مطالعه بافت شناسی و میکروسکوپ الکترونی بافت روده قزل آلای رنگین کمان(Oncorhynchusmykiss) به‏وسیله یک مدل آزمایشگاهی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: در مطالعه حاضر، مدلی آزمایشگاهی با هدف مطالعه بافت شناسی و ریخت شناسی روده قزل آلای رنگین کمان طراحی شد. مواد و روش ها: تعداد 20 قطعه ماهی با میانگین وزن 750 گرم و میانگین طول 38 سانتی‏متر تهیه شد و با محلول بنزوکائین بی‏هوش گردیدند. چهل دقیقه پس از بی‏هوشی، ماهیان کشته شده و قلب، سرخرگ‏های روده‏ای شکمی و پشتی توسط کالبد شکافی محوطه شکمی در معرض دید قرار گرفت. برای شروع آزمایش یک قسمت جدا شده از روده ماهی تهیه شد و سپس سرخرگ روده‏ای شکمی یا پشتی به‏وسیله یک کاتتر داخل رگی باریک کانال گذاری و بعد روده به‏‏صورت معلق در یک حمام حاوی محلول رینگر قرار داده شد. مایعات تزریقی گوناگون مانند رینگر، کورتلند، رینگر+ آدرنالین و کورتلند+ آدرنالین مورد آزمایش قرار گرفتند. روده تزریق نشده در محلول رینگر به‏عنوان شاهد در نظر گرفته شد. بعد از انکوبه شدن (60 و 180 دقیقه)، نمونه‏های روده از نظر بافت شناسی و میکروسکوپ الکترونی روبشی ((SEM مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج: نتایج بافت شناسی و میکروسکوپ الکترونی نشان داد که محلول‏های کورتلند و کورتلند+ آدرنالین، پس از گذشت 60 و 180 دقیقه، قادر به حفظ ساختار بافت روده ماهی بوده و تنها ادم خفیف و جدا شدگی ملایمی در اپی‏تلیوم مشاهده شد. نتیجه گیری: به‏وسیله این روش می‏توان بافت روده را برای مدتی به ‏حالت سالم در خارج از بدن ماهی زنده نگه‏داشت و بدین طریق می‏توان با دقت به مطالعه بافت شناسی و ریخت شناسی اپی‏تلیوم روده در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی پرداخت.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

به‏طور یقین در زیست شناسی حیوانات آبزی، بافت پوششی روده ماهی یکی ازپیچیده‏ترین بافت های بدن جهت حمل ونقل مواد است. این بافت پوششی به گونه‏ای طراحی شده است که به‏طور هم‏زمان انتقال الکترولیت‏ها، اسید و باز، مواد آلی و آب را انجام می‏دهد. روده مکان عمده هضم غذاست و ساختار آن، با توجه به تنوع وسیع عادات غذایی و وظایف آن بسیار گوناگون است. قابل مشاهده‏ترین تفاوت میان ماهیان، طول روده (از اسفنگتر پیلور تا مخرج) است. در بعضی از گونه ها، مشخصا در گونه‏های گوشت خوار طول روده ممکن است تنها حدود 20 درصد طول بدن باشد. در این ماهیان روده مستقیما از معده تا مخرج کشیده شده است. ماهیان بر خلاف سایر مهره‏داران فاقد کولون یا روده بزرگ مشخص هستند و وظایفی را که به‏عنوان مشخصه روده کوچک در نظر گرفته می‏شود مانند هضم و جذب در واقع از اسفنگتر پیلور تا مخرج قابل تشخیص است. جهت افزایش ناحیه سطحی لازم برای هضم و جذب مواد غذایی، تغییرات ساختاری در روده ماهیان مشاهده می‏شود. به‏عنوان مثال در آزاد ماهیان بافت مخاطی روده ضخیم شده و همچنین زوائد پیلوریک یا باب‏المعده‏ای در ابتدای روده واقع شده اند (1 و 2).

اگر چه ساختار روده در بین ماهیان بسیار متفاوت است، اما وظایف مربوط به آن‏ها نسبتا در بین گونه‏ها ثابت است. مواد غذایی که وارد روده می شوند با ترشحات حاصل از خود روده و یا سایر اندام ها نظیر کبد، کیسه صفرا و لوزالمعده مخلوط می‏شوند. این ترشحات برای تجزیه مواد غذایی ضروری هستند و شامل آنزیم های گوارشی و سایر اجزایی هستند که فعالیت‏های آنزیم‏ها را با تغییرات در محیط شیمیایی افزایش می دهند. سایر ترشحات اندازه ذرات را کاهش می‏دهند. برای مثال اسید‏های صفراوی حاصل از کیسه صفرا، چربی‏ها را همگن می‏کنند و همچنین نواحی سطحی قابل دسترس برای تاثیر آنزیم‏های لیپاز را بسیار زیاد می‏کنند. فرآیند‏های هضم که در مجرای داخلی روده اتفاق می‏افتد، پلی‏مرهای پیچیده موجود در مواد غذایی (برای مثال، پروتئین‏ها، چربی‏ها و مواد قندی) را کاهش می‏دهد و آن‏ها را به اجزای کوچک‏تر تبدیل می‏کند (1 و 3). مراحل انتهایی هیدرولیز در سطح غشای سلول‏های روده‏ای (آنترسیت‏ها) یا نزدیک به آن‏ها روی می‏دهد و منجر به آزاد شدن واحد‏های ساختمانی پلی‏مرها (برای مثال، مونوساکاریدها، اسیدهای آمینه، اسیدهای چرب، مونو گلیسریدها) می‏شود که در نتیجه توسط سلول‏های روده‏ای جذب می‏شوند (1 و 4 و 5).

وظایف گوارش شامل سه مورد از جمله تحرک، ترشح و جذب است که نیاز به تنظیم دارد. تنظیم این سه وظیفه دستگاه گوارش توسط فعالیت‏های توام پیام‏های دستگاه عصبی و پیام‏های شیمیایی صورت می‏گیرد. پیام‏های دستگاه عصبی ممکن است از دستگاه عصبی مرکزی منشا گیرد و از طریق دستگاه عصبی مستقل (اتونومیک) اعمال شود اما از دستگاه عصبی روده‏ای مرتبط با دستگاه گوارشی نیز ممکن است صورت گیرد (1 و 5).

