شناسنامه علمی شماره
نویسندگان
1 دانشگاه زابل، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، زابل، ایران
2 دانشگاه شاهد، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی، تهران، ایران
چکیده
هدف: دستورزی محیطهای کشت سلولی با الیسیتورها یکی از راه کارهای مهم جهت القای متابولیسم ثانوی و تولید متابولیتهای ارزشمند میباشد. سالیسیلیک اسید بهعنوان یک الیسیتور غیر زیستی در افزایش تولید متابولیتهای دارویی موثر است. هدف این مطالعه بررسی اثر سالیسیلیک اسید بر رشد، برخی از شاخصهای فیزیولوژیک و تولید تریگونلین در کشت سلولی شنبلیله است. مواد و روشها: کشت سلولی از قطعات جداکشت هیپوکوتیل شنبلیله روی محیط کشت جامد MS دارای نفتالن استیک اسید (4/0 میلیگرم در لیتر) و بنزیل آدنین (4/0 میلیگرم در لیتر) بهدست آمد. سالیسیلیک اسید با غلظتهای 5/12، 25 و 50 میلیگرم در لیتر استفاده شد. سپس واکنش سلولها در ارتباط با تولید تریگونلین و دیگر شاخصهای فیزیولوژیک پس از گذشت یک هفته از اعمال تیمار بررسی شد. نتایج: نتایج نشان داد که رشد سلولی و زنده مانی سلولها تحت اثر تیمارها نسبت به شاهد کاهش یافته است. مقدار پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی در سلولها نسبت به شاهد تحت اثر تیمارها افزایش یافت. کلیه تیمارها باعث افزایش تولید تریگونلین و فنل کل شدند. تیمار سلولها با غلظت 50 میلیگرم بر لیتر سالیسیلیک اسید باعث افزایش میزان تریگونلین بهمیزان دو برابر شاهد شد. نتیجه گیری: سالیسیلیک اسید میتواند بهعنوان محرک در کشت سلولی شنبلیله بهکار رود و باعث القای تولید بیشتر تریگونلین شود. واژگان کلیدی:
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Increased trigonelline production by salicylic acid in Fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) cell culture
نویسندگان [English]
- S E 1
- A R 2
چکیده [English]
Aim:Manipulation of cell culture media by elicitors is one of the important strategies for inducing secondary metabolism production as valuable metabolites. Salicylic acid (SA) as a biotic elicitor is effective for increasing medicinal metabolites. The aim of this study was to evaluate the effectiveness of salicylic acid on the growth, some of physiological parameters and trigonelline production in fenugreek cell culture. Material and Methods: The cell was obtained from hypocotyl explants of fenugreek on MS solid medium supplemented with naphthaleneacetic acid (0.4 mg/L) and benzyladenine (0.4 mg/L). Salicylic acid with concentrations of 12.5 and 25 and 50 mg/L were used. After one week, some of physiological parameters and trigonelline production in fenugreek cell culture were investigated. Results: Following treatments with salicylic acid, the results showed that the cell growth and viability of cells were decreased as compared to control. The treatments increased hydrogen peroxide content and lipid peroxidation rate in cells compared to control. In addition trigonelline and total phenol production were improved by all the treatments. Treatment of cells with 50 mg/L salicylic acid increased trigonellin 2- fold higher than control. Conclusion: Salicilyc acid can be used as an elicitor in fenugreek cell culture and induce more trigonelline production.
