تاثیر گرسنگی حاد بر هیستومورفولوژی هپاتوپانکراس میگوی لیتوپنئوس وانامی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیولوژی دریا، دانشکده علوم دریایی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر

2 مرکز تشخیص بیماری‏های میگو، بوشهر

-

چکیده

هدف: هپاتوپانکراس یک ارگان حیاتی در طول دوره زندگی میگو دستخوش تغییراتی می‏گردد که در ساختار بافت‏شناسی آن تاثیر مستقیم و مشهود می‏گذارد. با توجه به اینکه مطالعه‏ای در این خصوص انجام نگرفته است بنابراین تحقیق حاضر بر این اساس انجام پذیرفته است.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه 50 قطعه میگوی وانامی بالغ سالم از هر دو جنس از مزارع پرورشی با طول متوسط 1±12 سانتی‏متر و وزن متوسط  5/. ±18گرم صید گردیدند. پس آداپته کردن آن‏ها با شرایط آزمایشگاه، نمونه‏ها به‏صورت تصادفی در دو آکواریوم با شرایط مشابه نگه‏داری سپس یک گروه به‏مدت 5 روز گرسنه و گروه کنترل در طی این مدت تغذیه شدند. پس از آن 20 نمونه از هرگروه صید و در محلول دیویدسون تثبیت گردیدند. پس از تشریح و خارج نمودن هپاتوپانکراس  مراحل استاندارد و معمول پاساژ بافتی انجام در نهایت برش‏ها با روش معمول رنگ آمیزی و در نهایت زیر میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج: بر اساس نتایج  در بررسی میکروسکوپی انواع سلول‏های,B  ,R  EوM  تشخیص داده شدند. تعداد سلول‏ها، اندازه توبول‏ها و وزن هپاتوپانکراس درنمونه‏های سیر و گرسنه اندازه‏گیری و مطالعه آماری روی آن‏ها انجام گرفت. بر این اساس  نتایج حاکی از کاهش تعداد و مساحت توبول‏های هپاتوپانکراس بوده که به‏ویژه در سلول‏های جذبی- ذخیره‌ای نسبت به سایر سلول‏ها مشهود بوده است.
نتیجه گیری: طبق نتایج به‏دست آمده‏، وزن و مساحت هپاتوپانکراس، ‏اندازه سلول‏ها و توبول‏ها در نمونه‏های گرسنه درمقایسه با نمونه‏های سیر اختلاف معنی‏داری را نشان دادند.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

