بررسی اثر هورمون رشد انسانی نوترکیب و جمسیتابین بر تکثیر و روند چرخه سلولی سلول‫های طبیعی فیبروبلاست شش

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه صنعتی مالک اشتر، دانشکده علوم پایه، گروه بیوشیمی، تهران، ایران.

2 - دانشگاه صنعتی مالک اشتر، دانشکده علوم پایه، گروه بیوشیمی، تهران، ایران.

چکیده

هدف: در این بررسی اثر هورمون رشد انسانی نوترکیب و جمسیتابین به‏تنهایی و در ترکیب با یکدیگر بر سلول‫های فیبروبلاست شش انسانی مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها: هورمون رشد انسانی در مقادیر 10 تا 400 نانوگرم بر میلی‫لیتر و داروی جمسیتابین نیز در غلظت‏های 1 تا 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر با سلول‏های فیبروبلاست شش انسانی تیمار و بررسی‏ها با آزمون MTT، فلوسیتومتری به‏واسطه رنگ‫آمیزی با پروپیدیوم یدید و  روش خراش سلولی انجام شد.
نتایج: مطالعات و آنالیزهای چرخه سلولی و MTT نشان دهنده تاثیر هورمون رشد در پیشبرد چرخه سلولی و خروج از فاز  G1و تکثیر سلول‫ها نسبت به نمونه کنترل، و اثرات مهاری روند چرخه سلولی و رشد توسط جمسیتابین بود. نتایج حاصل از آزمون خراش سلولی نشان داد که هورمون رشد در غلظت‏های موثر خود سبب مهاجرت سلولی افزایش یافته نسبت به کنترل شد درحالی‫که داروی جمسیتابین مهاجرت سلولی را  نسبت به کنترل کاهش داد.
نتیجه گیری: با مصرف هم‫زمان هورمون رشد در دوره شیمی درمانی با جمسیتابین به‏نظر می‏رسد می‏توان روند مرگ و میر سلول‫های طبیعی را کاهش داد. زیرا سلول‫های طبیعی نسبت به سلول‫های سرطانی نسبت به هورمون رشد حساس‏تر می‏باشند.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

جمسیتابین (Gemcitabin) از جمله داروهای ضدسرطان می‏باشد که در درمان سرطان ریه سلول‫های غیر کوچک، کارسینومای پانکراس، تومورهای جامد، سرطان خون، سرطان مثانه، سرطانه سینه و سرطان تخمدان استفاده می‏شود (1،2). این دارو در مقادیر کم پس از فعال شدن توسط کیناز، با مهار آنزیم DNA پلیمراز سبب مهار سنتز DNA، (3) توقف چنگال همانندسازی در فاز S و نگه‫داری سلول‫ها در فاز G1 می‏‫شود (4)، در حالی‏که در مقادیر بالا سبب توقف تمامی فازهای چرخه سلولی و در نهایت آپوپتوزیس می‫شود (5).

مطالعات مختلف تائید کننده اثرات مهاری این دارو در رشد و تکثیر سلول‫ها می‏باشند. به‏عنوان مثال اثر جمسیتابین به‏تنهایی و در ترکیب با پوشش لیپوزومی بر سلول‫های تیروئید آناپلاستیک انسانی نشان‏دهنده اثر سمیت این دارو پس از 48 و 72 ساعت انکوباسیون بود. نرخ مرگ و میر سلول‫ها پس از 72 ساعت، 6/4 و 9/7 برابر نسبت به نمونه‫های کنترل به‏ترتیب برای دارو و داروی لیپوزومی گزارش شد (6). در بررسی دیگر اثر جمسیتابین به‏تنهایی و در ترکیب با سورافنیب (یک مولتی کیناز مهاری) بر سلول های سرطانی NSCLC (PC-9 و A5490) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج MTT نشان دهنده عملکرد ضد تکثیری بر هر دو رده‏ی سلولی وابسته به غلظت سورافنیب و جمسیتابین بود. از طرفی حساسیت هر دو رده‫ی سلولی به سورافنیب و جمسیتابین یکسان ارزیابی شد. همین سلول‫ها پس از 72 ساعت تیمار با جمسیتابین و سورافنیب جهت بررسی تغییرات چرخه سلولی با فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفتند. سورافنیب سبب افزایش سلول‫ها در فاز G0/G1 شد در حالی‏که سلول‏های در معرض جمسیتابین در فاز S تجمع یافتند (8،7).

هورمون رشد انسانی یک پروتئین با اثرات پیشبرنده رشد است که اثرات خود را به‏صورت مستقیم از طریق گیرنده‏ها در بافت‏ها و یا از طریق تحریک ترشح سایر عوامل رشد می‏گذارد. هورمون رشد از هیپوفیز قدامی ترشح شده و  سپس وارد جریان خون می‫شود و به گیرنده‫های سطح سلول متصل و سبب فعال شدن مسیر GHR/JAK2 می‫شود. این هورمون دارای عملکردهای مختلفی از جمله ایجاد تعادل مثبت نیتروژن و سنتز پروتئین در سلول های عضلانی، بازجذب اسید آمینه به عضله‏ی اسکلتی و تنطیم رشد طولی استخوان‏ها می‏باشد (9،10).