با توجه با مطالب فوق، مطالعه دستگاه گوارش ماهی و به‏ویژه بافت روده به‏عنوان یکی از پیچیده‏ترین بافت‏های بدن ماهی می‏تواند از نظر بافت شناسی، کالبد شناسی مقایسه‏ای، فیزیولوژی و زیست‏شناسی آبزیان بسیار حائز اهمیت باشد. همچنین مطالعه چگونگی عمل‏کرد بافت روده در هنگام برخورد با عوامل بیماری‏زا و غیر بیماری‏زا مانند پروبیوتیک‏ها و پربیوتیک‏ها، مواد غذایی و یا مواد سمی و داروهای گوناگون از نظر فرآیند عملی آن بسیار مهم است. از طرف دیگر مطالعه مستقیم بر روی هر موجود زنده و همچنین ماهی دارای مشکلاتی است که از آن جمله می‏توان به موارد زیر اشاره نمود: یکی از این موارد تاثیر عوامل ناخواسته داخلی و خارجی در حین انجام آزمایش بر روی بدن ماهی زنده است. مورد دوم وجود قانون حمایت از حیوانات (Animal Welfare)، و البته رعایت آن در هنگام انجام آزمایش است. بدین‏گونه که ماهیان به‏خاطر داشتن گیرنده‏های اپیوئیدی و ساختار مغزی، قدرت درک و احساس درد را داشته و بنابراین مطالعه مستقیم بر روی دستگاه‏های مختلف بدن ماهی دردناک بوده، که این امر بر خلاف قانون حمایت از حیوانات است. مورد دیگر آن است که آزمایش بر روی ماهی زنده نیازمند استفاده از تعداد نسبتا زیاد ماهی است و از آنجا که ماهیان دارای حساسیت و ادراک هستند، کوشش می‏شود که در ابتدا تعداد ماهیان مورد آزمایش را کاهش داده و هم‏چنین در تحقیقات از روش‏های آزمایشگاهی جایگزین (Alternative models) به‏جای ماهی زنده به‏منظور کاهش استرس و درد در این گونه جانوری استفاده نمود (4، 5 و6). بدین منظور، امروزه روش‏ها و مدل‏های آزمایشگاهی دستگاه‏های مختلف بدن جانوران، کاربرد بسیاری در تحقیقات پزشکی، دامپزشکی وعلوم زیستی پیدا کرده است. به‏وسیله این روش‏های آزمایشگاهی می‏توان اندام‏ها، بافت‏ها و یا قسمتی از اندام‏های مختلف بدن موجودات گوناگون را در بیرون بدن حیوان در آزمایشگاه، زنده نگه‏داشت و آزمایش‏های مختلفی را بدون ایجاد ناراحتی در حیوان با رعایت حقوق حیوانات بر روی آن‏ها انجام داد (6 و 7 و 8).

تاکنون، مدل‏های مختلف تزریق به روده (perfusion models) مانند مدل باز(open)، نیمه باز (semi-open)، بسته (closed)، تزریق به یک قسمت روده گره‏خورده (tied loop) درطول عمل جراحی و همچنین تزریق کولورکتال (colorectal perfusion) مورد استفاده محققیق قرار گرفته اند. با این حال مشکلات متعددی در حین استفاده از این روش‏های تزریقی مانند نشت محلول تزریقی، بروز ادم و از دست دادن موکوس و بافت مخاطی ممکن است ایجاد شود. ضمنا در اکثر این روش‏ها بررسی بافت‏شناسی بافت روده متعاقب تزریق که می‏تواند یک شناسه بسیار خوب برای مطالعه خصوصیات طبیعی و بقا سلولی بافت روده باشد، نادیده گرفته شده است (9و10 و11و 12و13و14). با توجه به موارد فوق، در مطالعه حاضر، مدلی آزمایشگاهی با هدف، مطالعه بافت شناسی و ریخت شناسی بافت اپی‏تلیوم روده ماهی قزل آلای رنگین کمان در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی طراحی شد.

مواد و روشها

تعداد 20 قطعه ماهی قزل آلای رنگین کمان با میانگین وزن 750 گرم و میانگین طول 38 سانتی‏متر تهیه شد. ماهی‏ها در تانک‏های جداگانه با ظرفیت تقریبا1000 لیتر که دارای سیستم جریان آب (14 تا 16 درجه سانتی‏گراد) هوا دهی شده نیز بود، به مدت یک هفته قبل از شروع آزمایش، نگهداری شدند. ماهی‏ها تا مدت دو روز قبل از شروع آزمایش، روزانه به‏وسیله خوراک تجاری تغذیه می‏شدند. برای اطمینان از سلامت ماهیان، از پوست، باله و آبشش آن‏ها گسترش مرطوب تهیه گردید و هیچ‏گونه آلودگی انگلی مشاهده نشد. برای بی‏هوش کردن ماهیان از محلول بنزوکائین (اتیل آمینو بنزوات) در اتانول (1/0 گرم در 1 میلی‏لیتر) استفاده شد .ماهیان به‏طور متوسط ظرف مدت 4 تا 5 دقیقه بی‏هوش شدند. سپس به‏صورت داخل صفاقی در فاصله بین باله سینه‏ای و باله شکمی با زاویه 45 درجه،  (IU/kg) 5000 هپارین به آن‏ها تزریق شد. در ادامه ماهیان را در آب تازه و هوادهی شده قرار داده تا به‏هوش آمدند. ماهیان به‏طور متوسط ظرف مدت 5 دقیقه به‏هوش آمده و به‏مدت 40 دقیقه رها شدند تا هپارین وارد دستگاه گردش خون شده و در بدن ماهی پخش شود. سپس ماهی‏ها با استفاده از دوز بالای محلول بنزوکائین کشته و به میز جراحی انتقال داده شدند.