کلیدواژه‌ها [English]
- Trigonelline
- Salicylic acid
- Fenugreek
مقدمه
شنبلیله (Trigonella foenum-graecum) گیاهی از تیره بقولات (Fabaceae) است که بومی ایران بوده، در بیشتر نواحی ایران از جمله آذربایجان، اصفهان، فارس، خراسان، سمنان و دامغان می‌روید و بهعنوان سبزی خوراکی کشت و مصرف می‌شود. شنبلیله دارای خواص ضد دیابتی، ضد سرطان، ضد میکروبی و کاهنده قندخون میباشد (1). خواص دارویی شنبلیله بهدلیل وجود ترکیبات استروئیدی، ترکیبات نیتروژندار، پلی فنل، ترکیبات فرار، آمینو اسید و... موجود در آن میباشد (2). دانههای شنبلیله دارای 45 تا 60 درصد قند، 20 تا 30 پروتئین، 5 تا 10 درصد لیپید، آلکالوئید تریگونلین (2/0تا 3/0 درصد)، آمینو اسیدهای آزاد و روغنهای فرار میباشد (3 و 4). بهطور کلی، شنبلیله دارای دو ترکیب شیمیایی مهم با خواص دارویی است: 1) دیوسجنین، یک ترکیب ساپونین استروئیدی و 2) تریگونلین، یک ترکیب آلکالوئیدی. دیوسجنین و تری گونلین در دانهها و برگهای شنبلیله دارای خواص ضد دیابتی و هایپوگلایسمیک است. تریگونلین یا N- متیل نیکوتینیک اسید، متابولیت ثانوی مشتق شده از نوکلئوتیدهای پیریدین است. تری گونلین ترکیب فعال فیزیولوژیکی در گیاهان است که القا کننده حرکات برگها میباشد و در زمان تنش در گیاه تجمع می یابد و بهعنوان یک محافظ اسمزی عمل میکند (4). علاوه بر این بهعنوان یک هورمون در کنترل چرخه سلولی عمل میکند. این ترکیب اولین بار از Trigonella foenum-graecum استخراج شد (5) و بعدها در بسیاری از گیاهان مانند قهوه، سویا، سیب زمینی، نخود فرنگی شناسایی شد (6). با توجه به اهمیت دارویی این ترکیب و افزایش تقاضا، تولید بیشتر آن حائز اهمیت می باشد. یکی از روشهایی که امروزه بیش از هر موضوع دیگر در زمینه بررسی متابولیتهای گیاهی مورد توجه قرار دارد، روش کشت اندام، بافت و سلول گیاهی است (1). پژوهشگران با استفاده از این روش سعی کردهاند تا تولید متابولیتهای ثانوی با ارزش در گیاهان را افزایش دهند. در کشت بافت میتوان متابولیتهایی مانند آلکالوئیدها را مستقل از عواملی مثل آب و هوا و شرایط جغرافیایی تولید نمود. بهطور خاص کشت تعلیقی سلولهای گیاهی همگام با افزایش سرعت رشد آنها سبب افزایش انباشتگی متابولیتهای مورد نظر در یک دوره زمانی کوتاه میگردد (7). در کشت کالوس گیاه شنبلیله Trigonella foenum-graecum میزان آلکالوئید تریگونلین بهمیزان 3 تا 4 برابر بیشتر از میزان موجود در دانههای این گیاه و همچنین 12 تا 13 برابر بیشتر از میزان تولید شده در ریشه و اندام هوایی آن گزارش شده است (8). علاوه بر این، میزان بالاتر این آلکالوئید در کشت سلول این گیاه گزارش شده است (8). روشهای متعددی برای افزایش تولید متابولیتهای ثانوی در کشت سلول استفاده می‌شود (9). یکی از روشهای افزایش تولید متابولیتهای ثانوی در کشت درشیشه (in vitro) استفاده از الیسیتورها میباشد. الیسیتورها ترکیباتی با منشا زیستی و یا غیر زیستی هستند که از طریق القای سیستم دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیتهای ثانوی میشوند (10). الیسیتورهای غیر زیستی مانند اشعه ماوراءبنفش، نمک فلزات سنگین و بعضی از ترکیبات شیمیایی مانند جاسمونیک