اثرات بهبود دهنده هورمون رشد نیز همواره مورد علاقه محققان بوده و تحقیقات مختلفی در رابطه با اثرات این هورمون بر تکثیر سلول‫ها به‫عنوان عامل حفاظت کننده و کاهش دهنده اثرات عوامل تخریب‏گر صورت گرفته است. دانشمندان در دانشگاه UQ به ‏بررسی اثرات هورمون رشد بر رده سلولی BaFB2B2  بر پایه‏ی تکثیر گیرنده‏های سطح هورمون رشد پرداختند. نتایج نشان داد، این هورمون تاثیرات به‏سزایی در افزایش روند تکثیر دارد و در رده سلولی ذکر شده، حدود 6000 گیرنده در سطح هر سلول برای هورمون رشد وجود دارد (11). در مطالعه‏ای دیگر در رده سلولی Ba/F3 نیز مشخص شد که هورمون رشد انسانی درغلظت‏های 1 و 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر سبب تحریک تکثیر سلولی، بهبود زخم و افزایش مهاجرت سلولی می‫شود (12).

هورمون رشد منجر به پیشبرد چرخه‫ی سلولی و کاهش تعداد سلول‏های مانا در فازهای G0/G1 می‏شود. همچنین مطالعات بسیاری نشان داده است که میزان گیرنده‏های این هورمون در سطح سلول‏های سالم حدود 5 برابر سلول‏های سرطانی می‫باشد. از سوی دیگر مشخص شده است که برخی از سلول‏های سرطانی در فاز G0 هستند و این نوع عمدتا سبب متاستاز شدیدی و تشدید بیماری می‏شوند، در حالی‏که کمتر تحت تاثیر اثرات مهاری داروهای شیمی درمانی قرار می‏گیرند. به‏همین دلیل برخی پیشنهاد می‏کنند که به‏دلیل اثرات تحریکی هورمون رشد جهت پیشبرد چرخه سلولی و تاثیرات اثبات شده آن در خروج سلول‫ها از فاز G0، بهتر است جهت افزایش اثر بخشی داروهای شیمی درمانی از هورمون رشد به‏عنوان داروی تکمیلی در روند درمان بیماران استفاده شد (13،14).

هدف از این مطالعه بررسی اثر تکثیری و چرخه سلولی هورمون رشد انسانی و جمسیتابین بر سلول‏های فیبروبلاستی به‏تنهایی و در ترکیب با یکدیگر می باشد. این قبیل مطالعات کمک شایانی در زمینه بهبود اثرات جانبی داروهای ضدسرطانی در بیماران می‏نماید.

 

مواد و روش‌ها

آزمون MTTو تیمار سلو‫‫‫لها با هورمون رشد و جمسیتابین: روش MTT یک روش رنگ سنجی است که بر اساس احیا و شکسته شدن کریستال‏های زرد رنگ تترازولیوم توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز و تشکیل کریستال‏های آبی رنگ نامحلول انجام می‏شود. در طی زمان انکوباسیون MTT، توسط سیستم سوکسینات دهیدروژناز سلول‏ها که یکی از آنزیم‏های چرخه‏ی تنفسی میتوکندری‏هاست احیا می‏شود. احیا و شکسته شدن این حلقه موجب تولید کریستال‏های آبی رنگ فورمازان می‏شود که در زیر میکروسکوپ به‏راحتی قابل تشخیص هستند. میزان رنگ تولید شده در 492 نانومتر با تعداد سلول‏های زنده رابطه‏ی مستقیم دارد.

کشت سلول‫های فیبروبلاست در محیط کشت DMEM  (Gibco)  با FBS 10درصد در انکوباتور با CO2، 5 درصد و رطوبت 90 درصد و دمای 37 درجه سانتی‫گراد انجام شد.

میزان LC50 داروی جمسیتابین ( (Ireland, Actavis در مطالعات اولیه به‫طور تقریب 150میکروگرم بر میلی‫لیتر تعیین شد.  جهت انجام آزمون MTT ابتدا سلول‏ها (100000 سلول) در پلیت‏های 96 خانه‏ای کشت شدند و پس از چسبیدن سلول‫ها، محیط کشت با محیط جدید حاوی هورمون رشد (Genotropin®) )با غلظت‏های مختلف (10، 20، 40، 60، 80، 120، 160، 240، 300، 360 و 400 نانوگرم بر میلی‫لیتر) جایگزین و تیمار به‏مدت 24 و 48 ساعت انجام شد. آزمایش‫های جمسیتابین نیز به‏همین ترتیب با غلظت‏های  (1، 5، 10، 50، 100 نانوگرم بر میلی‫لیتر) صورت پذیرفت. در آزمایش‫ها که هر دو عامل تیمار شدند. غلظت های مرتبط با جمسیتابین مطابق موارد ذکر شده در فوق در سه سری افزوده شد. دسته اول به‏عنوان کنترل و دسته دوم با غلظت 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر و سوم با غلظت 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر هورمون رشد انسانی تیمار شدند  )انتخاب دو غلظت از هورمون رشد انسانی پس از انجام آزمایش‫های اولیه بر هورمون رشد به‏تنهایی و تعیین غلظت مناسب صورت گرفت تا از پیچیدگی آزمایش‫ها جلوگیری شود). پس از گذشت زمان‏های مورد نظر، به‏هر چاهک 10 میکرولیتر محلولMTT  (غلظتmg/ml  5) (Sigma, USA) اضافه شد. پس از 4 ساعت محیط روئی خارج و با DMSO  (Merck,USA) جایگزین شد. در نهایت جذب نمونه‏ها در 492 نانومتر در دستگاه الایزا ریدرStat Fax-2100 model) Spain ) قرائت شد (15). توان زیستی سلول‏های تیمار شده با دارو (در هر غلظت از دارو) به‏شکل نسبت درصد جذب نوری فورمازان تولیدی در نمونه در مقایسه با میزان جذب نوری فورمازان تولیدی در کنترل (سلول‫های بدون تیمار دارویی) تعیین و در یک منحنی دوبعدی ترسیم شد. نمونه کنترل شامل سلول‏ها به‏همراه محیط کشت بود.