در رده سخت پوستان راسته‏ای به‏نام ده پایان وجود داردکه ازجنس‏های مختلفی تشکیل شده است و در میان جنس‏های مختلف ده پایان میگو از فراوانی گونه‏ای نسبتا زیادی برخوردار است و در اغلب آب‏های جهان اعم از آب شیرین و آب شور به حیات خود ادامه می‏دهد. میگوی وانامی عمدتا شور پسند بوده و درقسمت های کم عمق دریا زندگی می‏کند (1). اندازه بدن تا حدود 230 میلی‏متر می­رسد، همچنین به‏دلیل دارا بودن رنگ شفاف به‏عنوان میگوی سفید شهرت دارد (2). پرورش میگو به‏عنوان یکی از فعالیت‏های مهم آبزی پروری در جهان و ایران به‏ویژه در سواحل جنوبی در حال توسعه و گسترش می­باشد. این‏گونه برای اولین بار در تابستان سال 1383 توسط موسسه تحقیقات شیلات ایران جهت انجام کارهای پژوهشی به کشور معرفی گردید. با توجه به اهمیت این صنعت و نوپا بودن آن در ایران و جهان بررسی مشکلات موجود در زمینه پرورش و همچنین مطالعه و تحقیق در زمینه‏های فیزیولوژی، پاتولوژی و سایر علوم بر روی میگو ضرورت دارد. هپاتوپانکراس در ده‏پایان و از جمله میگوها یک ارگان حیاتی بوده و وظایف کبد، لوزالمعده و برخی اندام‏های دیگر مثل روده در مهره‏داران را با هم انجام می­دهد. عمل‏کرد صحیح هپاتوپانکراس در زمان سیری یا گرسنگی موجود تاثیر زیادی بر سلامت و رشد آن دارد و از آن به‏عنوان شاخص سلامت در میگو در مطالعات استفاده می­گردد (3). وظایف این ارگان مهم سنتز و ترشح آنزیم‏های گوارشی، جذب و هضم مواد غذایی ذخیره مواد آلی، چربی‏ها و کربوهیدرات‏ها، تولید مواد مورد نیاز جهت دوره های دگردیسی و ویتلوژنز، انجام عمل سم‏زدایی با نگه‏داری فلزات سنگین در سلول‏های جذبی، ذخیره سازی کلسیم، فسفات، گلیکوژن در مراحل مختلف دگردیسی است (1). عمل‏کرد این اندام در طول دوره زندگی میگو دستخوش تغییراتی می‏گردد که این تغییرات در ساختار بافت شناسی آن تاثیر مستقیم و مشهود می­گذارند (4). در برخی از بیماری‏های ویروسی نظیر لکه سفید نیز تغییرات پاتولوژیک در آن دیده شد (5). علی‏رغم اهمیت این اندام، مطالعه‏ای بر روی تغییرات چربی‏ها، کربوهیدرات‏ها و دیگر خصوصیات بافتی این اندام در طی دوره پرورش به‏ویژه در زمان گرسنگی صورت نگرفته است. این تغییرات می‏توانند فیزیولوژیک و یا گاهی آسیب شناختی باشند که در این مطالعه تغییرات آسیب شناختی در موارد گرسنگی مورد بررسی قرار گرفته و متعاقب آن می‏توان علت تغییرات را به‏صورت مجزا بررسی نمود. لازم به یادآوری می‏باشد که این‏گونه از لحاظ اقتصادی دراستان خوزستان و بوشهر بسیار مهم می‏باشد و از گونه‏های پرورشی درمزارع و استخرهای پرورشی می‏باشد. به‏دلیل اینکه هپاتوپانکراس یکی ازارگان‏های حیاتی درمیگو می‏باشد  پی بردن به بافت تشکیل دهنده این دستگاه درحالت طبیعی و تحت تاثیر استرس‏هایی چون گرسنگی اهمیت خاص دارد. همچنین این تحقیق می‏تواند مورد استفاده پرورش دهندگان میگو و مراکز تحقیقات شیلات قرار گیرد.

 

مواد و روش‏‏ها

برای این منظور 100 قطعه میگوی زنده از مزارع پرورش میگوی بوشهر منطقه حله صید گردید. سپس میگوها درون یک وان باگنجایش 250 لیتر قرارداده شدند و با یک کپسول اکسیژن 10 کیلوگرمی مجهز به رگلاتور‏، اکسیژن مورد نیاز نمونه‏ها تامین گردیده و به مرکز ملی تشخیص بیماری‏های میگو منتقل گردیدند. پس از عادت‏پذیری و اطمینان از سلامتی میگوها، 50 قطعه میگو را انتخاب و آن‏ها را به‏دو دسته 25تایی تقسیم نموده و هردسته را به یک آکواریوم با ابعاد80 ×90 ×60  سانتی‏مترکه با یک پمپ هوا ده مشترک هوادهی می شد، منتقل شدند. شرایط دو آکواریوم از نظر دما‏، اکسیژن‏، pH‏، نور، شوری وغلظت آمونیاک کاملا مشابه بود. سپس به میگوهای یکی از آکواریوم‏ها به‏مدت پنج روز گرسنگی داده شد ولی میگوهای آکواریوم دیگر به‏صورت روتین تغذیه شدند. در پایان دوره آزمایش از هپاتوپانکراس تمامی میگوها جهت هیستومورفولوژی نمونه‏برداری شد. تمامی مراحل معمول و تکنیک‏های تهیه مقاطع بافت‏شناسی بر روی نمونه‏ها انجام گرفته و برش‏های 6 میکرونی تهیه شده بروش هماتوکسیلین- ائوزین رنگ‏آمیزی شده  توسط میکروسکوپ نوری مدل الیمپیوس مجهز به لنز داینولیت مطالعه و توسط نرم افزارهای اکسل و  SPSSمورد تجزیه و تحلیل آماری به‏روش ANOVA یک‏طرفه و تی تست قرار گرفتند (6 و 7).