اسید و سالیسیلیک اسید نیز بهمنظور افزایش تولید این ترکیبات درکشت بافت مورد بررسی قرار گرفتهاند. ترکیباتی مانند سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید از مولکولهای تاثیرگذار در مسیر علامترسانی تنشها میباشند و بهطور گستردهای در این زمینه روی آنها مطالعه شده است (11). نقش سالیسیلک اسید بر بردباری گیاه نسبت به بیماریزاها و سایر عوامل تنشزا بهخوبی شناخته شده است. به تازگی نقش آن بهعنوان یک ترکیب پیام رسان در فعال کردن پاسخهای دفاعی گیاهان پررنگتر شده است (11). بهعلت نقشی که سالیسیلیک اسید بهعنوان یک محرک دارد و باعث افزایش بیان ژنهای مسیرهای بیوسنتزی متابولیتهای ثانوی می‌شود، مورد توجه ویژهای قرار گرفته است (12). مطالعات متعددی نشان دادهاند که سالیسیلیک اسید در تحریک تولید بسیاری از متابولیتهای ثانوی همچون ترپنوئیدها، مشتقات کومارین، آلکالوئیدها و فلاونوئیدها موثر میباشد (13). جستجو در منابع نشان میدهد که تاکنون مطالعاتی درباره اثر سالیسیلیک اسید بر میزان متابولیتهای ثانوی در کشت سلولی Trigonella foenum-graecum صورت نگرفته است. در این پژوهش اثر سالیسیلیک اسید بر رشد سلول و میزان تریگونلین و برخی شاخصهای بیوشیمیایی در کشت سلولی شنبلیله بررسی شد. میزان ترکیبات فنلی دارای مسیر بیوسنتزی مشترک با تریگونلین که نقش دفاعی نیز دارند، مورد بررسی قرار گرفت تا ارتباط مسیرهای متابولیسمی گیاه مشخص شود.
موادوروشها
القایتولیدکالوسوراه اندازیکشتسلولی: برای القای کالوس مناسب، از هیپوکوتیل گیاهچههای شنبلیله بهعنوان قطعات جدا کشت استفاده گردید. قطعات جدا کشت به محیط کشت MS پایه، حاوی NAA (4/0 میلیگرم در لیتر) و BA (4/0 میلیگرم در لیتر) منتقل شدند. پس از گذشت 2 هفته القای کالوس شروع شد. برای تهیه کشت تعلیقی 2 گرم کالوس نرم، سفید و هم سن، به 50 میلیلیتر محیط کشت MS با ترکیبات هورمونی یاد شده بدون آگار اضافه شد و روی شیکر با سرعت 120 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد در تاریکی نگهداری شد و هر دو هفته یکبار واکشت گردید.
تیمار سلول ها با سالیسیلیک اسید: برای انجام این مرحله از تحقیق، ابتدا بهمنظور ایجاد یک کشت همگن و یکنواخت، کشت سلولی تهیه شده در مرحله قبل، چندین بار واکشت شد. در هر مرحله سلولها با استفاده از قیف بوخنر و در شرایط مکش جمع آوری شدند و به محیط تازه منتقل گردیدند .قبل از اعمال تیمار، دوره رشد برای سلولها تعیین گردید. بدین منظور پس از انتقال یاختهها به محیط جدید از روز اول تا 23 روز پس از انتقال، به فاصله زمانی دو روز، نمونهبرداری انجام و بر اساس وزن تر سلول ها، منحنی رشد تعیین گردید. با توجه به منحنی رشد بهدست آمده، در روز چهاردهم سلولها بهطور جداگانه با غلظتهای 5/12، 25 و 50 میلیگرم در لیتر سالیسیلیک اسید تیمار شدند. واکنش سلولها در ارتباط با تولید تری گونلین، ترکیبات فنلی، مقدار پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی پس از گذشت یک هفته از اعمال تیمار مورد ارزیابی قرار گرفت. لازم به ذکر است که سلولها پس از برداشت توسط ازت مایع منجمد شده، در دمای 80- درجه سانتیگراد تا زمان اندازهگیری شاخص های فیزیولوژیک نگهداری شدند.
