سلول و بافت
فصلنامه

تاثیر نانوذرات نقره بر صفات فیزیکوبیوشیمیایی و عملکرد اسانس گیاه نعناع فلفلی (Mentha pipireta L.)

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسنده

محمد آبیاری

گروه علوم پایه، دانشگاه فرهنگیان، تهران، ایران

https://doi.org/10.61882/JCT.16.3.245
چکیده
هدف: نعناع فلفلی (Mentha piperita L.) یکی از گیاهان مهم از نظر اقتصادی و دارویی است که به‫واسطه پتانسیل خود در حوزه دارو و درمان، سبب جلب توجه محققان به استفاده از الیسیتورها برای افزایش اسانس و زیست­توده آن شده است. بنابراین، این مطالعه با هدف تعیین اثر نانوذرات نقره بر صفات فیزیکوبیوشیمیایی و عملکرد اسانس گیاه نعناع فلفلی انجام شد. مواد و روش‏ها: تعداد پنج ریزوم در در عمق 5 سانتی‌متری گلدان­های پلاستیکی کاشته شدند. با استقرار کامل گیاه در مرحله ده برگی، محلول­پاشی با غلظت­های صفر (شاهد)، 1 و 2 میلی­مولار نانوذرات نقره انجام شد. تاثیر نانوذرات نقره بر صفات فیزیکوبیوشیمیایی و عملکرد اسانس در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار تجزیه و تحلیل شد. نتایج: نتایج نشان داد که نانوذرات نقره، به‫ویژه با افزایش غلظت از 1 به 2 میلی­مولار، باعث افزایش صفات فیزیکوبیوشیمیایی و عملکرد اسانس نعناع فلفلی نسبت به شاهد شدند. غلظت 2 میلی­مولار نانوذره نقره به‫عنوان موثرین تیمار سبب افزایش محتوای H2O2، پروتئین، فنول، فلاونوئیدها، فعالیت آنزیم­های آنتی‫اکسیدانت SOD، CAT، و APX شد. در محتوای رنگیزه­های کلروفیل و کارتنوئیدها و عملکرد اسانس نیز  چنین افزایشی مشاهده شد. نتیجه‏گیری: با توجه به آثار نانوذرات نقره بر صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی نعناع فلفلی، استفاده از غلظت 2 میلی­مولار نانوذره نقره می­تواند باعث افزایش رنگیزه­های فتوسنتزی، بهبود محتوای اسانس و تقویت سیستم آنتی­اکسیدانتی آنزیمی و غیرآنزیمی گیاه شود.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

اسانس
سیستم آنتی-اکسیدانت
نانوذرات
نعناع فلفلی

موضوعات

عنوان مقاله English

The effect of silver nanoparticles on the physico-biochemical characteristics and essential oil performance of peppermint (Mentha pipireta L.)

نویسنده English

Mohammad Abyari
Department of Science, Farhanghiyan University, Tehran, Iran.
چکیده English

Introduction: Peppermint (Mentha piperita L.) is an economically and medicinally significant plant valued for its essential oil. Silver nanoparticles (AgNPs) act as potent elicitors, triggering defense responses that include the production of reactive oxygen species (ROS) and the accumulation of secondary metabolites. However, the impact of AgNPs on peppermint’s physico-biochemical traits and essential oil performance remains underexplored.
Aims:  This study aimed to evaluate the effects of AgNPs on various physico-biochemical characteristics and essential oil performance in peppermint. The analyzed parameters, including H₂O₂, soluble proteins, phenols, flavonoids, antioxidant enzymes (SOD, CAT, APX), and photosynthetic pigments (chlorophyll and carotenoids), were examined to determine the optimal concentrations for enhanced metabolic activity.
Materials and methods: Rhizomes were planted in pots and grown under controlled greenhouse conditions, including a daytime temperature of 25°C, a photoperiod of 16 h of light and 8 h of darkness, and a relative humidity of 60. At the ten-leaf stage, plants underwent foliar spraying with 0 (control), 1, and 2 mM AgNPs. The AgNPs solution was prepared, characterized via UV-Vis spectroscopy, and SEM (20 nm quasi-spherical particles). A completely randomized design with three replicates was used to assess parameters including H₂O₂ content, soluble proteins, phenols, flavonoids, antioxidant enzymes (SOD, CAT, APX), photosynthetic pigments (chlorophyll, carotenoids), and essential oil performance. Statistical analysis was performed using ANOVA and LSD tests (p<0.05).
Results: AgNPs significantly elevated all measured parameters compared to the control in a generally concentration-dependent manner: Treatment with 1 and 2 mM AgNPs increased H2O2 content by 2- and 3-fold, respectively. Treatment with 2 mM AgNPs resulted in a 2.4-fold increase in protein content. 1 and 2 mM AgNPs resulted in a 2.8- and 2.6-fold increase in leaf phenolic content, respectively. Concentrations of 1 and 2 mM AgNPs resulted in a 1.8- and 2.6-fold increase in leaf flavonoid content, respectively. Treatment with 2 mM AgNPs resulted in a 3.3-fold increase in SOD activity. Treatment with 2 mM AgNPs had a significant positive effect (about a 2.2-fold) on CAT enzyme activity. However, treatment with 1 mM AgNPs failed to affect CAT enzyme activity. AgNPs 1 and 2 mM increased APX enzyme activity by 1.7 and 2.5 times, respectively. Treatment with 1 and 2 mM AgNPs increased total chlorophyll concentration by 2.4- and 3-fold, respectively. 1 and 2 mM AgNPs increased carotenoid concentration by 1.8- and 3.5-fold, respectively. Treatment with 1 and 2 mM increased essential oil yield by 2.2- and 2.3-fold, respectively.
Discussion: AgNPs significantly increased the level of H₂O₂, soluble proteins, phenols, flavonoids, antioxidant enzymes (SOD, CAT, APX), chlorophyll, carotenoids, and essential oil yield. Although the mechanisms of plant response to AgNP elicitors are not well understood, we proposed that the improvement in peppermint’s physico-biochemical traits in our study was due to the following series of mechanisms: AgNPs induce ROS (e.g., H₂O₂) generation through NADPH oxidase activation and electron leakage from organelles. This oxidative stress activates MAPK cascades and calcium signaling, which upregulate transcription factors (MYB, bHLH). These transcription factors subsequently enhance the expression of phenylpropanoid pathway enzymes (e.g., PAL) and terpenoid biosynthesis genes, leading to increased essential oil biosynthesis and accumulation. AgNP elicitors also improve antioxidant enzyme activity (SOD, CAT, APX) to mitigate ROS damage. In addition to the enzymatic antioxidant system, AgNPs enhance components of the non-enzymatic antioxidant system, including phenols and phenoloids. Furthermore, these nanoparticles upregulate key chlorophyll biosynthesis genes (HEMA1, CHLH), while suppress degradation-related genes (NYC1, PAO), resulting in elevated photosynthetic pigment concentrations.
Conclusion: Foliar application of 2 mM AgNPs significantly enhances peppermint’s antioxidant capacity, photosynthetic efficiency, and essential oil biosynthesis by modulating ROS-mediated signaling. Therefore, this concentration is recommended for maximizing peppermint’s medicinal and economic potential. Future studies should explore broader concentration ranges and early gene expression responses (6–12 h post-treatment).