با هدف خارج کردن روده‏ها، محوطه بطنی را از سطح جانبی باز کرده و در عین حال به این نکته باید توجه کرد که به روده آسیب نرسد. سپس با دقت روده را به‏منظور پیدا کردن عروق خونی از محوطه بطنی بیرون کشیده و دو سرخرگ روده‏ای پشتی و شکمی بعد از زوائد باب المعدی نمایان شدند. سپس سرخرگ پشتی یا شکمی هر قطعه روده را با لوله پلی اتلین بلندی (20 سانتی‏متر) که در انتهای آن سر سوزنی (5/1 سانتی‏متر) با درجه 22 قرار داده شده بود، کانال گذاری کرده به‏گونه ای که در حدود 3/0 تا 4/0 سانتی‏متر از طول سر سوزن در داخل سرخرگ قرار گیرد و سپس با نخ ابریشم 0/2 روده محکم گره زده شد تا سر سوزن خارج نشود. قطعات روده متعاقبا برای تزریق محلول‏های جایگزین شونده خون مورد استفاده واقع شدند. مایعات تزریقی گوناگون مانند رینگر، کورتلند، رینگر+ آدرنالین (3/0 میلی‏گرم در لیتر) و کورتلند+ آدرنالین (3/0 میلی‏گرم در لیتر) مورد آزمایش قرار گرفتند (جدول 1).

محلول نمکی کورتلند، محلولی است که برای بافت های ماهیان آب شیرین طراحی شده و مورد استفاده قرار می گیرد (6 و19). قطعه‏ای از روده به‏عنوان قطعه‏ای که در آن هیچ مایعی تزریق نشد در محلول رینگر در دمای 14 تا 16 درجه سانتی‏گراد به‏عنوان کنترل منفی قرار داده شد. هر قطعه روده به‏صورت مجزا داخل حمامی که هوا دهی میشد، به‏صورت معلق

 

 

جدول1: ترکیبات محلول های رینگر و کورتلند مورد استفاده در مطالعه حاضر

Ringer (g/L)

Cortland (g/L)

 

50/8

25/7

Nacl

20/0

38/0

KCl

-

41/0

Na2HPO4

-

24/0

MgSO4

20/0

16/0

CaCl2

01/0

00/1

NaHCO3

-

00/1

Glucose

 

قرار گرفته شد. این حمام شامل محفظه‏ای بود که با محلول رینگر پرشده و به‏وسیله محفظه آبی (آکواریوم) با درجه حرارت 14 تا 16 درجه سانتی‏گراد احاطه می‏شد. سپس از یک ست سرم که تقریبا در ارتفاع 60 سانتی‏متر بالای حمام واقع شده بود، استفاده شد تا مایع جایگزین مورد نظر از طریق سرخرگ به قطعه روده تزریق شود (شکل 1).

 

شکل 1: نمای طرح کلی مدل آزمایشگاهی تزریق به روده ماهی A: کیسه مایع تزریقی، B: پیچ کنترل، C: سیستم سرد کننده، D: حمام رینگر، E: هواده، F: آکواریوم، G: قطعه روده ماهی

 

همان طور که قبلا بیان شد، در این مطالعه از چهار محلول جایگزین شونده خون برای زنده ماندن بافت روده ماهی در حالت آزمایشگاهی (in vitro) استفاده گردید و هر آزمایش 3 بار تکرار شد.

زمان برای هر آزمایش 60 و 180 دقیقه در نظر گرفته شد. پس از اتمام هر آزمایش برای بررسی وضعیت ریخت شناسی و بافت شناسی روده‏ها، از قطعات روده که در آن مایع جایگزین شونده تزریق شده بود و همچنین نمونه‏های کنترل (کنترل مثبت، کنترل منفی)، نمونه‏های بافت شناسی و میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) تهیه شد. جهت تهیه نمونه‏های بافت شناسی، یک قطعه کوچک از روده قطع شده و داخل بافر فرمالین 10 درصد به مدت 24 ساعت قرار داده شد. سپس بعد از آماده سازی بافت از آن‏ها برش‏هایی به عرض 5 میکرومتر تهیه و با رنگ هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ‏آمیزی شد. نمونه‏های تهیه شده با میکروسکوپ نوری مورد بررسی بافت شناختی قرار گرفتند.

برای تهیه نمونه‏های میکروسکوپ الکترونی روبشی، نمونه‏ها تا حد 5 میلی‏متر برش داده شدند زیرا محلول‏های تثبیت کننده و خشک کننده به‏سرعت قادر به نفوذ در نمونه‏های ضخیم‏تر نیستند. سپس نمونه‏ها در هیدروکسیل اتیل پیپرازین اتان سولفونیک اسید (HEPES) بافر (3/7  , pH1/0 مولار) حاوی 5/2 درصد گلوتارآلدهاید ((glutaraldehyde و 2 درصد پارافورمالدهاید (paraformaldehyde) قرار داده شدند و در آب مقطر حاوی 1 درصد اسمیم تتراکسید(osmium tetroxide) ثابت شد. بعد آب نمونه‏ها به‏وسیله الکل و استون گرفته شده و توسط دی اکسید کربن مایع مواد خشک کننده به‏طور کامل از نمونه‏ها جدا شدند. سپس نمونه‏ها با لایه‏ای از کربن و آلومینیوم آغشته شده و با لایه‏ای از پلاتین اندود شدند. بعد هر نمونه در یک قاب استوار قرار داده شده و سپس به‏وسیله میکروسکوپ الکترونی روبشی(JEOL, Tokyo, Japan)   مورد مطالعه قرارگرفتند.