آنالیز نمونه‏ها با استفاده از فلوسایتومتری: جهت آنالیز سلول‏ها با روش فلوسایتومتری لازم است سلول‏ها کاملا به‏صورت تک تک باشند. به ‏این ‏معنی که هیچکدام به‏هم نچسبیده باشند. سلول‏های فیبروبلاست از دید کشت سلولی، در رده سلول‏های چسبان قرار می‏گیرند. برای به‏کارگیری روش فلوسایتومتری در این گونه سلول‏ها، نخست می‏بایست آن‫ها را از کف فلاسک دارای محیط کشت جدا کرد و آنگاه با پیپتاژ شدید با کمترین آسیب به سلول‏ها آن‫ها را به‏صورت تک در آورد. سلول‫های رنگ‫آمیزی شده برای آنالیز به‏درون کووت‫های ویژهای ریخته شده، درون دستگاه جای می‏گیرند.

پروپیدیوم یداید رنگدانه‫ای می‏باشد که قادر به برهم کنش با DNA سلول‫های مرده می‫باشد و از این خاصیت می‏توان با استفاده از فلوسایتومتری به درصد سلول‫های مرده پی برد. چرا که این DNA سلول‫ها با پرویدیوم یداید برهم کنش داده و از خود نور فلورسانس تابش می‏کنند. در این تحقیق، با به‏کارگیری PI و دستگاه فلوسایتومتر محتوای DNA سلولی سنجیده شد و از روی این محتوا و با توجه به نمودار به‫دست آمده توسط نرم افزار مخصوص درصد سلول‫ها در فازهای مختلف چرخه سلولی حاصل شد (16). ابتدا در هر چاهک از پلیت‫های شش تائی 5/0 میلیون سلول به‏مدت 48 ساعت در محیط کشت، کشت داده شد. سپس محیط پیشین با محیط جدید حاوی FBS 1 درصد جایگزین شد و غلظت‫های موثر هورمون رشد و داروی جمسیتابین به‏هر چاهک اضافه شد و تیمار به‏مدت 48 ساعت ادامه یافت. در نمونه‏های کنترل هورمون رشد و جمسیتابین افزوده نشد. غلظت‏های تیمار به‏شرح زیر بود:

هورمون رشد 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 150میکروگرم بر میلی‫لیتر،  هورمون رشد 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر+ جمسیتابین 150میکروگرم بر میلی‫لیتر، هورمون رشد 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 400 میکروگرم بر میلی‫لیتر، هورمون رشد 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 400 میکروگرم بر میلی‫لیتر.

سلول‏ها پس از سپری شدن مدت زمان لازم تریپسینه شدند. به رسوب سلولی 500 میکرولیتر PBS افزوده شد و

به سوسپانسیون حاصل اتانول 70 درصد اضافه شد.

سلول‏ها،  سپس با رنگ پروپیدیوم یدید (PI) رنگ آمیزی و با دستگاه فلوسایتومتری (بکتون دیکینـسون(Dickinson-Becton) )، آنالیز شدند وDNA  سلولی سنجیده شـد. از سنجش DNA می‏توان تعداد سلولها در مراحل گوناگون را به‏دست آورد که معیاری جهت پی بـردن به‏طول چرخه سلولی و تغییرات آن می‏باشد. داده های حاصل ازدستگاه با نرم افزار Flowj آنالیز می‏شدند.

آزمون خراش:در هر چاهک از پلیت های شش تائی 5/0 میلیون سلول به‏همراه محیط کشت و FBS 10 درصد اضافه شد. پس از سپری شدن 24 ساعت با سر اسکالپر به‏صورت قطری خراشی در تمامی چاهک‏ها ایجاد شد. سپس سلول‏های با بافر PBS شستشو داده شدند و سلول‏ها با محیط (حاوی FBS 1 درصد) حاوی غلظت‏های 80 و 160 میکروگرم بر میلی‫لیتر هورمون رشد و 200 میکروگرم بر میلی‫لیتر دارو تیمار شدند و یک خانه به‏عنوان کنترل بدون دارو در نظر گرفته شد. سپس  هر از نمونه‏ها در زمان صفر و پس از تیمار 24 ساعت با دوربین عکس‫برداری شد. به‏طور کلی میزان بسته شدن خراش به‏صورت کیفی با پوشاندن محل خراش توسط سلول‏ها بررسی شد (17).

 

آنالیز آماری

 تمامی آزمایشات با سه بار تکرار بـه انجـام رسـید و داده‏های گزارش شده، نشان دهنده میانگین این سه با افـزایش و کـاهش انحراف معیار است. جهت محاسبه میانگین، انحراف معیار و ضریب همبستگی از نـرم افـزار SPSS  استفاده شد که داده‫های با مقادیر احتمال 05/0>p معنی‏دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

تاثیر هورمون رشد انسانی بر روند تکثیر سلولها با استفاده از روش رنگ سنجی MTT

در این پژوهش نیز به‏منظور انجام این روش مطابق آنچه در مواد و روش‫ها ذکر شد سلول‏ها با هورمون رشد انسانی در غلظت‏های ذکر شده تیمار شدند و میزان بقا سلول‏ها اندازه‫گیری شد. نتایج در شکل 1 نشان داده شده است. همان‏گونه که در شکل 1 دیده می‏شود به‏طور کلی می‏توان گفت با افزایش غلظت هورمون رشد تا مقادیر   400 نانو‫گرم بر میلی‏لیتر رشد سلول‏ها نیز افزایش می‏یابد. در زمان 24 ساعت این هورمون تا  غلظت 60 نانو گرم بر میلی‏لیتر تاثیر چندانی بر میزان تکثیر سلول‫ها ندارد (05/0<p). اما پس از این میزان تکثیر سلولی متناسب با غلظت هورمون دیده می‏شود (01/0>p). مقادیر کم هورمون (کمتر از50 نانو گرم بر میلی‏لیتر) در زمان 48 ساعت تاثیر خود بر تکثیر سلولی را القا می‏نمایند. با توجه به‏این‫که میزان FBS محیط 1 درصد بود، بنابراین می‏توان گفت تنها عامل تحریک کننده تکثیر هورمون رشد می‏باشد. با توجه به‏نتایج می‏توان گفت غلظت‫های تاثیر گذار از 80 تا 400 نانو گرم بر میلی‏لیتر می‏باشد و بهترین زمان تاثیر برای این شرایط 48 ساعت می‏باشد. آزمایش‫ها تا 72 ساعت و 96 ساعت نیز انجام شد که رشد سلول‫ها در این زمان‫ها به‏علت کمبود محیط و فضا جهت تکثیر متوقف شده بود. بنابراین سایر آزمایشات در زمان 48 ساعت و در دو غلظت 80 و 160 نانو‫گرم بر میلی‏لیتر صورت گرفت.