کلیدواژه‌ها English

Antioxidant system
Essential oil
Nanoparticles
Peppermint

مقدمه

نعناع فلفلی (Mentha piperita L.) یکی از گیاهان مهم از نظر اقتصادی و دارویی است و گیاهی چندساله و علفی از تیره نعناعیان می­باشد که برگ و سرشاخه‌های جوان آن برای تهیه اسانس استفاده می­شوند (1). از ابتدای رشد، ترکیبات اسانس نعناع فلفلی در اندام‌های رویشی تولید شده و در کرک‌های غده­ای ذخیره می‌شوند. منتون، منتول و متیل­استات از مهم‫ترین اجزای اسانس این گیاه دارویی به‫شمار می­آیند. بتایین و کولین، کاروتن، آلفا-توکوفرول، فلاونوئید‌ها و پلی­فنل‌های از دیگر ترکیب‌هایی هستند که در این گیاه یافت می‌شوند. این زیست­ترکیب­ها به‫عنوان ضد میکروب، ضد اسهال، ضد نفخ، ضد اسپاسم، ضد درد، ضد استفراغ، تب­بر، گندزدا و معرق شناخته می­شوند (1). با توجه به این فعالیت­ها، نعناع فلفلی در درمان مشکلات کبدی، نارسایی کیسه صفرا، التهاب روده و سندروم روده مورد استفاده قرار می­گیرد (2). با توجه به پتانسیل نعناع فلفلی در حوزه دارو و درمان، محققان تلاش کرده­اند تا با به‫کارگیری فنون مختلف نظیر الیسیتورها به افزایش اسانس و زیست­توده آن نائل شوند.

الیسیتور به طیف متنوعی از محرک­های زیستی و غیرزیستی اشاره می­کند که سبب پاسخ‌‌‌های مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی می‌شوند. در واقع، الیسیتور‌های گیاهی بر مبنای ماهیت خود به الیسیتور‌‌های زیستی و غیرزیستی و بر مبنای منشا خود به الیسیتور‌‌های بیرونی و درونی تقسیم می‌شوند (3). تیمار گیا‌هان با الیسیتورها سبب بروز پاسخ‌‌‌های دفاعی نظیر تولید گونه­های فعال اکسیژن و تجمع متابولیت‌‌‌های ثانویه در کشت‌‌‌های سلولی و یا بافت­های گیا‌هان می‌شود. الیسیتور‌ها با تغییر و تنظیم مقدار بیوسنتز، تجمع و یا تبادل مواد ذخیره‌شده در واکوئل‌‌ها، سطح متابولیت‌های ثانویه‌ را تحت تاثیر قرار می­دهند. خوشبختانه، نانوبیوتکنولوژی طیف متنوعی از محرک­های نانوئی را معرفی کرده است که می­توان از آن‫ها به‫عنوان الیسیتور استفاده کرد (4).

نانوبیوتکنولوژی با به‌کارگیری فنون بیوشیمیایی و زیست‌شیمیایی مولکولی به ساخت و کاربرد نانوموادی می­پردازد که از آن‫ها می­توان در صنایع مختلف استفاده کرد. سنتز نانوذرات از جمله دستاوردهای این حوزه تحقیقاتی به‫شمار می­رود که در پزشکی، کشاورزی و صنعت مورد استقبال قرار گرفته­اند (5). نانوذرات نقره (AgNPs)، نوعی نانوذره فلزی با اندازه 10- 100 نانومتر هستند. این نانوذرات دارای سطح تماس بالایی به‫خاطر اندازه کوچک خود می­باشند. درنتیجه، مقدار چسبندگی نانوذرات نقره به سطوح سلولی بالاست و به‫همین خاطر تاثیر سلولی آن‫ها نسبت به سایر نانوذرات بیشتر است. اثرات نانوذرات بر سلول و بافت گیاهی وابسته به ترکیب شیمیایی، اندازه، پوشش سطح، واکنش­پذیری و از همه مهم‫تر غلظت نانوذره است و از گیاهی به گیاه دیگر متفاوت است. بسته به این خصوصیات، نانوذرات نقره طیف متنوعی از تغییرات متابولیکی را در گیاهان اعمال می‌کنند (6).

مکانیسم‌های دقیق اثر نانوذرات نقره روی بیوسنتز اسانس و صفات فیزیکوبیوشیمیایی هنوز به‫خوبی درک نشده است. با این‫حال، محققان پیشنهاد می­کنند که AgNPs با انتقال از غشای سلولی (اندوسیتوز/حمل‌ونقل یونی)، موجب تنش اکسیداتیو از طریق تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) مانند H₂O₂ و ⁻O₂ در کلروپلاست و میتوکندری می‌شوند (5). اینROS ها به عنوان سیگنال‌های ثانویه، آبشارهای پیام‌رسانی سلولی شامل افزایش کلسیم سیتوزولی (⁺Ca²)، فعال‌سازی کینازهای MAPK و القای مسیر جاسمونات (JA) را آغاز می‌کنند. در مسیر جاسمونات، پروتئین‌های بازدارنده JAZ تخریب شده و فاکتورهای رونویسی MYC2 را آزاد می‌کنند که منجر به افزایش بیان ژن‌های کلیدی سنتز متابولیت­ها، بهبود کمّی و کیفی اسانس  و تعدیل صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در گیاه می­شوند. این اثرات به‫صورت وابسته به غلظت بوده و در غلظت‌های بهینه حداکثر بهره‌وری را نشان می‌دهند (6).   

تاکنون، مطالعات متعددی در خصوص تاثیر نانوذرات نقره بر صفات فیزیکوبیوشیمیایی و عملکرد اسانس انجام شده است. برای مثال، Abdull و همکاران (7) تاثیر غلظت‌های مختلف AgNPs را بر صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک-بیوشیمیایی گیاه دارویی Stevia rebaudiana در شرایط گلخانه ارزیابی کردند. یافته‌های آن‫ها نشان داد که گیاهان تیمارشده با 400 پی‌پی‌ام نانوذرات نقره، بیشترین وزن خشک و تر اندام هوایی را داشتند، درحالیکه گیاهان تیمارشده با غلظت‌های 80 تا 200 پی‌پی‌ام نانوذرات نقره، بالاترین محتوای گلیکوزیدهای استویول را نشان دادند. محققان با کاربرد 80 تا 200 پی‌پی‌ام نانوذرات نقره موفق به افزایش محتوای گلیکوزید استویوزید تا 2 برابر شدند. علاوه بر این، یافته‌های آن‫ها آشکار ساخت که غلظت‌های پایین نانوذرات نقره منجر به افزایش محتوای گلوتاتیون و ظرفیت کل آنتی‌اکسیدانJی و کاهش مالون‌دی‌آلدئید )MDA( می­شوند، درحالی‫که تیمار با غلظت‌های بالاتر، اثرات نامطلوبی بر گیاه داشت. بنابراین، تیمار با غلظت‌های پایین نانوذرات نقره، اثربخشی مطلوبی بر ویژگی‌های فیزیولوژیک-بیوشیمیایی و ریخت‌شناسی S. rebaudiana داشت. در کل، نویسندگان مدعی توانایی بالای کاربرد نانوذرات نقره در افزایش متابولیت‌های ثانویه گیاهان دارویی شدند. در مطالعه مشابهی، Shavalibor و همکاران (8) نشان دادند که نانوذرات نقره سبب افزایش پروتئین، پرولین، کربوهیدرات، آنتوسیانین، فنل و فلاونوئید بادرنجبویه تحت شرایط گلخانه­ای می­شوند. آن‫ها نشان دادند که محتوای مالون دی­آلدئید بخاطر افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی (کاتالاز، گایاکول پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز) تحت تیمار نانوذرات نقره کاهش یافت. درنتیجه، نویسندگان توصیه کردند که نانوذرات نقره می­توانند به‫عنوان الیسیتور مناسبی برای تقویت رشد و تولید متابولیت­های ثانوی استفاده شوند. همچنین، Jalilzadeh و همکاران (9) دریافتند که نانوذرات نقره (50 ppm) منجر به افزایش فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز، محتوای نیترات، پرولین و گلایسین بتائین، پروتئین و قند محلول، کلروفیل و کاروتنوئید در گل همیشه بهار  تحت شرایط گلخانه­ای می­شوند. آن‫ها پیشنهاد کردند که نانوذرات نقره با افزایش اسمولیت­های سازگار، گیاه را برای مواجه با تنش اکسیداتیو ناشی از تولید مازاد رادیکال­های آزاد اکسیژن آماده می­کنند.

