اثر بتا آمینو بوتیریک اسیدBABA) ) در القا مقاومت در گوجه‌فرنگی آلوده به باکتری Pseudomonas syringae pv. Syringa

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه شیراز، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی، شیراز، ایران

چکیده

هدف: به‫منظور بررسی اثر بتا آمینو بوتیریک اسید (BABA‫) در القا مقاومت سیستمیک در گوجه­فرنگی آلوده به باکتری Pseudomonas syringae pv. syringa این مطالعه انجام پذیرفت.
مواد و روش­ها: گیاهان گوجه­فرنگی رقم مجار در مرحله‫ی چهار برگی انتخاب شدند. برای هر گلدان 70 میلی‫لیتر محلول 250 میلی‫مولار، از BABA تهیه شد. محلول فوق روی برگ­های گیاه اسپری شد. گلدان­های تیمار شده درشرایط کنترل شده (‫16 ساعت روشنایی با دمای 30 درجه سانتی‫گراد و هشت ساعت تاریکی با دمای 25 درجه سانتی‫گراد) به‫مدت 2 روز قبل از القا باکتری نگه­داری شدند. پس از دو روز، باکتری به گیا‫ه تلقیح شد.RNA  کل از برگ­ها در زمان­های صفر، 24، 72، 96 ساعت پس از تلقیح باکتری استخراج شد. cDNA سنتز شد و الگوی بیان ژن به‫روشRT – PCR  مورد سنجش و بررسی قرار گرفت.
نتایج: میزان بیان سه ژن مرتبط با دفاع (‫PR1، NCED و SPR2)، در نتیجه آلودگی با باکتری افزایش می­یابد. با این‫حال، پیش­تیمار با BABA منجر به افزایش معنی­داری در بیان ژن­های مقاومت در پاسخ به چالش پاتوژن نسبت به گیاه شاهد شد و علایم ظاهری بیماری (به‫صورت لکه­های گرد و نامنظم تا قهوه­ای و سیاه با کلروز‫) که باعث خسارت در گوجه­فرنگی می­شود، کاهش یافت.
نتیجه­گیری: .پیش­تیمار گیاه توسط BABA باعث تقویت سیستم دفاعی گیاه می­شود و اثر بخشی فوق­العاده این القاگر را در ایجاد مقاومت در گیاه را نشان می­دهد. در نتیجه می­توان از این القاگر در جهت کنترل a P. syringae pv. Syring در گوجه­فرنگی استفاده کرد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

تنش به مفهوم تغییر شرایط طبیعی و بهینه فیزیولوژی گیاه است که رشد و توسعه گیاهان را به‫شدت کاهش می­دهد. آفات و بیماری­ها از جمله عوامل تنش­زای زیستی هستند که برروی عملکرد محصولات کشاورزی تاثیر می­گذارند. در 50 سال گذشته، شایع­ترین استراتژی مبارزه با آفات و بیماری­ها، استفاده از آفت­کش­ها و سموم شیمیایی بوده است. در سال­های اخیر کاهش مصرف سموم شیمیایی در انگلیس گزارش شده است. دلیل عمده این کاهش، کاهش آفات و بیماری نیست، بلکه تحقیقاتی است که امروزه خطرات احتمالی سموم شیمیایی را برجسته کرده و منجر به محدودیت در استفاده از آن‫ها شده است (1). با توجه به اهمیت این موضوع، دنیای امروز نیازمند نوآوری روش‫های کنترلی جایگزین برای موفقیت در تولید محصولات کشاورزی با کیفیت و دستیابی به نیازهای غذایی آینده در یک روش پایدار است (1). یکی از روش­های کنترلی، افزایش مکانیسم­های دفاعی گیاهان است. گیاهان در مقابل بیمارگر (پاتوژن) از مکانیسم­های متفاوتی برای دفاع از خود و مقاومت در برابر پاتوژن استفاده می­کنند. ﺗــﺎﻛﻨﻮن اﻧــﻮاع ﻣﺨﺘﻠﻔــﻲ از ﻣﻘﺎوﻣــﺖ ﮔﻴﺎﻫــﺎن ﻋﻠﻴــﻪﺑﻴﻤﺎرﮔﺮﻫﺎی ﮔﻴﺎﻫﻲ ﺷـﻨﺎﺧﺘﻪ ﺷـﺪه اﺳـﺖ ﻛـﻪ ﻣـﻲﺗـﻮان ﺑـﻪ ﻣﻘﺎوﻣــﺖ ﻏﻴﺮ ﻣﻴﺰﺑــﺎﻧﻲ، ﻣﻘﺎوﻣــﺖ القایی و ﻣﻘﺎوﻣﺖ ذاﺗﻲ (basal) ﮔﻴﺎه اﺷﺎره ﻛـﺮد (2). هورمون­های گیاهی از جمله اتیلن (ET)Ethylen ، جاسمونیک­اسید (JA)، اسید آبسیزیکAbsisic acide  (ABA) و اسید سالسیلیک  Salicillic acide  (SA) باعث ایجاد مقاومت ذاتی در گیاه می­شوند. بخشی از مقاومت ذاتی (basal)، مقاومت القایی Induced resistance)) است که این نوع مقاومت در گیاه سالم فعال نیست. مقاومت القایی به وسیله عوامل زیستی یا غیر زیستی در گیاه فعال می­شود.

از انواع مهم مقاومت القایی (Systemic Acquired Resistance) SAR و(Induced Systemic Resistance ISR می­باشند (3).

القایSAR  با افزایش موضعی و سیستمیک SA همراه است. همچنین بیان گروهی از ژن­های وابسته به بیماری‫زایی Pathogenesis-related genes  (PR) همراه با این نوع مقاومت دیده می­شود (4 و 3).

یکی دیگر از انواع مقاومت القایی، ISR می­باشد. باکتری­ها   (Plant growth promoting rhizobacteria) و یا قارچ‫های پاتوژن   promoting fungi) Plant growth) افزایش دهنده­ی رشد گیاهان در محیط ریشه، توانایی ایجاد مقاومت سیستمیک در گیاه را دارند. این قارچ­ها باعث ایجاد و پراکندگی سیگنال درگیاه می­شوند که منجر به ظهور مقاومتی به ‫نام ISR می­شود. در این نوع مقاومت سیگنال‫های اصلی ET و JA می­باشند، ولی تحقیقات اخیر نشان داده است که SA نیز در ایجاد این نوع مقاومت نقش داشته است (5).

مقاومت ناشی از القا در گیاه به‫صورت افزایش بیان ژن­های دفاعی گیاه بر علیه تنش­ها ظاهر می­گردد. امروزه می­توان با استفاده از ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ اﻟﻘﺎ کننده­ی مقاومت در تعدادی از گیاهان، با افزایش دادن ژن­های دفاعی، یک وضعیت فیزیولوژیکی منحصر به فرد بنام مستعد سازی priming) ) ایجادکرد، به‫طوری­که گیاه، وقتی دوباره در معرض استرس قرار گرفت دارای یک قابلیت مقاومت دربرابر بیماری و عامل عفونی است (6). ظرفیت اسید بتا آمینو بوتیریک (β-amino butyric acid) (BABA) برای القا مقاومت در گیاهان در برابر تنش­های زیستی و غیر زیستی سال­ها است که مورد توجه بوده است (7). تا به امروز مشخص شده است که BABA مسیر دفاعی را تقویت می‫کند که مناسب­ترین راه برای مقابله با وضعیت استرس می­باشد (7). BABA معمولا پاسخ­های دفاعی را مستقیما القا نمی­کند، اما گیاه را برای واکنش سریعتر و یا قویتر به استرس آماده می­کند. جالب توجه است که حالت پایه القا شده توسط BABA نیز می­تواند به فرزندان یک گیاه از طریق دانه­های آن انتقال داده شود (7). به‫طور کلی پذیرفته شده است که BABA، یک آمینو اسید غیر پروتئینی و یک عامل پرایمر قوی SAR در گیاهان است. اثرات بالای القا BABA در افزایش مقاومت در بسیاری از سیستم­های بیماری­زای گیاهی نشان داده شده است (8 و 9 و10). به‫علت اهمیت اقتصادی گوجه­فرنگی و اثرات مخرب باکتری P syringae pv. Syringبر روی این گیاه که گاهی بیش از 80 درصد یک گلخانه را تحت تاثیر قرار می­دهد و کاهش قابل توجه­ی در عملکرد گوجه­فرنگی ایجاد می­کند (11) و همچنین به‫منظور پی بردن به ساز و کار ایجاد مقاومت القایی براثر کاربرد  BABAدر گیاه تحت شرایط تنش با این باکتری، این پژوهش طراحی و اجرا شد. در این مطالعه، از سه ژن که در نتیجه­ی القای مقاومت در گیاه افزایش می‫یابند به‫عنوان مارکر استفاده شد. هر گونه تغییر در بیان این سه ژن (Pathogenesis related genes) PR1) نشانگر مقاومت SAR وsystemin-promediated responses (SPR2) و (NCED) 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenaset به‫عنوان مارکرهایی که در ایجاد مقاومتISR  نقش دارند) بیان‫گر ایجاد مقاومت القایی در این تحقیق می­باشد.

مواد و روش‌ها

تهیه گیاه: ابتدا ماسه­ی رودخانه­ای، دوبار به فاصله زمانی یک روز اتوکلاو می­شود. بذر گوجه­فرنگی (Lycopersicon esculentum Mill) در خزانه­ای که خاک اتو کلاو سرد شده در آن وجود دارد کاشته و پس از سه هفته که نشاها رشد کردند به گلدان­های یک کیلوگرمی که حاوی پیت ماس و ماسه به نسبت مساوی بود انتقال دادیم و گلدان­ها در شرایط اتاق کشت (16 ساعت روشنایی با دمای 30 درجه سانتی‫گراد و هشت ساعت تاریکی با دمای 25 درجه سانتی‫گراد) نگه­داری شد. گیاهان 3 مرتبه در هفته و از قسمت زیر گلدانی آبیاری شد. و به‫طور هفتگی با کود هوگلند تغذیه شدند. پس از رسیدن گیاه به مرحله­ی چهار برگی گیاهان به‫وسیله­ی مقادیر تعیین شده از غلظت 250 میلی‫مولار BABA (برای هر گلدان 70 میلی‫لیتر از محلول 250 میلی مولار (BABA) محلول­پاشی شد. در این آزمون از طرح کاملا تصادفی استفاده شد. در این طرح­ها تیمارها به‫طور کاملا تصادفی در کرت­ها قرار می­گیرند، به‫طوری‫که شانس همه­ی تیمارها برای قرار گرفتن در هر یک از طرح­ها با هم برابر است.

تهیه محیط کشت باکتریایی و بیمارگر: محیط کشت مورد استفاده جهت کشت باکتری،Pseudomonas syringae pv. Syringe محیط KB) King and Bertani) می­باشد. برای تهیه­ی جدایه­های سودوموناس، باکتری روی محیطKB  جامد کشت داده شد. بعد از گذشت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‫گراد، باکتری­های تک کلون به محیط کشت سوسپانسیون LB انتقال یافت. سپس سوسپانسیون­های باکتری­یایی در دمای 37 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 24 ساعت نگه­داری­شد. رشد باکتری­ها در محیط کشت را می­توان با خواندن چگالی نوری در 600 نانومتر سنجید.

گیاهان در مرحله­ی چهار برگی توسط BABA محلول­پاشی شدند و پس ازگذشت 48 ساعت، باکتری به گیاه تلقیح شد. تیمارها شامل: گیاه + باکتری، گیاه +BABA+ باکتری، گیاه+ BABA و گیاه شاهد بودند که برای هرکدام 3 تکرار در نظر گرفته شد. میزان ﺑﯿﺎن ژنﻫﺎی PR1، NCED و SPR2 (به ترتیب در نمودارهای 1، 3 و 2 نشان داده شده است) به‫عنوان مارکرهای القایی مقاومت (SAR , ISR) در زمان­های مختلف صفر، 24، 72، 96 ﺳﺎﻋﺖ ﭘﺲ از اﻋﻤﺎل ﺗﻨﺶ، ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از آزﻣﺎﯾﺶ Real Time PCR ﻣﻮرد ﺳﻨﺠﺶ ﻗﺮار ﮔﺮﻓﺖ.

استخراج RNA: استخراج RNA با استفاده از کیت -Plus RNXTM  شرکت سیناژن براساس دستورالعمل شرکت انجام شد.

تیمارDNase: حذف DNA ازRNA  استخراج شده با آنزیم DNase I شرکت Vivantis انجام شد.

سنتز cDNA: سنتزcDNA با استفاده از کیتcDNA synthetase  شرکت Vivantis و پرایمر oligo dT طی دو مرحله انجام شد.

توالی ژن­ها از سایت ncbi تهیه شد و آغازگرها توسط نرم افزار آلل ای دی ) Allel IDi ( طراحی شد (جدول 1).

 تکثیر ژن: برای تکثیر قطعه ژن، از آغازگرهای اختصاصی این ژن­ها استفاده شد. از میان این ژن­ها یک جفت Forward و Reverse، با طول قطعه قابل تکثیر توسط دو پرایمر اول 140 جفت باز و با مواد مورد نیاز انجام پذیرفت.

 

جدول 1: توالی آغازگرهای مورد استفاده در آزمایش

توالی برگشت

توالی رفت

ژن

5 '- GAA CCA CCA CCC ATT GTT GC - 3'

5 '- GCC AGA CTA TAA CTA GCT ACC – 3'

 

PR1

5' - GCC AGC AAG GGA AAG GGT AG - 3'

5 '- AAG CCA CAG AAC TCA TCA TCA G - 3'

 

SPR2

5' - CGT CTT CTT CCT TGC TGT TGG - 3'

5 '- GCT TAT TTG GCT ATC GCT GAA -3'

NCED

 

 

5 '- GCC AGC ATC ACC ATT CTT G -3'

 

GCC ACA CCT CGC ACA TTG - 3'  5 '-

 

ef1a

 

         

 

 

 

 

برای انجام Real time RT-PCR (Relative) از دستگاه Bioer ساخت کشور چین استفاده شد. و از کیتSYBR  برای تهیه مواد واکنش Real time RT-PCR استفاده شد. ابتدا همه نمونه­های cDNA ساخته شده 5 برابر رقیق شدند (به‫منظور کاهش دادن خطای پایپتینگ). مقدار 5 میکرولیتر از cDNA رقیق شده به‫عنوان الگو در شرایط یکسان برای تمام نمونه­ها در جریان واکنش Real time RT-PCR بکار گرفته شد. فرآیند PCR با استفاده از پرایمرهای کنترل داخلی  ef1و پرایمرهای ژن اصلی انجام شد. غلظت تمام مواد موجود در واکنش برای تمام نمونه­ها یکسان بود. کمی سازی ­و تعیین الگوی بیان ژن­ها (ژن PR1 در سیگنالینگ اسید سالسیلیک (SAR)، ژن SPR2 در سیگنالینگ جاسمونیک اسید و ژن NCED در سیگنالینگ اسید آبسیزیک (هردو ژن در ایجاد مقاومت القایی ISR) تحت تنش بیمارگر و در حضور و عدم حضور ماده­ی القا کننده (BABA) توسط  Real time RT-PCR مورد بررسی قرار گرفت. ﻣﻘﺎدﯾﺮ آﺳﺘﺎﻧﻪ­ای ﺗﻮﺳﻂ ﻧﺮم اﻓﺰار داﺧﻠﯽ دﺳﺘﮕﺎه ﻣﻄﺎﺑﻖ ﻓﺮﻣﻮل (ΔCT Target - ΔCT actin) 2 ﻣﺤﺎﺳﺒﻪ ﺷﺪ. ﭘﺮدازش دادهﻫﺎ و رﺳﻢ ﻧﻤﻮدار ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از ﻧﺮ‫م اﻓﺰار Exeel اﻧﺠﺎمﺷﺪ.

آنالیز داده­ها

 آﻧﺎﻟﻴﺰ ﺗﺠﺰﻳﻪ وارﻳﺎﻧﺲ داده­ﻫﺎ ﺑـﺎ اﺳـﺘﻔﺎده از نرم افزار( SAS Institute, 2005)  SAS اﻧﺠﺎم ﭘـﺬﻳﺮﻓﺖ و ﻣﻴـﺎﻧﮕﻴﻦ ﺑـﺎ اﺳـﺘﻔﺎده از روش داﻧﻜﻦ ﻣﻮرد ﻣﻘﺎﻳﺴﻪ ﻗﺮار ﮔﺮﻓﺘﻨﺪ (05/0= (p

نتایج

تاثیر القاگر BABA بر بیان ژن PR1

میزان بیان ژن PR1 در نتیجه­ی حضور القاگر و عدم حضور القاگر مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان بیان این ژن در حضور باکتری بدون دخالت القاگر نسبت به شاهد افزایش می­یابد  (نمودار 1 منحنیB ). همچنین PR1 هنگامی‫که گیاه با محلول 250 میلی­مولارBABA ، محلول­پاشی شد، افزایش بیان نشان داد (‫بدون هیچ­گونه تلقیحی با باکتری‫) (‫منحنی E‫). افزایش بیان ژن هنگامی نسبت به گیاهان منحنی B و E معنی­دار ( براساس نرم افزار SAS) است که، گیاه را قبل از تلقیح باکتری، با محلول 250 میلی‫مولار BABA پیش‫تیمار کنیم (نمودار 1منحنی ‫F). در حقیقت کاربرد القاگر و باکتری با هم باعث افزایش معنی­دار در بیان این ژن می‫شود. این بدان معنی است که گیاه پیش­تیمار شده، از طریق افزایش میزان رونوشت­برداری واکنش سریع‫تری نسبت به تنش باکتریایی داشته است. میزان بیان ژن مذکور در هر سه منحنی B و E و F (نمودار 1)  تا 24 ساعت حرکت صعودی دارد، تا ساعت 48 ثابت می­ماند و در ساعت 72 کاهش ژن را مشاهده کردیم. احتمالا تیمار با BABA، تلقیح با باکتری و تاثیر هردو به‫طور هم­زمان باعث ایجاد سازو کارهایی می‫شود که به موجب آن بیان ژن PR1 در ابتدا صعودی و پس از آن روند نزولی را طی کند. چنین کاهشی می­تواند ناشی از عمل سایر ژن­های دخیل در این مکانیسم باشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1: تاثیر BABA روی گیاه گوجه­فرنگی در القا مقاومت SAR در نتیجه­ی حضور و عدم حضور بیمارگر. ژن PR1 به‫عنوان مارکر انتخابی این مقاومت در نظر گرفته شده است. A : گیاه شاهد، B : اثر باکتری بدون هیچ پیش­تیمار باBABA ،E  : پیش­تیمار گیاه با BABA بدون اثر باکتری، F: پیش­تیمار گیاه باBABA  و پس از آن تلقیح با باکتری. بارها نمایانگر میانگین ± انحراف از استاندارد می­باشد و بارها براساس میانگین بیان 3 تکرار±استاندارد ترسیم شده­اند.

 

 

تاثیر القاگر BABA بر بیان ژن SPR2

میزان نسبی mRNA ژن SPR2 ﺑﺎ اﻓﺰاﯾﺶ زﻣﺎن، در ﺗﻨﺶ باکتری نسبت به گیاه شاهد اﻓﺰاﯾﺶ می­یابد (نمودار 2منحنیB  ). این افزایش ژن در گیاه محلول­پاشی شده با BABA (نمودار 2 منحنی E) نیز محسوس بود. هنگامی‫که گیاه با BABA  پیش­تیمار شد و پس از آن توسط باکتری تلقیح شد، ژن SPR2 با افزایش زمان، میزان رونوشت­برداری را به‫طور معنی­داری افزایش داد و در آخرین زمان اندازه‫گیری یعنی در ساعت 96 پس از تنش به بالاترین میزان خود رسید.

 

 

 

 

 

 

نمودار 2: تاثیر BABA روی گیاه گوجه­فرنگی در القا مقاومت ISR در نتیجه­ی حضور و عدم حضور بیمارگر. ژن SPR2 به‫عنوان مارکر انتخابی این مقاومت در نظر گرفته شده است. A : گیاه شاهد، B: اثر باکتری بدون هیچ پیش­تیمار باBABA ،E  : پیش­تیمار گیاه با BABA بدون اثر باکتری ، F: پیش­تیمار گیاه با BABA و پس از آن تلقیح با باکتری بارها نمایانگر میانگین ± انحراف از استاندارد می­باشد و بارها براساس میانگین بیان 3 تکرار±استاندارد ترسیم شده­اند.

 

 

تاثیر القاگر  BABAبر بیان ژن  NCED

ﻧﺘﺎﯾﺞ آﻧﺎﻟﯿﺰ ﺑﯿﺎن ژن NCED در نمودار 3 به‫وضوح بیان می‫کند که ﺗﻨﺶ باکتری و محلول­پاشی با BABA (‫منحنی­های B و E‫ در نمودار 3 ) ﻣﻮﺟﺐ اﻓﺰاﯾﺶ ﺑﯿﺎن اﯾﻦژن می­شوند، اما قابل توجه نمی­باشد. در این نمودار نیز، همانند دو ژن دیگر، افزایش بیان هنگامی روند صعودی قابل ملاحظه از خود نشان می­دهد که گیاه توسط BABA پیش­تیمار شود و پس از آن با باکتری تلقیح شود. به‫طوریکه در ساعت 96 میزان رونوشت ژن به حداکثر رسید.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 3: تاثیر BABA روی گیاه گوجه­فرنگی در القا مقاومت ISR در نتیجه­ی حضور و عدم حضور بیمارگر. ژن NCED به‫عنوان مارکر انتخابی این مقاومت در نظر گرفته شده است. A : گیاه شاهد، B: اثر باکتری بدون هیچ پیش­تیمارBABA ، E: پیش­تیمار گیاه با BABA بدون اثر باکتری ، F: پیش­تیمار گیاه باBABA  و پس از آن تلقیح با باکتری بارها نمایانگر میانگین ± انحراف از استاندارد می­باشد و بارها براساس میانگین بیان 3 تکرار±استاندارد ترسیم شده­اند.   

 

بحث

رشد گیاه و بهره­وری از آن به‫طورموثری تحت تاثیر شکل‫های مختلف عوامل تنش­زای زیستی و غیر زیستی قرار می­گیرید. امروزه حفاظت از گیاهان در برابر پاتوژن­ها و عوامل تنش­زا توسط سموم شیمایی مضر صورت می­گیرد. استفاده از مواد شیمیایی سمی مضر، برای محیط زیست و سلامت انسان خطرناک می­باشد (12). در کشاورزی پیشرفته سعی بر این است که عملکرد را در واحد سطح بالا برده و تا حد امکان ضایعات و خسارات ناشی از عوامل نامساعد را به حداقل برسانند. یکی از ره‫یافت­های نوین در بهبود کمی و کیفی محصولات کشاورزی، استفاده از القاگر مقاومت در گیاهان می­باشد. این مواد در غلظت­های بسیار کم، تاثیرات شگرفی بر فرآیندهای مختلف گیاهی دارند (‫13‫). محصولات مصنوعی از جمله بتا آمینو بوتیریک اسید (BABA)، می‫توانند باعث مقاومت طبیعی و بیان ژنتیکی ژن­هایی که در مقاومت، فعال هستند، شوند. این ژن­ها توسط تغییرات ژنوم (جهش، داخل شدن ژنتیکی مواد خارجی)، باعث افزایش ایمنی بیولوژیکی در گیاه می­شوند. بیان ژن­های دخیل در مقاومت  SARو ISR، از جمله مواردی است که تحت تاثیر این القاگر قرا می­گیرند و باعث افزایش یا کاهش مقاومت می­شوند (13).

در این مقاله به بررسی مکانیسم مقاومت­های القایی  SARو ISR در برابر بیماری باکتریایی Pseudomonas syringae pv. Syringaبا استفاده از پیش­تیماربا ماده­ی BABA پرداخته شده است. ﻧﺘﺎﯾﺞ ﺣﺎﺻﻞ از ﺑﺮرﺳﯽ ﺑﯿﺎن، ﺑﻪ‫ﺻﻮرت ﻧﺴﺒﺖ ﺑﯿﺎن ژنﻫﺎ در ﮔﯿﺎﻫﺎن ﺗﻨﺶ ﯾﺎﻓﺘﻪ ﺑﻪ ﺑﯿﺎن ژن­ها در ﮔﯿﺎﻫﺎن ﺷﺎﻫﺪ اراﺋﻪ شد، درﻧﺘﯿﺠﻪ ﻣﻘﺪار ﺑﯿﺎن نمونه­های ﺷﺎﻫﺪ در ﻧﻤﻮدارﻫﺎ ﺻﻔﺮمی­باشد.

در این پژوهش، ژن PR1 به‫عنوان یک مارکر مقاومت SAR در نظر گرفته شد. یک مسئله بسیار مهم در ارزیابی اثر بخشی SAR، انتخاب صحیح مارکر اطلاعاتی مناسب برای بررسی صفات در گیاه مرتبط می­شود، که به‫طور بالقوه افزایش یا به ارث برده می­شود. به‫طور کلی مشخص شده است که SAR در ارتباط با فعال شدن سیستمیک ژن­های مرتبط با PR های گیاهی است (14). شواهد فراوانی وجود دارد که در میان ژن­های مختلف PR، ژن PR1 بیشترین پاسخ را به القاگر در یک گیاه القا شده نشان می­دهد (15). در اصل برای دفاع، مسئله کلیدی این است که بیان ژن PR1 به‫عنوان یک اثر انگشت خوب از تاثیر  BABAاست و عمدتا پس از تلقیح شدن باکتری، فعال می­شود (15). همان­طور که در نمودار 1 نشان داده شده است میزان بیان این ژن در نتیجه­ی پیش­تیمار با BABA (نمودار 1 منحنی E)، حمله­ی باکتری (نمودار 1 منحنیB) و در منحنی F(نمودار1) (پیش­تیمار با BABA و پس از آن تلقیح با باکتری) افزایش می­یابد. در منحنیE  (نمودار 1)، BABA حتی اگر هیچ­گونه تهدیدی برای گیاه (مورد حمله­ی باکتری قرار نگیرد‫) وجود نداشته باشد بر روی سیستم­های مقاومت گیاهی تاثیرگذار است و باعث افزایش ژن PR1 و حساس­سازی سیستم­های دفاعی گیاه می­شود (1). همچنین طبق منحنی B بیان این ژن درنتیجه­ی حمله­ی باکتری نیز افزایش می­یابد. افزایش این ژن تنها منحصر به باکتریPseudomonas syringae pv. Syringaدر گوجه­فرنگی نمی­باشد بلکه در گوجه‫فرنگی، این ژن سبب ایجاد مقاومت به قارچ Phytophtera گردیده است (16). در منحنی F، پیش­تیمار با  BABAو پس از آن تلقیح با باکتری میزان رونوشت برداری را به‫طور معنی­داری افزایش داده است. به‫نظر می­رسد که پیش­تیمار با BABA، مستعد سازی(priming)  را در گیاه ایجاد کرده است و باعث القای مقاومت در گیاه شده، و به نوعی ایمن سازی یا واکسیناسیون را در گیاه بوجود آورده است. اگرچه برای القای مقاومت اصطلاح ایمن­سازی استفاده شده است اما در گیاهان این القا موجب افزایش ظرفیت دفاعی گیاه می­شود (5). در مطالعات مختلف مشخص شده که، BABA در گیاهان آلوده به Botrytis cinerea و Pseudomonas syringae از طریق پرایمینگ پاسخ­های دفاعی وابسته به SA، مقاومت ایجاد می­کند و باعث افزایش ژن PR1 می‫شوند (17). نکته ی قابل توجه کاهش این ژن پس از 48 ساعت می­باشد. مطالعات قبلی نشان داده است که دلیل این امر، رابطه­ی آنتاگونیستی این ژن با جاسمونیک اسید است. جاسمونیک اسید یک رابطه متضاد وپیچیده با SA دارد (‫16‫). متیل جاسمونیک از جمله هورمون­هایی به‫حساب می­آید که در زمان زخمی شدن گیاه، یا وقتی­که مورد حمله­ی حشرات قرار می­گیرید، در گیاه فعال می­شود و باعث مقاومت گیاه در برابر عوامل تنش­زا می­شود. این هورمون در ایجاد مقاومت القاییISR  نقش دارد (17). SPR2 به‫عنوان مارکری از مسیر جاسمونیک اسید در نظر گرفته شده است. در نمودار 2 افزایش بیان ژن SPR2 نشان داده شده است. در هر سه منحنی (E وB وF) در روز دوم گیاه یک حد آستانه­ی را از جاسمونیک درک خواهد کرد. این حد آستانه از SPR2 باعث اثر گذاری منفی بر روی PR1 می­شود (نمودار 1 منحنی E وB وF). این تاثیر، در نهایت کاهش ژنPR1 را در روزهای سوم به بعد در نمودار 1 را سبب می­شود. در مطالعات پیشین ثابت شده است که، افزایش جاسمونیک اسید باعث کاهش SA و به‫دنبال آن کاهش بیان ژنPR1  پس از 2 روز می­شود (18) و این با نتایج به‫دست آمده مطابقت داشت. در این پژوهش نشان داده شد که،PR1  رفتاری متفاومت از دو ژن دیگر (SPR2 & NCED) از خود نشان می­دهد. تجزیه و آنالیز داده­های نمودار 2 حاکی از آن است که، باکتری نیز، میزان بیان ژن SPR2 را افزایش می­دهد (منحنی B) و در نتیجه­ی آن، مقدار جاسمونات درگیاه افزایش می­یابد. افزایش جاسمونات درگیاه باعث کاهش حساسیت گیاه در برابر باکتری می­شود (17).

افزایش بیان ژن SPR2 در نمودار 2 در منحنی F محسوس­تر است. کاربرد BABA پیش از ایجاد تنش در گیاه، باعث فعال شدن مسیرهای سیگنالی وابسته به مقاومت القایی می­شود (طبق منحنی E) (19). این مسیرهای القایی باعث افزایش معنی­دار ژن SPR2 در منحنی F پس از تلقیح باکتری می­شوند. نتایج نمودار 2 باتمام نتایج ذکر شده در مطالعات گذشته (19 و 20 و 21) مطابقت داشت و استفاده از BABA بعنوان پیش­تیمار گوجه­فرنگی قبل از حمله­ی باکتر ی باعث افزایش مقاومت در گیاه و افزایش ژن SPR2 به‫طور معنی­داری شد.

نمودار 3 بررسی بیان ژن NCED را نشان می­دهد. این ژن از جمله ژن­های درگیر در مسیر اسید آبسیریک می­باشد. افزایش بیان این ژن نشان دهنده­ی افزایش ABA در گیاه در نظر گرفته می­شود.  بررسی­ها نشان داده است که افزایش اسید آبسیزیک عفونت را تحت تاثیر قرار می­دهد و ممکن است مکانیسم ABA، بر روی سیگنال­های مقاومت در برابر بیماری تاثیرگذار باشد (18 و 19). براساس این پژوهش و طبق نمودار 3، حمله­ی باکتری و پیش­تیمار با BABA ( بدون هیچ­گونه تلقیح باکتری) باعث افزایش ژن NCED می­شود (منحنی E و B). میزان بیان این ژن در دو منحنی تقریبا به یک میزان می­باشد. این دو منحنی (منحنی E و B) اثر تیمارها (باکتری و تیمار با BABA (بدون هیچ­گونه تلقیح باکتری) را بر مسیرهای مقاومت نشان می­دهند. همان­طور که مشاهده می­شود اگر گیاه را با BABA پیش‫تیمار کنیم و پس از آن با باکتری تلقیح شود، افزایش بیان ژن  NCEDمعنی­دار خواهد بود (منحنیF). موتانت‫های دارای نقص در مسیر بیوسنتز ABA به‫وسیله­ی کاربرد BABA حفاظت نمی­شوند (23 و 22). که این نتایج با تحقیقات پیشین که نشان دادند ABA به‫عنوان تنظیم کننده­ی مثبت در پاسخ­های دفاعی عمل می­کند (24)، مطابقت دارد. افزایش بیان ژن NCED به‫عنوان مارکر دخیل در سیگنالینگ اسید آبسیزیک در مقایسه با دو ژن دیگر که در مسیرهای اسید سالسیلیک  (PR1)و اسید جاسمونیک SPR2)) دخیل هستند، چندین برابر بیشتر بود. این موضوع تاثیر زیاد اسید آبسیزیک را در ایجاد مقاومت در گیاه را نشان می­دهد. به‫نظر می­رسد القا مقاومت در گوجه­فرنگی توسط BABA از سرکوب تجمع اسید آبسیزیک به‫وسیله­ی پاتوژن در گیاه جلوگیری کرده باعث افزایش اسید آبسیزیک در گیاه می­شود (18 و 19). ﻣﻘﺎوﻣـﺖ از ﻃﺮﻳﻖ ﻣﺴﻴﺮﻫﺎی ﺳﻴﮕﻨﺎﻟﻲ ABA در اﺛـﺮ ﺗﻴﻤـﺎر با BABA ﺑﺎﻋﺚ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻴﺰان ﻛﺎﻟﻮز در ﮔﻴـﺎه ﺷـﺪه ﻛـﻪ ﻧﻬﺎﻳﺘـﺎ باعث اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻘﺎوﻣﺖﻋﻠﻴﻪ ﺑﻴﻤﺎرﮔﺮﻫـﺎ می­‫شود (24). ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ اﻟﻘﺎ BABA ﻋﻠﻴﻪ تنش­های ﻣﺤﻴﻄﻲ ﻣﺎﻧﻨﺪ ﺧﺸﻜﻲ و ﺷﻮری ﻧﻴﺰ از ﻃﺮﻳﻖ ﻣﺴﺘﻌﺪﺳـﺎزی، ﺳـﺎزوﻛﺎرﻫـﺎی دﻓﺎﻋﻲ واﺑﺴﺘﻪ ﺑﻪ ABA ﻋﻤﻞﻧﻤﻮده و ﺑﺎﻋﺚ اﻓﺰاﻳﺶ ﺗﺠﻤـﻊ ABA در ﮔﻴﺎه ﺷﺪه، ﻛﻪ ﺑﻪ‫دﻧﺒﺎل آن ﺑﺴﺘﻪ ﺷﺪن روزﻧـﻪ­ﻫـﺎ و اﻓﺰاﻳﺶ ﺗﺤﻤﻞ ﮔﻴﺎه در ﻣﻘﺎﺑﻞ اﻳﻦ اﺳﺘﺮسﻫﺎ اﺗﻔﺎق می­افتد. اﻟﮕﻮی ﺑﻴﺎن ژن ﻣﺴﻴﺮهای SA و ABA در ارﺗﺒﺎط ﺑﺎ ﺳﺎﻳﺮ ﺑﻴﻤﺎرﮔﺮﻫﺎ ﻧﺸﺎن می­دﻫﺪ ﻛﻪ ﻫﺮ دو ﻣﺴﻴﺮﻫﻤﻴﺸـﻪ در ﻧﺘﻴﺠـﻪ ﺗﻴﻤـﺎر BABA ﻓﻌـﺎل می­شـﻮﻧﺪ (25).

 

نتیجه‫گیری

در این پژوهش بررسی بیان ژن­های دخیل در سیگنالینگ اسید آبسیزیک، جاسمونیک اسید و سالسیلیک اسید نشان داد که، BABA باعث القای مقاومت طبیعی و بیان ژنتیکی ژن­های فعال در ایجاد مقاومت می­شود. کشف مسیر سیگنالینگ و شناخت ژن­های دخیل در آن اجازه­ی تولید محصولات مقاوم و متحمل به تنش­ را از طریق دست‫کاری یا کنترل ژن­های موجود در این مسیرها مهیا می­کند. استفاده از القای مقاومت باعث کاهش میزان مصرف سموم شیمایی خطرناک می­شود، بنابراین در دنیای امروز که بشر به‫دنبال راهکارهای جدید کنترل بیماری­ها و تنش­های غیر زیستی می­باشد استفاده از این مواد، نوید بخش آینده­ای روشن در کنترل بیماری­ها محسوب می­شود.

تشکر و قدردانی

ﺑﺪﯾﻦ‫وﺳﯿﻠﻪ از ﭘﮋوﻫﺸﮑﺪه زﯾﺴﺖ­ﻓﻨﺎوری ﮐﺸﺎورزی دانشگاه شیراز ﺑﻪﺧﺎﻃﺮ ﻓﺮاﻫﻢ­سازی اﻋﺘﺒﺎرات ﻣﺎﻟﯽ و ﺗﺎﻣﯿﻦ اﻣﮑﺎﻧﺎت آزﻣﺎﯾﺸﮕﺎﻫﯽ ﺗﺸﮑﺮ و ﻗﺪرداﻧﯽمی­‫شود.

1. Wilkinson SW, Pastor V, Paplauskas S, Pétriacq P, et al. Long‐lasting β‐aminobutyric acid‐inducedresistance protects tomato fruit against Botrytis cinerea. Plant Pathology. 2018; 67(1): 30-4.

2. Heath MC. Nonhost Resistance in plant to Microbial Pathogense. In Ezekowitz RAB, Hoffmanna JA (eds) Infectious Disease: Innate Immunity, Humana Press, Totowa; 2002; NJ. pp 47-57.

3. Heil M. Bostock, RM. 2002. Induced Systemic Resistance (ISR) Against Pathogene in the Contex of Induced Plant Defences. Annals of Botany. 2002; 89: 503-512.

4. Ton J, Johan A, Van Pelt V, Loon C, et al. 2007 Differential Effectiveness of Salicylate-Dependent and Jasmonate/Ethylene-Dependent Induced Resistance in Arabidopsis., MPMI. 2007; 15(1): 27–34.

5. Edreva A, Velikova V, Tsonev T, Dagnon S, et al. Stress-protective Role of Secondary Metabolites:Diversity of Function and Mechanisms. Plant Physiology. 2004; 34 (1-2): 67-78.

6. Ward ER, Uknes SJ, Williams SC, Dincher SS, et al. Coordinate Gene Activity in Response to Agents that Induce Systemic Acquired Resistance. Plant Cell.1992. 3(10): 1085-1094. 

7. Ivan B, Brigitte MM. When the story proceeds backward The discovery of endogenous β-aminobutyric acid as the missing link for a potential new plant hormone. Communicative & Integrative Biology. 2017; ISSU 2.

8. Van W, Pieterse S, Van C, Pelt J, et al. A novel Signaling Pathway Controlling Induced Systemic Resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 1999; 10: 1571-1580.

9. Kuc J. Concepts and Direction of Induced Systemic Resistance in Plant and its Application. Jurnal Plant Pathology. 2001. 107(1): 7-12.

10. Van Loon LC. Induced Resistance in Plants and the Role of Pathogenesis-Related Proteins. Journal Plant Pathol. 1997; 103: 753-765.

11. Gullino ML, Gilardi G, Sanna M, Garibaldi A. Epidemiology of Pseudomonas syringae pv. syringae on tomato. Phytoparasitica. 2009 Nov 1; 37 (5) :461.

 

12. Fan J, Yuan T, Comstock J, Ghan S, et al. 2009. Dominant role by vertical wind shear in Regulating Aerosol Effects on Deep Convective Clouds. Journal of Adolescence. 2004; 27: 113–122.

13. Ton J, Mauch-Mani B. β-amino-butyric Acid-Induced Resistance Against Necrotrophic Pathogens is Based on ABA-Dependent Priming for Callose. The Plant Journal. 2007; 38(1): 119-130.

 

14. Luna E, Bruce TJA, Roberts MR., Flors V, et al. Next-generation systemic acquired resistance. Plant Physiol. 2012; 158: 844–853.

15. Luna E, van Hulten M, Zhang Y, Berkowitz O, et al. Plant perception of β-aminobutyric acid is mediated by an aspartyl-tRNAsynthetase. Nat. Chem. Biol. 2014; 10: 450–456.

16. Uknesc S, Mauch-Mani B, Moyer M, Potter  , et al. Acquired Resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 1992; 4: 645-656.

17. Cohen Y, Niderman T, Mosinger E, Fluhr R. Beta-Aminobutyric Acid lnduces the Accumulation of Pathogenesis-Related Proteins in Tomato (Lycopersicon esculentum L) Plants and Resistance to late Blight lnfection Caused by phytophthora infestam. Plant Physiology. 2002; 104: 59-66.

18. Fan J, Yuan T, Comstock J, Ghan S, et al. 2009. Dominant role by vertical wind shear in Regulating Aerosol Effects on Deep Convective Clouds. Journal of Adolescence. 2004; 27: 113–122.

19. Flors V, Ton J, Mauch-Mani B. The Multifaceted Role of ABA in Disease Resistanced. Trends in Plant Science. 2008; 14(6): 310-317.

20. Fan J, Yuan T, Comstock J, Ghan S, et al. 2009. Dominant role by vertical wind shear in Regulating Aerosol Effects on Deep Convective Clouds. Journal of Adolescence. 2007; 27: 113–122.

21. Thaler J, Owen  B, Higgins, V. The Role of the Jasmonate Response in Plant Susceptibility to Diverse Pathogens with a Range of Lifestyles. Department of Botany, University of Toronto. 2002; ​104: ​041566.

22. Agrios, GN. Plant Pathology , 5thEd, Elsevier Academic Press, San Diego, USA; 2005.

23. Turner J, Ellis  C, Devoto A. The Jasmonat Signal Pathway.Socity of Plant Biologists. Society of Plant Biologists. 2002; 153-s164.

24. Ton J, Mauch-Mani B. β-amino-butyric Acid-Induced Resistance Against Necrotrophic Pathogens is Based on ABA-Dependent Priming for Callose. The Plant Journal. 2007; 38(1): 119 - 130.

25. Charegani H, Majzoob S, Hamzehzarghani H, Karegar-Bide A. Comparision of DL-Β-Amino-n-Butyric Acid, Salicylic Acid And Abscisic Acide in Induction Of Resistance in  Tomato Infected by Meloidogyne Incognita .Iranian Journal of Plant Patology. 2015; 5: 50.