شکل 1:تاثیر هورمون رشد انسانی نوترکیب با استفاده از آزمون MTT برسلول­های فیبروبلاست در زمان­های مختلف.

 

بررسی تاثیر داروی جمسیتابین و هورمون رشد با استفاده از روش MTT

با توجه به مشخص شدن قدرت تکثیر هورمون رشد انسانی در غلظت‫های بالاتر از 80 نانو گرم بر میلی‏لیتر، در مرحله بعد تصمیم بر آن شد که از داروی جمسیتابین به‏صورت همزمان با هورمون رشد نیز استفاده شد. هدف از انجام این آزمایش این بود که مشخص گردد استفاده از هورمون رشد انسانی تا چه میزان می‫تواند تاثیرات سو، جانبی داروهای شیمی درمانی را کاهش دهد. بدین منظور ابتدا سلول‫های فیبروبلاست با غلظت‏های مختلف جمسیتابین تیمار شد تا تاثیر دارو در زمینه مهار رشد سلول‫های طبیعی اثبات شد. نتایج در شکل 2 نشان داده شده است. همان‫طور که در این شکل دیده می شود با افزایش غلظت جمسیتابین میزان رشد سلول‫ها کاهش می‫یابد و افزایش غلظت این دارو تا حد زیادی سبب مرگ سلول‫ها نیز می‫شود. با افزایش غلظت دارو از200 نانوگرم بر میلی‫لیتر تاثیرات کشندگی چندان افزایش معنی‫داری نداشته اند (05/0<p).

در مرحله بعد تاثیر هورمون رشد انسانی در غلظت های  160 نانوگرم بر میلی‫لیتر  و 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر در کشت همزمان با جمسیتابین با استفاده از روش MTT مورد بررسی قرار گرفت. همانگونه که در شکل 2 دیده می‫شود هورمون رشد توانسته است میزان مرگ و میر ناشی از داروی جمسیتابین را کاهش دهد. در این زمینه غلظت 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر هورمون رشد تاثیرات شاخص‫تری اعمال نموده است.

 

 

شکل 2: تاثیر داروی جمسیتابین به‫تنهایی و در حضور هورمون رشد با غلظت­های 160 و 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر با استفاده از آزمون MTT برسلول­های فیبروبلاست در غلظت­های مختلف.

آزمون خراش

در این بخش جهت انجام آزمون خراش از غلظت‫های 80 و 160 نانوگرم بر میلی‏لیتر هورمون رشد و دارو در غلظت 200 نانوگرم بر میلی‏لیتر به‏عنوان غلظت میانی استفاده شد. یک نمونه نیز تحت تاثیر دارو به‏تنهایی قرار گرفت. سپس از هر نمونه در محل خراش در لحظه صفر و 24 ساعت بعد از خراش با دوربین متصل به میکروسکوپ عکس‫برداری شد. مهاجرت سلولی به‏درون فضای خراش در ساعت‏های مذکور با کاهش فاصله میان دو لبه تعیین شد. به‏طور کلی میزان بسته شدن خراش به صورت کیفی مشاهده گردید. نتایج در شکل 3 نشان داده شده است.

 

A

B

C

D

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 3:  آزمون خراش سلولی A) نمونه کنترل B) نمونه جمسیتابین با غلظت 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر C) نمونه جمسیتابین با غلظت 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر میکروگرم بر میلی‏لیتر و هورمون رشد با غلظت80 نانوگرم بر میلی‏لیتر  D) نمونه جمسیتابین با غلظت 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر و هورمون رشد با غلظت 160 نانوگرم بر میلی‏لیتر

 

 

نتایج نشان دهنده‏ی آن است که پس از 24 ساعت سلول‫ها که در پاساژ دوم بودند در هر دو غلظت هورمون رشد مهاجرت را نشان دادند. اما سلول‫ها در معرض جمسیتابین مهاجرتی نداشته‏اند. میزان مهاجرت سلولی با افزایش غلظت هورمون رشد افزایش یافته بود.

مطالعات چرخه سلولی با استفاده از فلوسایتومتری

برای نمایش شمار سلول‏ها در مراحل گوناگون چرخه سلولی باید هیستوگرام پروفایل DNA نسبت به شمار سلول‫هـای رنگ آمیزی شده با پروپیدیوم یدید را رسم نمود (شکل4). در این نمودار دو قله وجود دارد. از آنجاکه بیشتر سلول‏ها در مراحل G0 و G1 هستند پس قله

 

نخست که بیشینه‏ای را در شـمار سلول‏ها نشان می‏دهد، نشان‏دهنده این مرحله از چرخه سلولی است.

 

شکل 4:هیستوگرام طبیعی DNA که سلول‫ها در اتانول فیکس شده‫اند و با پروپیدیوم یدید رنگ آمیزی شده‫اند.