با توجه این‫که هنوز تاثیر غلظت­های مختلف نانوذرات نقره بر جنبه­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی نعناع فلفلی به‫خوبی مطالعه نشده است لذا این مطالعه با هدف بررسی تاثیر نانوذرات نقره بر صفات فیزیکوبیوشیمیایی و عملکرد اسانس گیاه نعناع فلفلی صورت گرفت.

2- مواد و روش­ها

مواد گیاهی و تیمار آزمایشی: این آزمایش در گلخانه در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار تجزیه و تحلیل انجام شد. تعداد پنج ریزوم به‫طول ده سانتی­متر (حاوی جوانه­های سالم) در هر گلدان پلاستیکی 5/2 کیلوگرمی در عمق 5 سانتی‌متری کاشته شدند. خاک گلدان‌های پلاستیکی از ترکیب مساوی از خاک برگ، ماسه و خاک زراعی تشکیل شده بود. از نظر خصوصیات فیزیکوشیمیایی، خاک گلدان­ها دارای بافت خاک لومی رسی، اسیدیته کل اشباع 9/7 و هدایت الکتریکی 2/1 دسی­زمنس بود. شرایط گلخانه عبارت بود از: دمای 25 درجه­سانتی­گراد روز، فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و رطوبت نسبی 60 درصد. گیاهان هر دو روز یکبار به گونه­ای آبیاری شدند که از خیساندن کامل بستر کشت جلوگیری شود. با استقرار کامل گیاه در مرحله ده برگی، محلول­پاشی با غلظت­های 0 (شاهد)، 75/0 و 5/1 میلی­مولار نانوذرات نقره انجام شد. این غلظت­ها بر اساس مطالعهKhan  و همکاران (6) انتخاب شد که 75/0 و 5/1 میلی­مولار را جزء غلظت­های بهینه  نانوذرات نقره برای تیمار گیاهان می­دانند.

نانو پودر نقره با مشخصات زیر از شرکت Fine-Nano خریداری شد: جرم مولی نقره 87/107 گرم بر مول؛ خلوص نانو پودر نقره: 99/99 درصد؛ اندازه ذرات نانو نقره: 20 نانومتر؛ شکل ذرات: شبه­کروی شکل؛ رنگ نانو پودر نقره: خاکستری تیره. آنالیز طیف‌سنجی فرابنفش و میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) نانوذرات، اطلاعات نانوذرات ارائه شده توسط شرکت سازنده را تایید کرد. طیف‌سنجی فرابنفش، حداکثر جذب را در طول موج 383 نانومتر نشان داد و تصویر SEM نیز گویای همگنی نانوذرات بود (شکل 1). در نهایت، غلظت­های 75/0 و 5/1 میلی­مولار نانوذرات نقره با توزین 08/0 و 16/0 گرم در لیتر پور نانوذره تهیه شدند. نانوپودر در بالن ژوژه ریخته، آب دیونیزه افزوده و به‌مدت ۲۰ دقیقه در حمام اولتراسونیک قرار گرفت. سپس، با آب دیونیزه تا خط نشانه بالن ژوژه به حجم رسانیده شد تا در نهایت محلول یکنواخت به‫دست آید.

 

الف

ب

شکل 1: طیف­سنجی فرابنفش (الف) و میکروسکوپ الکترونی روبشی (ب) نانوذرات نقره.

 

سنجش صفات: بعد از گذشت 72 ساعت از آخرین محلول­پاشی، نمونه­برداری برگی انجام گرفت. این زمان بر اساس نتایج اغلب مطالعات نانوذره­ای انتخاب شد (8، 9) که امکان سنجش میان­مدت پاسخ صفات موردنظر را فراهم می­کند.

محتوای H2O2: سطح H₂O₂ با استفاده از روشLoreto  و Velikova (10) اندازه‌گیری شد. برگ‌های هموژنیزه با اسید تری‌کلرواستیک 1 درصد شستشو شدند. عصاره حاصل به‫مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد و با دور 10 هزار در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 5 میلی‌لیتر از محلول رویی با 5 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 10 میلی‌مولار (با pH برابر 7) و 1 میلی‌لیتر محلول 1 مولار پتاسیم یدید ترکیب شد. جذب نوری این مخلوط در طول‌موج 390 نانومتر اندازه‌گیری شد. غلظت H₂O₂ در هر نمونه با استفاده از ضریب خاموشی برابر با 28/0 M⁻¹cm⁻¹ محاسبه و برحسب میکرومول بر گرم وزن بافت گیاهی گزارش شد.

فلاونوئیدها: برای اندازه‌گیری غلظت فلاونوئیدها به‫روش رنگ‌سنجی مبتنی بر کمپلکس‌سازی با آلومینیوم کلراید، ابتدا 1/0 گرم پودر برگی با متانول 80 درصد حاوی 1 درصد اسید استیک استیک (pH 5/5) در دمای اتاق و به‫مدت 24 ساعت تحت شرایط تاریکی مخلوط شد. پس از سانتریفیوژ و جمع‌آوری مایه رویی، 500 میکرولیتر از عصاره متانولی با 500 میکرولیتر از محلول 2 درصد  آلومینیوم کلرید و 2 میلی‌لیتر از محلول استات پتاسیم 60 گرم بر لیتر مخلوط شد. پس از انکوباسیون به‫مدت 40 دقیقه در تاریکی، جذب نوری در طول موج 415 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر سنجش شد. غلظت کل فلاونوئیدها بر اساس منحنی استاندارد کورستین (20-200 میکروگرم بر میلی‌لیتر) محاسبه و بر حسب میلی‌گرم کورستین معادل بر گرم وزن خشک برگی گزارش شد (11).

فنول: به‫منظور تهیه عصاره بافت برگی نعناع فلفلی، 5/0 گرم از پودر برگی با 2 میلی‏لیتر متانول 80 درصد (حجمی/حجمی) ترکیب شده و به‌مدت 20 دقیقه در دستگاه اولتراسونیک با فرکانس 30 کیلوهرتز و تحت دمای 22 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. برای هر واکنش، 5/0 میلی‌لیتر عصاره را با 5/2 میلی‌لیتر معرف فولین-سیوکالتو 10 درصد  مخلوط و پس از ۵ دقیقه، ۲ میلی‌لیتر محلول کربنات سدیم 5/7 درصد  (وزن/حجم) اضافه شد. محلول حاصل به ۳۰ تا ۶۰ دقیقه در تاریکی و دمای اتاق انکوبه شده و جذب آن در طول موج ۷۶۵ نانومتر بر علیه بلانک (حاوی حلال به جای نمونه) در اسپکتروفتومتر قرائت شد. غلظت فنول کل بر اساس منحنی کالیبراسیون اسید گالیک (10 تا 300 میلی‏گرم‌در‌لیتر) و بر حسب میلی‏گرم گالیک‌اسید بر گرم وزن خشک گزارش شد (12).

