نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناسی ارشد فیزیولوژی جانوری، دانشگاه آزاد اسلامی واحد همدان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
2 دانشگاه بوعلی سینا همدان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
3 دانشگاه علوم پزشکی همدان، دانشکده پزشکی، گروه فیزیولوژی
چکیده
هدف: هدف این بررسی، مطالعه اثر محافظتی عصاره هیدروالکلی برگ پنیرک(Malva neglecta L.) بر کبد موشهای القا شده با تتراکلرید کربن میباشد.
مواد و روشها: در این بررسی 35 موش صحرایی نر در محدوده وزنی 230 تا 250 گرم به گروههای کنترل، شم، شاهد، تیمار 1 و2 تقسیم شدند. گروههای تیمار توسط تتراکلریدکربن القا و دو ساعت بعد توسط عصاره با دز 300 میلیگرم بر کیلوگرم و 600 میلیگرم بر کیلوگرم روزانه و بهمدت چهار روز و درون صفاقی تیمار شدند. گروه شاهد 2 میلی لیتر بر کیلوگرم تتراکلریدکربن با نسبت 1:1 با روغن زیتون، تک دز دریافت کردند.گروه کنترل و شم به ترتیب سالین نرمال و روغن زیتون 5/0 میلیلیتر روزانه و درون صفاقی دریافت کردند. سپس خونگیری جهت اندازهگیری آنزیمهای آسپارتات آمینوترانسفراز (AST)، آلانین آمینوترانسنفراز ALT)) و آلکالن فسفاتاز ((ALP انجام شد. نمونههای بافتی کبد تهیه و رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین صورت گرفت. دادهها توسط تست ANOVA ارزیابی شد و معیار اختلاف معنیدار 05/0 p < میباشد.
نتایج: نتایج افزایش آنزیمهایALT,AST وAP در گروه شاهد نسبت به گروه کنترل را نشان میدهد (001/0.(p < گروههای تیمار نسبت به شاهد التهاب کمتری را نشان دادند (01/0(p نتیجهگیری: نتایج نشان داد که تتراکلریدکربن بافت کبد را ملتهب و دچار نکروزه میکند. پنیرک دارای ترکیبات آنتیاکسیدانتی و فلاونوئیدی است و اثرات سمی تتراکلریدکربن را در کبد کاهش میدهد.
واژگان کلیدی
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Study of Hepatoprotective Effect of Malva neglecta L. Hydroethanolic Leaf Extract in Male Rat Induced with Carbon Tetrachloride
نویسندگان [English]
- SF T 1
- N M 2
- A S 3
چکیده [English]
Aim: In this study the hepatoprotectivity effect of Malva neglecta hydroethanolic extract (MHE) were investigated in male rats.
Material and Methods: 35 male rats with 230-250 gr weight were divided in 5 groups: control (taking normal saline,0.5ml/day, IP), sham(taking olive oil, 0.5ml/day,IP),carbon tetrachloride 1:1 with olive oil,0.5ml single dose, IP), treated 1&2 (carbon tetrachloride 1:1 with olive oil,0.5ml single dose and 300mg/Kg and 600mg/Kg MHE /day for 4 days, IP). After the end of examination the blood samples were collected from heart directly and AST, ALT and AP enzymes were analyzed. The microscopic studies of hepatic tissue were done and histological changes observed by (H&E) staining. All data analyzed with ANOVA test. Statistical significance was accepted at p < 0.05.
Results: The serum liver enzymes were increased in rats induced by ccl4 compare to the control group (p < 0.001) and decreased significantly in rats by treated MHE (p < 0.01). Histological finding revealed the necrosis in hepatic tissue. In animals treated with MHE the results showed that the reduction in necrotic cells and increase in hepatocytes regeneration.
Conclusion: Our results showed that the ccl4 has hepatotoxicity effect and it can improve inflammation and necrosis in liver tissue. The MHE have antioxidant and flavonoid that can decrease toxic effect of carbon tetrachloride in liver tissue.
کلیدواژهها [English]
- Malva neglecta L
- Carbon tetrachloride
- Hepatotoxicity
- Liver enzym
- Necrosis
مقدمه
کبد یکی از اندامهای حیاتی بدن است که در تنظیم بسیاری از فعالیتهای فیزیولوژیک دخیل است. هرگونه اختلال در عملکرد کبد باعث ایجاد مجموعهای از اختلالات میشود که میتواند صدمات جبران ناپذیری را به این عضو وارد نماید. عواملی مثل استرس اکسیداتیو، رادیکالهای آزاد، الکل سفید، مواد شیمیایی، ویروسها و داروها میتوانند باعث تخریب بافت کبدی شوند (1). حساسترین و پر مصرفترین آنزیمهای تشخیصی کبد، آمینوترانسفرازها هستند. که شامل: آسپارتات آمینوترانسفراز یا ASTو آلانین آمینوترانسفراز یا ALT میباشند (2). این آنزیمها بهطور معمول توسط سلولهای کبدی به مقدار معینی تولید میگردند. زمانیکه کبد دچار آسیب میشود سلولهای کبدی ترشح آنزیم های فوق را افزایش داده و موجب بالارفتن سطح پلاسمایی آنها میگردند، که بالارفتن سطح این آنزیمها در خون نشانهی آسیب کبدی است (3).
