(5):315-25.
  12. Goloudina AR, Demidov ON, Garrido C. Inhibition of HSP70: a challenging anti-cancer strategy. Cancer letters. 2012;325(2):117-24.
  13. Waks AG, Winer EP. Breast cancer treatment: a review. Jama. 2019;321(3):288-300.
  14. Liang G, Fan W, Luo H, Zhu X. The emerging roles of artificial intelligence in cancer drug development and precision therapy. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2020;128:110255.
  15. Waaijer SJ, Kok IC, Eisses B, Schröder CP, Jalving M, Brouwers AH, et al. Molecular imaging in cancer drug development. Journal of Nuclear Medicine. 2018;59(5):726-32.
  16. Rodríguez‐Hernández MA, González R, de la Rosa AJ, Gallego P, Ordóñez R, Navarro‐Villarán E, et al. Molecular characterization of autophagic and apoptotic signaling induced by sorafenib in liver cancer cells. Journal of cellular physiology. 2019;234(1):692-708.
  17. Li Y, Yan H, Xu X, Liu H, Wu C, Zhao L. Erastin/sorafenib induces cisplatin‑resistant non‑small cell lung cancer cell ferroptosis through inhibition of the Nrf2/xCT pathway. Oncology letters. 2020;19(1):323-33.
  18. Bronte G, Andreis D, Bravaccini S, Maltoni R, Cecconetto L, Schirone A, et al. Sorafenib for the treatment of breast cancer. Expert opinion on pharmacotherapy. 2017;18(6):621-30.
  19. Shoja S, Mahmoodi NO, Ghafouri H, Rassa M, Sharafshah A, Panahi Kokhdan E. Design, in silico, one-pot synthesis, and biological evaluations of novel bis-urea analogs. Research on Chemical Intermediates. 2020;46(7):3327-39.
  20. Nohara K, Wang F, Spiegel S. Glycosphingolipid composition of MDA-MB-231 and MCF-7 human breast cancer cell lines. Breast cancer research and treatment. 1998;48(2):149-57.
  21. Pulaski BA, Ostrand‐Rosenberg S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. 2000;39(1):20.2. 1-.2. 16.
  22. Olshansky S, Hayflick L. The role of the WI-38 cell strain in saving lives and reducing morbidity. AIMS public health. 2017;4(2):127.
  23. Wang K, Li Y, Zhang L-J, Chen X-G, Feng Z-Q. Synthesis and in vitro cytotoxic activities of sorafenib derivatives. Chinese Chemical Letters. 2014;25(5):702-4.
  24. Wang M, Xu S, Lei H, Wang C, Xiao Z, Jia S, et al. Design, synthesis and antitumor activity of Novel Sorafenib derivatives bearing pyrazole scaffold. Bioorganic & medicinal chemistry. 2017;25(20):5754-63.
  25. Yao J, He Z, Chen J, Sun W, Fang H, Xu W. Design, synthesis and biological activities of sorafenib derivatives as antitumor agents. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 2012;22(21):6549-53.
  26. Chen K-F, Tai W-T, Huang J-W, Hsu C-Y, Chen W-L, Cheng A-L, et al. Sorafenib derivatives induce apoptosis through inhibition of STAT3 independent of Raf. European journal of medicinal chemistry. 2011;46(7):2845-51.
  27. Chen K-F, Tai W-T, Hsu C-Y, Huang J-W, Liu C-Y, Chen P-J, et al. Blockade of STAT3 activation by sorafenib derivatives through enhancing SHP-1 phosphatase activity. European journal of medicinal chemistry. 2012;55:220-7.
  28. Jan R. Understanding apoptosis and apoptotic pathways targeted cancer therapeutics. Advanced pharmaceutical bulletin. 2019;9(2):205.
  29. Rérole A-L, Jego G, Garrido C. Hsp70: anti-apoptotic and tumorigenic protein. Molecular Chaperones: Springer; 2011. p. 205-30.
  30. Zaman S, Wang R, Gandhi V. Targeting the apoptosis pathway in hematologic malignancies. Leukemia & lymphoma. 2014;55(9):1980-92.
  31. Goldar S, Khaniani MS, Derakhshan SM, Baradaran B. Molecular mechanisms of apoptosis and roles in cancer development and treatment. Asian Pacific journal of cancer prevention. 2015;16(6):2129-44.
  32. Liu H, Su D, Zhang J, Ge S, Li Y, Wang F, et al. Improvement of pharmacokinetic profile of TRAIL via trimer-tag enhances its antitumor activity in vivo. Scientific Reports. 2017;7(1):1-11.
  33. Guo F, Sigua C, Bali P, George P, Fiskus W, Scuto A, et al. Mechanistic role of heat shock protein 70 in Bcr-Abl–mediated resistance to apoptosis in human acute leukemia cells. Blood. 2005;105(3):1246-55.
  34. Kumar S, Stokes III J, Singh UP, Gunn KS, Acharya A, Manne U, et al. Targeting Hsp70: A possible therapy for cancer. Cancer letters. 2016;374(1):156-66.
  35. Garrido C, Brunet M, Didelot C, Zermati Y, Schmitt E, Kroemer G. Heat shock proteins 27 and 70: anti-apoptotic proteins with tumorigenic properties. Cell cycle. 2006;5(22):2592-601.
  36. Aghdassi A, Phillips P, Dudeja V, Dhaulakhandi D, Sharif R, Dawra R, et al. Heat shock protein 70 increases tumorigenicity and inhibits apoptosis in pancreatic adenocarcinoma. Cancer research. 2007;67(2):616-25.
  37. Gurbuxani S, Bruey J-M, Fromentin A, Larmonier N, Parcellier A, Jäättelä M, et al. Selective depletion of inducible HSP70 enhances immunogenicity of rat colon cancer cells. Oncogene. 2001;20(51):7478-85.
  38. Klein SD, Brüne B. Heat-shock protein 70 attenuates nitric oxide-induced apoptosis in RAW macrophages by preventing cytochrome c release. Biochemical Journal. 2002;362(3):635-41.
  39. Stankiewicz AR, Lachapelle G, Foo CP, Radicioni SM, Mosser DD. Hsp70 inhibits heat-induced apoptosis upstream of mitochondria by preventing Bax translocation. Journal of Biological Chemistry. 2005;280(46):38729-39.
  40. Kong J, Li SS, Ma Q, Liu L, Zheng LJ. Effects of dihydroartemisinin on HSP70 expression in human prostate cancer PC‐3 cells. Andrologia. 2019;51(6):e13280.
  41. Lazarev VF, Sverchinsky DV, Mikhaylova ER, Semenyuk PI, Komarova EY, Niskanen SA, et al. Sensitizing tumor cells to conventional drugs: HSP70 chaperone inhibitors, their selection and application in cancer models. Cell death & disease. 2018;9(2):1-11.
  42. Lv F, Yu Y, Zhang B, Liang D, Li Z-m, You W. Inhibitory effects of mild hyperthermia plus docetaxel therapy on ER (+/−) breast cancer cells and action mechanisms. Journal of Huazhong University of Science and Technology [Medical Sciences]. 2013;33(6):870-6.
  43. Sverchinsky DV, Nikotina AD, Komarova EY, Mikhaylova ER, Aksenov ND, Lazarev VF, et al. Etoposide-induced apoptosis in cancer cells can be reinforced by an uncoupled link between Hsp70 and caspase-3. International journal of molecular sciences. 2018;19(9):2519.
  44. Yerlikaya A, Okur E, Şeker S, Erin N. Combined effects of the proteasome inhibitor bortezomib and Hsp70 inhibitors on the B16F10 melanoma cell line. Molecular medicine reports. 2010;3(2):333-9.
  45. Carlisi D, De Blasio A, Drago-Ferrante R, Di Fiore R, Buttitta G, Morreale M, et al. Parthenolide prevents resistance of MDA-MB231 cells to doxorubicin and mitoxantrone: the role of Nrf2. Cell death discovery. 2017;3(1):1-12.
سلول و بافت
دوره 13، شماره 4
بهمن 1401
صفحه 298-310
فایل ها
سابقه مقاله
  • تاریخ دریافت: 08 اسفند 1401
  • تاریخ پذیرش: 08 اسفند 1401
  • تاریخ اولین انتشار: 08 اسفند 1401
اشتراک گذاری
ارجاع به این مقاله
آمار