پروتئین: در راستای استخراج پروتئین کل و تعیین فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت، 5/۰ گرم از پودر برگی نعناع فلفلی با 5/2 میلی­لیتر بافر استخراج (بافر فسفات ۱۰۰ میلی­مولار با pH برابر 8/6) مخلوط شد. بعد از سانتریفیوژ با سرعت  g× ۱۳۰۰۰ به‫مدت ۱۵ دقیقه، مایع رویی نمونه­ها برای تخمین فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت استفاده شد. غلظت پروتئین برگی بر اساس تکنیک برادفورد برآورد شد (13).

فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD): 250 میکرولیتر بافر واکنش حاوی ترایتون ایکس- ۱۰۰ (۰۲۵/۰ درصد)، متیونین ۱۲ میلی­مولار، نیتروبلو تترازولیوم ۷۵ میکرومولار، بافر فسفات ۱۰۰ میلی­مولار (با pH برابر 7) و ۵ میکرو­لیتر از بافر ریبوفلاوین 2 میکرومولار به‫هر تیوب افزوده شد. واکنش­ها بر مبنای احیای نوری نیتروبلو تترازولیوم و توانایی SOD در مهار این واکنش­ها ارزیابی شد. در نهایت، فعالیت آنزیم SOD در طول موج 644 نانومتر و بر مبنای واحد آنزیم در دقیقه در میلی­گرم پروتئین برآورد شد (14).

فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT): ابتدا، 75 میکرولیتر عصاره آنزیم، ۳۰۰۰ میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم (با pH برابر 8/6) ۵۰ میلی­مولار و ۵ میکرولیتر پراکسید ­هیدروژن 4/۳ مولار باهم ترکیب شدند. سپس، جذب نمونه­ها در طول موج 240 نانومتر اسپکتروفتومتری خوانده شد و فعالیت کاتالاز بر مبنای میکرومول H2O2 تجزیه­شده در دقیقه در میلی­گرم پروتئین ارائه شد (15).

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX): فعالیت این آنزیم از طریق اسپکتروفتومتری در دمای اتاق برآورد شد. مخلوط واکنش عبارت بود از: ۱۰ میکرولیتر عصاره پروتئینی، H2O2 یک میلی­مولار، آسکوربات ۵ میلی­مولار، بافر فسفات پتاسیم (۸/۷pH=) ۵۰ میلی­مولار. بر مبنای حداکثر جذب آسکوربات در طول موج nm ۲۹۰، فعالیت آسکوربات پراکسیداز تعیین شد و بر مبنای میکرومول آسکوربات اکسیدشده در دقیقه در میلی­گرم پروتئین ارائه شد (16).

کلروفیل و کارتنوئید: غلظت رنگدانه­های فتوسنتزی به کمک روشArmon  (1949) اندازه­گیری شد. ابتدا، 1/0 گرم نمونه برگی با 3 میلی‌لیتر استون 80 درصد خرد شد و حجم نهایی به 15 میلی‌لیتر رسید. سپس، عصاره حاصل با سرعت × g 5000 به‫مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. برای تعیین میزان جذب نمونه­ها، از اسپکتروفتومتر (Shimadzu UV-160) استفاده گردید. اسپکتروفتومتر با استون 80 درصد صفر شد و جذب عصاره در طول‌موج­های 645 نانومتر، 663 نانومتر، 480 نانومتر  و 510 نانومتر ثبت شد (17). 

عملکرد اسانس: برای نیل به هدف تهیه اسـانس از برگ­های نعناع فلفلی، برگ­ها در فضای تاریک و دمای 30 درجه سانتی­گراد تحت فرایند خشـک­شدن قرار گرفتند. سپس، برگ­های خشک­شده از طریق آسیاب سرامیکی خرد و مخلوط شـدند. از دستگاه کلونجر برای اسـانس­گیـری از نمونه­های 25 گرمـی سه ساعت بعد از جوش­آمدن استفاده شد. درصد اسـانس (وزن اسانس/ماده خشک*100) بر حسب وزن خشک برگی تخمین خورد.

3- آنالیز آماری

نتایج حاصل از سنجش صفات نعناع فلفلی شکل میانگین سه تکرار ± انحراف معیار برای هر تیمار ارائه شدند. با تحلیل واریانس (ANOVA) و مقایسه میانگین LSD در سطح معنی­داری 05/0>P، اختلاف آماری معنی‌دار بین نمونه‌های شاهد و تیمار‌شده با غلظت‌های مختلف نانوذرات نقره معلوم شد.

4- نتایج

نتایج تجزیه واریانس

نتایج حاصل از تجزیه واریانس صفات فیزیکوبیوشیمیایی و عملکرد اسانس گیاه نعناع فلفلی در جدول 1 آورده شده است.

 

جدول 1: خروجی تجزیه واریانس صفات فیزیکوبیوشیمیایی و عملکرد اسانس گیاه نعناع فلفلی

منابع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

H2O2

پروتئین

فنول

فلاونوئیدها

SOD

CAT

APX

کلروفیل تام

کارتنوئید

اسانس

تیمار

2

**5/1914

**5/178

**8/1480

**2/807

**86/181

**035/0

**53/15

**001/0

**0026/0

**17/0

خطا

6

68/58

62/12

7/37

78/18

38/9

0044/0

436/0

00005/0

00005/0

0031/0

ضریب تغییرات

-

89/14

84/18

58/13

94/11

46/20

49/22

67/12

95/14

57/14

16/12

 

محتوای H2O2      

تجزیه واریانس داده­های صفت پراکسید هیدروژن با نرم­افزار SAS نشان داد که اختلاف معنی­داری مابین شاهد و تیمار نانوذرات نقره از منظر تاثیرگذاری بر مقدار H2O2 برگ­های نعناع فلفلی وجود دارد (جدول 1). مقایسه میانگین توسط LSD به وضوح بر این نکته تاکید داشت که محلول­پاشی نانوذرات نقره سبب افزایش معنی­دار میزان H2O2 نسبت به شاهد می­شود. چنین افزایشی وابسته به غلظت نانوذره نقره بود به شکلی که با افزایش غلظت نانوذره، فزونی بیشتری در غلظت H2O2 روئیت شد. غلظت 1 و  2 میلی­مولار نانوذره نقره به‫ترتیب سبب افزایش 2 و 3 برابری محتوای H2O2 شدند (شکل 1).

شکل 1:  تاثیر سطوح مختلف نانوذرات نقره (کنترل و غلظت‌های 1 و 2میلی مولار) بر محتوای H2O2 در برگ­های گیاه نعناع فلفلی. مقادیر، میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0p <  است.

 

غلظت پروتئین    

بر اساس نتایج تجزیه واریانس با نرم­افزار SAS، اختلاف معنی­داری مابین شاهد و تیمار نانوذرات نقره از منظر تاثیرگذاری بر غلظت پروتئین در برگ­های نعناع فلفلی وجود داشت (جدول 1). مقایسه میانگین نیز گویای این یافته بود که محلول­پاشی نانوذرات نقره باعث افزایش معنی­دار میزان پروتئین نسبت به شاهد شد. این افزایش وابسته به غلظت نانوذره نقره نبود یعنی اختلافی مابین تیمارهای 1 و 2 میلی­مولار نانوذرات نقره وجود نداشت. تیمار 2 میلی­مولار نانوذرات نقره منجر به افزایش 4/2 برابری میزان پروتئین شد (شکل 2).

 

شکل 2: تاثیر سطوح مختلف نانوذرات نقره (کنترل و غلظت‌های 1 و 2میلی مولار) بر غلظت پروتئین در برگ­های گیاه نعناع فلفلی. مقادیر، میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0p <  است.