 

نتایج

مطالعه حاضر به‏‏منظور ارزیابی، قابلیت زنده نگه‏داشتن بافت روده در بیرون بدن ماهی، با استفاده از محلول‏های جایگزین شونده خون و مقایسه این محلول‏ها، در دو فاصله زمانی 60 و 180 دقیقه صورت گرفت. نتایج به‏دست آمده از این مطالعه به‏طور مختصر در جدول 2 نشان داده شده است.  قطعاتی از روده که بلافاصله پس از کشتن ماهی، برش خورده و داخل بافر فرمالین قرار گرفتند (کنترل مثبت)، دارای اپی‏تلیوم سالم به‏همراه سلول‏های جامی  (Goblet cells)کاملا مشخص و حاشیه مسواکی سالم و دست نخورده (Intact brush border) بودند (شکل2و 3).

 

 

شکل2:  بافت طبیعی روده (کنترل مثبت)، که در آن اپی‏تلیوم سالم A))، سلول‏های جامی (Goblet cells) (B) و حاشیه مسواکی سالم و دست نخورده  (C) مشخص شده اند. رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین. بزرگنمایی × 160.

 

 

شکل3: بافت طبیعی روده (کنترل مثبت)، که در آن اپی‏تلیوم سالم و دست نخورده (A) و موکوس( B) مشخص شده‏اند و ساختار کلی بافت روده سالم و بدون صدمه است (µm20 = مقیاس)

 

در قطعات روده تزریق نشده، که بعد از 60 دقیقه در داخل بافر فرمالین 10درصد قرار گرفتند (کنترل منفی)، دژنراسیون شدید، جدا شدگی شدید در اپی‏تلیوم روده و نهایتا نکروز بافتی مشاهده گردید. در بعضی نمونه‏ها حالت پیکنوز و کاریورکسی متعاقب نکروز بافتی نیز دیده شد (شکل 4). همچنین در این نمونه‏ها بعد از 180 دقیقه، تقریبا به‏طور کامل ساختار بافت روده از بین رفته بود و نکروز به‏طور وسیع مشاهده گردید ( جدول 2).

 

 

شکل4: بافت روده تزریق نشده بعد از 60 دقیقه (کنترل منفی)، دژنراسیون شدید، جدا شدگی شدید در اپی‏تلیوم روده و در نهایت پیکنوز(A) و کاریورکسی (B) متعاقب نکروز بافتی. رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین. بزرگنمایی × 1000.

 

قطعات روده که محلول رینگر به مدت 60 دقیقه در آن تزریق شده بود، شباهت زیادی با نمونه‏های مربوط به قطعه‏های روده که هیچ‏گونه تزریقی در آن‏ها نشده بود (کنترل منفی) داشتند. در این نمونه‏ها ادم، نکروز و از دست رفتن ساختار روده دیده شد و بعد از گذشت 180 دقیقه، ضایعات بسیار شدید شده و ساختار روده به‏طور کامل از بین رفته بود (شکل5 و جدول 2).

 

شکل 5: بافت روده تزریق شده با رینگر پس از گذشت 180 دقیقه. در این نمونه‏های بافتی، ضایعات شدید در اپی‏تلیوم (A)، نکروز وسیع (B) و از دست رفتن ساختار روده دیده شد (µm20 = مقیاس).

 

قطعات روده که محلول رینگر+ آدرنالین به‏مدت 60 دقیقه در آن تزریق شده بود، شباهت زیادی با نمونه‏های مربوط به قطعه‏های روده که فقط محلول رینگر در آن‏ها تزریق شده بود، داشتند. در این نمونه‏ها، ضایعات شدیدی شامل ادم، دژنراسیون و نکروز مشاهده گردید و بعد از گذشت 180 دقیقه از تزریق محلول رینگر + آدرنالین به بافت روده، ضایعات بافتی شامل دژنراسیون و نکروز تشدید گردید و ساختار روده کاملا از بین رفته بود (جدول 2). در بافت روده که محلول کورتلند به مدت 60 دقیقه در آن تزریق شده بود، ادم ملایم و جدا شدگی خفیف در اپی‏تلیوم روده دیده شد و سلول‏های جامی و حاشیه مسواکی سالم و دست نخورده  به‏خوبی دیده شد. پس از گذشت 180 دقیقه تزریق محلول کورتلند، ادم و جدا شدگی خفیف در اپیتلوم روده دیده شد و در نهایت ساختار روده به خوبی حفظ شده بود (شکل6 و جدول 2).

 

شکل 6: بافت روده تزریق شده با محلول کورتلند به مدت 180 دقیقه. در این نمونه‏های بافتی، ادم و جدا شدگی خفیف در  اپی‏تلیوم روده دیده شد (A) و سلول های جامی  (B)و حاشیه مسواکی سالم و  دست نخورده  (C)به‏خوبی مشخص بود. رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین. بزرگنمایی × 160.

در بافت‏های روده که کورتلند + آدرنالین به مدت 60 دقیقه در آن تزریق شده بود، ادم مشاهده شد ولی ساختار طبیعی روده به خوبی حفظ شده بود (شکل 7).

 

شکل 7: بافت روده تزریق شده با محلول کورتلند+ آدرنالین به‏مدت 60 دقیقه. در این نمونه‏های بافتی، ادم ، جدا شدگی در اپی‏تلیوم روده(A) و سلول‏های جامی  (B)دیده شد و ساختار طبیعی روده به‏خوبی حفظ شد.  رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین. بزرگنمایی × 160.

 

 

پس از گذشت 180 دقیقه از تزریق کورتلند + آدرنالین به‏داخل بافت روده، همچنان ساختار روده حالت طبیعی خود را حفظ کرده بود و ادم خفیفی به همراه اندکی جدا شدگی و همچنین  ت عداد بسیار کمی سلول نکروزه در آن‏ها دیده می‏شد (شکل 8 و جدول 2).