اندازهگیری رشد سلولی وتعیین توان زیستی سلولها: رشد سلولی با اندازهگیری افزایش وزن خشک آنها تعیین شد. بدین منظور سلولها از محیط کشت جدا شدند و بهمدت 48 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد خشک و سپس توزین گردیدند. برای تعیین توان زیستی، از اوانس بلو (Evans blue) استفاده شد (14). بدینصورت که در زمان برداشت سلولها، یک قطره از کشت تعلیقی حاوی سلول بر روی لام قرار داده شد، سپس یک قطره از محلول آبی اوانز بلو (1/0 درصد) به آن اضافه شد و پس از گذشت سه الی چهار دقیقه با آب مقطر شسته شد و در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده گردید. سلولهایی که کاملا بهرنگ آبی در آمده بودند و سلولهایی که فقط دیواره آنها رنگ آبی بهخود گرفته بود بهترتیب سلولهای مرده و زنده در نظر گرفته شد. با شمارش سلولهای زنده و مرده و محاسبه کل آنها درصد توان زیستی سلولها تعیین گردید.
تعیین میزان پراکسیداسیون لیپیدها: مقدار مالون دی آلدیید (MDA) بهعنوان فرآورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا بهروش De Vos و همکاران (15) اندازهگیری شد. بدین منظور 200 میلی گرم از سلولهای منجمد با سه میلیلیتر تری کلرو استیک اسید (TCA) 10 درصد سائیده شد. پس از همگن سازی نمونهها ، سانتریفوژ (rpm12000، بهمدت 15 دقیقه) شدند. به یک میلیلیتر از نمونههای صاف شده، یک میلیلیتر تیو باربیتوریک اسید 25/0 درصد اضافه گردید و بهمدت نیم ساعت در دمای 100 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از قرار دادن نمونهها در حمام یخ، در طول موج 532 و 600 نانومتر جذب آنها اندازهگیری گردید. مقدارMDA بهکمک ضریب خاموشی /mM/cm 155 محاسبه گردید.
اندازه گیری پراکسید هیدروژن: مقدار پراکسید هیدروژن بر اساس روش (16) سنجیده شد. بدین منظور 200 میلیگرم توده سلولی منجمد با 5 میلیلیتر تریکلرو استیک اسید ساییده شد. نمونهها پس از همگن سازی، سانتریفوژ (rpm12000، بهمدت 15 دقیقه) شدند. به 5/0 میلیلیتر از روشناور، 5/0 میلیلیتر بافر فسفات پتاسیم (10 میلیمولار، 7pH= ) و یک میلیلیتر یدید پتاسیم (KI) اضافه شد و جذب آن در طول موج 390 نانومتر یادداشت شد. با استفاده از منحنی استاندارد مقدار پراکسید هیدروژن محاسبه گردید.
اندازه گیری میزان فنل کل: میزان ترکیبات فنلی کل بر اساس روش رنگ سنجی فولین-سیوکالتیو (17) و بر حسب منحنی استاندارد گالیک اسید در طول موج 765 نانومتر اندازهگیری شد. ابتدا 05/0 گرم از سلولهای منجمد در 3 میلیلیتر متانول 80 درصد همگن گردید و بهمدت 3 ساعت در بن ماری با دمای 70 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس بهمدت 15 دقیقه سانتریفوژ و عصاره متانولی از رسوب جدا شد. به 50 میکرولیتر عصاره متانولی، 500 میکرولیتر محلول فولین-سیوکالتیو اضافه شد. به مخلوط حاصل پس از 5 دقیقه 500 میکرولیتر محلول سدیم کربنات 7 درصد اضافه و جذب پس از 10 دقیقه در طول موج 765 نانومتر خوانده شد.