 

غلظت فنول

بر مبنای نتایج تجزیه واریانس با نرم­افزار SAS، مابین شاهد و تیمار نانوذرات نقره از منظر تاثیرگذاری بر غلظت فنل­های برگ­های نعناع فلفلی اختلاف معنی­داری وجود داشت (جدول 1). افزایش معنی­دار میزان فنل­های برگی از پی محلول­پاشی نانوذرات نقره نسبت به شاهد مشاهده شد. این افزایش در ترکیبات فنلی وابسته به غلظت نانوذره نقره بود یعنی تیمار 2 میلی­مولار نانوذرات نقره اثر بیشتری نسبت به تیمار 1 میلی­مولار داشت. غلظت 1 و 2 میلی­مولار نانوذره نقره به‫ترتیب سبب افزایش 2 و 3 برابری محتوای فنل­های برگی شدند (شکل 3).

شکل 3: تاثیر سطوح مختلف نانوذرات نقره (کنترل و غلظت‌های 1 و 2میلی مولار) بر غلظت فنول در برگ­های گیاه نعناع فلفلی. مقادیر، میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0p <  است.

 

غلظت فلاونوئیدها

نتایج تجزیه واریانس با نرم­افزار SAS نشان داد که تفاوت معنی­داری مابین اثر شاهد و تیمار نانوذرات نقره بر غلظت فلاونوئیدها برگ­های نعناع فلفلی وجود داشت (جدول 1). در پی محلول­پاشی نانوذرات نقره، افزایش معنی­دار میزان فلاونوئیدهای برگی نسبت به شاهد ثبت شد. تیمار 2 میلی­مولار نانوذرات نقره اثر بیشتری بر غلظت فلاونوئیدها نسبت به تیمار 1 میلی­مولار داشت. به عبارتی دیگر، این افزایش در ترکیبات فنلی وابسته به غلظت نانوذره نقره بود. غلظت 1 و 2 میلی­مولار نانوذره نقره به‫ترتیب سبب افزایش 8/1 و 6/2 برابری محتوای فلاونوئیدهای برگی شدند (شکل 4).

شکل 4: تاثیر سطوح مختلف نانوذرات نقره (کنترل و غلظت‌های 1 و 2میلی مولار) بر غلظت فلاونوئیدها در برگ­های گیاه نعناع فلفلی. مقادیر، میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0p <  است.

 

فعالیت SOD

خروجی تجزیه واریانس با نرم­افزار SAS دال بر این یافته بود که شاهد و تیمار نانوذرات نقره به‫طور متفاوتی بر فعالیت SOD در برگ­های نعناع فلفلی اثر می­گذارند (جدول 1). بعد از محلول­پاشی نانوذرات نقره، شاهد این بودیم که فعالیت SOD افزایش معنی­داری نسبت به شاهد یافت. همچنین، اختلاف معنی­داری مابین تیمار 2 میلی­مولار و تیمار 1 میلی­مولار وجود داشت. به عبارتی دیگر، تغییر فعالیت SOD بعد از تیمار نقره وابسته به غلظت نانوذره بود. تیمار 2 میلی­مولار نانوذرات نقره منجر به افزایش 3/3 برابری فعالیت SOD شد (شکل 5).

شکل 5: تاثیر سطوح مختلف نانوذرات نقره (کنترل و غلظت‌های 1 و 2میلی مولار) بر فعالیت SOD در برگ­های گیاه نعناع فلفلی. مقادیر، میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0p <  است.

 

فعالیت CAT

بر اساس تجزیه واریانس با نرم­افزار SAS، فعالیت آنزیم CAT در برگ­های نعناع فلفلی مابین شاهد و تیمار نانوذرات نقره متفاوت بود (جدول 1). فعالیت این آنزیم بعد از محلول­پاشی نانوذرات نقره افزایش معنی­داری نسبت به شاهد یافت. نسبت به شاهد، تیمارهای 1 میلی­مولار (با حدود 6/1 برابر افزایش) و 2 (با حدود 2/2 برابر افزایش) میلی­مولار نانوذرات نقره اثر مثبت معنی­دار بر فعالیت آنزیم CAT داشت (شکل 6).

شکل 6: فعالیت CAT در پاسخ گیاه نعناع فلفلی به تیمار نانوذرات نقره.

فعالیت APX         

مابین شاهد و تیمار نانوذرات نقره، فعالیت آنزیم APX در برگ­های نعناع فلفلی متفاوت از هم بود (جدول 1). بعد از محلول­پاشی نانوذرات نقره، فعالیت این آنزیم افزایش معنی­داری نسبت به شاهد پیدا کرد. تیمارهای 2 و 1 میلی­مولار نانوذرات نقره تاثیر مثبت معنی­دار بر فعالیت آنزیم APX نسبت به شاهد داشتند. غلظت 1 و 2 میلی­مولار نانوذره نقره به‫ترتیب سبب افزایش 7/1 و 5/2 برابری فعالیت آنزیم APX شدند (شکل 7).

شکل 7: تاثیر سطوح مختلف نانوذرات نقره (کنترل و غلظت‌های 1 و 2میلی مولار) بر فعالیت APX در برگ­های گیاه نعناع فلفلی. مقادیر، میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0p <  است.

 

غلظت کلروفیل - کل         

تجزیه واریانس با نرم­افزار SAS از اختلاف تاثیرگذاری شاهد و تیمار نانوذرات نقره بر غلظت کلروفیل کل در برگ­های نعناع فلفلی پرده برداشت (جدول 1). محلول­پاشی نانوذرات نقره باعث افزایش معنی­داری غلظت کلروفیل کل نسبت به شاهد شد. تیمارهای 2 و 1 میلی­مولار نانوذرات نقره تاثیر مثبت معنی­دار بر غلظت کلروفیل کل نسبت به شاهد داشتند. غلظت 1 و 2 میلی­مولار نانوذره نقره به‫ترتیب سبب افزایش 4/2 و 3 برابری غلظت کلروفیل کل شدند (شکل 8).

شکل 8: تاثیر سطوح مختلف نانوذرات نقره (کنترل و غلظت‌های 1 و 2میلی مولار) بر غلظت کلروفیل کل در برگ­های گیاه نعناع فلفلی. مقادیر، میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0p <  است.

غلظت کارتنوئیدها

تجزیه واریانس با نرم­افزار SAS حاکی از اختلاف تاثیرگذاری شاهد و تیمار نانوذرات نقره بر غلظت کارتنوئیدها در برگ­های نعناع فلفلی بود (جدول 1). محلول­پاشی نانوذرات نقره سبب افزایش معنی­داری غلظت کارتنوئیدها نسبت به شاهد شد. تیمارهای 2 و 1 میلی­مولار نانوذرات نقره تاثیر مثبت معنی­دار بر غلظت کارتنوئیدها نسبت به شاهد داشتند. غلظت 1 و 2 میلی­مولار نانوذره نقره به‫ترتیب سبب افزایش 8/1 و 5/3 برابری غلظت کارتنوئیدها شدند (شکل 9).

شکل 9: تاثیر سطوح مختلف نانوذرات نقره (کنترل و غلظت‌های 1 و 2میلی مولار) بر غلظت کارتنوئیدها در برگ­های گیاه نعناع فلفلی. مقادیر، میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0 P <  است.

 

عملکرد اسانس

تجزیه واریانس با نرم­افزار SAS و متعاقبا مقایسه میانگین با LSD گویای اختلاف مابین تیمارهای نانوذرات نقره بر عملکرد اسانس در برگ­های نعناع فلفلی بودند (جدول 1). تاثیر وابسته به غلظت در نتایج یافت شد که بر اساس آن، تیمار 2 نسبت به 1 میلی­مولار نانوذرات نقره تاثیر بیشتری بر عملکرد اسانس نسبت به شاهد داشت. غلظت 1 و 2 میلی­مولار نانوذره نقره به‫ترتیب سبب افزایش 2/2 و 2/3 برابری عملکرد اسانس شدند (شکل 10).