 

شکل8:  بافت روده تزریق شده با محلول کورتلند+ آدرنالین  به‏مدت 180 دقیقه. در این نمونه‏های بافتی اپی‏تلیوم سالم و دست نخورده روده (A ) و موکوس( B) مشخص شده‏اند و فقط تعداد کمی سلول نکروزه دیده شد (C) (µm10  = مقیاس)

 

 


جدول 2: نتایج بدست آمده از مطالعه قابلیت زنده نگه‏داشتن نمونه‏های روده در بین چهار محلول جایگزین شونده خون در دو فاصله زمانی 60 و 180 دقیقه

قطعات روده تزریق شده و تزریق نشده

تعداد نمو نههای بافتی

طول زمان تزریق

ادم

جدا شدگی

نکروز

ساختارروده

با فت طبیعی روده

12

0

-

-

-

طبیعی

محلول کورتلند

12

60

خفیف

خفیف

-

نسبتأ طبیعی

محلول رینگر

12

60

شدید

شدید

شدید

غیر طبیعی

محلول کورتلند+ آدرنالین

12

60

خفیف

خفیف

-

نسبتأ طبیعی

محلول رینگر+ آدرنالین

12

60

شدید

شدید

شدید

غیر طبیعی

قطعه روده تزریق نشده

12

60

شدید

شدید

شدید

غیر طبیعی

محلول کورتلند

12

180

خفیف

خفیف

_

نسبتأ طبیعی

محلول رینگر

12

180

شدید

شدید

شدید

غیر طبیعی

محلول کورتلند+ آدرنالین

12

180

خفیف

خفیف

_

نسبتأ طبیعی

محلول رینگر+ آدرنالین

12

180

شدید

شدید

شدید

غیر طبیعی

قطعه روده تزریق نشده

12

180

شدید

شدید

شدید

غیر طبیعی

 

 


 

بحث

امروزه انواع گوناگون ماهی، به‏عنوان حیوانات آزمایشگاهی توسط پژوهشگران در تحقیقات مختلف زیست شناسی، ژنتیک، فیزیولوژی، پزشکی و دامپزشکی آبزیان استفاده می‏شوند. تاکنون محققین متعددی سعی نمودند که با استفاده از محلول‏های گوناگون جانشین شونده خون، با روش های آزمایشگاهی مدلی مناسب را برای مطالعه بافت های مختلف ماهیان در شرایط آزمایشگاهی و قابل کنترل ارائه دهند (6 و7و10 و12و13و14و15).

خون در مقایسه با محلول‏های نمکی، ویژگی‏های مهم‏تری داشته و قابلیت انتقال اکسیژن بیشتری دارد، ولی استفاده از خون دراین گونه مدل‏های آزمایشگاهی مشکلاتی را به همراه دارد. اولا خون‏گیری در مقادیر زیاد، کاری بسیار سخت و دشوار می باشد. دوما، ویسکوزیته بالای خون ماهی، باعث بسته شدن کانال‏های تزریق شده و جلوگیری از ادامه جریان خون و تزریق آن می کند و سوما، خون مایعی گران می‏باشد، در صورتی که از ویژگی محلول‏های جایگزین شونده، ارزان بودن و سادگی تهیه آن‏ها است (11). همچنین پژوهشگران متعددی نیز درجستجوی یافتن مدل‏های آزمایشگاهی جایگزین برای اندام‏های مختلف داخلی ازجمله روده، کبد، ریه، کلیه و مغز بوده تا بتوانند بافت و اندام‏های مورد نظر را برای مدت زمان کافی در شرایط آزمایشگاهی زنده نگه‏داشته وبرای مطالعه فرآیندهای فیزیولوژیکی، سم شناسی و داروشناسی مورد استفاده قرار دهند. ضمنا، کاربردی بودن روش‏های گوناگون تزریق به روده در مطالعات زیست شناسی، داروشناسی و سم شناسی به اثبات رسیده و در این روش‏ها محققیق قادر به نگه‏داری و حفظ سلامتی بافت روده تا پایان مطالعات خود بوده‏اند (11و12و16 و17و18و19و20و21). در واقع سودمندی این روش‏های جایگزین آزمایشگاهی در به‏دست آوردن اطلاعات دارویی کامل و منظم با توجه به چگونگی روند جذب دارو و سوخت و ساز آن در بدن و عوامل موثر بر این فرآیندها به اثبات رسیده است (11و14).

از طرف دیگر، از این مدل‏های جایگزین آزمایشگاهی جهت بررسی بیماری‏های عفونی نیز استفاده شده است. Decostere و همکاران (6) یک مدل جایگزین آزمایشگاهی برای مطالعه اثر عوامل بیماری زای ماهی بر روی بافت آبشش کپور معمولی را ابداع نمودند. در این مطالعه از محلول‏های گوناگون فیزیولوژیک که به‏نظر می‏آمد، قابلیت زنده نگه داشتن بافت آبشش ماهی را دارا بودند، به جای خون استفاده شد. سپس در تحقیق دیگری از این مدل برای مطالعه چگونگی فرآیند برخورد باکتری فلاوباکتریوم کولومناره با بافت آبشش و همچنین عوامل محیطی موثر در بروز این بیماری استفاده نمودند (22). Nematollahi و همکاران (15) از مدل جایگزین آبشش برای مطالعه واکنش بین باکتری فلاوباکتریوم سایکروفیلوم با آبشش قزل آلای رنگین کمان استفاده نمودند و در این تحقیق مراحل اولیه واکنش بین باکتری و بافت آبشش ماهی به‏روش داخل آزمایشگاهی ارزیابی شد.

اولین مشکل در مطالعه حاضر چگونگی انجام مراحل کانال‏گذاری در رگ‏های روده ماهی بود. به‏طور کلی، کالبد شکافی رگ‏های خونی ماهی قزل آلای رنگین کمان مرده سخت بوده و تشخیص رگ‏های خونی در بافت‏های مرده به‏علت وجود چربی و زوائد باب المعدی (pyloric caeca) متعدد بسیار مشکل است. بدین منظور از انجام تکنیک کانال‏گذاری بر روی چهار عدد از بزرگترین ماهیان مورد مطالعه (1000 گرمی)، تجربه کافی برای انجام این تکنیک بر روی سایر ماهی‏ها به‏دست آمد. مسئله مهم بعدی چگونگی و سرعت تزریق بود. Perry و همکاران (19) در مطالعه‏ای در مورد روش‏های گوناگون تزریق به آبشش ماهی، سرعت تزریق 5/1 میلی‏لیتر در دقیقه به‏ازای هر کیلوگرم پیشنهاد نمودند. ولی در تحقیقات قبلی بیان شده بود که قدرت زیست اندام‏های تحت تزریق به‏سرعت تزریق مورد استفاده بستگی ندارد. به‏همین دلیل، چکاندن و یا تزریق به‏روش قطره‏ای، یک روش مناسب خواهد بود. Decostere و همکاران (7) نیز از همین روش تزریقی در مطالعات خود استفاده نمودند.