 

نتایج

هپاتوپانکراس درنمونه‏های تیمارشده به‏صورت یک اندام توبولار متشکل از چندین لوله به هم چسبیده در کنار یکدیگر مشاهده گردید (شکل‏های 1 و 2 که نمای ماکروسکوپی و آناتومیکی هپاتوپانکراس و از دید میکروسکوپی ترتیب سلول‏های تشکیل دهنده دیواره این اندام و بافت پوششی آن مشخص شده است). مجرای توبول‏ها اشکال نامنظم داشته و در برخی مشخصا ستاره‏ای شکل بود. سطح داخلی توبول‏ها توسط یک لایه از بافت پوششی استوانه‏ای ساده مفروش شده بود. در مطالعات میکروسکوپی بافت پوششی مورد نظر سلول‏های متعدد تشکیل دهنده آن یعنی سلول جذبی- ذخیره‏ای (Resorptive cell یا R-cell)، سلول  کیسه­ای شکل با هسته قاعده‏ای ( like cell-listerB  یا B- cell)، سلول  جنینیEmbryonic cell)  یا   E-cell) فاقد مجرا به سمت توبول، سلول روده‏ای (Midgut cell  یا cell-M) و سلول میواپی‏تلیال  Myoepithelial- cell به‏صورت کشیده و چسبیده به غشای پایه که وظیفه ترشحی سلول‏های ترشح کننده را بر عهده دارد، مشخص گردیدند. با اندازه‏گیری تعداد سلول‏های تشکیل دهنده توبول‏ها درنمونه‏های سیر و گرسنه و مساحت توبول‏های نمونه‏های سیر و گرسنه، نتایج حاکی از کاهش تعداد و مساحت توبول‏های هپاتوپانکراس می‏باشد که بیشتر در سلول‏های جذبی- ذخیره­ای نسبت به سایر سلول‏ها مشهود بود (شکل‏های 3، 4، 5، 6  که به‏ترتیب مقاطع متفاوت  توبول‏ها، به‏هم ریختگی و آتروفی آن‏ها در میگو‏های گرسنه، اندازه‏گیری آن‏ها در نمونه‏های شاهد و تیمار و نمودار 1 که میانگین مساحت توبول‏های هپاتوپانکراس نمونه‏های شاهد و گرسنه را نشان داده است).

 

 

 

شکل1: هپاتوپانکراس میگوی گرسنه پس از تشریح نشان داده شده است.

 

 

شکل2: سلول جذبی- ذخیره­ای یا R-cell،  سلول کیسه­ای یا B- cell، سلول‏های جنینی  یا E-cell ، سلول روده‏ای یا cell-M (فلش نازک) و  سلول میواپی‏تلیال (فلش قطور) در هپاتوپانکراس میگوی لیتوپنئوس وانامی سالم و غیر گرسنه مشخص شده است (رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین  بزرگنمایی‏×‏3000).

 

شکل3: اندازه‏های متفاوت و فضای ستاره‏ای شکل توبولوبول‏های هپا‏توپانکراس میگوی غیر گرسنه نشان داده شده است (رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین  بزرگنمایی‏×‏750).

 

 

شکل4: به‏هم ریختگی (پیکان عمودی) و آتروفی (پیکان های افقی) تعدادی از توبولوبول‏های هپا‏توپانکراس میگوی گرسنه نشان داده شده است (رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین  بزرگنمایی ×750).