شکل 10: تاثیر سطوح مختلف نانوذرات نقره (کنترل و غلظت‌های 1 و 2میلی مولار) بر عملکرد اسانس در برگ­های گیاه نعناع فلفلی. مقادیر، میانگین حداقل 3 تکرار مستقل هستند. حروف غیرمشابه نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های معنی‌دار در سطح 05/0 P <  است.

5- بحث

همان‫گونه که نتایج نشان داد، محلول­پاشی نانوذرات نقره سبب افزایش معنی­دار میزان H2O2 در نعناع فلفلی شد. در توافق با یافته­های این تحقیق، Tymoszuk و Kulus (18) نشان دادند که غلظت 20 پی­پی­ام نانوذره منجر به افزایش مقدار H2O2 تا سه برابر در گیاه دارویی Chrysanthemum indicum می­شود. مکانیسم مولکولی افزایش تولید H₂O₂ در گیاهان پس از تیمار نانوذرات نقره عمدتا شامل فعال‫سازی آنزیم‌های NADPH اکسیداز در غشای پلاسمایی می‌شود که سوپراکسید تولید می‌کنند. سوپراکسید نیز توسط سوپراکسید دیسموتاز (SOD) به‫سرعت به H₂O₂ تبدیل می‌شود. هم‫زمان، نانوذرات با اختلال در اندامک‌های سلولی، موجب نشت الکترون از زنجیره انتقال الکترون و تولید بیشتر O₂⁻ و H₂O₂ می‌شوند. مجموعه این عوامل سبب افزایش H₂O₂  بعد از تیمار نانوذرات نقره می­شود (6).

محلول­پاشی نانوذرات نقره سبب افزایش غلظت پروتئین در نعناع فلفلی شد. مشابه با نتایج حاصل،Babarabie  و همکاران (19) دریافتند که استفاده از غلظت 10 درصد  نانوذره نقره سبب افزایش محتوای پروتئین گیاه دارویی Pelargonium hortorum تا 70 درصد می­شود. به‫نظر می­رسد که ساز و کار مولکولی افزایش تولید پروتئین در گیاهان پس از تیمار نانوذره نقره شامل پیام­رسانی القاشده با نانوذرات و بازبرنامه‌ریزی رونویسی باشد. در واقع، نانوذرات موجب تولید گونه‌های فعال اکسیژن در آپوپلاست می‌شوند. ROSها نیز به‫عنوان مولکول سیگنال‌دهنده عمل کرده و فاکتورهای رونویسی پاسخ‌دهنده به تنش را فعال می‌کنند. این امر منجر به افزایش بیان ژن‌های کدکننده پروتئین‌های دفاعی (مانند آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت) می­شود. همچنین، نانوذرات بازده فتوسنتز را افزایش داده و انرژی و اسیدهای آمینه لازم برای سنتز پروتئین بیشتر را تامین می‌کنند (5).

افزایش محتوای فنل­های برگی از پی محلول­پاشی نانوذرات نقره در نعناع فلفلی نیز مشاهده شد. به شکل مشابهی، Sabertanha و همکاران (20) به این نتیجه رسیدند که غلظت 30 پی­پی­ام نانوذره نقره سبب افزایش معنی­دار میزان فنل­های گیاه Crocus sativus تا 3 برابر می­شود. بر افزایش ترکیبات فنولی در گیاهان پس از تیمار با AgNPs عمدتا از طریق یک مکانیسم مولکولی چند مرحله‌ای رخ می‌دهد: نخست نانوذرات نقره اقدام به تولید ROS می­کنند که به‫نوبه خود آبشارهای کیناز پروتئین فعال‌شده با میتوژن (MAPK) و جریان ⁺Ca² را فعال می‌کند که این امر منجر به افزایش بیان فاکتورهای رونویسی MYB و bHLH می‌شود. این فاکتورهای رونویسی به‫نوبه خود، رونویسی ژن‌های کدکننده آنزیم‌های کلیدی مسیر فنیل‌پروپانوئید، به‫ویژه فنیل‌آلانین آمونیاک‌لیاز (آنزیم محدودکننده سرعت در بیوسنتز فنول) را افزایش می‌دهند. فعالیت افزایش‌یافته PAL، جریان کربن را به سمت پیش‌سازهای فنولی هدایت کرده و منجر به تجمع انواع فنولیک‌ها می­شود (7).

افزایش میزان فلاونوئیدهای برگی نعناع فلفلی وابسته به غلظت نانوذره نقره بود. هم­سو با مطالعه پژوهش حاضر، Hosseini و همکاران (21) نتایجی ارائه دادند که کاربرد نانوذرات منجر به افزایش مقدار فلاونوئیدها در بادرنجبویه می­شود. محققان پیشنهاد می­کنند که افزایش فلاونوئیدها ناشی از تیمار نانوذرات نقره شبیه به افزایش فنول­ها است با این تفاوت که آنزیم­های فلاونوئید دهیدروکسیلازها نیز با تیمار نانونقره افزایش می­یابند که نقش مهمی در تولید فلاونوئیدها بر عهده دارند (22).

بعد از محلول­پاشی نانوذرات نقره، شاهد افزایش فعالیت آنزیم SOD در نعناع فلفلی بودیم. همراستا با پژوهش ما، Jadczak و همکاران (23) یافته­هایی ارائه دادند که نشان می­داد افزایش فعالیت آنزیمSOD  در واقع یک پاسخ طبیعی به تیمار نانوذرات نقره در گیاه دارویی Lavandula angustifolia است تا موجبات تجزیه رادیکال­های سوپراکسید را فراهم کند. افزایش فعالیتSOD  در گیاهان پس از تیمار با AgNPs عمدتا از طریق تنش اکسیداتیو رخ می­دهد. انفجار ROS از چند مکانیسم ناشی می­شود: (۱) تعامل نانوذرات با اجزای سلولی باعث نشت الکترون از زنجیره­های انتقال الکترون می­شود؛ (۲) یون­های Ag⁺ با اتصال به گروه­های تیول، آنزیمهای آنتی­اکسیدانتی را غیرفعال کرده و تجمع ROS را تشدید می­کنند. در پاسخ به این شرایط، گیاهان مسیر کینازهای مرتبط با میتوژن را فعال می­کنند که منجر به افزایش بیان ژن، سنتز آنزیم، و فعالیت SOD می­شود (6).

فعالیت آنزیم CAT بعد از محلول­پاشی نانوذرات نقره افزایش معنی­داری در نعناع فلفلی یافت. به‫طور مشابهی، Liu و همکاران (24) دریافتند که افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز احتمالا به این علت است که نانوذرات نقره می‌توانند بر فعالیت آنزیم‌های کلیدی درگیر در رشد سلولی اثر بگذارند. در واقع، نانوذرات نقره به دیواره سلولی گیاهی نفوذ کرده و نفوذپذیری دیواره سلولی را تحت شعاع قرار می­دهند و این‫گونه با تغییر در جذب و دفع مواد از دیواره سلولی بر فرآیندهای داخل سلول اثر می­گذارند. یکی از مکان­های مهم تاثیرگذاری یون­های نقره، ساختار پروتئین‌ها و آنزیم‌ها (مثل کاتالار) است که به‫نوبه خود بر فعالیت و عملکرد آنها تاثیر می­گذارد. علاوه بر ایفای نقش در تغییر ساختار آنزیم­ها و متعاقبا تعدیل کارکرد آن‫ها، نانوذرات نقره سبب القا سنتز رادیکال­های اکسیژنی نظیر H2O2 می­شوند که توسط آنزیم کاتالار تجزیه می­شود (24). این افزایش در سطح H2O2 با سنجش تجربی مقادیر H2O2 در برگ­های نعناع فلفلی مطالعه ما نیز تایید شد.