در مطالعه حاضر، نمونه‏های روده که پس از مرگ ماهی فورا تثبیت شده بود (کنترل مثبت)، دارای بافت و اپی‏تلیومی سالم به‏همراه سلول‏های جامی و سایر سلول‏های مخاطی روده بودند (شکل2و3). مقایسه اولیه‏‏ای بین قطعات روده‏ای تزریق شده به‏وسیله محلول کورتلند و یا محلول رینگر انجام گرفت. در بافت روده‏ای که به‏مدت 60 دقیقه با محلول رینگر، مورد تزریق قرار گرفته بود، ادم، نکروز و از دست رفتن ساختار روده دیده شد و بعد از گذشت 180 دقیقه تزریق رینگر، ضایعات بسیار شدید شده و ساختار روده به‏طور کامل از بین رفته بود. در حالی که سلول‏های مخاطی و زیر مخاطی اپی‏تلیوم روده تزریق شده با محلول کورتلند به مدت60 و 180 دقیقه، در شرایط ساختاری بهتری نسبت به تزریق با محلول رینگر قرار داشتند. آزمایشات بافت شناسی و میکروسکوپ الکترونی مربوط به قطعات روده‏ای که مورد تزریق محلول کورتلند (زمان تزریق 60 دقیقه ای) قرار گرفته بودند، هیچ‏گونه انحطاط بافتی و نکروز را نشان نداد و نیز پس از گذشت 180 دقیقه تزریق محلول کورتلند ، ادم و جدا‏شدگی خفیف در اپی‏تلیوم روده و نکروز بسیار خفیف دیده شد (شکل6).  در واقع روند انحطاط و از بین رفتن بافت روده، از ایجاد حالت پوسته پوسته و تولید یک دسته سلول مخاطی در اپی‏تلیوم روده تا ایجاد حالت نکروز و مرگ کامل بافت متغیر است. به‏عبارت دیگر، ساختار بافت روده در هنگام تزریق محلول کورتلند بهتر حفظ شده بود و میزان انحطاط سلولی به‏طور معنی داری کمتر دیده شد. در حقیقت، محلول تزریقی رینگر از پیشروی ادم و نیز از دست رفتن ساختار کلی بافت روده، نتوانست جلوگیری کند. در این بررسی، درجه پیشروی ادم از طریق تخمین یا برآورد میزان وسعت فضاهای بین نواحی مخاطی ارزیابی شد (شکل 4و 5 و جدول 2). در این آزمایش، به منظور جلوگیری از پیشروی ادم، آدرنالین به محلول‏های رینگر و کورتلند اضافه شد. اما محلول اضافه شده اثر مثبت بسیار کمی داشت. به‏علاوه، غنی سازی کورتلند، با آدرنالین در جلوگیری از پیشروی ادم تا حدودی زیادی موثر واقع شد ولی در خصوص محلول رینگر و آدرنالین این ترکیب نیز نتوانست از پیشروی ادم، نکروز و از دست رفتن ساختار کلی بافت روده جلوگیری کند (جدول 2).

مقاومت رگی ماهی‏ها به آسانی تحت تاثر شرایط فیزیولوژیکی قرار می‏گیرد و در نتیجه باعث تفاوت در جریان تزریق خواهد شد. در این مطالعه، محلول‏های مورد تزریق توسط یک صافی، پالایش شده بودند تا اجزا  میکروسکوپی درون این محلول‏ها حذف گردد. Rankinو Maetz (23) بیان کردند که استفاده از یک محلول نمکی فیلتر نشده باعث می‏شود که جریان تزریق ماده جانشین شونده به‏خوبی انجام نشود. به‏عبارت دیگر این محلول نمکی نمی‏تواند به‏راحتی در عروق و بافت جریان یابد، بنابراین، آن‏ها استفاده از یک میکرو فیلتر را جهت پالایش محلول فوق پیشنهاد نمودند. از طرف دیگر Smith (24)، بیان نمود که نیازی به استفاده از محلول‏های فیلتر شده در این گونه موارد نیست. ولی به نظر می‏رسد که استفاده از فیلتر در مطالعه حاضر سودمند بود. این موضوع توسط Decostere و همکاران (7) که به‏نتایج خوبی با استفاده از فیلتر (صافی) قهوه رسیده بودند، نیز اثبات شده است. محلول‏های نمکی مختلف برای تزریق روده ای در ماهی‏ها قابل استفاده اند و تفاوت‏های شیمیایی میان این محلول‏های تزریقی از اهمیت کمی برخوردار است ولی به‏طور کلی برخی از عناصر شیمیایی موجود در این محلول‏ها باید بیشتر مورد توجه قرار گیرند (6 و 7و 23). غلظت نسبتا کم کلسیم برای جلوگیری از گرفتگی رگ‏ها و نیز pH محلول مورد تزریق بسیار مهم می باشند. pH بین 6/7 تا1/8 ظاهرا ایده آل بوده و این pH ممکن است با استفاده از سدیم بی‏کربنات یا سدیم فسفات (که به عنوان بافر عمل می‏کنند) تنظیم شود. در این مطالعه، محلول کورتلند بهتر از رینگر در حفظ قدرت زیست بافت روده ای موثر بود. قبل از این، مقادیر زیادی از سدیم بی کربنات و سدیم فسفات به محلول اضافه می‏شد، اما در محلول های اخیر از خاصیت بافری کمتری استفاده می‏نمایند. اگر فشار اسمزی کلوئیدی محلول مورد تزریق کمتر از فشار بافت روده باشد، ممکن است ادم افزایش یابد (6 و 7و 23). Shuttleworth (25) بیان نموده که آدرنالین می‏تواند مقاومت رگ‏های خونی را از طریق گشاد سازی رگ‏ها و افزایش سیالی‏شدن محلول تزریقی کاهش دهد. به‏عبارتی دیگر، آزمایشات قبلی حتی بیان کرده‏اند که درجه بالای ادم با استفاده از آدرنالین می‏تواند ایجاد شود.