 

 

شکل5: نحوه اندازه‏گیری مساحت توبول‏های هپا‏توپانکراس نمونه تیمارشده نشان داده شده است (رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین  بزرگنمایی ×750).

 

شکل6: نحوه اندازه‏گیری مساحت توبول‏های هپاتوپانکراس نمونه گرسنه نشان داده شده است (رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین  بزرگنمایی ×750).

 

 

نمودار 1: مقایسه میانگین مساحت توبول‏های هپاتوپانکراس نمونه‏های شاهد (به‏رنگ آبی) وگرسنه (به‏رنگ بنفش) میگوی وانامی مشخص شده است. محور عمودی میانگین مساحت توبول‏ها و محور افقی میانگین ده عدد هپاتوپانکراس شاهد و گرسنه حاصل از ده میدان میکروسکوپی برای هر نمونه می‏باشد.

 

بحث

نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که ساختار بافت­شناسی هپاتوپانکراس شامل سلول‏های اصلی توبول‏ها که خود شامل سلول‏های جنینی، سلول‏های جذبی-ترشحی، سلول‏های کیسه‏ای شکل، سلول‏های روده­ای و سلول‏های میواپی‏تلیال می‏باشد که با تحقیقات زیلی و همکاران (8) که بروی گونه مارسوپنئوس گزارش کردند مطابقت دارد. همچنین مساحت توبول‏های اندازه‏گیری شده در میگوهای سیر و گرسنه با گزارشات سایر محققین در سایر گونه‏ها هم‏خوانی دارد و تنها تفاوت ساختاری هپاتوپانکراس در نمونه‏های گرسنه با نمونه‏های شاهد، کمتر شدن اندازه توبول‏ها و در نتیجه کاهش اندازه کل هپاتوپانکراس در نمونه‏های گرسنه است که خود ناشی از کوچک شدن سلول‏ها به‏دلیل مصرف ذخائر موجود در این سلول‏ها و کاهش تعداد سلول‏ها می‏باشد. کاهش تعداد سلول‏ها، ممکن است به‏دلیل توقف تقسیمات میتوزی بوده چراکه تقسیم سلولی زمانی‏که سلول‏ها در فقر غذایی قرار می‏گیرند، متوقف می‏شود (9). همانطوری‏که ذکر شد هپاتوپانکراس اصلی‏ترین اندام ذخیره انرژری در بدن میگو می‏باشد و بیشتر چربی و به‏میزان کمتری گلیکوژن ذخیره می‏کند. گرسنگی استرسی است که می‏تواند سبب آتروفی هپاتوپانکراس و سایر ارگان‏ها شود. این کاهش اندازه می‏تواند در اثر کاهش تعداد سلول‏ها و یاکاهش اندازه آن‏ها و یا ترکیبی از هر دو حالت باشد (10). درمواردی که موجودات در شرایط گرسنگی قرار می‏گیرند، روش‏هایی جهت پیشگیری از مرگ یا آسیب دیدن مثل خواب زمستانی و یا استفاده کردن از ذخیره انرژی انتخاب می‏کنند. در سخت‏پوستان به‏ویژه در میگوها هپاتوپانکراس از مهم‏ترین منبع ذخیره انرزی می‏باشد که در مواقع ضروری مانند استرس و گرسنگی  از آن استفاده می‏کند (11). در تحقیقات سایر محققین مشخص گردید که میگوها مانند سایرسخت‏پوستان، هنگام پوست اندازی غذا نمی‏خورند و درمعرض گرسنگی قرار می‏گیرند که باعث بروز تغییرات  فیزیولوژیکی، متابولیستی و رفتاری می‏گردد. برای درک تاثیرات گرسنگی بر منابع انرژی‏، میگوی لیتوپنائوس وانامی را به‏مدت 5 روز در معرض گرسنگی قرار دادند‏. این پنج روز برابر است با زمانی که میگو‏های جوان در هنگام پوست اندازی نمی‏توانند غذا