نتایج حاکی از افزایش فعالیت آنزیم APX بعد از محلول­پاشی نانوذرات نقره بود. در پژوهشی مشابه، Jadczak و همکاران (23)، مدارکی دال بر این یافته ارائه دادند که گویای افزایش فعالیت آنزیم APX در پاسخ به تیمار نانوذرات نقره درLavandula angustifolia بود تا موجبات تجزیه طیف متنوعی از ترکیبات با واسطه­گری H2O2 را فراهم کند. افزایش فعالیت آنزیم APX ناشی از افزایش H₂O₂ به‫عنوان مولکول سیگنال‌دهنده است که فاکتورهای رونویسی Zat12 و غیره را فعال می‌کند. این فاکتورها به عناصر پروموتر ژن APX متصل شده و منجر به افزایش رونویسی و ترجمه ژن می‌شوند که نتیجه آن، افزایش سنتز آنزیم APX است. علاوه بر این، H₂O₂ باعث تغییرات پساترجمه‌ای در آنزیم APX می­شود که به‫طور بالقوه فعالیت آن‌ها را افزایش می‌دهد (5).

در این مطالعه، نعناع فلفلی بر اثر محلول­پاشی نانوذرات نقره با افزایش غلظت کلروفیل مواجه شد. مشاهداتFalco  و همکاران (25)، از مطالعه تاثیر نانوذرات بر رنگیزه‌های فتوسنتزی نشان داد که مقدار این رنگدانه­ها در اثر تماس با نانوذرات نقره در مقایسه با شاهد افزایش معنی­دار یافت. مکانیسم مولکولی پشت افزایش کلروفیل ناشی از تیمار AgNPs، افزایش بیان ژن‌های کلیدی بیوسنتز کلروفیل (مانند HEMA1، CHLH و POR) است، درحالی‫که هم‫زمان بیان ژن‌های تجزیه‌کننده کلروفیل (مانند NYC1 و PAO) را کاهش می‌دهند. این امر سنتز کلروفیل را افزایش می‌دهد. علاوه بر این، AgNPs با تقویت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی (مانند SOD، CAT، APX) از آسیبROS ها به کلروفیل و ساختارهای کلروپلاست جلوگیری می‌کنند (6).

هم‫راستا با مشاهدات ما در خصوص اثر محلول­پاشی نانوذرات نقره بر غلظت کارتنوئیدها، Shahraki و همکاران (26) گزارش کردند که میزان کارتنوئیدها در برگ­های گیاه Ocimum basilicum تابع غلظت نانوذرات نقره است به نحوی که با افزایش غلظت نانوذره، نخست غلظت کارتنوئیدها افزایش یافت اما بعد از آن کاهش یافت. به‫عبارتی دیگر، غلظت بهینه نانوذرات نقره برای حصول حداکثر تولید و تجمع کارتنوئیدها لازم است و غلظت­های بالاتر از آن ممکن است به‫عنوان عامل بازدارنده بیوسنتز کارتنوئیدها عمل کنند. افزایش محتوای کاروتنوئیدها در گیاهان پس از تیمار با نانوذرات نقره عمدتا از طریق ROS است که فاکتورهای رونویسی خانواده WRKYرا فعال می­کند. این فاکتورهای رونویسی، بیان ژن­های کلیدی در مسیر بیوسنتز کاروتنوئیدها، به‫ویژه فیتوئن سنتاز (PSY) را افزایش می­دهند. در نتیجه، تقویت فعالیت آنزیمیِ منجر به تجمع کاروتنوئیدها می­شود (5).

نانوذرات نقره همچنین تاثیر مثبتی بر عملکرد اسانس نعناع فلفلی داشتند. هم‫راستا با یافته­های حاصل، Azadi و همکاران (27) گزارش نمودند که حضور نانوذرات فلزی نقره سبب تحریک سنتز ترپن­ها و ترپنوئیدها به‫عنوان جزء اصلی اسانس گیاه دارویی Thymus vulgaris می­شود. علاوه بر این، آن‫ها مشاهده کردند که تغییرات مهمی در نسبت اجزا تشکیل­دهنده اسانس این گیاه در پی تیمار با نانوذرات فلزی حاصل می­شود. افزایش محتوای اسانس‌های گیاهی پس از تیمار با  AgNPs عمدتا ناشی از این موضوع است که ROSها قدام به فعال‫سازی پاسخ‌های دفاعی گیاه می­کنند که از آن جمله می­توان به افزایش بیان ژن‌ها و فعالیت آنزیم‌های کلیدی در مسیرهای بیوسنتز ترپنوئیدها (اجزای اصلی اسانس‌ها) اشاره داشت. نانوذرات نقره فعالیت و تولید آنزیم‌های مهمی مانند HMG-CoA را افزایش داده و تولید پیش‌سازهای ایزوپرنوئیدی را تقویت می‌کنند. علاوه ‌بر این، نانوذرات نقره ممکن است بیان ترپن سینتاز‌ها را تحریک کرده و بر تکامل تریکوم‌های غده‌ای تاثیر بگذارند که در مجموع منجر به سنتز و تجمع بیشتر ترکیبات اسانس می‌شود (5، 6).

به‫طور کلی، نانوذرات نقره با نفوذ به بافت‌های گیاهی، تنش اکسیداتیو را از طریق تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) مانند پراکسید هیدروژن (H₂O₂) و سوپراکسید (⁻O₂) القا می‌کنند. اینROS ها به‫عنوان سیگنال‌های مولکولی عمل کرده و با فعال‌سازی فسفولیپاز سی  (PLC) سبب افزایش کلسیم سیتوزولی و فعال‌سازی کینازهای وابسته به کلسیم (CDPK) و مسیرهای انتقال پیام سلولی می­شوند. این فرآیند منجر به فعال‌سازی آبشار MAPK و فسفریلاسیون فاکتورهای رونویسی می‌شود که بیان ژن‌های مرتبط با دفاع گیاهی و متابولیسم ثانویه را تنظیم می‌کنند. با تاثیر بر فاکتورهای رونویسی (مانندMYB  وMYC2 )، بیان ژن‌های کلیدی بیوسنتز اسانس و متابولیت‌های ثانویه افزایش می­یابند. در غلظت‌های بهینه، نانوذرات نقره نه تنها از طریق مکانیسم پاسخ دوگانه به تنش موجب افزایش عملکرد اسانس می‌شوند، بلکه صفات فیزیولوژیکی گیاه را نیز بهبود می‌بخشند (28).

محدودیت‌های این مطالعه شامل دامنه غلظت‌های نانوذرات مورد بررسی بود. لذا پیشنهاد می­شود که دامنه غلظت­ها افزایش یابد تا طیف پاسخ نعناع فلفلی به نانوذرات نقره به‫خوبی مشخص شود. برای پژوهش­های آینده توصیه می­شود که نمونه­برداری در فاصله 6 الی 12 ساعت بعد از آخرین محلول­پاشی انجام شود تا تغییر بیان ژن­های کلیدی درگیر در بیوسنتز متابولیت­های ثانویه مهم نعناع فلفلی در مراحل اولیه پیام­رسانی تعیین شوند.