آزمایشات بافت شناسی مربوط به قطعات روده‏ای که مورد تزریق نبوده‏اند بیانگر تجزیه و نکروز رو به توسعه بافتی بود. این انحطاط یا تجزیه، از ایجاد حالت پوسته پوسته (ناشی از انبوه سازی و تجمع سلول های دیوارۀ مخاطی) تا ایجاد حالت نکروز و از بین رفتن کامل ساختار سلول‏ها می‏تواند روی دهد. همان طور که قبلا ذکر شده، در بافت‏های روده‏ای که سریعا پس از مرگ ماهی تثبیت شده‏اند (کنترل مثبت)، سلول‏های جامی و بعضی درجات جدا شدگی در اپی‏تلیوم بافت‏های روده‏ای قابل توجه است. این فرآیند، قضاوت در مورد چگونگی بقا و زنده ماندن هر یک از مقاطع بافتی تزریق شده توسط مایعات گوناگون جانشین شونده خون را مشکل خواهد ساخت.

مدل تزریق روده‏ای، مدلی ساده و موثر است که به‏وسیله آن، می‏توان، اولا به مطالعه بافت شناسی روده در خارج از بدن ماهی پرداخت و دوما مراحل اولیه برخورد عوامل بیماری زا (باکتری، ویروس، انگل) را بر روی بافت روده مورد بررسی قرار داد. از طرف دیگر استفاده از این گونه مدل‏های آزمایشگاهی، در مطالعات گوناگونی نظیر فارماکولوژی، سم شناسی، آسیب‏شناسی، فیزیولوژی مناسب به نظر می رسد. همچنین با استفاده از این روش‏ها می‏توان خواص زیان آور عوامل شیمیایی و محیطی مانند سموم گوناگون در آب (نیترات، نیتریت، آمونیاک، H2S) را مورد بررسی قرار داد و اثرات آن ها را بر روی بافت‏های بدن ماهی بررسی نمود (10 و12و13و14و15و 21و 22و 26 و27و 28).

علاوه بر مزایای اشاره شده، مدل آزمایشگاهی تزریق روده‏ای می‏تواند به‏عنوان یک روش جایگزین با ارزش به‏جای استفاده از ماهی زنده در تحقیقات گوناگون مورد استفاده قرار گیرد. این مدل به شکل موفقیت آمیزی سه ویژگی مورد نظرRussell  و  Burch(26) که عبارت از جایگزینی (Replacement) ، کاهش تعداد حیوانات (Reduction) و تسکین درد (Refinement) است را دارا بوده که جنبه‏های اساسی اصول رعایت حقوق حیوانات در مطالعات انجام شده بر روی آن‏ها است (26و 27).

در مدل آزمایشگاهی فوق، از هر ماهی می‏توان 2 الی 3 قطعه روده تهیه نمود ودر نتیجه از تعداد ماهیان مورد آزمایش کاسته می‏شود. علاوه بر این ماهیان، بلافاصله قبل از خروج روده از محوطه بطنی کشته می شوند (Euthanasia) و در نتیجه در معرض عفونت‏های احتمالی نیستند. این موضوع، به‏طور مشخصی میزان درد و استرس ماهی را کاهش می‏دهد و مدل تزریق روده‏ای را روش مناسبی از جهت عدم تحمل درد توسط حیوان می‏سازد.

از بین محلول‏های جایگزین به‏کار برده شده در بررسی حاضر، محلول رینگر نتوانست از بافت روده محافظت کند و ساختمان اصلی بافت روده به‏طور کامل از بین رفت، در حالی که محلول کورتلند توانست ساختمان اصلی روده را در زمان های تزریقی 60 و 180 دقیقه تا حدود زیادی حفظ نماید که بسیار شبیه حالت طبیعی بافتِ روده (کنترل مثبت) بود (جدول2). تفاوت بین محلول رینگر و محلول کورتلند وجود مقدار بالای فسفات سدیم و بی‏کربنات سدیم در محلول کورتلند می‏باشد. این دو ترکیب در pH نهایی مایع تزریقی دخیل است. ضمنا  pHنهایی بر روی قابلیت سالم نگه داشتن بافتِ روده مؤثر است. لازم به ذکر است که میزان فشار اسمزی مایع تزریقی به بافت روده نیز مهم به‏نظر می‏آید. زمانی که فشار اسمزی مایع تزریقی از فشار اسمزی بافت کمتر باشد، ادم رخ می‏دهد. البته قابلیت نفوذ پذیری سلول‏های پایه در این میان دخالت دارند. در نتیجه به‏نظر می‏آید که محلول کورتلند، محلول جایگزین مناسب‏تری از نظر فشار اسمزی در مقایسه با محلول رینگر می‏باشد.

تجمع مایع در بافت بینابینی باعث ضخیم شدن سد آبی- خونی می‏شود، در نتیجه انتقال اکسیژن از آب به خون، کاهش می یابد (4و 5و 12). محلول رینگر+ آدرنالین ضایعات شدیدی در بافت روده ایجاد نمود و بعد از گذشت 180 دقیقه ساختار بافت روده ماهی کاملا از بین رفت. در مقابل، محلول کورتلند+ آدرنالین ضایعات خفیفی در بافت روده ایجاد نمود و ساختار روده به‏خوبی حفظ شده بود (جدول2).