قله دوم که کوتاه‫تر از قله پیشین است، سلول‏هایی را کـه در مراحل G2 و M هستند نمایش می‏دهد. بخشی از نمودار که در میان این دو جـای مـی‏گیـرد نـشان دهنـده مرحلـه S می‏باشد (18).

نتایج حاصل از نمودارهای هیستوگرامی فلوسایتومتری در جدول 1 آورده شده است. مطابق نتایج موجود در جدول، هورمون رشد در غلظت‏های 80 نانوگرم بر میلی‏لیتر و 160 نانوگرم بر میلی‏لیتر بر سلول‫های فیبرو‫بلاست‏ به‏ترتیب باعث کاهش حدودا 23/3 و 54/2 درصدی این سلول‫ها در فازG1  نسبت به کنترل شد (05/0>p). اعمال هورمون رشد در همین غلظت‏ها بر سلول‏‏های فیبرو‫بلاست به‫ترتیب باعث افزایش 97/4 و 14/2 درصدی سلول‏ها در فاز S می‏شد (05/0>p). این تغییرات در غلظت 160 نانوگرم بر میلی‏لیتر هورمون رشد نسبت به غلظت 80 نانوگرم بر میلی‏لیتر بیشتر می‏باشد. نتایج مربوط به فازG2  در غلظت 160 نانوگرم بر میلی‏لیتر هورمون رشد نشان‏دهنده افزایش 03/2 درصدی این سلول‫ها نسبت به کنترل می‏باشد (05/0>p).

اما در غلظت 80 نانوگرم بر میلی‏لیتر اختلاف معنی‫داری نسبت به کنترل حاصل نشد. داروی جمسیتابین نیز در غلظت‏های 150، 200 و 400 میکروگرم بر میلی‏لیتر اعمال شد، نتایج فلوسایتومتری در فاز G1 تغییرات شدیدی را در حضور دارو نسبت به نمونه کنترل نشان داد و سبب افزایش تعداد سلول‏ها در فاز G1 به‏صورت وابسته به دوز در این فاز نسبت به نمونه کنترل شد (05/0>p). از طرفی نتایج مربوط به فازS  در همین غلظت‏ها نشان دهنده کاهش قابل ملاحظه سلول‏ها در فاز S نسبت به کنترل می‏باشد (05/0>p). نتایج مربوط به فاز G2 در غلظت 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر داروی جمسیتابین اختلاف معنی‏داری با کنترل نشان نداد، اما در غلظت‏های 200 و 400 میکروگرم بر میلی‏لیتر کاهش معنی‏داری را نشان داد (05/0>p).

 

 

جدول 1: درصد سلول­های فیبروبلاست در مراحـل گونـاگون چرخـه سلولی پس از تیمـار بـا جمسیتابین و هورمون رشد انسانی.

G2/M

S

G0/G1

نمونه

05/7

69/1

28/91

کنترل

51/8

42/3

07/88

هورمون رشد ng/ml 80

09/5

16/6

75/88

هورمون رشد ng/ml 160

25/8

04/26

72/65

جمسیتابین μg/ml 150

93/4

21/23

87/71

جمسیتابین μg/ml 200

8/6

42/19

78/73

جمسیتابین μg/ml 400

06/10

37/13

57/76

هورمون رشد ng/ml 80 + جمسیتابین μg/ml 150

37/13

45/11

18/75

هورمون رشد ng/ml 160 + جمسیتابین μg/ml 150

24/5

14/16

62/78

هورمون رشد ng/ml 80 + جمسیتابین μg/ml 400

94/9

66/16

4/73

هورمون رشد ng/ml 160 + جمسیتابین μg/ml 400

 

 

با اعمال هورمون رشد و داروی جمسیتابین با چهار غلظت متفاوت شامل هورمون رشد 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر+ جمسیتابین 150 میکروگرم بر میلی‫لیتر،  هورمون رشد 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 150 میکروگرم بر میلی‫لیتر، هورمون رشد 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 400 میکروگرم بر میلی‫لیتر، هورمون رشد 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر+ جمسیتابین 400 میکروگرم بر میلی‫لیتر به‏ترتیب منجر به‏کاهش 63/15، 67/14، 60/12، 77/17 میزان سلول‫ها در فاز G1 نسبت به نمونه کنترل شد (05/0>p).

از طرفی نتایج مربوط به فازS  در غلظت های 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 150 میکروگرم بر میلی‫لیتر ،  هورمون رشد 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر+ جمسیتابین 150 میکروگرم بر میلی‫لیتر، هورمون رشد 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر+ جمسیتابین 400 میکروگرم بر میلی‫لیتر ، هورمون رشد 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر+ جمسیتابین 400 میکروگرم بر میلی‏لیتر نشان دهنده به‏ترتیب  افزایش 32/12، 21/10 ،91/14، 20/22 درصدی این سلول‏ها نسبت به نمونه کنترل می‏باشد (05/0>p).

نتایج مربوط به‏فازG2  در غلظت‫های 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر+ جمسیتابین 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر ،  هورمون رشد 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر ، هورمون رشد 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 400 میکروگرم بر میلی‏لیتر ترکیب از داروی جمسیتابین و هورمون رشد منجر به کاهش 99/2، 10/6، 41/1 درصدی سلول‏ها نسبت به کنترل شد.

اما در غلظت هورمون رشد 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 400 میکروگرم بر میلی‫لیتر  منجر به‏ افزایش 23/1 درصدی این سلول‏ها شد (05/0>p).