استخراج و اندازه گیری تری گونلین: کالوسهای برداشت شده پس از خشک شدن در دمای آزمایشگاه برای سنجش میزان ماده موثره تریگونلین استفاده شدند. 2/0 گرم از سلولهای خشک، پودر شده و با 10 میلیلیتر متانول توسط حمام اولتراسونیک بهمدت نیم ساعت سونیکت شدند. سپس مخلوط بهدست آمده بهمدت 10 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. سوپرناتانت جدا و تبخیر گردید و ماده خشک باقیمانده در 2 میلیلیتر متانول حل شد و در یخچال در دمای حدودا 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. برای تعیین مقدار تریگونلین از روش Rongjie و همکاران (18) بهکمک دستگاه HPLC (Knauer, Germany) با دکتورUV استفاده شد. ستون مورد استفاده (C18, 25 Cm x 4.6 mm I.D., 5 µm)، فاز متحرک استونیتریل: آب (10:90) با شارش 1 میلیلیتر در دقیقه و طول موج مورد استفاده 263 نانومتر بود. شناسایی و اندازهگیری تریگونلین بهکمک مقایسه زمان بازداری نمونهها با ماده استاندارد (سیگما) صورت گرفت.
تجزیهوتحلیلآماری
همه آزمایشها با 3 تکرار از حداقل 3 نمونه مستقل انجام گرفت. مقایسه میانگینها با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 18 و آزمون دانکن برای تعیین معنیدار بودن تفاوتها در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.
نتایج
تعیینمنحنیرشدسلول
پیش از اعمال تیمار مورد نظر، میزان رشد سلولها در مدت 23 روز در کشت تعلیقی بررسی شد (شکل 1). نتایج نشان داد که پس از کشت، میزان سلولها افزایش یافته، که این روند تا روز نهم ادامه دارد. پس از این زمان وزن کاهش مییابد. شیب رشد یاخته ای در روز چهاردهم افزایشی بود که در این زمان سلولها در اواسط دوره نمایی رشد بوده، به شدت در حال تقسیم هستند. در این زمان حجم توده سلولی بهمیزان مناسبی رسیده، بنابراین روز چهاردهم بهعنوان زمان افزودن تیمار انتخاب گردید.
شکل1: منحنیرشدسلولیدرکشتسلولیشنبلیلهدر محیط کشت MS.
اثر سالیسیلیک اسید بر رشد و توان زیستی سلولها
اثر سالیسیلیک اسید روی رشد و زنده مانی سلولهای شنبلیله در شکلهای ۲، الف و ۲، ب نشان داده شده است. نتایج نشان داد که غلظتهای مختلف سالیسیلیک اسید بهطور معنیداری (در سطح 05/0 p ≤) رشد سلولی را کاهش داد. با افزایش غلظت، رشد کاهش بیشتری نشان داد، بهطوریکه غلظت 50 میلیگرم بر لیتر میزان رشد را بهمیزان 40 درصد کاهش داد. زنده مانی سلولها در تمامی غلظتها بهطور معنیداری کمتر از نمونههای شاهد بود. تفاوت معنیداری بین غلظتهای 25 و 50 میلی گرم بر لیتر مشاهده نشد. بیشترین میزان کاهش زنده مانی سلولها در غلظت 50 میلیگرم بر لیتر بهمیزان 22 درصد نسبت به نمونههای شاهد مشاهده شد.
شکل 2: اثر سالیسیلیک اسید روی الف) وزن خشک و ب) زنده مانی در کشت سلولی شنبلیله.مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE ± (انحراف معیار) میباشد. میانگینهای دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنیدار ندارند.
اثر سالیسیلیک اسید بر مقدار پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدها
مقدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی که بهعنوان شاخصی از تنش میباشد، نیز تحت تاثیر کلیه تیمارها نسبت به شاهد افزایش معنیداری نشان داد (شکل 3، الف). بیشترین مقدار این پارامتر در غلظت 50 میلیگرم بر لیتر مشاهده شد. همانطوریکه شکل 3، ب نشان میدهد غلظتهای 25 و 50 میلی گرم بر لیتر باعث افزایش معنیدار (در سطح 05/0p ≤) مقدار پراکسید هیدروژن سلولهای شنبلیله در مقایسه با شاهد گردیده است. تفاوت معنیداری در نمونههای شاهد و غلظت 5/12 میلیگرم مشاهده نشد.