نتیجه گیری

در مطالعه حاضر محلول‏های کورتلند و کورتلند+ آدرنالین محلول‏های جایگزین شونده مناسبی بودند. نتایج بافت شناسی و میکروسکوپ الکترونی نشان داد که محلول‏های کورتلند و کورتلند+ آدرنالین، پس از گذشت 60 و 180 دقیقه، قادر به حفظ ساختار بافت روده ماهی بوده و تنها ادم خفیف و جدا شدگی ملایمی در اپی‏تلیال بافت روده مشاهده شد. همچنین به‏وسیله این روش می‏توان بافت روده ماهی را برای مدتی به حالت سالم در خارج از بدن ماهی زنده نگه داشت و با دقت به مطالعات گوناگون زیست شناسی، داروشناسی، دامپزشکی و غیره در بافت اپی‏تلیال روده این گونه جانوری آبزی در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی پرداخت.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان برخود لازم می‏دانند تا ازکمک‏های ارزشمند آقایان یدا... خسروی، نادر احمدی، آیت ا... حاتم پور دراین پژوهش تشکر و سپاسگزاری نمایند. بدین‏وسیله ازتحصیلات تکمیلی دانشگاه شهرکرد به خاطر حمایت مالی درانجام این تحقیق قدردانی شده و ضمنا، ازدانشگاه گنت نیزدرراستای انجام این پژوهش قدردانی می‏گردد.

  1. Sattari, M. Ichthyology (1), Anatomy and Physiology. 1st Ed. Guilan: Universityof Guilan&NaghshMehr Pub; 2002; (In Persian).
  2. Nematollahi A, Shafiie S. CLASIFICATAION OF FISH with Emphasis on Iranian Fish. Tehran: MabnayeKherad Pub; 2010. (In Persian).
  3. Stoskopf M, Fish Medicine. ART Sciences LLC co; Second Edition. 2011.
  4. Keivany Y. Biology of Fishes. Isfahan University of Technology Pub; 2005. (In Persian).
  5. Bone, Q, Marshall, N.B. Biology of fishes. 2th Ed. Blackie Academic & Professional; 1995.
  6. Decostere A, Turnbull JF, Ducatelle R, Haesebrouck F. Development of a gill perfusion apparatus for studying the interaction of fish pathogens with gill tissue. Altern Lab Anim: ATLA. 2000; 28(1): 53-61.
  7. Decostere A, Henckaerts k, Ducatelle R, Haesebrouck F. An Alternative model to study the association of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss L.) pathogens with the gill Tissue. Lab Anim. 2002; 36: 369-402.
  8. Evans, D.H, Claibone, J.B. The physiology of Fishes: 3th Ed. New York: CRC press; 2006.
  9. Lennernäs H. Human intestinal permeability. J Pharm Sci. 1998; 87(4): 403-410.

10. Handy RD, Musonda MM, Phillips C, Falla SJ. Mechanisms of gastrointestinal copper absorption in the African walking catfish: copper dose effects and a novel anion-dependent pathway in the intestine. J Exp Biol. 2000; 203(15): 2365-2377.

 

11. Curtis CG, Chein B, Bar-Or D, Ramu K. Organ perfusion and mass spectrometry: a timely merger for drug development. Curr Top Med Chem. 2002; 2(1): 77-86.

12. Glover CN, Hogstrand C. In vivo characterization of intestinal zinc uptake in fresh water rainbow trout. J Exp Biol. 2002; 205: 141-150.

13. Kimpe A, Decostere A, Hermans K, Mast J et al. Association of Streptococcus gallolyticusstrains of high and low virulence with the intestinal tract of pigeons. Avian Dis. 2003; 47: 559-565.

14. Mourad FH. Animal and human models for studying of drugs on intestinal fluid transport in vivo. J PharmacolToxicol Methods. 2004; 50(1): 3-12.

15. Nematollahi A, Decostere A, Pasmans F, Ducatelle R, et al. Adhesion of high and low virulence Flavobacteriumpsychrophilum strains to isolated gill arches of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss). Dis Aquat Org. 2003; 55:101-107.

16. Dautrey S, Felice K, Petiet A, Lacour B. Active intestinal elimination of ciprofloxacin in rats: modulation by different substrates. Br J Pharmacol. 1999; 127(7): 1728–1734.

17. Evans DH. Cell signaling and ion transport across the fish gill epithelium. J Exp Zool. 2002; 293(3): 336-347.

18. MacIntyre NR. Respiratory system simulations and modelling. Respir Care. 2004; 49(4): 401-409.

19. Perry S.F, Davie P.S, Daxboeck C, Ellis A.G, et al. Perfusion methods for the study of gill physiology. In: Hoar WS, Randall DJ, (eds). Fish Physiology. London: Academic Press; 1984; 325-55

20. Roden D, Matheson PJ, Carricato ND, Spain DA, et al. Immune-enhancing enteral diet selectively augments ileal blood flow in the rat. J Surg Res. 2002; 106(1): 25-30.

21. Wang J, Nation RL, Evans AM, Cox S. Isolated rat kidney perfused with dextran and bovine serum albumin: A stable model for investigating renal drug handling. J PharmacolToxicol Methods. 2004; 49(2): 105-113.

22. Decostere A, Haesebrouck F, Turnbull JF, Charlier G. Influence of water quality and temperature on adhesion of high and low virulence Flavobacteriumcolumnarestrains to isolated gill arches. 1998 J Fish Dis. 22(1): 1-11.

24. Smith, DG. Sites of cholinergic vasoconstriction in trout gills. Am J Physiol. 1977; 233(5): 222-229.

26. Russell WMS, Burch RL. The Principles of Humane Experimental Technique.London: Methuen & Co. Ltd. 1959; 26(3): 21

27. Nematollahi A, Decostere A, Pasmans F, Ducatelle R, et al.  Development of a gut perfusion model as an alternative to the use of live fish. Lab Animal. 2005; 39: 194-199.

Harper GM, Monfort M, Saoud IP, Emery M, et al. An ex vivo approach to studying the interactions of Pediococcus acidilactici and Vibrio (Listonella) anguillarum in the anterior intestine of rainbow trout Oncorhynchus mykiss. J Aquac Res Development S1:004. Doi. 2011; 10: 4172/2155-9546.S1-004.