بخورند. گلوکز، گلیکوژن‏، تمامی پروتئین‏های قابل حل، استروئید‏ها و اکیل گلیسرید در پلاسما و هپاتوپانکراس به‏ویژه در سلول‏های جذبی- ذخیره­ای به‏شدت کاهش یافت که با یافته‏های مطالعه اخیر بر روی میگوی وانامی در خصوص سلول‏های مذکور مطابقت دارد (12). میگوی وانامی درشرایط گرسنگی کوتاه مدت در زمانی برابر با مدت زمان پوست اندازی از منابع انرژی غیرپروتئینی استفاده می‏کند. ابتدا از اکیل گلیسرید و سپس به‏سرعت از گلوکز به‏عنوان منبع اصلی انرژی استفاده می‏کند (13). به‏نظر می‏رسد اندازه هپاتوپانکراس‏، شکل و تعداد انواع سلول‏های آن تحت تاثیر فاکتورهای محیطی و عوامل داخلی یا فیزیولوژیک قرار می‏گیرد. بر اساس گزارش زیلی و همکاران (3) مشخص گردید که در دوره پیش از پوست‏اندازی هم‏زمان با کلسیفیه شدن کوتیکول، تعداد سلول‏های جذبی- ذخیره ای نسبت به سایر سلول‏ها در هپاتوپانکراس افزوده می‏شود. این تغییرات احتمالا به‏دلیل افزایش جذب کلسیم توسط سلول‏های مذکور صورت می­گیرد بدین‏معنی که به‏دلیل نیاز به کلسیم بیشتر، سلول‏های جذبی- ذخیره‏ای بیشتری تولید می‏شوند. ساراوانا و همکاران (14) گزارش کردند که گرسنگی کوتاه مدت نیز باعث کاهش وزن و اندازه هپاتوپانکراس نسبت به وزن و اندازه میگو شده است. همچنین مواد شیمیایی، سموم و بیماری‏ها نیز می‏توانند باعث تغییرات هیستوپاتولوژیک در هپاتوپانکراس شوند که این تغییرات در میگوی ماکروبراکیوم و در اثر مسمومیت با اندوسولفان توسط محققین گزارش گردید و علت آن کاهش سلول‏های جذبی- ذخیره ای و نقش آن در جذب و نگه‏داری سموم بوده است. پس از بررسی‏های اولیه، تعداد سلول‏های تشکیل دهنده هر توبول هپاتوپانکراس در نمونه‏های گرسنه و سیر شمارش شد. میانگین سلول‏های هر توبول در نمونه‏های سیر و گرسنه 45 تا60 سلول بوده و در این خصوص در نمونه‏های گرسنه و سیر اختلافی مشاهده نگردید. این نتیجه نشان می‏دهد که گرسنگی موجب تغییر در اندازه سلول‏ها شده است. این یافته با تحقیقات مشابه که بیان داشت بر اثر گرسنگی اتولیز بافتی صورت نگرفته ولی وزن هپاتوپانکراس نسبت به کل بدن کاهش می‏یابد، مطابقت دارد (15 و 16). همچنین هاوان و همکاران (17) گزارش کردند که کاهش فعالیت آنزیم تریپسین و فراوانی ترانس کریپت‏ها ممکن است راه‏کاری برای جلوگیری از مصرف منبع انرژی در شروع دوره گرسنگی باشد. این نوع تغییرات در سطح سنتز آنزیم‏ها برای ذخیره کردن منابع ارزشمند انرژی بسیار سودمند است. اطلاعات حاصل از بررسی‏های مخلف بیانگر تاثیر گرسنگی بر اندازه  و تعداد سلول‏ها ودر نتیجه اندازه توبول‏های هپاتوپانکراس می‏باشد که خود می‏تواند ناشی از مصرف ذخایر گلیکوژن و چربی موجود در سلول‏های این اندام حیاتی باشد. بنابراین با توجه به مطالعات انجام گرفته توسط سایر محققین تغییرات مشاهده شده در هپاتوپانکراس میگوهای گرسنه  به‏دلیل توقف درتقسیم سلول‏ها به‏دلیل کاهش یافتن منبع غذایی صورت پذیرفته است.