نقش عملکردی آمینوترانسفرازها چنین است که باعث کاتالیز واکنشهای شیمیایی در سلولها میشوند که در آن گروه آمین از یک مولکول دهنده به مولکول گیرنده منتقل میگردد. بههمین دلیل به آنها آمینوترانسفراز گفته میشود. آنزیم AST بهنام ترانس آمینازاگزالواستیک سرم (SGOT) نیز نامیده میشود و ALT نیز بهنام ترانس آمینازپیرویک گلوتامیک سرم (SGPT) مشهور است (4). ضایعه وارده به کبد ممکن است بخش کوچک یا بزرگی از کبد را در برگیرد. در ضایعات سلولهای کبدی محتویات آنها از سلول خارج شده و وارد جریان خون میشود. لذا آنزیمهایی مانند AST، ALT و ALP در خون افزایش مییابند. با توجه به وسعت ضایعه سطح آنزیمها نیز تغییرات متناسب پیدا میکنند. افزایش نسبی ALT وAST سرم میتواند نوع ضایعه را نشان دهد. در سلولهای کبدی میزانAST بیشتر از ALT است وAST در میتوکندری و سیتوپلاسم وجود دارد در صورتیکه ALT فقط در سیتوپلاسم سلول جای دارد. در بیماریهایی مانند هپاتیت ویروسی که ابتدا جدار سلولها دچار ضایعه میشوند بیشتر آنزیمهای موجود در سیتوپلاسم وارد مایع خارج سلولی و خون میشوند. در نتیجه میزان ALT بیشتر از AST است ولی در بیماریهایی که ضایعه تمام قسمتهای سلول را فرا میگیرد مانند سیروز و هیپوکسی بهطور نسبی افزایش AST بیشتر از ALT است (3). عوامل شیمیایی مختلفی میتواند باعث ایجاد آسیب کبدی و در نهایت سیروز شوند که شامل پاراستامول (5)، کلرید کادمیوم (6)، تتراکلرید کربن (7)، پاراکورات (8)، پاراکسون (9)، ریفامپین (10)، دی-گالاکتوز آمین (11) و ... میباشند. یکی از مهمترین این مواد تتراکلرید کربن است که در اثر القا سمیت توسط تتراکلرید کربن آسیب کبدی شدیدی در نمونههای حیوانی (موش صحرایی) دیده شده است (12). فیبروز و سیروز القا شده توسط تتراکلرید کربن یکی از قدیمیترین و گستردهترین مدلهای تجربی براساس این نوع سم است. همچنین با استفاده از این مدل تجریبات جامعی درباره تغییرات بیوشیمیایی و هیستولوژیکی و تغییرات همراه با آسیب، التهاب و فیبروز بهدست آمده است. تجویز تتراکلرید کربن در موش در مقایسه با سموم دیگر در زمان کوتاهتری منجر به بروز آسیب کبدی و سیروز میشود که تقریبا شبیه سیروز در انسان است (13).
در بررسیهای صورت گرفته بر روی جوندگان که از تتراکلریدکربن برای القا آسیب کبدی استفاده شده است، دیده شده است که تجویز یک دوز از تتراکلرید کربن باعث فیبروز کبدی، سیروز و سرطان سلولهای کبد (HCC) میشود (14). تجویز تتراکلرید کربن بهروشهای زیر جلدی، داخل صفاقی و استنشاقی نشان میدهد که همه این روشها در نهایت به سیروز منتهی میشوند، اما سریعترین روش ایجاد سیروز، روش تزریق داخل صفاقی است (15).
تجویز تتراکلرید کربن در رتها باعث افزایش گاماگلوتامیل ترانسفراز (GGT)، آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) و آلکالن فسفاتاز( ALP) میشود. همچنین میزان کلاژن و پراکسیداسیون لیپیدها را افزایش و مقدار گلوتاتیون را کاهش میدهد (16). رادیکالهای آزاد مشتق از ccl4 باعث تجمع مالوندیآلدهید (MDA )که یکی از محصولات نهایی پراکسیداسیون لیپیدهاست شده و این امر در نهایت باعث غیر فعال شدن آنزیمهای آنتیاکسیدانتی سوپر اکسید دیسموتاز (SOD )، کاتالازCAT) ) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPX) میگردد (17).
در حالات مولکولی، ccl4 تومور نکروز فاکتور آلفا (TNF-α)، نیتریک اکساید NO)) و فاکتور رشد ترانسفرمی آلفا و بتا (TGF-α,β ) در داخل سلول را فعال میکند، که این فرآیندها سلول را بهسمت تخریب یا فیبروزه شدن هدایت میکند. TNF-αآپوپتوسیز و TGF-α,β فیبروز را به دنبال دارد (18).
یکی از اختلالات کبدی فیبروز است که در اثر تجمع بیش از اندازه پروتئینهای ماتریکس خارج سلولی مثل کلاژن اتفاق میافتد و در اکثر بیماریهای مزمن کبدی دیده میشود (19). در واقع فیبروز کبدی پاسخ ژنتیکی به عوامل گوناگونی است که در نهایت به سیروز منتهی میشوند و عوارضی چون نقص کلیوی، افزایش فشارخون و سرطان سلولهای کبدی را بهدنبال دارد (20). سیروز نیز بهنوبه خود باعث تولید سلولهای کبدی فاقد عملکرد، افزایش مقاومت کبد به جریان خون و در نهایت افزایش فشارخون میگردد (19). در سیروز خفیف کبد میتواند خود را ترمیم کرده و اعمالش را انجام دهد اما در نوع پیشرفته، آسیبهای کبدی بیشتری ایجاد شده و کبد نمیتواند اعمال خود را به درستی انجام دهد. عوارض اصلی سیروز شامل آسیت، خونریزی، آنسفالوپاتی، سندرم کبدی-کلیوی و پریتونیت باکتریایی خودبهخودی میباشد. سیروز عموما برگشت ناپذیر است و درمراحل پیشرفته تنها درمان انتخابی پیوند کبد است (21).
تحقیقات گسترده انجام شده نشان میدهد که گیاهان مختلف با دارا بودن ترکیبات شیمیایی گوناگون میتوانند اثرات تخریبی و آسیب کبدی ناشی از تترا کلرید کربن را بهبود داده و از پیشرفت آسیب جلوگیری کنند. گیاهانی مانند: مانند کلاله زعفران (10) برگ ویتکس (22)، سیلیبینین (23) برگ پونه (1)، ریشه گیاه فیزالیس (24).
پنیرک گیاهی دو ساله و پایا از تیره Malvaceae است. ساقهای به ارتفاع 50 تا 120 سانتیمتر دارد و ریشهای سفید رنگ وگوشتدار دارد. برگهای آن پنجهای 5 تا 7 لوبه، دندانهدار میباشد. پنیرک گلهایی به رنگ گلی مایل به بنفش منقوش به خطوط ارغوانی رنگ دارد. قسمتهای مورد استفاده انواع پنیرک از نظر درمانی برگ، گل و حتی ریشه میباشد قسمتهای مورد استفاده انواع پنیرک از نظر درمانی برگ، گل و حتی ریشه میباشد. Malva neglecta دارای اثراتی چون: نرم کننده، رفع التهاب، معالج بیماریهای سینه میباشد. زیرا در آنها بهخصوص در گلهای این گیاه مواد لعابی فراوانی وجود دارد (25).
نتایج نشان میدهد که لینولنیک اسید، لینولئیک اسید، پالمیتیک اسید و اولئیک اسید بیش از 82 درصد کل اسیدهای چرب برگ و دمبرگ این گیاه را در برمیگیرند (26). گیاه پنیرک تقویت کننده سیستم ایمنی میباشد و بهعنوان مکمل آبشاری در فعالسازی اثرات ضد التهابی، تحریک گلبولهای سفید خون و ماکروفاژها عمل میکند (27). از گیاه پنیرک در رفع تحریکات دستگاه گوارش، التهابات مجاری ادراری، دستگاه تنفسی و میگرن استفاده میشود (28).
با توجه به خواص درمانی پنیرک و با توجه به اینکه در مورد خواص محافظت بافتی این گیاه تحقیقی صورت نگرفته است بر آن شدیم تا اثر حفاظتی عصاره این گیاه بر آسیب بافت کبد مورد مطالعه و بررسی قرار دهیم.
مواد و روشها
در این تحقیق از 35 رت نر نژادWistar در محدوده وزنی 230 تا 250 گرم استفاده شده است، که این حیوانات از موسسه انستیتو پاستور ایران خریداری شدند. حیوانات به منظور سازگاری با شرایط محیط در دمای حدود 2±22 درجه سانتیگراد و 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی، همچنین آب و غذا بهصورت روزانه و آزاد، بهمدت یک هفته در اتاق حیوانات نگهداری شدند.