 

بحث

هورمون رشد، با توجه به ترشح در خون و عملکردهای متعدد زیستی، اثرات مستقیم و غیر مستقیمی بر رشد می‏گذارد و به‫عنوان موثرترین هورمون  بدن مورد توجه محققین، پزشکان و حتی ورزشکاران قرار گرفته است. همچنین با توجه به اهمیت دارویی این هورمون در درمان بسیاری از نارسایی‌های ناشی از کمبود آن، تولید این هورمون به‌صورت نوترکیب در داخل و خارج کشور مورد توجه بسیار است. در این پژوهش تلاش جهت ارزیابی فعالیت زیستی هورمون رشد بر اساس کشت سلول انجام شد. ابتدا آزمون MTT انجام شد. نتایج گویای اثر بخشی قطعی هورمون رشد در زمان‏های بیشتر از 24 ساعت است. در مطالعه‫های انجام شده (12،13)، رشد و تکثیر سلول‫های فیبروبلاست تحت اثر هورمون رشد با آزمون MTT انجام شد و در غلظت‫های 100، 400 و 700 نانوگرم بر میلی‏لیتر رشد سلول‏های فیبروبلاست در مقایسه با نمونه کنترل دیده شد.

از آنجایی‏که هورمون رشد سبب افزایش تکثیر سلول‏های طبیعی و هم سلول‏های سرطانی می‏شود، برخی از دانشمندان بر این باورند که این هورمون در غلظت‏های بالا سبب افزایش خطر سرطان خون و تومورهای جامد شود. برخی دیگر نیز در افزایش خطر ایجاد سرطان روده در غلظت‏های بالای هورمون رشد تاکید کردند. هاورکمپ و همکارانش (19) اثر هورمون رشد را در افزایش سلول‏های آنیپلوئیدی در سندرم ترنر عنوان کردند. با وجود مطالعاتی که بر عملکرد افزاینده‏ی تومور توسط هورمون رشد انجام شده است، هریسون (20) بیان کرد که هورمون رشد نمی‏تواند سبب تسریع کارسینومای پانکراس شود. همچنین تک و همکارانش (21) بیان کردند که درمان با هورمون رشد در دوره‏ی کوتاه سبب بهبود سریع‏تر عملکرد سیستم ایمنی، افزایش سلول‏های کشنده طبیعی و مهار بازگشت تومور می شود. در مطالعه‏ی دیگری در شرایط آزمایشگاهی و هم شرایط داخل بدن شواهد حاکی از عدم تاثیر هورمون رشد بر رشد تومور بود. بارتلت پیشنهاد داد که هورمون رشد مهارکننده‏ی رشد تومور در حیوانات با کمبود پروتئین است. البته مطالعات دیگری هم در جهت عدم رشد تومور توسط هورمون رشد وجود دارد (24-22).

جمسیتابین اثرات سمیت خود بر DNA که عمدتا مهار تشکیل DNA است، از طریق جمسیتابین سه فسفات و با اتصال به رشته‏های DNA انجام می‏دهد. همچنین جمسیتابین دی فسفات به‏شدت مهار کننده‏ی ریبونوکلئوتید ردوکتاز است، که منجر به کاهش رقابت میان دئوکسی ریبونوکلئوتیدهای لازم جهت تشکیل DNA می شود. (22).

در مرحله‏ی بعد اثر داروی ضد سرطان جمسیتابین بر سلول‏های فیبروبلاست پوستی با استفاده از تست MTT انجام شد. رشد سلول ها نسبت به نمونه‏ی کنترل کمتر بود. در مطالعه‏ایی که پیش تر بر سلول‏های سرطانی تیروئید انجام شده بود داروی جمسیتابین پس از 72 ساعت در غلظت‏های 1 و 100 میکرومولاری منجر به مرگ سلولی شده است و زمانی که با یک پوشش مانند لیپوزوم یا داروی دیگر مانند سیس پلاتین یا سورافنیب همراه شود در 24 ساعت نیز اثر کشندگی خود را بر سلول‏های سرطانی می‏گذارد (24). نتایج این بررسی نیز حکایت از توقف رشد دارو داشت که می‏توان به‏عنوان اثرات جانبی دارو در نظر گرفت. در مطالعه‏ایی که پیش تر بر سلول های سرطانی تیروئید انجام شده بود داروی جمسیتابین پس از 72 ساعت در غلظت‫های 1 و 100 میکرومولار منجر به مرگ سلولی شده است (23، 25).

اولین بار آزمون خراش توسط لی و همکارانش (26) به‏منظور سنجش مهاجرت سلول‫ها ارائه شد. سنجش ترمیم زخم به‫وسیله آزمون خراش به‫طور گسترده‏ای به‏منظور بررسی اثر انواع شرایط تجربی مانند مواد شیمیایی، در مهاجرت سلول‏های پستانداران و تکثیر سلول ها استفاده می‏شود. در آزمون خراش ابتدا، یک شکاف در یک تک لایه ی سلول ایجاد می‏شود. ترمیم این شکاف، با مهاجرت سلولی و رشد به سمت مرکز شکاف تحت نظر قرار می‏گیرند. عوامل تغییر دهنده تحرک و رشد سلول می‏توانند سرعت ترمیم شکاف را افزایش یا کاهش دهند (27). مطالعات نشان داده‏اند که فاکتورهای رشد و عوامل آنکوژنیک سبب افزایش مهاجرت سلولی و ترمیم زخم می‏شوند. در حالی‏که عوامل سرکوب کننده‏ی تومور و داروهای ضد سرطانی سبب کاهش مهاجرت سلولی و کاهش ترمیم زخم در کشت‏های سلولی می‏شوند (17). نتایج این مطالعه نیز در راستای مطالعات گذشته می‏باشد که هورمون رشد به عنوان یک فاکتور رشد سبب افزایش مهاجرت سلولی می‏شود.