 

نتیجه گیری

با توجه به اینکه از وظایف این اندام ذخیره کردن چربی‏ها، گلیکوژن، مواد معدنی و سایر مواد مغذی می‏باشد عمل‏کرد مناسب و میزان ذخیره چربی و گلیکوژن در این بافت شاخص سلامت و تغذیه و مرحله زندگی این جانور می‏باشد. طبق نتایج به‏دست آمده، وزن هپاتوپانکراس و اندازه سلول‏ها و توبول‏ها در نمونه‏های گرسنه درمقایسه بانمونه‏های سیر اختلاف معنی‏داری نشان دادند.

  1. Lightner DV, Bell, TA. Handbook of Normal Penaeidae Shrimp Histology. 1988; 58-63.
  2. Brown L. Aquaculture for Veterinarians. Fish Husbandry and Medicine. Pergomon Press. 1th Edition, chapter 16. 1993; 271-296.
  3. Zilli L, Schiavone R, Storelli C, Vilella S. Analysis of calcium fluctuation in Hepatopancreatic
 

R-cells of (Marsupenaeus japonicas) during the moulting cycle.  Biol Bull 212. 2007; 161-168.

  1. Boonyaratpalin S. Shrimp larval diseases (in Malaysia) Edited by Micheal, B. N. Henri, D. S. Tariochan, s. Technical and economic aspects of shrimp farming. 1990; 18-163.
  2. Allan G L, Maguire GB. Effect of pH and salinity on survival, growth and osmoregulation in (Penaeus monodon) (Fabricius). Aquaculture. 1992; 104: 33–47.
  3. De Barros Guerralha AC. Shrimp hatching development in Brazil .Global Aquaculture Advocate. 2003; 67-70.
  4. Lee ET, Wang JW. Statistical methods for survival data analysis.2003; 3rd edn. John Wiley & Sons, New York press, 534 pages.
  5. Zilli L, Schiavone R, Scordella G, Zonna V, et al. Changes in celltype composition and enzymatic activities in the hepatopancreas of (Marsupenaeus japonicas) during the moulting cycle.Journal of comparative physiology B. 2003; 173(40: 355-363.
  6. Jimenez-Yan L. Energy balance of Litopenaeus vannamei postlarvae fed. 2006; pp. 235.
10. Cuzon G. Nutrition of (Litopenaeus vannamei) reared in tanks or ponds. Aquaculture. 2004; 235: 523-551.

11. Hu KJ, Leung PC. Food digestion by cathepsin L and digestion-related rapid cell differentiation in shrimp hepatopancreas, Comparative Biochemistry and Physiology, Part B, 2006; 146: 69-80.

12. Repetto M, Griffen BD. Phsiological consequences of parasite infection in the burrowing mud shrimp, Upogebia pugettensis, and a widespread ecosystem engineer. Marine and freshwater research. 2011; 214-220.

13. Rosenberry B. World shrimp farming. Shrimp news international. 2002; pp.276.

14. Saravana Bhavan P, Gerdaline P. Histopathology of the hepatopancreas and gills of the prawn (Macrobrachium malcolmsonii) exposed to endosulfan. Aquatic Toxicology. 2000; 50(4): 331-339.

15. Sanchez-paz A, Garcia-Carreno F, Hernandez-Lopez J, Muhlia-Almazian A, et al. Effect of short-term starvation on hepatopancreasand plasma energy reserves of the Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 2007; 340: 184- 193.

16. Millamena OM, Trino AT. Low-cost feed for Penaeus monodon reared in tanks and under semi-intensive and intensive conditions in brackishwater ponds. Aquaculture. 1997; 154: 69–78.

17. Bhavan PS, Geraldine P. Histopathology of the hepatopancreas and gills of the prawn Macrobrachium malcolmsonii exposed to endosulfan. Aquat. Toxicol. 2000; 50: 331–339.