6- نتیجه­گیری

در کل، تیمار نعناع فلفلی با نانوذرات نقره به‌ویژه در غلظت ۲ میلی‌مولار، تاثیر قابل‌توجهی بر بهبود شاخص‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه داشت. این نانوذرات از طریق القای تنش اکسیداتیو و تولیدROS ، سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانتی گیاه را فعال کرده و منجر به افزایش معنادار فعالیت آنزیم‌های آنتی­اکسیدانت شدند. هم‫زمان، تجمع متابولیت­ها به‌طور چشمگیری افزایش یافته و در نهایت عملکرد اسانس تا ۳.۲ برابر نسبت به شاهد بهبود یافت. بنابراین، کاربرد غلظت بهینه ۲ میلی‌مولار نانوذرات نقره می‌تواند به‌عنوان یک راه‫کار موثر در افزایش کمّی و کیفی ترکیبات دارویی نعناع فلفلی و تقویت سیستم آنتی‌اکسیدانتی آن مورد استفاده قرار گیرد. برای تحقیقات آتی، بررسی سازوکارهای مولکولی در سطح ترانسکریپتوم و کاربرد این نانوذرات در شرایط مزرعه‌ای پیشنهاد می‌شود.

 7- تشکر و قدردانی

  کمال سپاسگزاری را از همکارانی داریم که ما را در اجرای این مطالعه مساعدت نمودند.

-

1.  Siddhi S, Sonawane S. Mentha: The Remarkable Herbal with Endless Healing and Culinary Benefits. International Journal of Scientific Research and Technology. 2025 Apr 22.
2.  Hafeeza H, Kouser S. Fodanj (Mentha Piperita): Clinical applications in medicine and beyond. World Journal of Advanced Research and Reviews. 2025 Feb 28;25(2):2004-10.
3.  Naik PM, Al-Khayri JM. Impact of abiotic elicitors on in vitro production of plant secondary metabolites: a review. J Adv Res Biotech. 2016;1(2):7.
4. Maffei ME, Arimura GI, Mithöfer A. Natural elicitors, effectors and modulators of plant responses. Natural product reports. 2012;29(11):1288-303.
5. Lala S. Nanoparticles as elicitors and harvesters of economically important secondary metabolites in higher plants: A review. IET nanobiotechnology. 2021 Feb;15(1):28-57.
6. Khan S, Zahoor M, Khan RS, Ikram M, Islam NU. The impact of silver nanoparticles on the growth of plants: The agriculture applications. Heliyon. 2023 Jun 1;9(6).
7. Abdull SR, Rashid SH, Ghafoor BS, Khdhir BS. Effect of Ag Nanoparticles on morphological and physio-biochemical traits of the medicinal plant Stevia rebaudiana. Caryologia. 2022 Sep 21;75(2):15-22.
8. Shavalibor A, Esmaeilzadeh Bahabadi S. Effect of biologically synthesized silver nanoparticles on Melissa officinalis L. Evaluation of growth parameters, secondary metabolites and antioxidant enzymes. Iranian Journal of Plant Physiology. 2021 Aug 1;11(4):3799-809.
9. Jalilzadeh E, Jamei R, Hosseini Sarghein S. Effect of magnetic field and silver nanoparticles on some biochemical factors of Calendula officinalis L. Modares Journal of Biotechnology. 2017 Apr 10;8(1):10-20.
10. Loreto F, Velikova V. Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage, quenches ozone products, and reduces lipid peroxidation of cellular membranes. Plant Physiology. 2001 Dec 1;127(4):1781-7.
11. Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food chemistry. 1999 Mar 1;64(4):555-9.
12. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventós RM. [14] Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. InMethods in enzymology 1999 Jan 1 (Vol. 299, pp. 152-178). Academic press.
13. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 1976 May 7;72(1-2):248-54.
14. Beyer Jr WF, Fridovich I. Assaying for superoxide dismutase activity: some large consequences of minor changes in conditions. Analytical biochemistry. 1987 Mar 1;161(2):559-66.
15. Change B, Maehly AC. Assay of catalases and peroxidase. Methods Enzymol. 1955;2:764-75.
16. Ranieri A, Castagna A, Pacini J, Baldan B, Mensuali Sodi A, Soldatini GF. Early production and scavenging of hydrogen peroxide in the apoplast of sunflower plants exposed to ozone. Journal of Experimental Botany. 2003 Nov 1;54(392):2529-40.
17. Armon D. Copper enzymes in isolated chloroplast. Plant physiology. 1949; 24: 1-5.
18. Tymoszuk A, Kulus D. Silver nanoparticles induce genetic, biochemical, and phenotype variation in chrysanthemum. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 2020 Nov;143(2):331-44.
19. Babarabie M, Zolfaghary P, Sardoei AS, Fotoohiyan Z, Ghorbanzadeh A, Danyaei A, Afsharipour S. The effect of foliar application of silver nanoparticles synthesized by Moringa oleifera on improving the yield and quality of Pelargonium hortorum under drought stress. Scientific Reports. 2025 Jul 2;15(1):23239.
20. Sabertanha B, Fakheri B, Mehdinezhad N, Alizade Z. The effect of silver nanoparticles on physiological characteristics of some saffron (Crocus sativus L.) ecotypes of South Khorasan under moderate water deficit stress. Environmental Stresses in Crop Sciences. 2018 Sep 23;11(3):627-43.
21. Hosseini SM, Ramezan D, Rahimi M, Mohkami Z, Hadadi T. The effect of carrageenan, saffron extract containing silver nanoparticles and Trichoderma harzanium on some morphophysiological and phytochemical traits of lemon balm condition (Melissa officinalis). Iranian Journal of Field Crop Science. 2023 Mar 21;54(1):169-82.
22. Chung IM, Rajakumar G, Thiruvengadam M. Effect of silver nanoparticles on phenolic compounds production and biological activities in hairy root cultures of Cucumis anguria. Acta Biologica Hungarica. 2018 Mar; 69: 97-109.
23. Jadczak P, Kulpa D, Drozd R, Przewodowski W, Przewodowska A. Effect of AuNPs and AgNPs on the antioxidant system and antioxidant activity of lavender (Lavandula angustifolia Mill.) from in vitro cultures. Molecules. 2020 Nov 25;25(23):5511.
24. Liu W, Worms I, Slaveykova VI. Interaction of silver nanoparticles with antioxidant enzymes. Environmental Science: Nano. 2020;7(5):1507-17.
25-. Falco WF, Queiroz AM, Fernandes J, Botero ER, Falcão EA, Guimarães FE, M’Peko JC, Oliveira SL, Colbeck I, Caires AR. Interaction between chlorophyll and silver nanoparticles: a close analysis of chlorophyll fluorescence quenching. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 2015 Feb 15; 299: 203-9.
26. Shahraki SH, Ahmadi T, Jamali B, Rahimi M. The biochemical and growth-associated traits of basil (Ocimum basilicum L.) affected by silver nanoparticles and silver. BMC Plant Biology. 2024 Feb 6;24(1):92.
27. Azadi M, Moghaddam SS, Rahimi A, Pourakbar L, Popović-Djordjević J. Biosynthesized silver nanoparticles ameliorate yield, leaf photosynthetic pigments, and essential oil composition of garden thyme (Thymus vulgaris L.) exposed to UV-B stress. Journal of Environmental Chemical Engineering. 2021 Oct 1;9(5):105919.
28. Siddiqi KS, Husen A. Plant response to silver nanoparticles: a critical review. Critical Reviews in Biotechnology. 2022 Oct 3;42(7):973-90.
سلول و بافت
دوره 16، شماره 3
پاییز 1404
صفحه 245-262

  • تاریخ دریافت 20 اسفند 1403
  • تاریخ بازنگری 08 مرداد 1404
  • تاریخ پذیرش 06 مهر 1404

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما