کالوس زایی و باززایی ارقام گندم نان از ریزنمونه‌های مختلف

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 1- دانش‌آموخته کارشناسی ارشد، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، تبریز، ایران

2 دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، تبریز، ایران

چکیده

هدف: هدف از انجام این تحقیق، مطالعه بررسی اثر تنظیم کننده­های رشدگیاهی، نوع و ترکیبات محیط کشت، ژنوتیب رقم مورد استفاده و نوع ریزنمونه بر قابلیت کالوس­زایی و باززایی ارقام گندم است.
 مواد و روشها: در این تحقیق از دو نوع محیط کشت (N6، MS) و سه ریزنمونه جنین نارس، جنین رسیده و قطعات برگی استفاده شد. برای کالوس­زایی در ریزنمونه جنین­رسیده و قطعات برگی از محیط کشت N6 حاوی تنظیم کننده رشد 2, 4-D و برای باززایی از محیط کشت N6 حاوی تنظیم کننده رشد NAA، BAP و Kin استفاده شد. در ریزنمونه جنین نابالغ از برای کالوس زایی و باززایی از محیط کشت MS حاوی تنظیم کننده رشد مختلف استفاده شد.
نتایج: کالوس­زایی و باززایی در این تحقیق بسته به ژنوتیپ و نوع ریزنمونه و نوع ترکیبات محیط کشت متفاوت بود. به‫طوری‫که در ریزنمونه جنین نابالغ بیشترین میزان کالوس­زایی و باززایی مربوط رقم چمران بود. در ریزنمونه جنین بالغ، بیشترین میزان کالوس­زایی و باززایی مربوط به لاین C-D-9 بود. در ریزنمونه قطعات برگی، بیشترین میزان کالوس­زایی مربوط به لاین C-D-9 و سطح 4/2 میلی­گرم در لیتر 2, 4-D بود. بیشترین درصد شاخه­زایی مربوط به  لاین C-D-9 در محیط کشت 6)N6 (حاوی mg/l IAA 1+ mg/l BA 1به‫دست آمد.
نتیجه گیری: پاسخ به کشت بافت در گندم تحت تأثیر عوامل متعددی از قبیل ژنوتیپ، نوع ریزنمونه، تنظیم کننده های رشد می­باشد. از این آزمایش می‫توان این نتیجه را گرفت که نوع و غلظت تنظیم کننده­های رشدگیاهی  مورد استفاده در محیط کشت از  رقمی به رقم دیگر برای القای کالوس­زایی و باززایی گندم متفاوت است و  جنین نارس بهترین ریزنمونه و ژنوتیپ رقم مورد استفاده، از مهم­ترین فاکتورهای تاثیرگذار در کشت بافت گندم است.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

گندم مهم‌ترین محصول ایران و جهان است. سطح زیر کشت این محصول در دنیا برابر 220 تا 230 میلیون هکتار و در ایران حدود 6/5 میلیون هکتار است که از سایر غلات بیشتر و برابر 22 درصد سطح زیر کشت کلیه غلات است (1). به‫همین علت غذای عمده بیش از 40 کشور جهان است که جوابگوی 35 درصد جمعیت دنیاست (2). در گندم از ریزنمونه‌های مختلفی نظیر گل‌آذین، جنین نارس و جنین بالغ برای تولید کالوس استفاده‌ شده است و تا به حال کشت جنین نارس گندم به‫عنوان بهترین ریزنمونه در مطالعات کشت کالوس در گندم شناخته ‌شده است (3، 4، 5، 6) تولید کالوس در گیاهان تک‌لپه‌ای معمولا مشکل­تر از گیاهان دولپه­ای صورت می­گیرد، به‫همین دلیل برای القا و تشکیل کالوس، نیاز به ‌اضافه کردن هورمون­های مصنوعی می­باشد (7). باززایی گیاه از کالوس یک پدیده مروفوژنتیکی پیچیده می­باشد که عوامل داخلی و خارجی فیزیولوژیک گیاه نقش مهمی در آن ایفا می­کنند (8). میــزان موفقیــت در رشــد کــالوس و باززایی گیاه در غـلات بسـتگی زیـادی بـه نوع ریزنمونه جداشده دارد. به‌طور کلی قسمت­های رویشی گیاهان نسبت به قسمت­هـای زایشی آمـادگی بیشـتری بـرای بـاززایی دارنـد و قابلیت ژنتیکی باززایی در این خصوص در تمام ارقـام وجـود دارد(9). اگرچه جنین نابالغ یکی از مناسب‌ترین ریز نمونه‌ها در کشت بافت این غلات می­باشد، اما به‌‫عنوان ریزنمونه دارای برخی از معایب نیز می­باشد. ازجمله در دسترس بودن آن‌ها محدود به دوره­ی کوتاهی از زمان رشد در سال می­باشد، جداسازی سخت و مشخص کردن مرحله­ی کشت مناسب آن مشکل می­باشد (10). اما به‫دلیل سهولت استفاده از جنین رسیده پژوهشگران ترجیح می­دهند از این نوع جنین برای مطالعه خود به‫جای جنین نارس استفاده نمایند (11) جنین­های بالغ به‫دلیل در دسترس بودن در هر فصل از سال، جداسازی آسان و حداقل تغییرپذیری و وضعیت فیزیولوژیکی آن (12) به‫عنوان یک جایگزین مؤثر برای جنین­های نابالغ می­باشد. ولی وقتی جنین­های بالغ به‌عنوان ریزنمونه استفاده می­شوند فراوانی باززایی از کالوس در مقایسه با جنین­های نابالغ کم می­شود (10). امروزه از جنین­های بالغ به‫همراه آندوسپرم (13)، بدون حمایت آندوسپرم (14) و تکه­های نازک از آن (15) به‌‫عنوان ریزنمونه در کشت بافت گندم استفاده می­شود. کشور ایران به‫دلیل برخورداری از تنوع بالای زیستی بستر مناسب برای تهیه و تولید ارقام مختلف گندم می­باشد. و  با توجه به اینکه میزان پاسـخ ارقام بومی گندم نسبت به ارقام اصلاح‌شده از لحاظ القـای کــالوس و بــاززایی و انتقال ژن بیشــتر اســت، روی این اصل، در تحقیق حاضر واکنش ریزنمونه‫های جنین بالغ، جنین نابالغ و قطعات برگی  ارقام بومی گندم نان، از نظر القای کالوس و باززایی در سطوح مختلف هورمون‌های اکسینی و سیتوکینین مورد بررسی قرار گرفت. بنابراین هدف از انجام این آزمایش، شناسایی بهترین ژنوتیپ و تعیین مناسب­ترین ترکیب هورمونی برای کالوس‫زایی و باززایی و ارزیابی ارقام مختلف گندم می­باشد. ارائه پروتکل کارآمد برای کشت بافت و ریز ازدیادی ارقام مورد مطالعه و فراهم کردن ابزار کارآمد برای مطالعه انتقال ژن و دست‌کاری ژنتیکی با استفاده از روش­های مبتنی بر کشت بافت در دورنمای آینده است.

 

مواد و روش‌ها

این آزمایش به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید مدنی آذربایجان در سال 1395 انجام گرفت. در این آزمایش 7 رقم گندم به نام­های (الوند، اترک، آزادی، شیرودی، چمران، فلات، تجن) و چهار لاین گندم (C-D-4, C-D-6, C-D-8, C-D-9) استفاده شد. بذور گندم از موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج تهیه شد. در ریزنمونه­های جنین بالغ و جنین نابالغ ( ابتدا گندم درگلخانه کشت شده بعد از 16-14 روز ﭘﺲ از ﮔـﺮده اﻓشانی خوشه­ها، جنین آن‫ها برداشت شد ) بذوری که ظاهری سالم داشتند برای ضدعفونی و کشت انتخاب شدند. ضدعفونی با قرار دادن بذور در الکل 70 درصد به‫مدت 1 دقیقه و سپس شستشوی بذور با شناور ساختن آن‌ها در آب مقطر استریل آغاز شد. سپس بذور در زیر محفظه‌ی استریل هود لامینار در محلول هیپوکلریت سدیم 45 درصد حجمی (25/2 درصد ماده­ی موثره) همراه با 1 قطره تویین 20 به‫مدت 15 دقیقه قرار داده شدند. در مرحله­ی آخر این بذور سه بار متوالی به‫مدت 3،1 و 5 دقیقه با آب مقطر دو بار استریل شستشو داده شدند. سپس روی کاغذ صافی استریل قرار داده شد تا آب سطحی آن‌ها کاملا خشک شود در ریزنمونه قطعات برگی، زمانی که بذرهای موردنظر استریلیزاسیون سطحی شدند برای جوانه­زنی در محیط ½ MS قرار گرفتند. وقتی‌که اندازه گیاهچه به 5 تا 10 سانتی‫متر رسید، کلئوپتیل به‌اندازه 2-1 سانتی­متر از بخش ساقه جدا شد. این قسمت از برگ به قطعات 1 تا 2میلی‫متری تقسیم شد. سپس این قطعات در محیط ML1G1 (16)، (حاوی ویتامین­ها و نمک­های N6 و 2 میلی­گرم در لیتر گلایسین، 2880 میلی­گرم در لیتر- L پرولین، 100 میلی­گرم در لیتر کازوئین، 30 گرم در لیتر ساکارز با اسیدیته 8/5) برای القا کالوس قرار گرفتند ولی در ریزنمونه جنین بالغ ( ML1G1)  و جنین نابالغ (جدول 1) مستقیماً  بر روی محیط کشت القای کالوس، کشت شدند به نحوی که ناحیه اسکوتلوم آن­ها رو به بالا باشد. در هر پتری دیش که حاوی 20 میلی­لیتر از محیط کشت بود، تعداد 9 ریزنمونه کشت شد. سپس درب ظروف با پارافیلم بسته شد. نمونه­ها جهت کالوس­زایی در شرایط تاریکی و دمای 1± 25 درجه­ی سانتی‌گراد به‫مدت 2 هفته قرار داده شدند. بعد از شکل‌گیری کالوس­ها، تعداد کالوس­های تولید شده در هر پتری دیش شمارش‌ شده و درصد کالوس­زایی برای هر رقم و هر تیمار به‌طور جداگانه محاسبه شد. در مرحله­ی بعد کالوس­های تولید شده جهت رشد و تکثیر و تولید کالوس­های جنین­زا به محیط کشت مشابه­ای ML1C2 (16)، با این تفاوت که حاوی mg/l 10 نیترات نقره بود، واکشت شدند. دو هفته پس از واکشت، کالوس­های جنین­زا برای باززایی به محیط کشت باززایی مخصوص هر ریزنمونه، جنین بالغ( ML1R3)  و جنین نابالغ (جدول2) و قطعات برگی (جدول 3) انتقال داده شدند. بعد از کشت کالوس­ها در محیط باززایی، ابتدا نمونه­ها به‫مدت 1 هفته در شرایط تاریکی و دمای 1±25 درجه­ی سانتی‌گراد تیمار گردیدند. بعد از این مدت نمونه­ها تحت تیمار 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 1±25 درجه­ی سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از آغاز باززایی، کالوس­های تغییر رنگ داده به لوله­های آزمایش با محیط کشت مشابه منتقل شدند تا فضای کافی برای رشد گیاهچه وجود داشته باشد. شاخه­های باززا شده به‫طول 2 الی 3 سانتی‌متر، جهت تولید و توسعه­ی ریشه­ها، به محیط کشت MS فاقد هورمون حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز انتقال داده شد. گیاهان ریشه­دار شده از لوله­ی آزمایش خارج ‌شده و پس از کشت در خاک استریل به محیط سازگار سازی انتقال داده شدند (شکل 5).

 

 

 

 

 

 

جدول1: محیط­های مختلف القا کالوس در جنین‎های نارس گندم

محیط القا   کالوس

ترکیب محیط

منابع

B1

MS   (Macro+Micro+vitamins) + Thiamine cl(0.04mg/l) + L-Asparagine(150mg/l) +   2,4-D(2.5mg/l) + Sucrose(60g/l)  + Agar(8g/l) pH=5.7 with NaOH

(17)

B2

MS(Macro+Micro)   + Glycine(75mg/l) + L-Glutamine(877mg/l) + L-Aspartic acid(266mg/l) +   L-Arginine(228mg/l) + 2,4-D(2mg/l) + Kinetin(0.2mg/l)+ Gibberellic   acid(0.1mg/l) + Sucrose(30g/l)  +   Agar(8g/l) pH=5.7 with NaOH

(17)

B3

MS(Macro+Micro)   + Thiamine-Hcl(40mg/l) + L-Asparagine(150mg/l) + 2,4-D(2mg/l) +   Maltose(20g/l)  + Agar(8g/l) pH=5.8   with KOH

(18)

B4

MS(Macro+Micro+vitamins)   + myo inositol(100mg/l) + 2,4-D(2mg/l) + Sucrose(30g/l)  + Agar(8g/l) pH=5.7 with NaOH

(19)

 

 

 

جدول2: محیط­های مختلف مورد استفاده در آزمایش به‫منظور باززایی جنین‎‎های نارس گندم

منابع

ترکیب محیط   باززایی

محیط باززایی

(17)

MS(Macro+Micro)   + Thiamine cl(0.04mg/l) + L-Asparagine(150mg/l) + IAA(0.5mg/l) + BAP(1mg/l) +   Sucrose(20g/l)  + Agar(8g/l) pH=5.7   with NaOH

C1

(18)

MS(Macro+Micro)   + Thiamine-Hcl(40mg/l) + L-Asparagine(150mg/l) + IAA(0.5mg/l) + BAP(1mg/l) +   Kinetin(1mg/l) + Maltose(20g/l)  +   Agar(8g/l) pH=5.8 with KOH

C2

(19)

MS(Macro+Micro+vitamins)   + myo inositol(100mg/l) + IAA(0.5mg/l) + BAP(1mg/l)  + Sucrose(30g/l)  + Agar(8g/l) pH=5.7 with NaOH

C3

 

جدول 3: انواع محیط کشت باززایی مورد استفاده برای ریزنمونه قطعات برگی گندم

محیط کشت پایه

ترکیب محیط باززایی

محیط کشت پایه

ترکیب محیط باززایی

محیط کشت پایه

ترکیب محیط باززایی

محیط کشت پایه

ترکیب محیط باززایی

MS(1)

 

بدون   هورمون

MS(4)

 2 mg/L Kin+ 0.5 mg/L NAA

N6(1)

0.5 mg/L   BAP

N6(4)

0.5 mg/LKin

MS(2)

1 mg/L   IAA+ 1 mg/L BA

MS(5)

2 mg/L   BAP+ 0.5 mg/L IAA

 

N6(2)

2 mg/L   BAP

N6(5)

2 mg/L   BAP+0.5 mg/L NAA

MS(3)

 

1 mg/L IAA+ 0.5 mg/L   BA

MS(6)

2 mg/L   BAP+ 1 mg/L NAA

N6(3)

2 mg/L   Kin+ 0.5 mg/L NAA

N6(6)

 

1 mg/L   IAA+1 mg/L BA


 

 

 

 


 

 

 

 

نتایج

کالوس­زایی و باززایی از ریزنمونه جنین ‎نارس

با توجه به اینکه برخی از صفات مورد بررسی مثل صفات مرتبط با کالوس­زایی مستقل از باززایی هستند بنابراین تجزیه واریانس جداگانه‎ای برای صفات کالوس­زایی و باززایی انجام شد (جداول 4 و 5). تجزیه واریانس داده‎ها نشان داد که بین ارقام گندم مورد مطالعه از نظر کلیه صفات اندازه‎گیری شده تفاوت معنی‎داری حداقل در سطح احتمال 5 درصد به غیر از درصد القاء کالوس 30 روز بعد از کشت وجود داشت. تفاوت محیط‎های مختلف القای کالوس از نظر کلیه صفات در سطح احتمال 1 درصد معنی‎دار بود (جدول 4). اثر متقابل رقم × محیط القا کالوس برای صفاتی نظیر درصد القا کالوس 15 و 30 روز بعد از کشت، حجم کالوس 15 روز بعد از کشت، درصد نقطه سبز 7 ، 21 و 28 روز بعد از بازکشت، تعداد نقطه سبز 14 روز بعد از بازکشت، درصد کالوس­های باززا شونده، فراوانی باززایی حداقل در سطح احتمال 5 درصد معنی‌دار بود (جدول 5).  این بدین مفهوم است که  ارقام مختلف پاسخ­های متفاوتی به محیط‎های مختلف القاء کالوس نشان می‎دهند.

  بین سطوح مختلف محیط‎های باززایی از نظر صفات درصد نقطه سبز 14، 21 و 28 روز بعد از بازکشت، تعداد نقطه سبز 14 روز بعد از بازکشت، درصد تشکیل ساقه‎چه، فراوانی باززایی تفاوت معنی‎داری حداقل در سطح احتمال 5 درصد وجود داشت (جدول 5).

اثرمتقابل رقم × محیط باززایی برای صفاتی نظیر درصد نقطه سبز 21 و 28 روز بعد از بازکشت، تعداد نقطه سبز  14روز بعد از کشت، درصد تشکیل ساقه‎چه، فراوانی باززایی حداقل در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود. اثرمتقابل محیط کالوس­زایی × محیط باززایی برای صفات مورد مطالعه معنی­دار نبود و بیانگر این مطلب است که اثر دو محیط مختلف برای القاء کالوس و باززایی مستقل از هم بود. ترکیبات تیماری سه جانبه رقم، محیط کالوس­زایی و محیط باززایی به استثنای صفات درصد نقطه سبز و تعداد نقطه سبز معنی‌دار نبود (جدول 5).

 

 

جدول 4: تجزیه واریانس صفات مورد اندازه‎گیری در شرایط درون­شیشه‎ای برای ارقام مورد مطالعه گندم در محیط‎های مختلف القای کالوس

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

درصد القای کالوس بعد از 15 روز

درصد القای کالوس بعد از 30 روز

درصد کالوس جنین‎زا

حجم کالوس 15 روزه

حجم کالوس 30روزه

وزن کالوس

رقم

6

24/345**

46/84ns

28/494*

97/7**

32/2*

28/1**

خطای 1

21

69/81

41/121

510/171

42/0

86/0

17/0

محیط کالوس­زایی

3

57/1261**

27/406*

16/1221**

99/9**

62/3**

84/1**

رقم×محیط کالوس­زایی

18

44/160*

33/221*

09/167ns

78/0*

67/0ns

14/0ns

خطای 2

57

34/77

84/101

86/175

40/0

46/0

10/0

ضریب تغییرات (CV%)

07/10

90/11

10/22

13/7

38/6

15/11

ns ، * و ** به‫ترتیب غیرمعنی‫دار و معنی‫دار درسطح احتمال 5 درصد و 1درصد می‎باشند.

 

 

 

جدول 5: تجزیه واریانس صفات مورد اندازه‎گیری در شرایط درون شیشه‎ای برای ارقام مورد مطالعه در محیط‎های مختلف القای کالوس و محیط‎های مختلف باززایی

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

درصد نقطه سبز بعد از 7 روز

درصد نقطه سبز بعد از 14 روز

درصد نقطه سبز بعد از 21 روز

درصد نقطه سبز بعد از 28 روز

تعداد نقطه سبز در هر کالوس بعد از   14 روز

درصد تشکیل

ساقه‎چه

فراوانی باززایی

رقم

6

52/7**

81/4**

59/8149*

56/6138*

71/885*

81/1

09/17**

خطای 1

21

91/0

22/1

74/226

25/2225

22/295

61/0

43/0

محیط کالوس­زایی

3

56/11**

80/2**

22/5261**

93/5730**

74/840**

51/16

93/60**

رقم×محیط کالوس­زایی

18

73/1*

95/0ns

99/2505*

20/2980*

68/392*

44/1

59/6*

خطای 2

57

85/0

64/0

14/1239

62/1321

65/174

73/0

56/3

محیط باززایی

2

09/0ns

61/1**

94/5229**

60/4919**

54/627**

82/1**

4/32**

رقم* محیط باززایی

12

25/0ns

31/0ns

47/846**

11/1015**

88/122**

62/0ns

57/4*

محیط کالوس­زایی * محیط باززایی

6

11/0ns

056/0ns

94/305ns

88/544ns

48/69ns

50/0ns

01/1ns

رقم× محیط کالوس­زایی* محیط باززایی

36

40/0**

23/0ns

02/537*

44/673**

02/84**

41/0ns

70/2ns

خطای 3

149

22/0

19/0

26/339

53/348

55/42

30/0

03/2

ضریب تغییرات (CV)

53/21

48/17

33/29

93/28

91/27

17/30

98/8

ns ، * و ** به‫ترتیب  غیرمعنی‫دار و معنی‫دار درسطح احتمال 5 درصد و 1درصد می‎باشند.

 

 

 

مقایسه میانگین سطوح عوامل مورد مطالعه و ترکیبات تیماری آن‫ها برای صفات مورد مطالعه در جدول 6، 7، 8 نشان داده شده است. ارقام فلات و چمران با 4/93 و 2/93 درصد القاء کالوس در 15 روز بعد از کشت برترین ارقام و رقم شیرودی و آزادی با کالوس­زایی پایینی در همان زمان ضعیف‎ترین ارقام بودند. از نظر تولید کالوس جنین­زا رقم الوند و چمران به‫ترتیب با 35/70 و 63/64 درصد بهتر از بقیه ارقام نسبت به محیط کالوس­زایی پاسخ دادند. این نتایج نشان داد که رقم تجن با القای 50 درصد کالوس جنین‎زا نسبت به سایر،  از نظر القاء کالوس جنین­زا و غیر جنین­زا ضعیف‎ترین رقم بود. رقم چمران بیشترین و رقم الوند کمترین حجم کالوس را 15 و 30 روز بعد از کشت دارا بودند.  بیشترین وزن کالوس مربوط به رقم چمران و کمترین به رقم فلات و الوند با 59/2 و 69/2 گرم اختصاص داشت (جدول 6). مراحل مختلف تولید کالوس در شرایط درون شیشه‌ای در شکل ‌4 آورده شده است.

 

رقم تجن کمترین درصد نقطه سبز را 7، 14، 21 و 28 روز بعد از بازکشت در محیط باززایی داشت و رقم چمران بالاترین درصد نقطه سبز را نشان داد. از نظر تعداد نقطه سبز در هر کالوس رقم فلات و چمران به‫ترتیب با 53/29 و 08/28 بیشترین و رقم تجن با 67/16 کمترین تعداد نقطه سبز را دارا بودند (جدول 6). شکل1 مراحل مختلف باززایی و ریشه‌زایی را نشان می‌دهد. رقم چمران و آزادی بترتیب با 78/18 و 90/3 درصد از بیشترین و کمترین درصد تشکیل ساقه‎چه برخوردار بودند. همچنین رقم چمران و الوند بترتیب با 5/82 و 3/70 درصد بیشترین و رقم آزادی با 5/49 درصد کمترین فراوانی باززایی را داشتند. با توجه به نتایج حاصل رقم چمران که یک رقم بهاره است بهترین رقم از نظر پاسخ به کشت بافت جنین نارس بود.

 

 

جدول6 : مقایسه میانگین ارقام  مورد مطالعه از نظر صفات درون شیشه‎ای اندازه‎گیری شده

رقم

درصد القاء کالوس بعد   از 15 روز

درصد کالوس جنین‎زا

حجم کالوس 15 روزه

حجم کالوس 30روزه

وزن کالوس

درصد نقطه سبز بعد از   7 روز

الوند

AB

11/90

A

35/70

C

68/8

C

16/10

BC

65/2

A

91/29

اترک

BC

64/84

BC

28/57

B

27/9

BC

46/10

BC

91/2

A

46/30

آزادی

C

82

BC

78/56

BC

87/8

ABC

73/10

BC

87/2

A

37/18

شیرودی

C

73/80

BC

03/58

B

23/9

BC

47/10

B

94/2

A

65/33

چمران

A

20/93

AB

63/64

A

25/10

A

31/11

A

48/3

A

54/34

فلات

A

40/93

ABC

61/61

D

86/7

AB

95/10

C

59/2

A

54/33

تجن

ABC

78/87

C

74/50

C

47/8

ABC

84/10

BC

75/2

B

55/2

 

رقم

درصد نقطه سبز بعد از   14 روز

درصد نقطه سبز بعد از   21 روز

درصد نقطه سبز بعد از   28 روز

تعداد نقطه سبز در هر   کالوس بعد از 14 روز

درصد تشکیل

ساقه‎چه

فراوانی باززایی

الوند

A

17/34

BC

12/52

B

39/54

BC

93/19

AB

57/16

AB

3/70

اترک

A

17/46

BC

27/66

AB

51/61

ABC

88/22

BC

21/8

BC

5/62

آزادی

A

03/39

ABC

63/59

AB

74/60

ABC

87/21

C

95/3

C

5/49

شیرودی

A

25/45

AB

86/69

AB

73/67

ABC

83/24

ABC

12/9

BC

58

چمران

A

10/56

AB

47/73

A

71/77

AB

08/28

A

78/18

A

50/82

فلات

A

93/65

A

79

A

50/81

A

53/29

AB

17/14

BC

20/60

تجن

B

35/10

C

40

B

52/48

C

67/16

AB

18/11

BC

30/62

میانگین های دارای حروف متفاوت در هر ستون تفاوت معنی‎داری در سطح احتمال 5 درصد دارند

 

 

 

مقایسه میانگین بین محیط‌های مختلف القای کالوس نشان ‎داد (جدول 7) که محیط کشت B2 کمترین درصد القای کالوس با متوسط 92/76 و محیط های B3 و B1 به‫ترتیب با متوسط 67/91 و  48/91 بیشترین درصد القای کالوس 15 روز بعد از کشت جنین نارس در محیط کالوس­زایی داشته است، اگرچه تفاوت محیط B4 نسبت به محیط‎های B3 و B1  از نظر آماری معنی‎دار نبود. وجود اثر متقابل معنی‎دار بین رقم و محیط کالوس­زایی نشان داد که عکس العمل رقم  به محیط­های مختلف کالوس­زایی یکسان نمی‎باشد (جدول 4). همچنین روند پاسخ به محیط کالوس‫زایی 30 روز بعد از کشت مشابه 15 روز می‎باشد.

