ساخت نانوذرات آلبومین بارگذاری ‌شده با مهارکننده GSK3β و بررسی اثر آن بر زیستایی سل‌لاین سرطان سینه MCF-7

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری پزشکی، گروه پزشکی ملکولی

2 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری پزشکی، گروه سلول های بنیادی

چکیده

هدف: در این مطالعه به سنتز نانو­ذرات آلبومینی به‏عنوان حامل7-برومو­ایندیروبین ­3 مونوگزیم (7-BIO­) که یک مهارکننده­ی قوی آنزیم گلیکوژن ­سنتاز­ کیناز (­GSK-3β­) و دارای اثرات ضد­توموری است و  به‏دلیل حلالیت و جذب پایین و سمت گوارشی، امکان استفاده بالینی با محدودیت رو به‫رو خواهد بود، مبادرت شد.
مواد و روشها: با استفاده از غلظت‫های اولیه‫ی متفاوت آلبومین سنتز نانو­ذراتی انجام و اندازه آن‫ها با میکروسکوپ الکترونی آزمون شد. پس از کونژوگاسیون ذرات با 7-BIO و ­تیمار سلول‫های سرطانی­، زیستایی و وجود آپوپتوزیس سلولی با استفاده از آزمون MTT و آکریدین اورنج و اتیدیوم بروماید سنجش شدند. اثر بخشی و فعالیت 7-BIO نیز با بررسی میزان فسفریلاسیون GSK-3β به‏روش وسترن بلاتینگ آنالیز شد. نتایج آزمایش توسط آنالیز آماری One-Way ANOVA مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: آزمون سنتز نانو­ذرات نشان داد که برای سنتز نانو­ذرات نشان داد که در غلظت اولیه 10 میلی­گرم در میلی­لیتر آلبومین، نانوذراتی هموژن با قطر 7±42/89 نانومتر به‏دست می­آیند. آزمون MTT نشان داد که نانوذرات بارگذاری شده با 7-BIO اثر سمیت بیشتری بر سلول­های رده سرطانی MCF-7 در مقایسه با 7-BIO آزاد اعمال­ کرده­‏اند. رنگ­آمیزی آکریدین اورنج و اتیدیوم بروماید سلول­های تیمار شده با 7-BIO نیز حاکی از القای آپوپتوزیس بود. همچنین 7-BIO افزایش قابل رویتی در میزان فرم فسفریله GSK-3β در سلول­های سرطان سینه ایجاد می‏کند.
 نتیجهگیری: به‏این‏ترتیب نانوذرات آلبومین کونژوگه‌شده با مهارکننده GSK3β زیستایی سل‌لاین سرطان سینه MCF-7 را به‏طور قابل ملاحظه‏ای کاهش می‏دهند که می‏توانند به‏عنوان یک راه‫کار درمانی در آینده مورد آزمون قرار گیرند.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

در میان انواع نانوذرات، نانوذراتی که با استفاده از برخی از پروتئین­ها مثل کازئین، آلبومین و ژلاتین تهیه می­شوند، دارای ویژگی­های مناسب ازجمله زیست­ سازگاری، زیست­ تخریب ­پذیری، غیر آنتی­ژنیک بودن و نیز سهولت در تهیه هستند. آلبومین از پرکاربردترین پروتئین‫های مورد استفاده در دارورسانی است. همچنین تهیه نانوذرات آلبومینی در حجم­های بالا برای مصارف تجاری نیز امکان پذیر است. نانوساختارهای آلبومین قادر به حل کردن داروهای نامحلول در آب هستند و سمیت را در سلول­های سالم کاهش می­دهند و نوکلئیک اسیدها را از تخریب محافظت می­کنند. در سیستم دارو رسانی لیگاندهای مختلف می­توانند به آلبومین متصل شوند تا دارو رسانی هدفمند را برای سلول­های مشخصی 
انجام دهند. به­دلیل حضور گروه­های کاربردی آمین و کربوکسیل روی سطح نانوذرات، امکان اتصال پیوند کووالانسی به لیگاند­های مختلف برای هدف قرار دادن سلول­ها وجود دارد (1-3). آلبومین دارای گروه­های عاملی مختلف و متعددی بوده و بنابراین ظرفیت اتصال به مقادیر قابل توجه دارو را دارد. شناخت کامل از توالی آمینو اسیدی و ساختار آلبومین و گروه­های باردار متعدد اجازه اتصال انواع دارو به نانوذرات آلبومینی با مکانیسم­های مختلف شامل جاذبه الکترواستاتیک با داروهای دارای بار منفی مانند جنسایکلوویر (Ganciclovir) و نیز ترکیبات دوگانه دوست مانند دوکسوروبیسین (Doxorubicin) و آبگریز مانند پکلیتکسل Paclitaxel را می­دهد (3).

تجویز نانوذرات آلبومین در یک محدوده ی دوز وسیع (2، 20 و 390 میکروگرم برای هر حیوان) به ریه­های موش (BALB/C mice) نشان داد که این نانوذرات تنها در دوزهای بالا موجب التهاب خفیف می­شوند (4).

روش­های فیزیکی و شیمیایی مختلفی برای تهیه نانوذرات آلبومین استفاده می­شود، از روش­های شیمیایی می‏توان به Desolvation، Emulsification وSelf-assembly اشاره کرد و از روش­های فیزیکی می‏توان Thermal gelation، NAB-technology، Nano spray drying را نام برد (1, 5).

روش­های مختلفی نیز برای بارگذاری نانوذرات آلبومین با داروی مورد نظر وجود دارد، مثلا اتصال کووالانسی، پوشش دهی سطح و جذب الکترواستاتیکی که به‏علت وجود گروه‏های عملکردی مختلف در ساختار اولیه آلبومین می‏تواند مورد استفاده قرار گیرد (2). داروهای آبدوست می­توانند با روش­های مختلف بارگذاری شوند. مثلا، انکوباسیون دارو با پیش ساز نانوذرات آلبومینی. در روش دارو می­تواند بر سطح نانوذره جذب شود یا داخل نانوذره قرار گیرد. داروی Ganciclovir یک داروی ضد­ ویروسی که برای درمان عفونت های سیتو مگالو ویروس استفاده می­شود و نیز داروی گاباپنتین Gabapentin که برای درمان صرع مورد استفاده قرار می­گیرد با استفاده از این روش­های دارو رسانی موجب پایداری بیشتر دارو و نیز کاهش اثرات جانبی شده­اند (2, 6, 7).

روش­های مختلفی نیز برای بارگذاری داروهای کم و نامحلول در آب در نانوذرات آلبومینی استفاده شده است. اتصال دارو­ها به نانوذرات می­تواند توسط جذب الکترواستاتیکی یا اتصال کووالانسی بین دارو و ماتریکس آلبومینی نانوذرات باشد. برای این نوع بارگذاری، چندین روش از جمله Nab-technology و Self assembly وجود دارد. برای مثال داروی Paclitaxel  که حلالیت پایینی در آب دارد در صورت تجویز با غلظت بالا، واکنش‏های آلرژیک شدیدی را ایجاد می­کند، ولی پس از کونژوگه شدن با نانوذرات آلبومینی افزایش توجهی در قابلیت حلالیت آن و اثر­گذاری‫اش بر سلول­های رده سرطان پستان حاصل می‫شود. در مطالعه‫ای دیگر از نانوذرات آلبومینی به‏منظور حمل وینبلاستین سولفات Vinblastine sulfate (VBLS) استفاده شد که تسهیل در دارو رسانی به‏محل تومور را موجب شد (8, 9). نانوذرات آلبومینی برای بهبود حلالیت و افزایش اثرگذاری داروهای دیگری نیز استفاده­­ شده­اند که می­توان به مواردی مانند دیکلوفناک، متو تروکسات، آسپیرین، دی متان سولفونات، تروکلیموس زیر اشاره کرد (2, 10, 11).

یافته‏های متعددی نشان می­دهند که ایندیروبین و مشتقات آن هم می­توانند کاندید مناسبی برای درمان بیماری­هایی نظیر سرطان باشند. تحقیقات Marko و همکارانش نشان داد که ایندیروبین دارای اثر مهاری روی CDKs (Cyclin Dependent Kinases) و GSK-3β است و از این طریق اثرات ضد تکثیری خود را اعمال می‏کند (12).

Wei و همکاران (13) اثر ایندیروبین را بر سلول­های PC-3 سرطان پروستات مورد بررسی قرار دادند. تیمار سلول­ها با ایندیروبین موجب مهار چرخه سلولی و کاهش 2/52 درصد زنده مانی سلول­ها در غلظت 5 میکرومولار، مهار بیان سیکلین D1 و c-myc در مسیر پیام­رسان Wnt شد که حاکی از سرکوب تکثیر سلول­های PC-3 توسط ایندیروبین با اثر روی چرخه سلولی و مسیر پیام‫رسانWnt  است.

ایندیروبین در سه نوع سلول سرطانی نیز مورد آزمایش قرار گرفته است. Shi و همکارانش (14) سلول­های هلا (سرطان دهانه ی رحم)، سلول­های رده HepG2 (سرطان کبد) و سلول­های رده HCT116 (سرطان کلون) را با ایندیروبین تیمار و نشان دادند که موجب القای آپوپتوزیس خارجی وابسته به دوز مصرفی و زمان می­شود.Lee  و همکاران (15) نیز نشان دادند ایندیروبین باعث ایجاد آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی ریه انسان از طریق p53 و مسیر وابسته به میتوکندری می­شود.

گزارش‫هایی از این دست در دیگر سرطان­ها نیز ارائه شده است. ازآنجایی‏که ایندیروبین مادهای آبگریز، با حلالیت پایین در محلول­های آبی و سمی است، بهمنظور افزایش قابلیت استفاده از آن در سلول­های مختلف به سنتز مشتقات مختلفی از جمله 7-BIO مبادرت شده است (16). همچنین از نانو ذرات آلبومینی می‫توان برای افزایش اثر بخشی و کاهش سمیت آن استفاده کرد که در این تحقیق به کونژوگه کردن GSK-3β با نانو ذرات آلبومینی پرداخته شد و زیستایی سل لاین سرطان سینه تیمار شده مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد و روش‌ها

روش سنتز نانوذرات آلبومینی: دراین تحقیق نانوذرات آلبومینی با روش Desolvation سنتز ­شدند (17-19). ابتدا غلظت­های 100، 50 و 10 میلی­گرم در میلی­لیتر از محلولBSA  با حلال NaCl (­10 میلی­مولار) تهیه شدند. سپسpH  این محلول با سود تهیه شده به 2/8 رسانده شد. سپس اتانل به‫صورت قطره قطره با سرعت یک میلی‫لیتر در دقیقه اضافه شد. در این شرایط محلول با دور550 تحت هم زدن است. اضافه شدن اتانل تا زمانی ادامه یافت که محلول از حالت شفاف به کدر تغییر کرده و معرف تشکیل نانوذرات بود و سپس گلوتارآلدئید 4 درصد به‫منظور ایجاد اتصال متقاطع اضافه شد. به‏منظور تبخیر اتانل، نانوذرات به‏مدت 12 ساعت تحت هم زدن قرار گرفتند. پس از تبخیر اتانل، جهت جداسازی نانوذرات ابتدا نمونه به‏مدت 10 دقیقه با دور rpm 2000 سانتریفیوژ شد و سپس محلول رویی به‏مدت 20 دقیقه با دور 10000 سانتریفیوژ گشت و رسوب حاصل که نانوذرات مورد نظر بود برای آنالیز و آزمون‫های بعدی جدا شد.

بارگذاری 7-BIO در نانوذرات آلبومینی:در این روش که از گلوتارآلدئید 4 درصد بمنظور ایجاد اتصال متقاطع استفاده شد (3). مقدار 100 میکروگرم 7-BIO حل شده در DMSO ( 28 میکرولیتر)، دریک میلی­لیتر اتانل حل شد و به‏صورت قطرهای به 5/0 میلی­لیتر محلول آلبومین با غلظت 10 میلی­گرم در میلی­لیتر با pH 2/8 تحت شرایط هم زدن با دور  rpm550 اضافه گشت. پس از ایجاد کدورت و تشکیل، گلوتارآلدئید 4 درصد به‫منظور ایجاد اتصال متقاطع اضافه شد. پس از گذشت 12 ساعت و تبخیر اتانل، نانوذرات آلبومینی که دارای داروی جذب شده بودند با دور 2000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند تا نانوذرات بزرگ‫تر جدا شده و محلول رویی که حاوی نانوذرات با سایز مورد نظر بود با دور 10000 به‫مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. نانوذرات بارگذاری شده پس از سنتز، به‫منظور حذف داروی بارگذاری نشده، دو بار با آب دیونیزه شسته شدند.

تهیه منحنی استاندارد غلظت 7-BIO در اتانل: به‫منظور تعیین و بررسی میزان بارگذاری 7-BIO در نانوذرات آلبومینی، منحنی استاندارد غلظت رسم شد. بدین‫منظور ابتدا طول موج مناسب با اسکن کردن 7-BIO در اتانل (‫با غلظت 20 میکروگرم در میلی­لیتر) با دستگاه اسپکتروفتومتری یافت شد. سپس غلظت های 5، 10، 15، 20 و 25 میکروگرم در میلی­لیتر تهیه و OD آن­ها در طول موج 290 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری خوانده شد. سپس، نمودار OD بر حسب غلظت رسم و معادله­ی خط به‫دست آمد.

بررسی میزان بارگذاری 7-BIO در نانوذرات آلبومینی: به‫منظور بررسی مقدار داروی بارگذاری شده در نانوذرات آلبومینی، پس از سنتز نانوذرات بارگذاری شده با دارو و دو بار شستشو با آب دیونیزه، مقدار 300 میکرولیتر اتانل به نانوذرات اضافه شد و به‏مدت 1 ساعت در دستگاه حمام التراسونیک قرار گرفت. با این روش، اتانل نانوذرات را تخریب کرده و دارو رها شده و وارد محیط اتانل می­شود. سپس، نمونه به‏مدت 20 دقیقه و با دور 13000 سانتریفیوژ شد و OD محلول رویی در طول موج 290 نانومتر خوانده شد. غلظت داروی موجود در 300 میکرولیتر با استفاده از منحنی استاندارد 7-BIO محاسبه شد. ظرفیت بارگذاری و بازدهی بارگذاری با استفاده از معادله­های 1 و 2 نیز محاسبه شد (20).

                         


معادله 1 :

 

 


معادله 2 :

بررسی رهایش 7-BIO از نانوذرات آلبومینی: در این تحقیق با الهام گیری از روش سایر محققین نظیر (19-23) به‫منظور تاثیر مقادیر مختلف گلوتارآلدئید بر میزان رهایش دارو، نانوذرات با محلول­های گلوتارآلدئید 0، 1، 2، 3، 4 و 8 درصد، سنتزو رهایش دارو از آن­ها در ساعات 1، 12، 24، 48، 72 در دو نوع محیط رهایش بررسی شد. محیط رهایش اول PBS با pH 4/7 و محیط رهایش دوم PBS با pH 4/7 به­همراه 5/0 درصد، SDS بود. محیط مورد آزمون نهایی اتانول به‫تنهایی بود.

علی‏رغم آن‫که در محیط‫های تحت آزمون فوق انکوباسیون با مدتهای ذکر شده انجام شد، با در معرض قرار کیری اتانول این رهایش به‏طور فوری و با سرعتی صورت گرفت که نیازی به انکوباسیون نشد. مقدار نانوذرات حاوی دارو 1 میلی­گرم در 5/0 میلی­لیتر محیط رهایش بود. نمونه­های تهیه شده در PBS و SDS در شیکر انکوباتور با دورrpm  100 و دمای 37 درجه سانتی­گراد قرار داده ­شدند. پس از اتمام ساعات ذکر شده، به‏مدت 20 دقیقه و دور 13000 سانتریفیوژ شدند و OD محلول رویی  در طول موج 290 خوانده شد و با استفاده از نمودار منحنی استاندارد غلظت 7-BIO، میزان داروی رها شده محاسبه شد.

کشت و نگه‏داری سل لاین سرطانی سینه رده­ی MCF-7

سل لاین ذکر شده در فلاسک T25 با محیط کشت DMEM  حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی به‏مقدار کلی 5 میلی‫­لیتر کشت داده شد و در انکوباتور قرار گرفتند. محیط کشت این سلول­ها هر سه روز یک‫بار تعویض شد. سلول­ها پس از حدود 5  تا 7 روز کف فلاسک را پر کرده و آماده­ی پاساژ بودند. برای نگه‫داری طولانی مدت سلول­ها، بعد از تریپسینه کردن سلول­ها، به رسوب سلولی 100 میکرولیتر DMSO و 900 میکرولیتر FBS اضافه و به فریزر 70- درجه سانتی‫گراد یا تانک ازت منتقل شد.

روش آزمون MTT و رنگ آمیزی آکریدین اورنج و اتیدیوم بروماید: سلول­ها به تعداد 10000 در هر خانه از پلیت 96 خانه کشت داده و تیمار شدند. محلول MTT به نسبت 1:10 با محیط کشت رقیق شد. محیط کشت از پلیت 96 خانه کشت داده و تیمار شدند. محلول MTT به نسبت 1:10 با محیط کشت رقیق شد. محیط کشت سلول­ها خارج و به‫هر خانه 100 میکرولیتر از محلول MTT رقیق شده اضافه شد و سلول­ها برای 4 ساعت در انکوباتور قرار گرفتند. پس از آن محیط سلول­ها خارج و به هر خانه 100 میکرولیتر از DMSO اضافه شد. سپس جذب نمونه­ها در طول موج­های 580 و 620 نانومتر به‫وسیله دستگاه Microplate Reader خوانده شد و نتایج با استفاده از نرم افزار Graph pad prism مورد آنالیز آماری قرار گرفتند. پس از اتمام زمان تیمار، محیط کشت سلول­ها خارج شد. سلول­ها یک مرتبه با PBS شسته شدند و مقدار 50 میکرولیتر از محلول آکریدین اورنج و اتیدیوم بروماید به آن‫ها اضافه شد. برای مشاهده­ی سلول‏های زنده و آپوپتوتیک از میکروسکوپ فلورسنس در اتاق تاریک استفاده شد.

استخراج پروتئین کل سلول: با استفاده از روش ابداعی (1966) Edwin Joseph Cohn پروتئین کل سلولی استخراج شد (24). به این ترتیب که پس از اتمام زمان تیمار، محیط سلول­ها خارج و فلاسک دو بار با PBS سرد شستشو داده شد. سپس به هر فلاسک T25، 300 میکرولیتر تریپسین اضافه و فلاسک برای 5 دقیقه در انکوباتور قرار گرفت. بعد از 5 دقیقه و اطمینان از جدا شدن سلول­ها از کف فلاسک، PBS دارای 10 درصد، FBS به سلول­ها اضافه شد و سپس به تیوپ 15 میلیلیتری منتقل شد. پس­از سانتریفیوژ به‏مدت 5 دقیقه با سرعت 1500 دور در دقیقه، محلول رویی دور ریخته شد و رسوب سلولی در یک میلی­لیتر PBS تعلیق شد و به یک ویال 5/1 میلی­لیتری انتقال یافت. این بار با سرعت 2000 دور در دقیقه به‏مدت 5 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد و رسوب سلولی یا برای نگهداری طولانی در فریزر 70- درجه سانتی‫گراد یا مستقیما برای استخراج پروتئین مورد استفاده قرار گرفت. به رسوب سلولی100 میکرولیتر از بافر لیز سلولی کامل (حاوی سدیم فلوراید و سدیم اورتووانادات و مهارکنندههای پروتئازها) اضافه شد. سپس به‏مدت 20 دقیقه بر روی یخ قرار گرفت به‏طوری‏که هر 5 دقیقه پیپتاژ شد تا لیز سلولی به صورت کامل انجام شود. پس از آن برای جدا کردن مواد زائد و ضایعات سلولی از پروتئین ها، سانتریفیوژ با سرعت 12000 دور در دقیقه برای 20 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‫گراد انجام شد. محلول رویی دور ریخته شد و رسوب سلولی یا مستقیما برای استخراج پروتئین مورد استفاده قرار گرفت و یا برای نگه‫داری طولانی در فریزر 70- درجه سانتی‫گراد  قرار داده شد.

سنجش غلظت پروتئین با استفاده از روش بردفورد: با استفاده از روش ابداعی (1966) Bradford سنجش غلظت پروتئین انجام شد (25).

به‏این‏ترتیب که به‏منظور بارگذاری مقادیر مساوی از نمونه‏های پروتئینی بر روی ژل پلی­آکریل­آمید، ابتدا غلظت پروتئین نمونه­ها با استفاده از روش بردفورد تعیین شد. محلول بردفورد دارای رنگ کوماسی­بلو است که به گروه­های آمین موجود در اسیدهای آمینه متصل می­شود و رنگ آبی ایجاد می­کند. بنابراین، میزان رنگ آبی ایجاد شده با مقدار اسیدهای آمینه و در نتیجه غلظت پروتئینی رابطه مستقیمی دارد. در این روش، غلظت­های متوالی از BSA تهیه و پس از اضافه نمودن محلول برادفورد ، جذب آن توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 595 خوانده شد. بر اساس جذب­های به‏دست آمده و غلظت استاندارد­ها، منحنی استاندارد غلظت رسم شد. 60 میکروگرم از نمونه‫ی پروتئینی با 30 میکرولیتر از Sample buffer (2X) مخلوط شد و به‏مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرار گرفت. ژل پیش از قرار­ گیری پروتئین­ها در آن، 15 دقیقه در جریان برق (130 ولت) قرار گرفت. سپس جریان برق قطع شد و نمونه­ها توسط سمپلر در چاهک‫های ژل ریخته شدند. 10 میکرولیتر از نشانگر پروتئینی نیز در یکی از چاهک­ها ریخته شد تا بر اساس آن جایگاه پروتئین مورد نظر مشخص شد. سپس جریان دوباره برقرار گشت (­110 ولت و 15 میلیآمپر) تا پروتئین‫ها از بالا (قطب منفی) به‏سمت پایین (قطب مثبت) حرکت کنند. ژل جمع کننده، پروتئین­ها را در مرز ژل جدا کننده جمع می­کند تا با هم وارد ژل پایین شوند. در ژل پایین، پروتئین­ها بر اساس جرم مولکولی (پروتئین‫های سنگین تر در بالا و پروتئین­های سبک تر در پایین) از هم جدا می­شوند. پس از اینکه پروتئین­ها به‫میزان دلخواه روی ژل حرکت کردند و از هم جدا شدند، جریان برق قطع شد تا ژل برای ترانسفر آماده شد.

انتقال پروتئین­ها بر روی کاغذ PVDF: وسترن بلاتینگ با روش ابداعی Towbin و همکارانش انجام شد (26). به‫منظور انتقال پروتئین‫ها از ژل بر روی کاغذ PVDF از روش خیس استفاده شد. ابتدا کاغذ PVDF به اندازه ژل برش خورد و سپس از روی آن 4 تکه به‏همان اندازه از کاغذ صافی تهیه شد.

PVDF ابتدا به‫منظور فعال شدن 30 ثانیه با متانول آغشته و مرطوب گردید و پس از آن در بافر ترانسفر قرار گرفت. سپس، کاغذ صافی، کاغذ PVDF، ژل و دوباره کاغذ صافی به‏ترتیب بر روی هم گذاشته شدند.

این مجموعه از کاغذها و ژل درون تانک ترانسفر گذاشته شدند به‏طوری‏که کاغذ PVDF به‏سمت قطب مثبت قرار گرفت. باید دقت کرد که هیچ‫گونه حبابی میان لایه­ها نباشد، چرا که از برقراری جریان و در نتیجه انتقال پروتئین در آن نقطه جلوگیری می­کند. جریان 350 تا 400 میلی آمپر می­تواند عمل انتقال پروتئین­ها را طی زمان 2 ساعت انجام دهد. البته انتقال می­بایست در اتاق 4 درجه سانتیگراد انجام شود، زیرا که جریان بالا سبب گرم شدن بافر و از بین رفتن پروتئین­ها می­شود. انتقال تمام باندهای نشانگر رنگی بر روی PVDF بهترین موید جهت انجام کامل انتقال پروتئین­ها می­باشد.

ایمونوبلاتینگ Immunoblotting: پس از انتقال پروتئین­ها بر روی PVDF، مراحل ایمونوبلاتینگ انجام شد، بدین ترتیب که بلات در محلول بلوک کننده حاوی شیر خشک و سپس روی شیکر به‏مدت یک ساعت در دمای آزمایشگاه قرار گرفت.

آبکشی سریع توسط TBST و اضافه نمودن آنتیبادی اولیه: 1- آنتی­بادی pGSK3: رقیق شده با نسبت 1:1000 در TBST، 1 شب در دمای 4 درجه سانتی­گراد و روی شیکر

2- آنتی­بادی GSK3: رقیق شده با نسبت 1:2000 در TBST، یک ساعت در دمای آزمایشگاه و روی شیکر

3- جمع آوری آنتی­بادی اولیه و 4 شستشوی 15 دقیق‫های با TBST در دمای آزمایشگاه و روی شیکر

4- اضافه نمودن آنتی­بادی ثانویه (از این مرحله به بعد نباید در معرض نور مستقیم قرار داشته باشد).Anti rabbit IgG, HRP-Conjugated رقیق شده با نسبت 1:2000 در TBST، یک ساعت در دمای آزمایشگاه و روی شیکر

5- جمع آوری آنتی­بادی ثانویه و 4 شستشوی 15 دقیقه‏ای با TBST در دمای آزمایشگاه و روی شیکر

با توجه به‫روش ابداعی Chemilluminescense توسط Eilhard Wiedemann (1988) (27) بلات درون یک نایلون و سپس در کاست عکاسی قرار گرفت. محلول ECL (enhanced Chemilluminescense) بر روی بلات به‏حدی که سطح را بپوشاند اضافه شد. در اتاق تاریک فیلم X-ray ، بسته به شدت نور، برای مدت زمان 1 تا 10 دقیقه روی بلات قرار گرفت. سپس فیلم درون داروی ظهور انداخته شد. پس از 5 دقیقه شستشو با آب مقطر، فیلم در داروی ثبوت قرار داده و پس از آن با آب شسته شد.

پاک­سازی (Stripping ): با توجه به‏روش اشاره شده توسط بسیاری از شرکتهای تجاری نظیر Abcam و BioRad، کاغذ PVDF قابلیت دوباره بلات شدن با آنتی­بادی­ها­ی جدید را داشته و لذا با پاکسازی آنتی بادی‫ها­ی اتصال یافته میتوان غشاها را مجددا مورد استفاده قرار داد. در مطالعهی حاضر، به‫دلیل همسانی محل باند پروتئینهای pGSK-3 و GSK-3 ابتدا بلات برای pGSK-3 انکوبه شد و پس از پاک شدن برای GSK-3 انکوبه شد. مراحل پاک­سازی به‏صورت زیر انجام شد:

1-     قرار دادن بلات در بافر استریپ، 2 بار و هر بار ب‏مدت 12 دقیقه روی شیکر در دمای آزمایشگاه

2-     قرار دادن بلات در PBS، 2 بار و هر بار به‏مدت 10 دقیقه روی شیکر در دمای آزمایشگاه

3-     قرار دادن بلات در TBST، 2 بار و هر بار به‏­مدت 5 دقیقه روی شیکر در دمای آزمایشگاه

گروه­های آزمایشی مورد مطالعه عبارت بودند از: 1- آزمون غلظت­های 50، 100، 150، 200 و 250 میکروگرم در میلی لیتر نانوذرات آلبومینی بر سلول­های MCF-7 و بررسی زنده­مانی سلولها با MTT

2- آزمون غلظت­های 1، 5، 10، 15 و 20 میکرومولار 7-BIO و نانوذرات بارگذاری شده با 7-BIO بر سلول­های MCF-7 و بررسی زنده مانی سلول‏ها با MTT3- انتخاب غلظت 15 میکرومولار 7-BIO برای سلول‫های  MCF-7 و بررسی میزان فسفریلاسیون آنزیم GSK3β با استفاده از روش وسترن بلاتینگ

 

آنالیز آماری

نتایج آزمایش به‫صورت Mean ± SE بیان شده اند، توسط آنالیز آماری One-way ANOVA مورد بررسی واقع و 05/0p≤ به‫عنوان سطح معنی‫داری در نظر گرفته شد.

 

نتایج

بررسی اندازه و شکل نانوذرات آلبومینی سنتز شده:

بررسی اندازه و شکل ذرات سنتز شده به کمک تصاویر SEM صورت گرفت. متوسط قطر نانوذرات و همچنین توزیع اندازه آن­ها با اندازه­گیری نانوذرات در هر تصویر به‫کمک نرم افزار Image J به‫دست آمد. تصاویر SEM (شکل 1) نشان می‫دهند که نانوذرات تهیه شده کروی هستند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 1: تصویر SEM نانوذرات سنتز شده با غلظت­های متفاوت آلبومین. A) 100 میلی­گرم در میلی­لیتر B) 50 میلی­گرم در میلی­لیتر C) 10 میلی‫گرم در میلی­لیتر

 

 

 

همان‫طور که در نمودارهای توزیع اندازه مشاهده می­شود (نمودار 1)، متوسط قطر نانوذرات سنتز­ شده با غلظت اولیه 100 میلی­گرم در میلی­لیتر آلبومین، 23±36/103 نانومتر، با غلظت اولیه 50 میلی­گرم در میلی­لیتر آلبومین 14±43/71 نانومتر و با غلظت اولیه 10 میلی­گرم در میلی­لیتر آلبومین، 7±42/89  نانومتر تعیین شد.

 

 

نمودار 1: نمودار­های توزیع اندازه نانوذرات آلبومین سنتز شده با غلظت­های متفاوت آلبومین A) 100 میلی­گرم در میلی­لیتر B) 50 میلی­گرم در میلی‫لیتر C) 10 میلی­گرم در میلی­لیتر

 

 

با توجه به انحراف معیارهای به‏دست آمده، غلظت 10 میلی­گرم در میلی­لیتر آلبومین، همگن­ترین نانوذرات را از نظر قطر متوسط به‫دست داد.

بررسی بارگذاری و رهایش 7-BIO از نانوذرات آلبومینی

بارگذاری 7-BIO بر نانوذرات آلبومینی

به منظور بررسی میزان 7-BIO بارگذاری­شده بر نانوذرات آلبومینی، 100 میکروگرم 7-BIO همراه با 5 میلی­گرم آلبومین و گلوتارآلدئید 4 درصد سنتز شد. با توجه به ‏اندازه مناسب و انحراف معیار پایین ­تر نانوذرات آلبومینی در غلظت 10 میلی­گرم بر میلی­لیتر، این غلظت جهت بارگذاری ترکیب 7-BIO انتخاب شد.  با توجه به اینکه نانوذرات در حضور اتانل و امواج اولتراسونیک، تخریب شده و داروی موجود در آن­ها خارج می­شود، پس از سانتریفیوژ کردن نمونه، با اندازه گیری OD محلول رویی و استفاده از منحنی استاندارد غلظت دارو در اتانل، مقدار داروی موجود در نانوذرات سنتز شده بدست آمد. با توجه به‏ مقدار نانوذرات (2 میلی­گرم) و میزان داروی اولیه (100 میکروگرم)، بازدهی بارگذاری و ظرفیت بارگذاری با استفاده از معادله های 1 و 2 (در بخش روش‏ها ذکر شده است) محاسبه شد. بدین ترتیب بازدهی بارگذاری 33 درصد و ظرفیت بارگذاری 5/16 میکروگرم 7-BIO در میلی­گرم نانوذره به‫دست آمد.  

 

بررسی رهایش دارو از نانوذرات آلبومینی

با توجه به ‏اینکه برای پایدارسازی نانوذرات آلبومینی معمولا از ایجاد اتصال عرضی با استفاده از گلوتارآلدئید کمک گرفته می­شود و این امر بر رهایش ترکیبات کونژوگه شده با درون نانوذرات تاثیر گذار است، در این تحقیق، نانوذرات بارگذاری شده با 7-BIO با مقادیر مختلفی از گلوتارآلدئید (1 تا 8 درصد) تیمار شدند و میزان رهایش دارو برای همه نمونه­ها در محیط PBS طی 72 ساعت بررسی شد. نتایج نشان داد (نمودار A2)، رهایش 7-BIO از نانوذرات آلبومینی حتی پس از سه روز

 

 

 

نیز صورت نمی­گیرد. همچنین، اضافه کردن مقادیر مختلف گلوتارآلدئید بر میزان رهایش دارو تاثیر نداشت. با توجه به اطلاعات سایر محققین، افزودن SDS به‏دلیل برهمکنش­ با مولکول­های آلبومین و همچنین مولکول­های ترکیب قرار گرفته‏ی درون نانوذرات می­تواند بر رهایش ترکیب موثر باشد (28). اما در این تحقیق، اضافه کردن SDS باعث رهایش 7-BIO نشد (نمودار B2).

 

 

 

 

 

 

نمودار 2: بررسی رهایش 7-BIO از نانوذرات آلبومینی. (A) رهایش 7-BIO از نانوذرات تیمار شده با مقادیر مختلف گلوتارآلدئید در محیط PBS (4/7pH ) (B) رهایش 7-BIO از نانوذرات تیمار شده با گلوتارآلدئید 4 درصد در محیط PBS حاوی SDS (5/0 درصد وزنی حجمی)

 

 

در نهایت با استفاده از اتانول 7-BIO به‏سرعت از نانوذرات رها ­شد که در شکل 2 به تصویر کشیده شده است. شکل 2 نشان میدهد که 7-BIO موجود در نانوذرات آلبومینی به‏محض قرار گرفتن در معرض اتانل رها می­شود، درصورتیکه رهایش آن در PBS و نیز PBS حاوی SDS طی مدت 72 ساعت انجام نشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: پایداری و یا رهایش  7-BIO از نانوذرات آلبومینی در محیط­های مختلف A) PBS B) PBS به همراه SDS C) اتانل


 

 

بررسی سمیت سلولی نانوذرات بارگذاری نشده

به‏منظور سنجش سمیّت نانوذرات آلبومینی بر سل لاین سرطان سینه، پس از کشت سلول­ها در پلیت‏های 96 خانه­ای، تیمار با غلظت­های مختلف نانوذرات (صفر تا 250 میکروگرم بر میلی­لیتر) به‏مدت 48 ساعت انجام شد. میزان زنده­مانی سلول­های تیمار شده با آزمون MTT سنجش شد. نتایج نشان داد که نانوذرات آلبومینی در هیچ یک از غلظت­ها اثر سمیت بر رده­ی سلولی آزمایش شده ندارند (نمودار 3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 3: بررسی اثر سمیت نانوذرات آلبومینی در غلظت­های مختلف بر سلول­های MCF-7  با استفاده از آزمون MTT (3n=).

 

 

بررسی میزان بقای سل لاین سرطان سینه تیمار شدهبا 7-BIO به روش MTT

به‏ منظور سنجش تاثیر تیمارها بر میزان بقای سلولی از آزمون MTT استفاده شد. پس از کشت سلول­های MCF-7 در پلیت های 96 خانه ای، 24 ساعت بعد تیمار با غلظت­های مختلف انجام شد. سلول­های MCF-7 با غلظت­های 1، 5، 10، 15 و 20 میکرو مولار 7-BIO آزاد و همچنین نانوذرات بارگذاری شده با 7-BIO به‏مدت 24 و 48 ساعت تیمار شدند. نتایج آزمایش توسط آنالیز آماری One-Way ANOVA مورد بررسی قرار گرفت.

 

 

نمودار 4 (B و A) میزان زنده­مانی سلول­های MCF-7 تیمار شده­ را نشان می­دهد. در تیمار 24 ساعته، غلظت IC50 برای 7-BIO آزاد 20 میکرومولار مشخص شد. در این بازه زمانی، اثرگذاری 7-BIO آزاد در غلظت­های 15 و 20 میکرومولار به‏طور معنی داری بیش­تر از 7-BIO بارگذاری ­شده بود. اما با گذشت 48 ساعت، اثرگذاری 7-BIO بارگذاری شده بیشتر از 7-BIO آزاد شد. غلظت IC50 در 48 ساعت، برای 7-BIO آزاد و 7-BIO بارگذاری شده به­ترتیب 15 و 10 میکرومولار مشخص شد.

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 4: بررسی میزان زنده­مانی سلول­های MCF-7 تیمار شده با 7-BIO آزاد و همچنین 7-BIO بارگذاری شده بر نانوذرات آلبومینی به‫مدت 24 ساعت A)) و 48 ساعت (B) با استفاده از آزمون MTT ) 3p ≤ 0.0001, n=). از حلال DMSO به‫میزان متناظر با نمونه­های حاوی دارو و به‫عنوان کنترل استفاده شد.

 

 

بررسی آپوپتوزیس سل لاین سرطان سینه با استفاده از رنگ آمیزی آکریدین­اورنج و اتیدیوم­بروماید

به‏منظور بررسی مرگ سلول­های تیمار شده بر اثر آپوپتوزیس، از رنگ­آمیزی آکریدین­ اورنج و اتیدیوم بروماید استفاده شد. رنگ آکریدین­اورنج با برهمکنش با  DNA سلول زنده ایجاد رنگ سبز فلورسنس می‫کند. این در حالی است که اتیدیوم بروماید تنها از غشاهای آسیب دیده عبور می­کند و وارد DNA سلول­های آپوپتوزیس شده و آن‫ها را به رنگ نارنجی در می‫آورد (29).

 سلول­های MCF-7 با غلظت 15 میکرومولار 7-BIO آزاد و همچنین نانوذرات بارگذاری شده با 7-BIO به‏مدت 48 ساعت تیمار شدند.

پس از رنگ‫آمیزی آکریدین­اورنج و اتیدیوم بروماید سلول‫ها با میکروسکوپ فلورسنس تصویربرداری شدند. در شکل 3 سلول­های نارنجی-قهوه­ای معرف آپوپتوزیس هسنتد که با فلش آبی مشخص شده­اند. نتایج نشان دادند که در سلول­های تیمار شده با 7-BIO و نانوذرات بارگذاری شده میزان سلول‫های دچار آپوپتوزیس بیشتر از سلول‫های تیمار نشده مشاهده می‫شوند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: نمونه­هایی از تصاویر میکروسکوپ فلورسنس حاصل از رنگ­آمیزی آکریدین­ اورنج و اتیدیوم­بروماید  MCF-7 تیمار شده با: 1) نمونه کنترل 2) DMSO 3) نانوذرات آلبومینی 4) 7-BIO 5) نانوذرات آلبومینی بارگذاری شده با 7-BIO به‫مدت (48 ساعت). سلول­های آپوپتوزیس شده در شکل با فلش مشخص شده‫اند.

 

بررسی فعالیت آنزیم گلیکوژن سنتاز کیناز3 بتا در سلول­های تیمار شده

با توجه به نقش مهارکنندگی ایندیروبین­ها بر فعالیت آنزیم  GSK-3βاز طریق فسفریلاسیون آن، اثر نانوذرات آلبومینی بارگذاری­شده با 7-BIO بر میزان فسفریلاسیون GSK-3β (شکل غیر فعال این آنزیم) با روش وسترن بلاتینگ بررسی شد. پس از تیمار سلول­های سرطانی MCF-7  با غلظت 3 میکرومولار 7-BIO آزاد و نانوذرات بارگذاری­ شده با 7-BIO به‏مدت 24 ساعت و استخراج پروتئین سلولی، ایمونوبلاتینگ انجام شد (شکل 4).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4: وسترن بلاتینگ برای نمایاندن بیان آنزیم فسفریله (pGSK-3β, 47 KDa) و آنزیم کل ( GSK-3β, 47 KDa) پس از تیمار سلول­ها با نانوذرات بارگذاری شده با 7-BIO در مقایسه با 7-BIO آزاد

 

 

با استفاده از نرم افزار Quantity One میزان شدت باندها محاسبه شد. نسبت آنزیم فسفریله به آنزیم کل در نمونه ی کنترل 1 در نظر گرفته شد و تغییرات مشاهده شده در این نسبت در نمونه­ها­ی تیمار شده با کنترل سنجیده شد. نتایج نهایی نشان داد که میزان فسفریلاسیون GSK-3β پس از تیمار با 7-BIO آزاد، 06/3 برابر و پس از تیمار با نانوذرات بارگذاری­شده با 7-BIO، 4/2 برابر افزایش می یابد (نمودار 5).

 

 

 

نمودار 5: بررسی میزان بیان آنزیم فسفریله (pGSK-3β) به آنزیم کل (GSK-3β) در سلول­های تیمار شده  با نانوذرات بارگذاری شده با 7-BIO و 7-BIO آزاد n=2)­­­ p ≤ 0.0001 , *** p≤0.001 , * p≤0.05  ****).

 

آنالیزهای آماری نشان دهنده اختلاف معنی­دار بین حالت کنترل با حالت­های تیمار شده با 7-BIO آزاد و نانوذرات آلبومینی بارگذاری­شده با 7-BIO است. میزان فسفریلاسیون GSK-3β در سلول­های تیمار شده با 7-BIO آزاد بیشتر از سلول­های تیمار شده با نانوذرات آلبومینی بارگذاری شده با 7-BIO است (p≤ 0.05).

نتایج نهایی مربوط به سلول­های MCF-7 نشان داد که میزان فسفریلاسیون GSK-3β پس از تیمار با 7-BIO آزاد و نانوذرات بارگذاری شده با 7-BIO، 2/2 برابر افزایش یافت (شکل 4). آنالیز­های آماری نشان دهنده اختلاف معنی­دار بین حالت کنترل با حالت­های تیمار شده با ترکیب 7-BIO آزاد و نانوذرات آلبومینی بارگذاری شده با 7-BIO است.

 

بحث

هدف از انجام این تحقیق، طراحی یک سامانه دارو رسانی با استفاده از نانوذرات آلبومینی، به‏­منظور
بهبود اثرگذاری 7-BIO بر سلول­های سرطانی سینه بود و در طی آن با پاسخ به سؤالات زیر در این راستا گام برداشته شد:

چگونه می­توان نانوذرات آلبومینی با متوسط قطر مناسب و همگن به دست آورد؟

نانوذرات و متوسط قطر آن­ها در حمل داروها نقش اساسی دارد، یکی از راه­های دستیابی به این هدف استفاده از غلظت­های مناسب ماده­ی اولیه برای سنتز نانوذرات است. نانوذرات کوچکتر از 200 نانومتر، ورود آسان­تری به منطقه توموری را دارند (1).

Desai و همکاران (30) نشان دادند که ورود نانوذرات با اندازه 100 نانومتر به سلول­های سرطانی روده (Caco-2)، 5/2 برابر نانوذرات با اندازه 1000 نانومتر است. در مطالعه انجام شده توسط Jose و همکاران در سال 2015، میانگین اندازه نانوذرات آلبومین سنتز شده به‏منظور بارگذاری متفورمین Metformin، 97 نانومتر بوده است (3, 22).

با توجه به یافته­هایی که اشاره شدند در این تحقیق نیز مبادرت به سنتز نانوذرات با اندازه­ی کمتر از 200 نانومتر شد و با آزمون غلظت­های متفاوتی از آلبومین، دریافت شد که غلظت اولیه 10 میلی­گرم بر میلی ­لیتر آلبومین ذراتی کروی با متوسط قطر 7± 42/89 نانومتر بدست می­دهند که به این ترتیب این نانوذرات به­دلیل همگنی بیشتر و همچنین استفاده کمتر آلبومین برای حمل دارو، یعنی بارگذاری 7-BIO مورد استفاده قرار گرفتند.

آیا نانوذرات آلبومینی می­توانند به­عنوان حامل 7-BIO محسوب شوند؟

در گزارش­های متعدد و شرایط مختلف، میزان بارگذاری داروهای مختلف در نانوذرات آلبومینی متغیر است. به‏طور مثال، بازدهی بارگذاری 5-Fluorocytosine، از  4/12 درصد  تا 65 درصد در نانوذرات آلبومینی گزارش شده است. در تحقیقی مشابه، حداکثر بازدهی بارگذاری داروی Metformin، 92 درصد بوده است (3).

در این تحقیق نیز با بهینه­سازی شرایط لازم برای بارگذاری 7-BIO در نانوذرات آلبومینی به بازدهی و ظرفیت بارگذاری به‏ترتیب 9/1±53/31 و 97/0±76/15 درصد میکروگرم 7-BIO بر میلی­گرم نانوذرات انتخاب شدند.

بعد از بارگذاری دارو، بررسی رهایش آن از نانوذرات در شرایط مختلف، حائز اهمیت است. محیط PBS قادر به القای رهایش 7-BIO از نانوذرات آلبومینی حتی پس از سه روز هم نبود. همچنین، اضافه کردن مقادیر مختلف گلوتارآلدئید بر میزان رهایش دارو تاثیر نداشت. اضافه کردن SDS معمولا به‏دلیل برهم‫کنش­های آن با مولکولهای آلبومین و همچنین داروی قرار گرفته درون نانوذرات می­تواند بر رهایش ترکیب موثر باشد (28).

نتایج ما نشان داد که اضافه کردن SDS نیز باعث رهایش 7-BIO نمی­شود. شاید این امر به‏دلیل ویژگی­های آبگریزی شدید 7-BIO باشد، که با یکدیگر و همچنین با بخش­هایی از ساختار آلبومین حاوی خواص آبگریزی، برهمکنش­های جذبی پایداری را برقرار کرده و لذا درون ساختار نانوذرات آلبومینی باقی ­مانده و رها نمی­شوند. در تحقیقات مشابهی که توسط محققین دیگر در زمینه رهایش داروهای آبگریز از نانوذرات آلبومینی انجام شده است نتایج متفاوتی را نشان می­دهد. به‏طور مثال، بیش از90 درصد داروی Paclitaxel، طی مدت 20 ساعت از نانوذرات آلبومینی رها شد (23). در مطالعه دیگر، 50 درصد از رهایش داروی آبگریز Metformin طی 24 ساعت و 40 درصد دیگر تا 72 ساعت انجام شد (22).

همانطور که ذکر شد، تفاوت مشاهده شده میان نتایج این تحقیق و تحقیقات دیگران، می­تواند به­دلیل خاصیت آبگریزی بیشتر 7-BIO در مقایسه با دیگر ترکیبات مورد استفاده در سایر گزارش­ها باشد. از آنجایی‫‏که حلال­های قطبی با اثرگذاشتن بر اتصالات الکترواستاتیکی، باندهای هیدروژنی و برهمکنش­های آبگریز بین مولکولی باعث تغییر شکل فضایی پروتئین­ها و ناپایداری آن­ها میشود، برای اثبات وجود دارو در نانوذرات می­توان از این حلال­ها مانند اتانل یا استونیتریل برای تخریب نانوذرات پروتئینی و خارج کردن دارو استفاده کرد (19, 21). در این تحقیق، با اضافه کردن اتانل، خروج 7-BIO از نانوذرات تخریب شده مشاهده شد که بیانگر حمل 7-BIO توسط نانوذرات آلبومینی می‏باشد.

آیا نانوذرات آلبومینی سنتز شده بهتنهایی برای سلول­های MCF-7، سمی هستند؟

یکی از شرایط لازم و ضروری نانو حامل­های مورد استفاده در دارو­ رسانی، غیر سمی بودن آن است. تاکنون بررسی‏های سایر محققین نشان داده است که نانوذرات آلبومینی به تنهایی سمی نیستند. به‫طور مثال Tirkey و همکاران (3) با بررسی اثر سمیت نانوذرات آلبومینی (با متوسط قطر 6/212 نانومتر) بر سلول­های ریه رده L132، غیر سمی بودن این نانوذرات را نشان دادند. علاوه بر آن، تجویز (به‏صورت استنشاقی) نانوذرات آلبومینی در یک محدوده‏ی دوز وسیع (2، 20 و 390 میکروگرم برای هر حیوان) به ریه­های موش (BALB/C mice) نشان داد که این نانوذرات تنها در دوز­های بالا موجب التهاب خفیف می­شود (4).

نتایج به‏دست آمده­ی ما نیز نشان داد که استفاده از نانوذرات سنتز شده به‫تنهایی بر بقای سلول­ها تأثیر نمی‏گذارد. به‏این‏ترتیب هرگونه آثار مشاهده شده بر بقای سلولی را می­توان منتسب به 7-BIO دانست.

چه تفاوتی میان میزان غلظت­های استفاده شده از 7-BIO بارگذاری شده در نانوذرات در مقایسه با 7-BIO آزاد در ایجاد آپوپتوزیس در سلول سرطان سینه وجود دارد؟

نتایج به‏دست آمده­ی ما از سنجش زنده­مانی سلول­های تیمار شده نشان می­دهد که 7-BIO آزاد، زنده­­مانی سلول­ها را طی مدت 24 ساعت بسیار بیشتر از 7-BIO بارگذاری شده در نانوذرات آلبومینی کاهش می­دهد. این امر می­تواند بهدلیل آزاد نشدن 7-BIO از نانوذرات طی 24 ساعت اول باشد. اما با گذشت 48 ساعت، 7-BIO بارگذاری شده به‏میزان قابل توجهی بیش از 7-BIO آزاد زنده­مانی سلول­ها را کاهش می­دهد. با توجه به خاصیت شدید آبگریزی 7-BIO آزاد، میزان کمتری از آن به درون سلول وارد می­شود، در حال‏یکه پس از بارگذاری آن در نانوذرات آلبومینی این خاصیت آبگریزی به حداقل می‏رسد. لذا پس از 48 ساعت که نانوذرات زمان کافی برای ورود به سلول را دارند و به­دلیل عوامل موجود در سلول از جمله مکانیسم فعال در لیزوزوم­ها و یا آنزیم­های درون سلولی، نانوذرات تخریب شده و رها سازی دارو انجام می­شود و میزان زنده­مانی سلول­ها به شدت کاهش می‏یابد. این امر، برای 7-BIO آزاد برعکس است به‫عبارتی دیگر، اثر کوتاه مدت آن زیاد و اثر طولانی مدت آن به‏دلیل عدم ماندگاری در محیط پایین است.

به‏طورکلی، استفاده از سامانه دارو ­رسانی مبتنی بر نانوذرات آلبومینی، حلالیت داروهای آبگریز متصل به نانوذرات را در پلاسما افزایش می­دهد و ویژگی­های فارماکوکینتیک مولکول­های دارو را در محیط زیستی بهبود می­بخشد. Singh و همکاران (31) نشان دادند داروی ضد توموری و آبگریز Ginsenoside بارگذاری شده در نانوذرات آلبومینی نسبت به داروی آزاد کاهش معنی­داری را در میزان زنده­مانی سلول­های سرطانی ریه، کولون و کبد ایجاد می­کند.

همچنین Zhao و همکارانش (23) افزایش اثرگذاری داروی آبگریز Paclitaxel در سلول­ سرطانی سینه رده MCF-7 با استفاده از نانو ذرات آلبومین در سال 2014 گزارش کردند. کاهش حجم و وزن تومور در اثر تیمار با نانوذرات آلبومینی بارگذاری شده با داروهای Disulfiram و Regorafenib در مطالعات in vivo، نیز بهبود اثر گذاری داروهای بارگذاری شده در نانوذرات را تائید می­کند (28). بدین ترتیب امروزه استفاده از این نانوذرات برای بهبود اثر گذاری و کاهش دوز داروها گزینه جذابی می­باشد.

آیا 7-BIO بارگذاری شده در نانوذرات آلبومینی قادر به ایفای نقش بیولوژیکی خود یعنی مهار آنزیم GSK-3β است؟ نتایج نهایی ما پس از تیمار با 7-BIO آزاد و 7-BIO بارگذاری شده بر نانوذرات نشان داد که میزان فسفریلاسیون GSK-3β (شکل غیر فعال این آنزیم) به‏طور معناداری افزایش می یابد. این یافته­ها حاکی از آن است که 7-BIO بارگذاری شده مشابه 7-BIO آزاد قادر به مهار GSK-3β  است.

بر اساس مطالعات متعدد گذشته‏ی سایر محققین، مهارGSK-3β  توسط ایندیروبین­ها (به‏صورت داروی آزاد) صورت می­گیرد. قدرت ایندیروبین­ها در مهار GSK-3β با روش­های مختلفی ازجمله بررسی فسفریلاسیون سوبسترا­های GSK-3β و یا اندازه گیری فعالیت کینازی آن بررسی شده­ است (32-34).

اگرچه نقش و فعالیت GSK-3β در پیشرفت یا سرکوب تومور همچنان مورد بحث است. شواهد متضادی در ارتباط با فعال یا غیرفعال بودن GSK-3β در سرطان­های مختلف گزارش شده است (35). بعضی از این مطالعات به نقش ضد توموری GSK-3β در حالت فعال اشاره می‏کنند. بهطور مثال، در سال 2010 گزارش شد که %2/47 از بیماران مورد مطالعه­ی­ مبتلا به سرطان سینه، دارای سطح بالایی از GSK-3β فسفریله بودند (36).

در مطالعه مشابه دیگری، کاهش سطح بیان GSK-3β در سلول­های سرطان پوست مشاهده شد. احتمالا در این موارد، GSK-3β فعال از طریق مسیر Wnt/β-catenin موجب ارتقا و توسعه تومور می­شود (37, 38). مطالعات متضادی نیز اشاره به نقش GSK-3β در پیشرفت تومور و تکثیر سلول­های سرطانی داشته‏اند.

این مطالعات، پیشنهاد می­کنند که مهار فعالیت این آنزیم به کاهش بقا و تکثیر سلول­های سرطانی کمک می­کند. همچنین در راستای این فرضیه، آزمایشات این محققین نشان داد که فعالیت و سطح بیان GSK-3β در سلولهای سرطانی کلون و کولورکتال بیشتر از حالت طبیعی است. مطالعات مشابه نیز موید اهمیت مهار این آنزیم در سرکوب تومور انجام شد.

به‏طور مثال، مهار این آنزیم با استفاده از دارو یا RNAهای تداخلی، در کاهش بقا و تکثیر سلول­های سرطانی کلون در محیط آزمایشگاه و در موجود زنده بودند (36, 37, 39). در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد که مهار GSK-3β توسط 7-BIO با کاهش زنده­مانی سلول­ها همراه است که همسو با گزارش­های قبلی بیان کننده اهمیت مهار GSK-3β برای درمان سرطان است. همچنین، مطالعه ما نشان داد که 7-BIO بارگذاری شده در نانوذرات آلبومینی مشابه 7-BIO، توانایی مهار این آنزیم را دارد.

 

نتیجه­گیری

در این تحقیق­، از نانوذرات آلبومینی برای حمل 7-BIO، به­منظور بهبود اثرگذاری بر سلول­ سرطانی سینه MCF-7 استفاده شد. تهیه نانوذرات آلبومینی با اندازه مناسب و بارگذاری 7-BIO بر این نانوذرات صورت گرفت. نانوذرات بارگذاری شده با 7-BIO قابلیت بیشتری در ایجاد سمیت در غلظت­های کمتر نسبت به 7-BIO آزاد دارد و قادر به مهار آنزیم GSK-3β هستند، پس، می­توان ادعا کرد که نانوذرات آلبومینی گزینه مناسبی برای حمل 7-BIO به­‏منظور افزایش اثرگذاری آن بر سلول­های سرطانی سینه هستند. 

 

تشکر و قدردانی

این پروژه در قالب قرار داد شماره ی 640-I-601- 511  در پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری به انجام رسیده است. ساخت و کونژوگه ساختن نانو ذرات با 7-BIO با راهنمایی های جناب آقای دکتر آرپنایی عضو هیات علمی پژوهشکده ی صنعت پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری به انجام رسیده است که از ایشان تشکر و قدردانی ویژه می‫شود.

 

منابع

1. Kouchakzadeh H, Safavi MS, Shojaosadati SA. Efficient delivery of therapeutic agents by using targeted albumin nanoparticles. Adv Protein Chem Struct Biol. 2015; 98: 121-143.

2. Karimi M, Bahrami S, Ravari SB, Zangabad PS, et al. Albumin nanostructures as advanced drugdelivery systems. Expert Opin Drug Deliv 2016; 13(11): 1609-1623.

3. Tirkey B, Bhushan B, Uday Kumar S, Gopinath P. Prodrug encapsulated albumin nanoparticles as an alternative approach to manifest anti-proliferative effects of suicide gene therapy. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2017; 73: 507-515.

4. Woods A, Patel A, Spina D, Riffo-Vasquez Y, et al. In vivo biocompatibility, clearance, and biodistribution of albumin vehicles for pulmonary drug delivery. J Control Release 2015; 210: 1-9.

5. Elzoghby AO, Samy WM, Elgindy NA. Albumin-based nanoparticles as potential controlled release drug delivery systems. J Control Release 2012; 157(2): 168-182.

6. Irache JM, Merodio M, Arnedo A, Camapanero MA, et al. Albumin Nanoparticles for the Intravitreal Delivery of Anticytomegaloviral Drugs. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 2005; 5(3): 293-305.

7. Wilson B, Lavanya Y, Priyadarshini SR, Ramasamy M, et al. Albumin nanoparticles for the delivery of gabapentin: preparation, characterization and pharmacodynamic studies. Int J Pharm 2014; 473: 73-79.

8. Zhao D, Zhao X, Zu Y, Li J, et al. Preparation, characterization, and in vitro targeted delivery of folate-decorated paclitaxel-loaded bovine serum albumin nanoparticles. Int J Nanomedicine. 2010; 5: 669-677.

9. Zu Y, Zhang Y, Zhao X, Zhang Q, et al. Optimization of the preparation process of vinblastine sulfate (VBLS)-loaded folate-conjugated bovine serum albumin (BSA) nanoparticles for tumor-targeted drug delivery using response surface methodology (RSM). Int J Nanomedicine 2009; 4: 321-333.

10. Dadparvar M, Wagner S, Wien S, Kufleitner J, et al. HI 6 human serum albumin nanoparticles--development and transport over an in vitro blood-brain barrier model. Toxicol Lett 2011; 206(1): 60-66.

11. Das S, Bellare JR, Banerjee R. Protein based nanoparticles as platforms for aspirin delivery for ophthalmologic applications. Colloids Surf B Biointerfaces 2012; 93: 161-168.

12. Marko D, Schatzle S, Friedel A, Genzlinger A, et al. Inhibition of cyclin-dependent kinase 1 (CDK1) by indirubin derivatives in human tumour cells. Br J Cancer 2001; 84(2): 283-289.

13. Wei YF, Su J, Deng ZL, Zhu C, et al. [Indirubin inhibits the proliferation of prostate cancer PC-3 cells]. Zhonghua Nan Ke Xue 2015; 21(9): 788-791.

14. Shi J, Shen HM. Critical role of Bid and Bax in indirubin-3'-monoxime- Biochem Pharmacol 2008; 75(9): 1729-1742.

induced apoptosis in human cancer cells.

 

15. Lee JW, Moon MJ, Min HY, Chung HJ, et al. Induction of apoptosis by a novel indirubin-5-nitro-3'-monoxime, a CDK inhibitor, in human lung cancer cells. Bioorg Med Chem Lett 2005; 15: 3948-3952.

16. Blažević T, Heiss EH, Atanasov AG, Breuss JM, et al. Indirubin and Indirubin Derivatives for Counteracting Proliferative Diseases. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015; 2015:654098. 1-12.

17. Mohammad-Beigi H, Shojaosadati SA, Morshedi D, Mirzazadeh N, et al. The Effects of Organic Solvents on the Physicochemical Properties of Human Serum Albumin Nanoparticles. Iran J Biotechnol. 2016; 14(1): 45-50.

18. Tarhini M, Benlyamani I, Hamdani S, Agusti G, et al. Protein-Based Nanoparticle Preparation via Nanoprecipitation Method. 2018; 11(3): E394.

 19. Liu R, Qin P, Wang L, Zhao X, et al. Toxic effects of ethanol on bovine serum albumin. J Biochem Mol Toxicol 2010; 24(1): 66-71.

20. Zhao P, Yin W, Wu A, Tang Y, et al. Dual-Targeting to Cancer Cells and M2 Macrophages via Biomimetic Delivery of Mannosylated Albumin Nanoparticles for Drug-Resistant Cancer Therapy. Advanced Functional Materials 2017; 27: 1700403.

21. Qi L, Guo Y, Luan J, Zhang D, et al. Folate-modified bexarotene-loaded bovine serum albumin nanoparticles as a promising tumor-targeting delivery system. Journal of Materials Chemistry B 2014; 2: 8361-8371.

22. Jose P, Sundar K, Anjali CH, Ravindran A. Metformin-loaded BSA nanoparticles in cancer therapy: a new perspective for an old antidiabetic drug. Cell Biochem Biophys 2015; 71(2): 627-636.

23. Zhao L, Zhou Y, Gao Y, Ma S, et al. Bovine serum albumin nanoparticles for delivery of tacrolimus to reduce its kidney uptake and functional nephrotoxicity. Int J Pharm 2015; 483 (1-2)::180-187.  

24. Edsall JT. Edwin Joseph Cohn (1892–1953). Biographical Memoirs 1961; 35: 47-83.

25. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72)1–2(: 248-254.

26. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology 1992; 24: 145-149.

27. Wiedemann E. Ueber Fluorescenz und Phosphorescenz I. Abhandlung. Annalen der Physik 1888; 270(7): 446-463.

28. Zhao P, Wang Y, Kang X, Wu A, et al. Dual-targeting biomimetic delivery for anti-glioma activity via remodeling the tumor microenvironment and directing macrophage-mediated immunotherapy. 2018; 9(10): 2674-2689.

29. Ribble D, Goldstein NB, Norris DA, Shellman YG. A simple technique for quantifying apoptosis in 96-well plates.BMC Biotechnology. 2005; 5: 12.

30. Desai MP, Labhasetwar V, Walter E, Levy RJ, et al. The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent. Pharm Res 1997; 14(11): 1568-1573.

31. Singh P, Singh H, Castro-Aceituno V, Ahn S, et al. Bovine serum albumin as a nanocarrier for the efficient delivery of ginsenoside compound K: preparation, physicochemical characterizations and in vitro biological studies. RSC Advances 2017; 7: 15397-15407.

32. Meijer L, Skaltsounis A-L, Magiatis P, Polychronopoulos P, et al. GSK-3-selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins. Chemistry & biology 2003; 10(12): 1255-1266.

33. Vougogiannopoulou K, Skaltsounis A-L. From Tyrian Purple to Kinase Modulators: Naturally Halogenated Indirubins and Synthetic Analogues. Planta Medica 2012; 78(14): 1515-1528.

34. Leclerc S, Garnier M, Hoessel R, Marko D, et al. Indirubins inhibit glycogen synthase kinase-3 beta and CDK5/p25, two protein kinases involved in abnormal tau phosphorylation in Alzheimer's disease. A property common to most cyclin-dependent kinase inhibitors? J Biol Chem 2001; 276(1): 251-260.

35. McCubrey JA, Steelman LS, Bertrand FE, Davis NM, et al. GSK-3 as potential target for therapeutic intervention in cancer. 2014;5(10): 2881-911

36. Armanious H, Deschenes J, Gelebart P, Ghosh S, et al. Clinical and biological significance of GSK-3beta inactivation in breast cancer-an immunohistochemical study. Hum Pathol 2010; 41(12): 1657-1663.

37. Luo J. Glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) in tumorigenesis and cancer chemotherapy. Cancer Lett 2009; 273(2): 194-200.

38. Ma C, Wang J, Gao Y, Gao T-W, et al. The Role of Glycogen Synthase Kinase 3β in the Transformation of Epidermal Cells. Cancer Research 2007; 67: 7756-7764.

39. Shakoori A, Ougolkov A, Yu ZW, Zhang B, et al. Deregulated GSK3β activity in colorectal cancer: Its association with tumor cell survival and proliferation. Biochemical and Biophysical Research Communications 2005; 334(4): 1365-1373.

1. Kouchakzadeh H, Safavi MS, Shojaosadati SA. Efficient delivery of therapeutic agents by using targeted albumin nanoparticles. Adv Protein Chem Struct Biol. 2015; 98: 121-143.

2. Karimi M, Bahrami S, Ravari SB, Zangabad PS, et al. Albumin nanostructures as advanced drugdelivery systems. Expert Opin Drug Deliv 2016; 13(11): 1609-1623.

3. Tirkey B, Bhushan B, Uday Kumar S, Gopinath P. Prodrug encapsulated albumin nanoparticles as an alternative approach to manifest anti-proliferative effects of suicide gene therapy. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2017; 73: 507-515.

4. Woods A, Patel A, Spina D, Riffo-Vasquez Y, et al. In vivo biocompatibility, clearance, and biodistribution of albumin vehicles for pulmonary drug delivery. J Control Release 2015; 210: 1-9.

5. Elzoghby AO, Samy WM, Elgindy NA. Albumin-based nanoparticles as potential controlled release drug delivery systems. J Control Release 2012; 157(2): 168-182.

6. Irache JM, Merodio M, Arnedo A, Camapanero MA, et al. Albumin Nanoparticles for the Intravitreal Delivery of Anticytomegaloviral Drugs. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 2005; 5(3): 293-305.

7. Wilson B, Lavanya Y, Priyadarshini SR, Ramasamy M, et al. Albumin nanoparticles for the delivery of gabapentin: preparation, characterization and pharmacodynamic studies. Int J Pharm 2014; 473: 73-79.

8. Zhao D, Zhao X, Zu Y, Li J, et al. Preparation, characterization, and in vitro targeted delivery of folate-decorated paclitaxel-loaded bovine serum albumin nanoparticles. Int J Nanomedicine. 2010; 5: 669-677.

9. Zu Y, Zhang Y, Zhao X, Zhang Q, et al. Optimization of the preparation process of vinblastine sulfate (VBLS)-loaded folate-conjugated bovine serum albumin (BSA) nanoparticles for tumor-targeted drug delivery using response surface methodology (RSM). Int J Nanomedicine 2009; 4: 321-333.

10. Dadparvar M, Wagner S, Wien S, Kufleitner J, et al. HI 6 human serum albumin nanoparticles--development and transport over an in vitro blood-brain barrier model. Toxicol Lett 2011; 206(1): 60-66.

11. Das S, Bellare JR, Banerjee R. Protein based nanoparticles as platforms for aspirin delivery for ophthalmologic applications. Colloids Surf B Biointerfaces 2012; 93: 161-168.

12. Marko D, Schatzle S, Friedel A, Genzlinger A, et al. Inhibition of cyclin-dependent kinase 1 (CDK1) by indirubin derivatives in human tumour cells. Br J Cancer 2001; 84(2): 283-289.

13. Wei YF, Su J, Deng ZL, Zhu C, et al. [Indirubin inhibits the proliferation of prostate cancer PC-3 cells]. Zhonghua Nan Ke Xue 2015; 21(9): 788-791.

14. Shi J, Shen HM. Critical role of Bid and Bax in indirubin-3'-monoxime- Biochem Pharmacol 2008; 75(9): 1729-1742.

induced apoptosis in human cancer cells.

 

15. Lee JW, Moon MJ, Min HY, Chung HJ, et al. Induction of apoptosis by a novel indirubin-5-nitro-3'-monoxime, a CDK inhibitor, in human lung cancer cells. Bioorg Med Chem Lett 2005; 15: 3948-3952.

16. Blažević T, Heiss EH, Atanasov AG, Breuss JM, et al. Indirubin and Indirubin Derivatives for Counteracting Proliferative Diseases. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015; 2015:654098. 1-12.

17. Mohammad-Beigi H, Shojaosadati SA, Morshedi D, Mirzazadeh N, et al. The Effects of Organic Solvents on the Physicochemical Properties of Human Serum Albumin Nanoparticles. Iran J Biotechnol. 2016; 14(1): 45-50.

18. Tarhini M, Benlyamani I, Hamdani S, Agusti G, et al. Protein-Based Nanoparticle Preparation via Nanoprecipitation Method. 2018; 11(3): E394.

 19. Liu R, Qin P, Wang L, Zhao X, et al. Toxic effects of ethanol on bovine serum albumin. J Biochem Mol Toxicol 2010; 24(1): 66-71.

20. Zhao P, Yin W, Wu A, Tang Y, et al. Dual-Targeting to Cancer Cells and M2 Macrophages via Biomimetic Delivery of Mannosylated Albumin Nanoparticles for Drug-Resistant Cancer Therapy. Advanced Functional Materials 2017; 27: 1700403.

21. Qi L, Guo Y, Luan J, Zhang D, et al. Folate-modified bexarotene-loaded bovine serum albumin nanoparticles as a promising tumor-targeting delivery system. Journal of Materials Chemistry B 2014; 2: 8361-8371.

22. Jose P, Sundar K, Anjali CH, Ravindran A. Metformin-loaded BSA nanoparticles in cancer therapy: a new perspective for an old antidiabetic drug. Cell Biochem Biophys 2015; 71(2): 627-636.

23. Zhao L, Zhou Y, Gao Y, Ma S, et al. Bovine serum albumin nanoparticles for delivery of tacrolimus to reduce its kidney uptake and functional nephrotoxicity. Int J Pharm 2015; 483 (1-2)::180-187.  

24. Edsall JT. Edwin Joseph Cohn (1892–1953). Biographical Memoirs 1961; 35: 47-83.

25. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72)1–2(: 248-254.

26. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology 1992; 24: 145-149.

27. Wiedemann E. Ueber Fluorescenz und Phosphorescenz I. Abhandlung. Annalen der Physik 1888; 270(7): 446-463.

28. Zhao P, Wang Y, Kang X, Wu A, et al. Dual-targeting biomimetic delivery for anti-glioma activity via remodeling the tumor microenvironment and directing macrophage-mediated immunotherapy. 2018; 9(10): 2674-2689.

30. Desai MP, Labhasetwar V, Walter E, Levy RJ, et al. The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent. Pharm Res 1997; 14(11): 1568-1573.

31. Singh P, Singh H, Castro-Aceituno V, Ahn S, et al. Bovine serum albumin as a nanocarrier for the efficient delivery of ginsenoside compound K: preparation, physicochemical characterizations and in vitro biological studies. RSC Advances 2017; 7: 15397-15407.

32. Meijer L, Skaltsounis A-L, Magiatis P, Polychronopoulos P, et al. GSK-3-selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins. Chemistry & biology 2003; 10(12): 1255-1266.

33. Vougogiannopoulou K, Skaltsounis A-L. From Tyrian Purple to Kinase Modulators: Naturally Halogenated Indirubins and Synthetic Analogues. Planta Medica 2012; 78(14): 1515-1528.

34. Leclerc S, Garnier M, Hoessel R, Marko D, et al. Indirubins inhibit glycogen synthase kinase-3 beta and CDK5/p25, two protein kinases involved in abnormal tau phosphorylation in Alzheimer's disease. A property common to most cyclin-dependent kinase inhibitors? J Biol Chem 2001; 276(1): 251-260.

35. McCubrey JA, Steelman LS, Bertrand FE, Davis NM, et al. GSK-3 as potential target for therapeutic intervention in cancer. 2014;5(10): 2881-911

36. Armanious H, Deschenes J, Gelebart P, Ghosh S, et al. Clinical and biological significance of GSK-3beta inactivation in breast cancer-an immunohistochemical study. Hum Pathol 2010; 41(12): 1657-1663.

37. Luo J. Glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) in tumorigenesis and cancer chemotherapy. Cancer Lett 2009; 273(2): 194-200.

38. Ma C, Wang J, Gao Y, Gao T-W, et al. The Role of Glycogen Synthase Kinase 3β in the Transformation of Epidermal Cells. Cancer Research 2007; 67: 7756-7764.

39. Shakoori A, Ougolkov A, Yu ZW, Zhang B, et al. Deregulated GSK3β activity in colorectal cancer: Its association with tumor cell survival and proliferation. Biochemical and Biophysical Research Communications 2005; 334(4): 1365-1373.