علت انتخاب سلول‏های فیبروبلاست برای این آزمون نقش اصلی و مهم این سلول‏ها در کنار کراتینوسیت‏ها در ترمیم زخم است. در آزمونی که مشابه این پژوهش که بر  سلول‏های فیبروبلاست و کراتینوسیت‏ها انجام شد پس از 24 ساعت شکاف نمونه‏های تحت اثر هورمون رشد نسبت به نمونه‏ی کنترل کاهش یافت. به‏عبارتی هورمون رشد محرک مهاجرت کراتینوسیت‏ها و سلول‏های فیبروبلاست است که با نتایج MTT و تکثیر سلول‏ها که قبلا هم بیان شده بود مطابقت داشته است (29،28). 

حال با استناد بر این یافته‏ها می توان گفت:

1-  نتیجه استفاده از هورمون رشد خروج سلول‏ها از فاز G1 به S و در نهایت تکمیل چرخه‏ی سلولی بود که تقریبا با یک روند ثابتی انجام شد. همچنین در تمام غلظت‫ها این پروسه تغییر چشمگیری نداشت.

2- در مرحله‏ی بعد اعمال اثر جمسیتابین بود که طبق مطالعاتی قبلی سبب توقف تکثیر سلول‏ها در فاز S می شود. در مطالعات ما نیز توقف سلولی بیشتر در فاز S مشاهده شد. از طرفی ورود به فاز G2 نسبت به نمونه‏ی کنترل کاهش داشت. که این مشاهدات در راستای مطالعات قبلی بوده است.

3- در مرحله ی بعد جهت کاهش عوارض جانبی داروی جمسیتابین و بررسی عملکرد هورمون رشد از جنبه‏ی دیگر، سلول‫های تحت تیمار هر دو دارو به‏صورت همزمان قرار گرفتند. می‏دانیم عموما، سلول‏هایی که در فاز G0 هستند حساسیت کمتری به داروهای شیمی درمانی برای درمان سرطان نشان می‏دهند و در بیشتر مواقع سبب متاستاز سلولی و تشدید بیماری می‏شوند. مطالعات پیشین نیز نشان داده‏اند که مکانیسم عمل جمسیتابین عمدتا از طریق فاز S و مهار این مرحله می‏باشد. به‏نظر می‏رسد هورمون رشد سبب تحریک سلول‏های مهار شده توسط جمسیتابین در فاز S می‏شود. در مطالعات فلوسیتومتری نیز اثبات شد، اثر مهاری جمسیتابین بیشتر در فاز S می باشد. استفاده هم‫زمان از هورمون رشد و جمسیتابین سبب می‏‫شود که سلول‫های مهار شده تحریک شوند و فاز S را گذرانده و وارد فاز G2 شوند که در نهایت سلول وارد مرحله میتوز می‏شود که البته این مشاهده جهت کاهش اثرات سو داروهای شیمی درمانی برای سلول‫های طبیعی مفید می‏باشد. در زمینه سلول‏های سرطانی مطالعات حاکی از نبود گیرنده‏های هورمون رشد در سطح سلول‏های سرطانی می‏باشد که این امر نیاز به تحقیقات بیشتری دارد (2،3).

4- نتایج آزمون همبستگی نشان می‏دهد که میان آزمایش‏های MTT و فلوسیتومتری همبستگی معنی‏داری وجود دارد (R2 >96).

 

نتیجه­گیری

مطالعات مختلف و نتایج حاصل از این پژوهش نشان داده است که هورمون رشد منجر به تکثیر و پیشبرد چرخه‏ی سلولی با روندی ثابت می‏گردد. به‏عبارتی هورمون رشد در سلول‏ها منجر به کاهش سلول‏ها در فاز G0/G1 و افزایش سلول‏ها در فاز S/M می‏شود. در تحقیقات اخیر مشخص شد که بیان گیرنده‏ی هورمون رشد در سلول‏های سرطانی 3 تا 6 درصد است در حالی‫که در سلول‏های سالم بیان این گیرنده به‏میزان 35 تا 50 درصد می‏باشد. از طرفی سلول‏هایی که در فاز G0 هستند حساسیت کمتری به داروهای شیمی درمانی جهت درمان سرطان دارند و در بیشتر مواقع سبب متاستاز سلولی و تشدید بیماری می‏شوند. از این‫رو همراه کردن هورمون رشد انسانی توانست سلول‏ها را از فازG0  خارج کند و از این رو هورمون رشد انسانی اثر بخشی داروهای شیمی درمانی را افزایش  می‏دهد (2).

جمسیتابین توانایی متوقف سازی چرخه سلولی در بیشتر فازها بویژه در فاز G1 و کاهش میزان سلول‫ها در فاز G2 را دارد (20،21) همچنین این دارو موجب توقف و یا تاخیر چنگال همانندسازی در فاز S چرخه‏ی سلولی می‏شود. مدل سازی‫ها و نتایج آزمایشگاهی از این دارو بیانگر توقف فاز S چرخه‏ی سلولی در غلظت‏های پایین دارو است در حالی‏که در غلظت‏های بالا باعث توقف تمام فازهای چرخه سلولی می‏شود. همچنین منجر به آپوپتوزیس سلول‏ها در غلظت‏های حداقلی در طول دوره‏ی زمانی شده است (30).

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله از حمایت‫های مالی دانشگاه صنعتی مالک اشتر که انجام این مطالعه را ممکن ساخته‏اند، سپاسگزاری مـی‏نماینـد.

1. Lekic P, McCulloch C. Periodontal ligament cell populations: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record ،Anat Rec. 1996; 245(2): 327-41.

2. Xinyang H, Geliang X, Rongnan X.، Effect of reorganized-human growth hormone on cell  cycle kinetics in liver cancer in vitro. Hepatobiliary Pancreat Dis Int.  2002; 1(2): 224-7.