تهیه عصاره: پس از شناسایی پنیرکMalva neglecta ، مقدار کافی از گیاه جمع آوری شد. گیاه جمع آوری شده را در سایه قرارداده تا کاملا خشک شود. سپس پودر از آن تهیه کرده و بهمدت 12 روز در الکل 96 درصد قرار داده تا تمام مواد موثره آن خارج و در الکل حل گردد. سپس آنرا صاف نموده و توسط دستگاه روتاری اپراتور اقدام به تهیه عصاره تقریبا خالص گردید.
روش انجام آزمایش: در این بررسی، حیوانات بهطور تصادفی به 5 گروه کنترل، شاهد، شم، تیمار1 و تیمار2 تقسیم شدند (7=n). گروه کنترل، نرمال سالین 9/0 درصد را بهمیزان 5/0 میلیلیتر روزانه و درون صفاقی دریافت کردند. گروه شم، 5/0 میلیلیتر روغن زیتون را فقط در روز اول آزمایش بهصورت درون صفاقی دریافت کردند.گروه شاهد، محلول تتراکلرید کربن 50 درصد و روغن زیتون را که با فیلتر سر سرنگی استریل شده ( با نسبت 1:1 ) بهمیزان 2 میلیلیتر بر کیلوگرم بهصورت تک دوز و درون صفاقی دریافت کردند. گروه تیمار 1، ابتدا محلول تتراکلرید کربن و روغن زیتون استریل شده (با نسبت 1:1) را بهمیزان 2 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن دریافت کردند. بعد از 2 ساعت، عصاره الکلی پنیرک با غلظت 300 میلیگرم بر کیلوگرم که با فیلتر سر سرنگ استریل شده بهصورت درون صفاقی دریافت کردند. تزریق تتراکلرید کربن و روغن زیتون در این گروه بهصورت تک دوز فقط در روز اول انجام شد. گروه تیمار2، این گروه نیز، محلول تتراکلرید کربن و روغن زیتون استریل شده به میزان 2 میلیگرم بر کیلوگرم، بهصورت تک دوز و درون صفاقی در روز اول دریافت کردند و 2 ساعت بعد، عصاره الکلی پنیرک با دز 600 میلیگرم بر کیلوگرم تزریق شد. تزریق عصاره بهمدت 4 روز متوالی و 24 ساعت پس از تزریق اول انجام گرفت. حیوانات پس از هر نوبت تزریق، از نظر میزان آب و غذای مصرفی، سلامت، نحوه اثر عصاره و میزان مرگ و میر مورد ارزیابی قرار گرفتند. پس از گذشت 96 ساعت در روز پنجم، با رعایت اصول اخلاقی، پس از بیهوشی توسط اتر، خونگیری مستقیم از قلب از گروههای مختلف انجام شد. پس از خونگیری نمونههای خون بهدست آمده از حیوانات گروههای مختلف، در داخل لوله آزمایش ریخته، نمونههای خون سانتریفیوژ گردید و سرم آنها جدا شد. سرمهای بهدست آمده را بهآرامی با سمپلر برداشته و به میکروتیوبهای مخصوص منتقل شد. نمونههای سرم، جهت اندازهگیری و سنجش آنزیمهای آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) ،آلانین آمینوترانسنفراز ALT)) و آلکالن فسفاتاز ((ALP بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شدند.
جهت بررسیهای بافت شناسی، بعد از باز کردن بدن حیوان، بافت کبد را از بدن جدا کرده، سپس با سرم فیزیولوژی آنرا شسته و در داخل ظروف مخصوص قرار ریخته و فرمالین 10 درصد روی آن میریزیم. بعد از یک هفته، قطعهای از بافت کبد به ابعاد 5 ×5 میلیمتر را به کمک پنس و اسکالپر برای انجام مراحل مختلف تهیه بافت جدا شد. بعد از انجام مرحله فیکساسیون، مرحله آبگیری از بافت صورت گرفت که در این مرحله نمونهها در الکلهای 50، 70، 90، 96 درصد و الکل مطلق بهمدت 2 ساعت قرار داده شد. تا عمل دهیدراسیون بافتی بهخوبی صورت گیرد. سپس جهت شفاف کردن، نمونهها در زایلن بهمدت 45 دقیقه قرار داده شدند. در مرحله بعد که مرحله آغشته سازی است نمونهها در پارافین مذاب بهمدت45 دقیقه در انکوباتور قرار گرفتند. آخرین مرحله قالبگیری و سپس تهیه برش توسط دستگاه میکروتوم صورت گرفت. مقاطع بافتی توسط میکروتوم با ضخامت 5 تا 7 میکرومتر تهیه و مطالعه شدند. بعد از تهیه لامها رنگآمیزی با رنگ هماتوکسیلین – ائوزین (H&E) انجام شد.