شکل 3: اثر سالیسیلیک اسید روی الف) مقدار مالون دی آلدیید، ب) مقدار پراکسید هیدروژن در کشت سلولی شنبلیله. مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE ± (انحراف معیار) میباشد. میانگینهای دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنیدار ندارند.
اثر سالیسیلیک اسید برمیزان فنل کل
میزان فنل کل در تیمارها به استثنای غلظت 5/12 میلیگرم بهطور معنی داری نسبت به شاهد افزایش یافت. تفاوت معنیداری در میزان فنل کل در غلظتهای 25 و 50 میلیگرم بر لیتر مشاهده نشد ( شکل 4).
اثر سالیسیلیک اسید بر میزان تریگونلین
نتایج بررسی تری گونلین نشان داد که غلظتهای 25 و 50 میلیگرم بر لیتر سالیسیلیک اسید میزان تریگونلین را بهطور معنیداری بهمیزان 2 برابر، نمونههای شاهد افزایش داد. میزان تریگونلین در غلظت 5/12 میلیگرم بر لیتر نیز بهطور معنیداری افزایش یافت که البته قابل توجه نبود (شکل 5).
شکل 4: اثر سالیسیلیک اسید روی میزان فنل کل. مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE ± (انحراف معیار) میباشد. میانگینهای دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنیدار ندارند.
شکل 5: اثر سالیسیلیک اسید بر میزان تریگونلین. مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE ± (انحراف معیار) میباشد. میانگینهای دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنیدار ندارند.
بحث
مطالعات متعددی نشان دادهاند که سالیسیلیک اسید باعث افزایش میزان برخی از متابولیتهای ثانوی بهویژه آنهایی که در ساز و کارهای دفاعی گیاه نقش دارند، می‌شود (19). در پژوهش حاضر، اثر سالیسیلیک اسید بر رشد سلول و میزان تریگونلین و برخی شاخصهای فیزیولوژیک بررسی شد. تاثیر سالیسیلیک اسید به عواملی نظیر گونه، مرحله نموی گیاه، نحوه اعمال تیمار و غلظت آن وابسته میباشد. اسید سالیسیلیک در غلظتهای بالاتر وضعیت اکسایشی گیاه را بیش از حد توان گیاه تحت تاثیر قرار می دهد و در نهایت منجر به مرگ گیاه می‌شود (20). مهار رشد و کاهش زنده مانی، در نتیجه زوال تمامیت سلولی و تخریب غشاهای سلولی است که توسط سالیسیلیک اسید القا می‌شود. در پژوهش حاضر، رشد و زنده مانی سلولها تحت تاثیر غلظتهای مورد استفاده در این پژوهش بهطور معنیداری کاهش یافت. با توجه به رابطه معکوس بین رشد یا تولید زیتوده و تجمع متابولیتهای ثانوی، مهار رشد سلولی توسط سالیسیلیک اسید ممکن است که سنتز متابولیتهای ثانوی را القا نماید. با توجه به نتایج بهدست آمده، مهار رشد سلولها توسط سالیسیلیک اسید، منجر به تولید بیشتر تریگونلین گردید (شکل 5)، که بهنظر میرسد بهدلیل کاهش متابولیسم اولیه و آغاز متابولیسم ثانوی باشد. با توجه به این که پیش مادههای بیوسنتز متابولیتهای ثانوی از متابولیسم اولیه منشا میگیرند، لذا تحت شرایط تنش شدید، متابولیسم اولیه بهسمت متابولیسم ثانوی تغییر مییابد و منابع ضروری از رشد به سمت دفاع تغییر مسیر میدهند (21). گونههای فعال اکسیژن یا ROS (Reactive Oxygen Species)از جمله پراکسید هیدروژن از عوامل مهم در تنش اکسایشی بوده، که بهطور قابل توجهی رشد سلول و متابولیسم ثانوی را تحت تاثیر قرار میدهد. گزارش شده است که سالیسیلیک اسید باعث تولید پراکسید هیدروژن می‌شود (22). مطالعات نشان داده است که بین ROS بهویژه پراکسید هیدروژن و مرگ سلولی در گیاهان ارتباط نزدیکی وجود دارد و علاوه بر این ROS از اکسیدکنندههای قوی بوده که میتوانند اثرات مخربی روی ماکرومولکولهای زیستی نظیر DNA و پروتئینها داشته باشند (23). با توجه به اینکه کلیه تیمارها باعث القای تولید پراکسید هیدروژن گردیدند، تصور می‌شود که از این طریق زنده مانی و رشد را کاهش داده اند (شکلهای 1، الف و 1، ب). یوسف زادی و همکاران (24) مشاهده کردند که با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید در کشت سلول کتان سفید (Linum album) مقدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی افزایش یافت. روند مشاهده شده در تولید MDA تحت اثر تیمارها با روند تغییرات رشد و زنده مانی (شکلهای 1، الف و 1، ب) مشابه هم است و تصور می‌شود که ارتباط نزدیکی بین افزایش پراکسیداسیون لیپیدها و کاهش رشد و زنده مانی وجود دارد. گیاهان ترکیبات فنلی را در پاسخ به یکسری از ترکیبات پیام رسان آزاد میسازند، که نقش دفاعی مهمی دارند (25). در انگور، غلظت 150 میکرومول سالیسیلیک اسید باعث افزایش میزان ترکیبات فنلی بعد از هشت ساعت شده است و بعد از 24 ساعت به اوج میزان خود میرسد و در نهایت بعد از 48 ساعت کاهش مییابد (26). در پژوهش حاضر میزان فنل کل نیز همچون تریگونلین تحت تاثیر سالیسیلیک اسید افزایش یافت. گزارش شده است که الیسیتورهایی مانند سالیسیلیک اسید و جاسمونات از موثرترین محرکهای شیمیایی برای تحریک تولید متابولیتهای ثانوی در گیاهان مختلف بوده است که از طریق فعال کردن بیان ژنهای مسیر بیوسنتزی متابولیتهای ثانوی باعث افزایش تولید آنها میشوند (10). تاثیر گذاری و القای بیوسنتز متابولیتهای ثانوی توسط سالیسیلیک اسید خارجی ممکن است با نقش آن بهعنوان یک علامت رسان مرتبط باشد.
نتیجه گیری
در این پژوهش نشان داده شد که سالیسیلیک اسید میتواند بهعنوان محرک در کشت سلولی شنبلیله عمل نموده و باعث القای تولید بیشتر تریگونلین شود. بنابراین بهنظر میرسد تجمع تریگونلین در سلولهای شنبلیله پاسخی زیستی به این محرک باشد.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه زابل که هزینه این طرح پژوهشی را فراهم نمودهاند تشکر و قدردانی میگردد.
- Mehrafarin A, Rezazadeh Sh, Naghdi Badi H, Noormohammadi Gh, et al. A Review on Biology. Cultivation and Biotechnology of Fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) as a Valuable Medicinal Plant and Multipurpose. J Medicinal plants. 2011; 10(37): 1-19.
- Fazli F, Hardman R. The spice, fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.): It conmmercial varieties of seed as a source of diosgenin. Tropical Sciences. 1968; 10: 66-78.
- Hardman R. Pharmaceutical products from plant steroids. Tropical Sciences. 1969; 11: 196 – 222.
- Mehrafarin A, Qaderi A, Rezazadeh Sh, Naghdi Badi H, et al. Bioengineering of Important Secondary Metabolites and Metabolic Pathways in Fenugreek (Trigonella foenumgraecu L.). J Medicinal plants. 2010; 9: 1 – 18.
- Johns E. Ueber die alkaloide des bockshornsamens. Ber Deut Chem Ges. 1885; 18: 2518 - 23.
- Zheng XQ, Nagai C, Ashihara H. Pyridine nucleotide cycle and trigonelline (Nmethylnicotinic acid) synthesis in developing leaves and fruits of Coffea arabica. Physiol Plant. 2004; 122: 401 - 11.
- Petropoulos, G. Fenugreek. The genus Trigonella. London and New York: Taylor and Francis; 2002.
- Radwan SS, Kokate CK. Production of higher levels of trigonelline by cell cultures of Trigonella foenum-graecum than by the differentiated plant. Planta. 1980; 147: 340 –4.
- Verpoorte R, Alfermann A. Metabolic Engineering of Plant Secondary metabolism. Plant Cell Tiss Org. 2002; 68: 211–212.
10. Zhao J, Davis L, Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnol Advance. 2005; 23(4): 283–333.
11. Hayat Q, Hayat S, Irfan M, Ahmad Q .Effect of exogenous salicylic acid underchanging environment: A review. Environ Exp Bot. 2009; 68: 14-25.
12. Pu GB, Dong-Ming M, Chen JL, Ma LQ, et al. Salicylic acid activates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L. Plant Cell Rept. 2009; 28:1127–1135.
13. Kang S, Jung H, Bahk J, Yang J. Effects of methyl jasmonate and salicylic acid on the production of tropane alkaloids and the expression of PMT and H6H in adventitious root cultures of Scopolia parviflora. Plant Science. 2004; 166: 745-751.
14. Schützendübel A, Schwanz P, Teichmann T, Gross K, et al. Cadmium-Induced changes in antioxidative systems, hydrogen peroxide content, and differentiation in scots pine roots. Plant Physiol. 2001; 127: 887-898.
15. De Vos CH, Schat H. Increased resistance to copper-induced damage of the root plasma membrane in copper tolerant Silene cucubalus. Physiol Plantarum. 1991; 82: 523–528.
16. Velikova V, Yordanov I, Edreva A. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated been plants protective role of exogenous polyamines. Plant Science. 2000; 151: 59–66.
17. Singleton VL, Rossi JR. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungestic acid reagent. Am J Enol Viticult. 1965; 16: 144-58.
18. Rongjie Z, Li W, Longxing W. Determination of trigonelline in Trigonella foenum-graecum L. by hydrophilic interaction chromatography. chin j chromatogr. 2010; 4: 379-382.
19. Kang SM, Jung HY, KangYM, Yun DJ, et al. Effects of methyl jasmonate and salicylic acid on the production of tropane alkaloids and the expression of PMT and H6H in adventitious root cultures of Scopolia parviflora. Plant Science. 2004; 166: 745-751.
20. Kovacik J, Backor M, Strnad M, Repcak M. Salicylic acid-induced changes to growth and phenolic metabolism in Matricaria chamomilla plants. Plant Cell Rep. 2009; 28:135–143.
21. Iriti M, Faoro F. Chemical diversity and defence metabolism: How Plants Cope with pathogens and ozone pollution. Int Mol Sci. 2009; 10: 3371-3399.
22. Antoine L, Harfouche E, Rugini E, Mencarelli F, et al. Salicylic acid induces H2O2 production and endochitinase gene expression but not ethylene biosynthesis in Castanea sativa in vitro model system. J Plant Physiol. 2008; 165: 73465l .
23. Gao CJ, Xing D, Li LL, Zhang LR. Implication of reactive oxygen species and mitochondrial dysfunction in the early stages of plant programmed cell death induced by ultraviolet-C overexposure. Planta. 2008; 227: 755–767.
24. Yousefzadi M, Sharifi M, Behmanesh M, Moyano E, et al. Salicylic acid improves podophyllotoxin production in cell cultures of Linum album by increasing the expression of genes related with its biosynthesis. Biotechnol Lett. 2010; 32(11): 1739–1743.
25. Bais HP, Park SW, Weir TL, Callaway RM, et al. How plants communicate using the underground information superhighway. Trends in Plant Science. 2004; 9: 26–32.
26. Chen JY, Wen PF, Kong W, Pan QH, et al. Effect of salicylic acid on phenylpropanoids and phenylalanine ammonia-lyase in harvested grape berries. Postharvest Biol Tec. 2006; 40: 64–72.
)