3. Almeida AA, Ramos F. Acute myeloid leukemia in the older adults.Leuk Res Rep. 2016; 6: 1–7.

4. D Ross DDChen SRCuddy DP. Effects of 1-Beta-D-arabinofuranosylcytosine on DNA replication intermediates monitored by pH-step alkaline elution. Cancer research Cancer Res. 1990; 50(9): 2658-66.

5. Bergman AMAdema ADBalzarini JBruheim S, Fichtner I, et al.  ntiproliferative activity، mechanism of action and oral antitumor activity of CP- 1116 ،  a fatty acid derivative of gemcitabine، in in vitro and in vivo tumor models، Invest New Drugs. 2011; 29(3): 456-66

6. Li J, Pan Y-Y, Zhang Y. Synergistic interaction between sorafenib and gemcitabine in EGFR‑TKI‑sensitive and

 

EGFR‑TKI‑resistant human lung cancer cell lines. Oncol Lett. 2013; 5(2): 440–446.

7. Ferrandina GLudovisi MLorusso DPignata S, et al. Phase III trial of gemcitabine compared with pegylated liposomal doxorubicin in progressive or recurrent ovarian cancer.J Clin Oncol. 2008;  26(6):890-6.

8. Hamamoto JYasuda HAizawa KNishino M, et al. Non-small cell lung cancer PC-9 cells exhibit increased sensitivity to gemcitabine and vinorelbine upon acquiring resistance to EGFR-tyrosine kinase inhibitors. Oncol Lett. 2017; 14(3): 3559-3565.

9. Waters MJ, Brooks AJ. JAK2 activation by growth hormone and other cytokines. Biochem J. 2015; 466(Pt 1): 1–11.

10. Ikeda M, Wada M, Fujita Y, Takahashi S, et al. A novel bioassay based on human growth hormone (hGH) receptor mediated cell proliferation: measurement of  11K-hGH and its modified forms. Growth Horm IGF Res. 2000; 10(5): 248-55.

11. Ishikawa M, Nimura A, Horikawa R, Katsumata N. et al. A novel specific bioassay for serum human growth hormone، J Clin Endocrinol Metab. 2000; 85(11):4274-9.

12. Lee SWKim SHKim JYLee Y. The effect of growth hormone on fibroblast proliferation and keratinocyte migration. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010; 63(4): e364-9.

13. Lincoln DTSinowatz FTemmim-Baker LBaker HI, et al. Growth hormone receptor expression in the nucleus and cytoplasm of normal and neoplastic cells. Histochem Cell Biol. 1998; 109(2): 141-59.

14. He XYXu GLXu RNZe ZM. Effect of reorganized-human growth hormone on cell cycle kinetics in liver cancer in vitro. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2002; 1(2): 224-7.

15. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983; 65:55–63. 

17. Liang CCPark AYGuan JL. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2007; 2(2): 329-33.

18. Potter AJ, Gollahon KA, Palanca BJA, Harbert MJ, et al. Flow cytometric analysis of the cell cycle phase specificity of DNA damage induced by radiation, hydrogen peroxide and doxorubicin. Carcinogenesis. 2002; 23(3):389–401.

19. Haverkamp F, Wolfle J, Zerres K, et al. Growth retardation in Turner syndrome: aneuploidy, rather than specific gene loss, may explain growth failure. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84: 4578–82.

20. Harrison LE, Blumberg D, Berman R, Ng B, Hochwald S, Brennan MF, Burt M. Effect of human growth hormone on human pancreatic carcinoma growth, protein, and cell cycle kinetics. J Surg Res. 1996;61: 317–322.

21. Tacke J, Bolder U, Herrmann A, Berger G, Jauch KW. Long-term risk of gastrointestinal tumor recurrence after postoperative treatment with recombinant human growth hormone. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2000; 24:140–144.

22. Hamed SSStraubinger RMJusko WJ. Pharmacodynamic modeling of cell cycle and apoptotic effects of gemcitabine on pancreatic adenocarcinoma cells. Cancer Chemother Pharmacol. 2013; 72(3): 553-63. 

23. Celano MCalvagno MGBulotta SPaolino D, et al. Cytotoxic effects of gemcitabine-loaded liposomes in human anaplastic thyroid carcinoma cells. BMC Cancer. 2004 Sep; 13; 4(1):63.

24. da Silva GNde Castro Marcondes JPde Camargo EAda Silva Passos Júnior GA, et al. Cell cycle arrest and apoptosis in TP53 subtypes of bladder carcinoma cell lines treated with cisplatin and gemcitabine. Exp Biol Med (Maywood). 2010; 235(7): 814-24. 

25. Meriggi F. Zaniboni A. Gemox: a widely useful therapy against solid tumors-review and personal experience.  Journal of Chemotherapy. 2010; 22(5): 298-303.

26. Li WHenry GFan JBandyopadhyay B, et al. Signals that initiate, augment, and provide directionality for human keratinocyte motility. J Invest Dermatol. 2004; 123(4): 622-33.

27. Lampugnani M.G. Cell migration into a wounded area in vitr. Methods Mol Biol. 1999; 96: 177-82.

28. Ding j, Wirostko B, Sullivan DA. Human Growth Hormone Promotes Corneal Epithelial Cell Migration in Vitro. Cornea. 2015; 34(6): 686–692.

29. Zare-Mirakabadi A, Sarzaeem A,  Moradhaseli S,   Sayad A, et al. Necrotic Effect versus Apoptotic Nature of Camptothecin in Human Cervical Cancer Cells. Iran J Cancer Prev. 2012; 5(3): 109–116.

30. Affram K, Udofot O, Agyare E. Cytotoxicity of gemcitabine-loaded thermosensitive liposomes in pancreatic cancer cell lines. Integr Cancer Sci Ther.2015; 2(2): 133-142