آنالیز آماری: جهت مقایسهی سطوح سرمی AST، ALT و ALP در گروههای کنترل، شم، شاهد، تیمار1 و تیمار2 از نرم افزار ,SPSS آزمون ANOVA استفاده شد. پس از بررسی وضعیت نرمال بودن دادهها توسط تست کولموگروف اسمیرنوف، جهت تجزیه و تحلیل دادهها از آزمون آماری آنالیز واریانس یکطرفهی بین آزمودنی و برای مقایسات دو به دو از آزمون تعقیبی LSD استفاده شد.
نتایج
با توجه به نتایج مندرج در نمودار 1 دیده شده است که سطح سرمی AST در موشهای صحرایی نر در گروه شاهد (دریافت کنندهی تتراکلرید کربن 2 میلیلیتر بر کیلوگرم بهصورت تک دوز و درون صفاقی نسبت به گروه کنترل اختلاف معنیداری وجود دارد که با توجه به 0005/0p-value< دریافت تتراکلرید کربن باعث افزایش معنیدار سطح سرمی AST نسبت به گروه کنترل شده است (001/0.(p< این میزان در گروههای تیمار1 (دریافت عصارهی پنیرک 300 میلیگرم بر کیلوگرم) و تیمار2 (دریافت عصارهی پنیرک 600 میلیگرم بر کیلوگرم) نسبت به گروه کنترل معنیدار نیست (05/0.(p> میزان AST سرم در گروههای تیمار1و تیمار2 نسبت به گروه شاهد اختلاف معنیدار است (001/0.(p< همچنین بین گروههای شم (دریافت کنندهی روغن زیتون)، تیمار1 و تیمار2 بهصورت مقایسه دو به دو اختلاف معنیداری در سطح سرمی AST مشاهده نشده است (05/0.(p>
نتایج موجود در نمودار 2 بیان کننده این مطلب است که میزان سطح سرمی ALT در گروه دریافت کننده تتراکلرید کربن که گروه شاهد است نسبت به گروه کنترل که نرمال سالین دریافت کرده است، اختلاف معنیداری وجود دارد (001/0 (p<که با توجه به 0005/0p-value< دریافت تتراکلریدکربن منجر به افزایش میزان ALT شده است. همچنین میزان ALT سرم در گروههای تیمار1 و تیمار2 نسبت به گروه شاهد اختلاف معنیداری را نشان میدهد (001/0 (p<که این اختلاف در مقایسه با گروه کنترل معنیدار نیست (05/0.(p>
همچنین مقایسه بین گروههای شم و شاهد نیز اختلاف معنیداری را در سطح سرمی ALT نشان میدهد (001/0.(p<
نمودار 1: مقایسهی سطح سرمی آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) در گروههای مختلف مورد آزمایش. دادهها بهصورت Maen±SEM ارائه شده است.
* بیانگر معنیداری نسبت به گروه کنترل و # بیانگر معنیداری نسبت به گروه دریافت کنندهی تترا کلرید کربن (CCl4) است. (***P<0.001) و (###P<0.001)
نمودار 2: مقایسهی سطح سرمی آنزیم آلانین آمینوترانسنفراز (ALT) در گروههای مختلف مورد آزمایش. دادهها بهصورت Maen±SEM ارائه شده است.
* بیانگر معنیداری نسبت به گروه کنترل و # بیانگر معنیداری نسبت به گروه دریافت کنندهی تترا کلرید کربن (CCl4) است. (***:P<0.001) و (###:P<0.001)
نمودار3 بیان کننده آن است که میزان ALP سرم در گروه شاهد دارای اختلاف معنیدار نسبت به گروه کنترل میباشد (001/0.(p< همچنین گروههای تیمار1 و تیمار2 که دریافت کننده عصاره میباشند دارای اختلاف معنیداری در میزان سرمی ALP نسبت به گروه شاهد است (001/0 (p<که مقایسه این دو گروه با گروه کنترل اختلاف معنیداری را نشان نمیدهد (05/0.(p>اختلاف بین گروه شم و گروه شاهد معنیدار است(P<0.001) که این ختلاف نسبت به گروه تیمار1 و تیمار2 معنیدار نیست (05/0.(p>
نمودار 3: مقایسهی سطح سرمی آنزیم آلکالن فسفاتاز (ALP) در گروههای مختلف مورد آزمایش. دادهها بهصورت Maen±SEM ارائه شده است.
* بیانگر معنیداری نسبت به گروه کنترل و # بیانگر معنیداری نسبت به گروه دریافت کنندهی تترا کلرید کربن (CCl4) است. (***:P<0.001) و (###:P<0.001)
نتایج بررسیهای میکروسکوپی نمونههای بافتی
نمونههای بافتی تهیه شده توسط میکروسکوپ نوری (ZEISS,Axioskop 2, mot/plus,Germany) با بزرگنمایی ×400 مطالعه شدند. نتایج تاثیر عصاره هیدروالکلی برگ پنیرک و تغییرات بافتی کبد بعد از دریافت دز 2 میلیلیتر بر کیلوگرم محلول تترا کلرید کربن(CCl4) که با نسبت 1:1 با روغن زیتون استریل مخلوط شده بود نشان میدهد که تترا کلرید کربندر مدت کوتاهی سبب آسیب حاد کبدی میشود که با نکروز هپاتوسلولار و تجمع سلولهای التهابی در نواحی مرکز لوبولی همراه است (شکل 3).
تصاویر تهیه شده از مقاطع بافتی رنگ آمیزی شده با روش هماتوکسیلین-ائوزین در شکلهای1، 2، 3، 4 و 5 نشان داده شده است. بافت کبد حیوانات کنترل کاملا طبیعی بوده و طنابهای سلولی بهطور منظم در اطراف سیاهرگ مرکزی قرار گرفته و هیچ نکروزی در هپاتوسیتها به چشم نمیخورد (شکل1). تصاویر مربوط به مقاطع بافتی حیوانات شاهد دریافت کننده تترا کلرید کربن بهمیزان2 میلیلیتر بر کیلوگرم، نشان دهنده ایجاد نکروز گسترده هپاتوسلولار، بههم ریختگی نظم سلولی و سینوزوئیدهای کبدی و تجمع قابل توجهی از سلولهای التهابی نظیر لنفوسیتها و نوتروفیلها در اطراف سیاهرگ مرکزی و فضاهای پورت میباشد (شکل 3). در حیوانات تیمار شده با دز 300 میلیگرم بر کیلوگرم، ناحیه نکروزه بهمیزان قابل توجهی کوچکتر شده و نیز از انبوه سلولهای التهابی ارتشاح یافته در این ناحیه تا حد زیادی کاسته شده است (شکل4) که نسبت به گروه شاهد از اختلاف معنیداری برخوردار است (05/0 (p
شکل1: مقطع بافتی تهیه شده از کبد حیوانات گروه کنترل. هپاتوسیتها و طنابهای سلولی لوبولها بهطور منظم در اطراف سیاهرگ مرکزی قرار گرفته و هیچ نکروزی به چشم نمیخورد (پیکان). بزرگنمایی ×400 و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.
شکل2 : مقطع بافتی تهیه شده از کبد گروه شم (دریافت کننده روغن زیتون بهمیزان 5/0 میلیلیتر). هپاتوسیتها کاملا سالم بوده و هیچگونه اختلالی در سلولها و نظم آنها و سیاهرگ مرکزی اتفاق نیفتاده است (پیکان). بزرگنمایی ×400 و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.
شکل3: مقطع بافتی تهیه شده از کبد گروه دریافت کننده تتراکلرید کربن بهمیزان 2 میلیلیتر بر کیلوگرم بهمدت چهار روز. نکروز گسترده هپاتوسیتها (پیکانها)و تجمع قابل توجه سلولهای التهابی حول سیاهرگ مرکزی و فضای پورت قابل مشاهده میباشد. طنابهای سلولی کبدی کاملا بههم ریخته شده و واکوئولدار شدن هپاتوسیتها دیده میشود. بزرگنمایی ×400 و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.
شکل4: مقطع بافتی تهیه شده از کبد گروه تیمار شده با دز 300 میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی پنیرک همزمان با دریافت تتراکلرید کربن بهمیزان 2 میلیلیتر بر کیلوگرم. روند نکروزه کند بوده و ناحیه ناحیه نکروزه بهمیزان قابل توجهی کوچکتر شده است. کاهش در ارتشاح سلولهای التهابی در ناحیه نکروزه رخ داده است (پیکان). بزرگنمایی ×400 و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.
شکل 5: مقطع بافتی تهیه شده از کبد گروه تیمار شده با دز 600 میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی پنیرک همزمان با دریافت تتراکلرید کربن بهمیزان 2 میلیلیتر بر کیلوگرم. کاهش بسیار زیاد سلولهای التهابی و تعداد بسیار اندک و قابل توجه سلولهای نکروتیک در اطراف سیاهرگ مرکزی و فضای پورت. بازگشت نظم طنابها و بازسازی داربست سلولی (پیکان). بزرگنمایی ×400 و رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.
بحث
مواد شیمیایی مانند آمونیاک، انواع داروها، الکل و ویروسها از جمله عواملی هستند که میتوانند باعث آسیب بافت کبد شده و بیماریهای کبدی را بهدنبال داشته باشند. از جمله بیماریهایی که در کبد دیده میشود، شامل هپاتیت ویروسی و هپاتیت حاد الکلی میباشد که میتوانند منجر به سیروز کبدی گردند. یرقان یا زردی، کلستاز (3)، یرقان انسدادی، انسداد مجاری بدون وجود یرقان (29)، کبد چرب (30)، کارسینوم هپاتوسلولار، سیروز صفراوی اولیه و سیروز (29) از دیگر بیماریهای کبد میباشند که تقریبا تمامی این بیماریها منجربه سیروز میشوند، اما در بیشتر موارد سیروز، ناشی از هپاتیت مزمن است (29). از جمله اختلالاتی که در آسیب بافت کبد دیده میشود، نکروز و بهدنبال آن فیبروز است که بهدلیل تجمع پروتئینهایی مثل کلاژن در ماتریکس سلول صورت میگیرد (19).
تتراکلرید کربن یکی از مواد شیمیایی بسیار سمی و خطرناک است که مواجهه با آن باعث نکروز، سیروز، سرطان کبد و نهایتا کما یا مرگ میشود (30). در آسیب کبدی ناشی از تتراکلرید کربن افزایش ALT، AST، ALP (31-33) گزارش شده است.همچنین بهدنبال تزریق تتراکلرید کربن در موش، افزایش میزان فعالیت-α,β, NO TGF (18)، وTNF-α (34)، دیده میشود.
تتراکلرید کربن با تولید رادیکالهای آزاد، با مولکولهای مختلف مانند اسیدآمینه، نوکلئوتیدها، اسیدهای چرب، پروتئینها، اسیدهای نوکلئیک و لیپید واکنش داده (35) و باعث تخریب شدید فرآیندهای سلولی میشود. این اثرات در میتوکندری، شبکه آندوپلاسمی و غشا پلاسمایی دیده شده وآسیب سلولی شدیدی را در پی دارند. از جمله تاثیرات پاتولوژِیک ccl4 در میتوکندری میتوان به عدم ایجاد فسفریلاسیون اکسیداتیو و اختلال در انتقالCa+2 اشاره کرد (18). گیاهان دارای ترکیباتی چون آلکالوییدها، فلوباتانین، تانن، ترپنوئید، گلیکوزید و آنتراکوتینون (36) و فلاونویید هستند که میتوانند از طریق فعالیت آنتیاکسیدانتی (37) خود باعث حفظ ثبات و پایداری غشا سلول شوند و آسیب وارده به بافت را بهبود بخشند (23). استفاده از عصارههای آبی و الکلی گیاهان مختلف میتواند اثرات تخریبی کبد ناشی از تزریق تتراکلرید کربن را کاهش داده و باعث بهبود بافت کبد شوند. در آسیب کبدی ناشی از تتراکلرید کربن حل شده در روغن زیتون (با نسبت 1:1) دیده شده که تزریق عصاره گیاه Gink gobiloba از نکروز و فیبروز کبد در برابر آسیب ناشی از تتراکلرید کربن جلوگیری میکند. اثر محافظتی گیاه فوق از طریق کاهش آنزیمهای مارکرکبدی و پراکسیداسیون لیپیدها صورت می پذیرد (38). در تحقیقی مشخص شد که عصاره آبی و الکلی ساقههای گیاهCapparis decidua دارای فعالیت محافظت کبدی در برابر هپاتوتوکسیسیته ناشی از تتراکلرید کربن حل شده در روغن پارافین در رت است که از این گیاه در طب سنتی در درمان یرقان و زردی استفاده میشود. این تحقیق نشان داد که وجود ترکیباتی چون آلکالوئیدها، فلاونوئیدها، تاننها، استرولها، ساپونین،گلیکوزیدهای سیانوژنیک و کومارینها اجزای اصلی عصاره هستند که میتوانند از آسیب بافت کبد در برابر تتراکلرید کربن جلوگیری کنند (39). بررسی صورت گرفته روی عصاره آبی و اتانولی برگ گیاه Vitex trifolia مشخص شد، که این گیاه از آسیب بافت کبدی ناشی از ccl4 جلوگیری میکند. که با کاهش توتال بیلیروبین و آنزیمهای کبدی از آسیب ناشی از تتراکلرید کربن محافظت میشود. بررسیهای هیستوپاتولوژی بافت کبد این نتایج را تایید میکند (40). آنالیز فیتوشیمیایی عصاره متانولی برگ گیاه Carissa Opaca نشان میدهد که ترکیباتی چون فلاونوئید، تانن، آلکالوئید، فلوباتانین، ترپنوئید، کومارین، آنتراکوتینون و گلیکوزیدها در این عصاره وجود دارد که میتوانند از بافت کبدی در برابر آسیب ایجاد شده توسط ccl4 از طریق فعالیت آنتیاکسیدانتی و حفظ ثبات و پایداری غشا محافظت کند (41). برگها و دمبرگ گیاه پنیرک برای تعیین نوع و مقدار ترکیبات اسیدهای چرب، عناصر معدنی، فلاونوئید کل و موسیلاژ مورد آنالیز قرار گرفت. میزان ترکیباتی مانند تانن و نیترات نیز تعیین شدند. نتایج نشان داد که لینولنیک اسید، لینولئیک اسید، پالمیتیک اسید و اولئیک اسید بیش از 82 درصد کل اسیدهای چرب برگ و دمبرگ این گیاه را در بر میگیرند. تجزیه کروماتوگرافی طیف سنجی جرمی عصاره متانولی مشخص کرد که 2- متوکسی-4- وینیل فنل، ترکیب اصلی در عصاره این گیاه است که گیاه پنیرک با داشتن این ترکیبات میتواند فعالیت آنتی اکسیدانتی و جذب رادیکالهای آزاد داشته باشد. (42). علاوه بر پژوهشهای فوق سایر گیاهان دارویی مانند کلاله زعفران(10)، برگ پونه (1)، ریشه گیاه فیزالیس (24)، پیکانتوس (32) کرکیوما (43)، فیکوس (33)، سیلیبینین (23) نیز از طریق داشتن ترکیبات شیمیایی مختلف و فعالیت آنتی اکسیدانتی و جذب رادیکالهای آزاد میتوانند اثرات تخریبی ناشی از تزریق تتراکلرید کربن در کبد را کاهش داده و باعث بهبود بافت کبد شوند. پنیرک دارای ترکیباتی چون لینولنیک اسید، لینولئیک اسید، پالمتیک اسید (26)، موسیلاژ میباشد. این گیاه همچنین حاوی تانن، لوکوآنتوسیانین، آنتوسیانین (44)، فنولها، فلاونوئیدها، کاروتنوئیدها، آلکالوئید، که سبب افزایش آنزیمهای آنتیاکسیدانتی مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز،گلوتاتیون پراکسیداز میگردد (45).
از آنجائیکه آنتیاکسیدانتها قادرند با کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و نکروز هپاتوسیتی تا حد زیادی کبد را در مقابل آسیبها محافظت کنند، تصور میشود علت کاهش تعداد سلولهای نکروتیک، در اثر القا بافت کبد به تتراکلرید کربن وجود آنتی اکسیدانتهای موجود در عصاره گیاه پنیرک باشد (46).
با توجه به نتایج تحقیقات انجام شده بر روی گیاهان مختلف که وجود ترکیبات آنتیاکسیدانتی آنها اثبات شده است، و با توجه به اثبات وجود این ترکیبات در گیاه پنیرک میتوان اذعان نمود که احتمالا گیاه پنیرک از طریق فعالیت آنتیاکسیدانتی و جاروکنندگی رادیکالهای آزاد با کمک این ترکیبات دارای فعالیت محافظت بافتی به ویژه در بافت کبد میباشد.
نتیجه گیری
نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تیمار با عصاره هیدروالکلی پنیرک (Malva neglecta L.) بهدلیل دارا بودن آنتیاکسیدانتها موجب تخفیف آسیب کبدی القا شده توسط تتراکلریدکربن شده و بهصورت معنیداری تمامی شاخص های آسیب بافتی را بهبود بخشد. عصاره گیاه پنیرک احتمالا با مهار برهم کنشهای شیمیایی رادیکالهای آزاد ناشی از تتراکلریدکربن که آغاز کننده استرس اکسیداتیو، پراکسیداسیون لیپید و تغییرات مولکولی هستند و همچنین با سرکوب روند التهاب بافتی در کبد، اثر حفاظت کنندگی خود در کبد را اعمال میکند.
تشکر و قدردانی
در این تحقیق لازم است از زحمات مسئول محترم آزمایشگاه تشخیص طبی بزرگمهر جناب آقای دکتر جواد رشیدی و همچنین از پرسنل محترم آزمایشگاه فیزیولوژی و بافت شناسی دانشگاه آزاد اسلامی واحد همدان صمیمانه تشکر نمائیم.