از نظر درصد القاء کالوس جنین‎زا (جدول 7) نتایج تجزیه نشان ‎داد که محیط کشت B1 با القاء 64/50 درصد کالوس جنین‎زا کمترین و محیط‎های B2 و B3 به‫ترتیب با متوسط 18/67 و 07/62 درصد بیشترین کالوس جنین‎زا را تولید کرده اند. همچنین محیط B3 و در گام بعدی محیط کشت B1 بیشترین حجم کالوس 15 و 30 روز بعد از کشت را داشتند. محیط کشت B2 کوچکترین حجم کالوس را در محیط درون شیشه‎ای ارائه نمود، و نیز محیط B3  کالوس با وزن بیشتر و محیط B2 کالوس با وزن کمتری را تولید کرد.

 

 

جدول7 : مقایسه میانگین محیط‎های مختلف کالوس­زایی  برای صفات درون شیشه‎ای 

محیط القای کالوس

درصد القای کالوس بعد   از 15 روز

 

درصد القای کالوس بعد   از 30 روز

درصد کالوس جنین‎زا

حجم کالوس 15 روزه

حجم کالوس 30روزه

وزن کالوس

B1

A

67/91

 

A

82/87

B

64/50

A

38/9

B

40/10

B

94/2

 

B2

B

92/76

 

B

66/78

A

18/67

C

09/8

B

46/10

C

55/2

 

B3

A

48/91

 

A

26/87

A

07/62

A

53/9

A

14/11

A

20/3

 

B4

A

22/89

 

A

52/85

A

80/59

B

85/8

AB

78/10

B

87/2

 

ادامه جدول 5:

محیط القاء کالوس

درصد نقطه سبز بعد از   7 روز

درصد نقطه سبز بعد از   14 روز

درصد نقطه سبز بعد از   21 روز

درصد نقطه سبز بعد از   28 روز

تعداد نقطه سبز در هر   کالوس بعد از 14 روز

درصد تشکیل

ساقه‎چه

فراوانی باززایی

B1

B

49/6

B

02/24

B

90/50

B

97/51

B

51/18

C

98/10

C

2/46

B2

A

47/28

A

79/43

A

91/67

A

28/69

A

17/25

B

02/13

B

7/65

B3

A

12/31

A

31/45

A

02/65

A

93/68

A

01/25

A

09/28

A

80

B4

A

85/35

A

46

A

53/67

A

96/67

A

80/24

B

12

B

1/64

میانگین های دارای حروف متفاوت در هر ستون تفاوت معنی‎داری در سطح احتمال 5 درصد دارند.

 

 

 

 

 

 از نظر درصد تشکیل ساقه‎چه (جدول 7)، محیط B3  با  09/28 درصد بیشترین  و محیط B1  با 89/10 درصد کمترین ساقه‎چه را تولید نموده است. فراوانی باززایی در این محیط‎ها بترتیب 80 و 2/46 درصد بود. بنابراین در کل و بدون درنظر گرفتن اثرات متقابل معنی‎دار محیط B3  که شامل ترکیبات

 [MS(Macro+Micro) + Thiamine-Hcl(40mg/l) + L-Asparagine(150mg/l) + 2,4-D(2mg/l) + Maltose(20g/l)  + Agar(8g/l) pH=5/8with KOH]

 است بهترین محیط جهت کالوس­زایی، تولید کالوس با حجم و وزن بالا، کالوس با تعداد و درصد نقطه سبز بیشتر، کالوس با درصد ساقه‎چه بالا و بویژه تولید کالوس با فراوانی باززایی بالا می‎باشد. مقایسه میانگین بین محیط‎های مختلف باززایی (جدول 8) بیانگر این مطلب است که از نظر درصد نقطه سبز و تعداد در هر کالوس، محیط C3  نسبت به بقیه محیط‎ها از کارایی بالاتری برخوردار بود. این محیط با تولید 9/14 درصد ساقه‎چه و 6/72 درصد فراوانی باززایی نسبت به سایر محیط‎ها برتری داشت. ترکیبات تشکیل دهنده محیط C3   بشرح زیر می‎باشد:

[MS(Macro+Micro+vitamins) + myo inositol(100mg/l) + IAA(0/5mg/l) + BAP(1mg/l)  + Sucrose(30g/l)  + Agar(8g/l) pH=5/7 with NaOH]

بنابراین، استفاده از محیط موراشیگ اسکوک به­همراه ویتامین‎ها اسید اندول‎­ استیک به­میزان 5/0 میلی­گرم در لیتر محیط کشت و BA به ­میزان 1 میلی­گرم در لیتر کارایی باززایی را تا 6/72 درصد افزایش می‎دهد. نکته جالب در این است که تفاوت محیط C1 و C2  نسبت به محیط C3  در  وجود آسیدآمینه آسپاراژین ، تیامین و نیز هورمون سیتوکینین و Kin می‎باشد و بیانگر این موضوع است که در محیط باززایی نیازی به افزودن این مواد نیست و کافی است با افزودن میواینوزیتول به‫جای این مواد کارایی باززایی را تا حدود زیادی بالا برد.

 

 

 

جدول8: مقایسه میانگین محیط‎های مختلف باززایی  برای صفات درون شیشه‎ای

فراوانی باززایی

درصد تشکیل

ساقه‎چه

تعداد نقطه سبز در هر   کالوس

درصد نقطه سبز بعد از   28 روز

درصد نقطه سبز بعد از   21 روز

درصد نقطه سبز بعد از   14 روز

محیط باززایی

2/58

B

98/8

B

03/22

B

74/60

B

85/57

B

91/35

B

1                       C

8/59

B

51/9

B

92/21

B

54/60

B

55/59

B

51/33

B

2                       C

6/72

A

9/14

A

23/26

A

48/72

A

18/71

A

42/48

A

3                       C

میانگین های دارای حروف متفاوت در هر ستون تفاوت معنی‎داری در سطح احتمال 5% دارند.

 

 

                       

شکل 1: مراحل کشت و القا کالوس و باززایی گیاه گندم از ریزنمونه جنین نارس.:A شروع کالوس دهی در اتاق تاریک یک هفته بعد از کشت جنین نارس گندمB  : کالوس ‎زایی جنین‎نارس گندم  4 هفته بعد از کشت در محیط تاریکی C: ظهور نقطه سبز در محیط باززایی بعد از 7 روز کشت کالوس‎های جنین‎زای گندم در محیط روشنایی  D: تشکیل جنین سوماتیکی در محیط باززایی در کشت جنین نارس گندم  F: باززایی کالوس­های جنین‎زا در در محیط کشت MS یک ماه بعد از واکشت   G: القاء ریشه‎زایی ساقه‎چه‎های تولید شده گندم در محیط کشت 1/2MS


 

 

 

 


تاثیر غلظت­ 2, 4-D بر القای کالوس­زایی قطعات برگی

 

تجزیه واریانس داده­های حاصل از کالوس­زایی بر روی سطوح مختلف تنظیم کننده های رشد 2, 4-D نشان داد که بین چهار لاین گندم، سطوح مختلف هورمون 2, 4-D ، اثر متقابل لاین × سطوح مختلف هورمون از نظر درصد کالوس­زایی در سطح احتمال یک درصد اختلاف معنی‌داری وجود دارد (جدول 9).

 

 

 

 

جدول 9: تجزیه واریانس تاثیر سطوح مختلف 2, 4-D و لاین­های گندم بر روی درصد کالوس­زایی از ریزنمونه قطعات کولئوپتیل

میانگین مربعات   درصد کالوس­زایی

درجه آزادی

منابع تغییر

**77/2

2

2,   4-D

**56/49

3

لاین

**83/3

6

لاین× 2, 4-D

375/0

24

خطا

45/12

ضریب تغییرات (CV %)

* و ** به‫ترتیب نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد و 1درصد است.

 

 

با توجه به معنی­دار بودن اثرمتقابل، بالاترین میزان کالوس‫زایی را لاین C-D-9 و لاین C-D-8 در سطوح 2 و 4/2 میلی­گرم در لیتر 2, 4-D داشتند و کمترین میزان کالوس­زایی متعلق به لاین C-D-4 در سطوح 2 و 4/2 میلی­گرم در لیتر 2, 4-D بود. در لاین C-D-9 با تغییر سطوح هورمون2, 4-D  از 2 به 3 میلی‌گرم در لیتر، تغییر معنی‫داری در کالوس­زایی ایجاد نشد. در حالی‫که در لاین C-D-4 با افزایش غلظت هورمون2, 4-D  از 4/2 به 3

 

 

میلی‌گرم در لیتر افزایش معنی­داری در میزان کالوس­زایی حاصل شد. در ژنوتیپ C-D-8 برعکس لاین C-D-4، افزایش غلظت هورمون 2, 4-D  از 4/2 به 3 منجر به کاهش معنی­داری در میزان کالوس­زایی شد. به‫طور کلی، لاین C-D-9 از توان کالوس­زایی بالاتری نسبت به سایر لاین­ها برخوردار بود و در بین تیمارهای مختلف هورمونی، سطح2  و 4/2 میلی­گرم در لیتر 2, 4-D نسبت به سایر سطوح در اکثر لاین­ها به کشت بافت بهتر پاسخ نشان­داده است (شکل 3).

 

 

شکل 2: مراحل کشت و القاء کالوس و باززایی گیاه گندم از ریزنمونه قطعات برگی.:A گیاهچه­های رشد کرده در شرایط استریل روی محیط MS 2/1.:B برگ­های زیر کلئوپتیل برای القا کالوس به قطعات 2-1 میلی­متری تقسیم و کشت شدند. C: القا کالوس از قطعات برگ روی محیط ML1G1 پس از 5 هفته کشت در تاریکی. D: تکثیر کالوس­های جنین­زایی به‌دست‌آمده از قطعات برگ روی محیط ML1C2. E: نمایی نزدیک از یک کالوس جنین­زا. F: نمای نزدیک از یک کالوس غیر جنین­زا. G: القا ساقه هوایی از کالوس­های جنین‌زا به‌دست‌آمده از قطعات برگ در محیط ML1R3. H و I: نمایی نزدیک از یک ساقه هوایی حاصل از کالوس جنین­زا. J: انتقال گیاهچه­های حاصل از باززایی به محیط کشت ریشه­زایی. K: انتقال گیاهچه­های ریشه­دار شده به خاک و سازگاری گیاهان به شرایط طبیعی.

 

 

       

شکل 3: مقایسه­ی میانگین درصد کالوس­زایی لاین­های مختلف گندم در سطوح مختلف غلظت   هورمون 2, 4-D

 

 

تاثیر انواع محیط کشت بر توان باززایی کالوس­های حاصل از قطعات برگی

برای بررسی اثر انواع محیط کشت در توانایی باززایی لاین­ها، ابتدا ریزنمونه­های قطعات برگی آن در محیط کشت حاوی 4/2 میلی‌گرم در لیتر 2, 4-D کشت شدند و بعد از تولید کالوس، کالوس­ها به دو نوع محیط کشت پایه مطابق جدول 3 (MS و N6) که هرکدام شامل شش محیط کشت  باززایی متفاوت بودند منتقل شدند. بعد از شش هفته درصد شاخه­زایی در محیط کشت ثبت گردید. با بررسی داده­های به‌دست‌آمده از این دو نوع محیط کشت  پایه مشخص شد که بین محیط­های کشت و لاین و اثرمتقابل لاین و محیط کشت از نظر درصد باززایی تفاوت معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد وجود دارد (جدول 10).

 

 

جدول 10: تجزیه واریانس فاکتوریل تاثیر محیط کشت­های مختلف و لاین­های مختلف گندم بر روی باززایی بر روی ریزنمونه قطعات برگی

منابع تغییر

درجه آزادی

درصد باز­زایی

محیط کشت

11

33/5**

لاین

3

54/3 *

لاین×   محیط کشت

33

431/0 ns

خطا

96

062/1

ضریب   تغییرات(CV %)

65/17

ns، * و ** به‫ترتیب نشان‌دهنده غیر معنی­دار، اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد و 1درصد است.

 

 

تاثیر محیط کشت MS بر باززایی کالوس­های جنین‌زا لاینهای مختلف گندم

باززایی در این آزمایش بسته به لاین و نسبت به محیط کشت متفاوت بود (جدول10). بالاترین میزان باززایی لاین C-D-9 در محیط کشت پایه MS حاوی1 mg/L IAA+ 0.5 mg/L BA به‫میزان (22/22 درصد) و کمترین میزان باززایی لاین  C-D-9 در محیط کشت پایه MS حاوی 1mg/L IAA+  mg/L BA 1 و  mg/L BAP 0.5 mg/L IAA+2 به میزان (7/3 درصد) بود. بالاترین میزان باززایی لاین  C-D-8 در محیط کشت پایه MS حاوی1 mg/L IAA+ 0.5 mg/L BA به‫میزان (51/18 درصد) و کمترین میزان باززایی لاین  C-D-8 در محیط کشت پایه MS حاوی 1mg/L IAA+ 1 mg/L BA و  mg/L BAP 0.5 mg/L IAA+2   بود. بالاترین میزان باززایی لاین  C-D-6 در محیط کشت پایه MS فاقد تنظیم‌کننده رشد و محیط کشت پایه MS حاوی mg/L BAP 1mg/L NAA+2 به میزان (81/14 درصد) و کمترین میزان باززایی لاین C-D-6 در محیط کشت پایه MS حاوی  1mg/L IAA+ 1 mg/L BA و mg/L BAP 0.5 mg/L IAA+2  و mg/L Kin  0.5 mg/L NAA+2  به میزان (7/3 درصد) بود. بالاترین میزان باززایی لاین C-D-4 در محیط کشت پایه MS حاوی1 mg/L IAA+ 0.5 mg/L BA به‫میزان (95/25 درصد) و کمترین باززایی لاین C-D-4 در محیط کشت پایه MS فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد و محیط کشت پایه MS حاوی1mg/L IAA+ 1 mg/L BA به‫میزان (4/7 درصد) بود. به‫طورکلی، بیشترین میزان باززایی­ دراکثر محیط­های کشت MS مربوط به لاین C-D-4  و کمترین میزان باز­زایی در اکثر محیط­های کشت MS مربوط به لاین C-D-6  بود (شکل 4).

 

       

 

شکل 4: مقایسه­ی میانگین درصد باززایی لاین­های مختلف گندم در محیط کشت مختلف MS

 

 

 

تاثیر محیط کشت N6 بر باززایی لاین­های گندم

باززایی در این آزمایش بسته به لاین و نسبت به محیط کشت متفاوت بود (جدول9)که با نتایج سایر محققین نیز مطابقت دارد(20، 21، 22، 23) . مقایسه میانگین اثر متقابل نشان داد بالاترین میزان باززایی لاین C-D-9، در محیط کشت پایهN6 حاوی mg/L IAA 1mg/L BA+1 به‫میزان (62/29 درصد) و کمترین میزان باززایی لاین C-D-9، در محیط کشت پایهN6 حاوی0.5 mg/LKin بود. بالاترین میزان باززایی لاین C-D-8 در محیط کشت پایهN6 حاویmg/L Kin 0.5 mg/L NAA+2 و mg/L BAP mg/L NAA+2 0.5 به میزان (51/18 درصد) و کمترین میزان باززایی لاین C-D-8 در محیط کشت پایهN6 حاوی 0.5 mg/L BAP و  mg/LKin 0.5 بود. بالاترین میزان باززایی لاین C-D-6 در محیط کشت پایهN6 حاوی mg/L Kin 0.5 mg/L NAA+2  به میزان (81/14 درصد) و کمترین میزان باززایی لاین C-D-6 در محیط کشت پایهN6 حاوی 0.5 mg/L BAP و  mg/LKin 0.5 بود. بالاترین میزان باززایی لاین C-D-4 در محیط کشت پایهN6 حاوی mg/L Kin 0.5 mg/L NAA+2 به میزان (95/25%) و کمترین میزان باززایی لاین C-D-4 در محیط کشت پایهN6 حاوی mg/LKin 0.5 بود. در نهایت، بیشترین میزان باززایی­ در محیط کشت N6 مربوط به لاین C-D-9 و کمترین میزان باز­زایی مربوط به لاین C-D-6 می­باشد. همچنین  برای اکثر لاین­ها بیشترین میزان باززایی­ مربوط به محیط کشت پایهN6 حاوی mg/L Kin 0.5 mg/L NAA+2  با میانگین (04/20 درصد) و کمترین میزان باززایی مربوط به محیط کشت پایهN6 حاوی mg/LKin 0.5  بود (شکل 5).

 

 

 

       

شکل5: مقایسه­ی میانگین اثرمتقابل لاین­های مختلف گندم در محیط کشت مختلف N6 روی درصد باززایی

 

 


القای کالوس و تولید کالوس­های جنین­زا در شرایط تاریکی از ریزنمونه جنین بالغ گندم

در این تحقیق برای القای کالوس­زایی از جنین بالغ و از سه غلظت مختلف هورمون 2, 4-D (2، 4/2 و 3 میلی‌گرم در لیتر) استفاده شد. چند روز بعد از اینکه ریز نمونه‌ها در محیط کشت کالوس­زایی (ML1C1) قرار گرفتند شروع به کالوس­زایی کردند. در دو هفته اول رشد کالوس­ها خیلی کم

 

بود و بعد از دو هفته کالوس‌ها رشد بیشتری از خود نشان دادند. کالوس­های حاصله از نظر ساختار متراکم، ترد و دارای سطح ناصاف بودند و از لحاظ رنگ کرم تا کرم مایل به زرد (به دلیل قرارگیری در شرایط تاریکی و عدم تولید کلروفیل) بودند (شکل 6).

 

 

 

شکل 6. مراحل مختلف القا کالوس و باززایی گیاه جو از ریزنمونه جنین بالغ. A: کشت جنین بالغ در محیط کالوس­زایی ML1G1. B: القا کالوس از جنین بالغ‌بر روی محیط ML1G1 پس از 5 هفته کشت در تاریکی. C: تکثیر کالوس­های جنین­زایی به‌دست‌آمده از جنین بالغ روی محیط. D: نمایی نزدیک از یک کالوس جنین­زا. E: نمای نزدیک از یک کالوس غیر جنین­زا. F: ایجاد نقاط سبزرنگ بر روی کالوس بعد از انتقال کالوس به محیط باززایی. G: القا ساقه هوایی از کالوس­های جنین‌زا به‌دست‌آمده از جنین بالغ در محیط. H: نمایی نزدیک از یک ساقه هوایی حاصل از کالوس جنین­زا. I: انتقال گیاهچه­های حاصل از باززایی به محیط کشت ریشه­زایی. J: انتقال گیاهچه­های ریشه­دار شده به خاک و سازگاری گیاهان به شرایط طبیعی.

 

 

تجزیه واریانس داده­های حاصل از کالوس­زایی بر روی سطوح مختلف هورمون 2, 4-D نشان داد که بین چهار لاین گندم، سطوح مختلف هورمون 2, 4-D و نیز اثر متقابل لاین × سطوح مختلف هورمون حداقل در سطح احتمال پنج درصد از نظر درصد کالوس­زایی اختلاف معنی‌داری وجود دارد (جدول 11)

 

 

جدول11. تجزیه واریانس فاکتوریل تأثیر سطوح مختلف 2, 4-D و لاین­های گندم بر روی کالوس­زایی جنین بالغ گندم

منابع تغییرات

درجه آزادی

درصد کالوس­زایی

2,4-D

2

**437/6

رقم

3

**748/54

×   2,4-D رقم

6

*678 /1

خطا

24

771/0

ضریب* و ** به‫ترتیب نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 5   درصد و 1 درصد است.

 

 

کالوس­زایی گندم در این تحقیق بسته به ژنوتیپ و غلظت 2, 4-D متفاوت بود که با نتایج سایر محققین نیز مطابقت دارد(23، 24، 25). بیشترین میزان کالوس­زایی مربوط به لاین C-D-9 (55/79%( و کمترین میزان کالوس­زایی مربوط به لاین C-D-6 (22/22%) بود (شکل 8). همچنین در سطوح مختلف هورمون 2, 4-D  بیشترین میزان کالوس­زایی مربوط به سطح 4/2 میلی­گرم در لیتر با میانگین (77/58 درصد) بود (شکل 7). با توجه به معنی­دار بودن اثرمتقابل، بالاترین میزان کالوس­زایی را لاین C-D-9 در تمامی غلظت­های مختلف 2, 4-D و لاین C-D-8 در سطوح 4/2 میلی­گرم در لیتر 2, 4-D تولید کردند  و کمترین میزان کالوس­زایی متعلق به لاین C-D-6 در سطوح 2 و 4/2 میلی­گرم در لیتر 2, 4-D بود (شکل 9).

 

       

       

شکل 7: مقایسه­ی درصد کالوس­زایی ارقام   گندم در غلظت­های مختلف هورمون 2, 4-D  (2، 4/2 و 3 میلی‌گرم در لیتر)

 

شکل 8: مقایسه­ی میانگین درصد کالوس­زایی   ارقام مختلف گندم

 

 

 

 

       

شکل 9: مقایسه­ی میانگین اثر متقابل ارقام گندم در   سطوح مختلف غلظت هورمون 2, 4-D

 

 

انتقال کالوس­های به دست آمده از جنین بالغ گندم به محیط باززایی

بعد از انتقال کالوس به‫دست ‌آمده از بهترین تیمار هورمونی (4/2 میلی‌گرم در لیتر 2, 4-D) حاصل از جنین بالغ گندم در شرایط تاریکی و انتقال کالوس­ها به محیط جنین­زایی سوماتیکی حاوی 10 میلی­گرم بر لیتر نیترات نقره، کالوس‫های جنین­زا در محیط باززایی به‫مدت شش هفته قرار گرفتند و بعد از این مدت میانگین درصد شاخه­زایی هر رقم ثبت گردید. تجزیه واریانس داده­های باززایی نشان داد که بین ارقام، محیط­های مختلف کشت و اثرمتقابل لاین در محیط کشت از نظر درصد شاخه­زایی حداقل در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی‌داری وجود دارد (جدول 12).


 

جدول 12. تجزیه واریانس فاکتوریل تاثیر محیط کشت­های مختلف و لاین­های گندم بر روی درصد باززایی جنین بالغ گندم

منابع تغییرات

درجه آزادی

درصد باز­زایی

محیط کشت

5

31/9**

رقم

3

30/6**

رقم× محیط کشت

15

915/1**

خطا

48

0/399

**   نشان‌ دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است.

تغییرات (CV %)

 

 

 

 

محیط کشت باززایی شامل هورمون Kin در سطوح 5/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر، و BAP در سطوح 5/0، 2 و 3 میلی‫گرم در لیتر بود. تقریباً کمتر از یک هفته پس از کشت کالوس­ها در محیط باززایی در شرایط روشنایی (نور سفید)، آغاز اندام­زایی به صورت نقاط سبزرنگ در سطح کالوس­ها مشاهده گردید. روند تبدیل جنین­های سوماتیکی به اندام در کالوس­ها در هفته­های بعد افزایش یافت. به نحوی که در هفته­های آخر بر تعداد و رشد نوساقه­های تشکیل شده اضافه شد.

بیشترین میزان باز­زایی مربوط به لاین  C-D-9 با میانگین (66/20 درصد( و کمترین میزان باززایی مربوط به لاین C-D-6 با میانگین (88/4 درصد) بود (شکل11). همچنین در محیط­های کشت متفاوت بیشترین میزان میانگین باز­زایی مربوط به محیط کشت mg/l Kin2 با میانگین 22/27 درصد بود (شکل 10). و با توجه به معنی­دار بودن اثر متقابل محیط­های کشت متفاوت با لاین­های مورد مطالعه، بیشترین میزان باززایی در C-D-8 و C-D-9 در سطح 2 میلی­گرم در لیتر هورمون Kin به میزان (40 درصد) مشاهده شد (شکل 12).

 

 

       

       

شکل 10: مقایسه­ی میانگین درصد باززایی محیط­های کشت متفاوت   ارقام گندم

 

شکل11: مقایسه­ی میانگین درصد باززایی ارقام گندم مورد مطالعه

 

       

 

شکل 12. مقایسه­ی میانگین درصد باززایی محیط­های کشت متفاوت   و لاین­های مختلف گندم

 

     

 

بحث

چندین فاکتور مؤثر درکشت بافت سلول در شرایط آزمایشگاه وجود دارد. یک سری از این فاکتورها داخلی و یک سری از این فاکتورها خارجی هستند. نوع ریزنمونه،

 

ژنوتیپ رقم مورد استفاده و ترکیبات محیط کشت از فاکتورهای مهم درکشت بافت می­باشد. تصور می­شود مهم‌ترین فاکتور مؤثر ساختار ژنتیکی ریزنمونه است. در پژوهشی در گیاه گندم از جنین بالغ، میان‫گره و بخش‌های محور سنبله به‫عنوان ریزنمونه و از محیط MS حاوی 1 میلی­گرم در لیتر 2, 4-D استفاده نمودند و نتایج نشان داده که کالوس­زایی به ژنوتیپ ارقام مورد استفاده بستگی دارد. همچنین این محققین نشان دادند حضور اکسین در محیط القای کالوس ضروری است (26). در مطالعه­ای که بر روی کالوس­زایی از جنین­های بالغ گندم صورت گرفت درصد کالوس­زایی در محیط کشت حاوی 2 میلی‌گرم در لیتر 2, 4-D ، 67/86% و در محیط کشت حاوی 3 میلی‌گرم در لیتر 2, 4-D ،86/87 درصد و در محیط کشت حاوی 4 میلی‌گرم در لیتر 2, 4-D ، 85 درصد به‫دست آمد (27 ). در محیط کشت حاوی 2 میلی‌گرم در لیتر 2, 4-D درصد کالوس­زایی از جنین­های بالغ بین 20/96-75/68% متغیر بود (28). در آزمایشی دیگری از 2 میلی‌گرم در لیتر 2, 4-D برای القای کالوس استفاده کردند و مشاهده شد که درصد کالوس­زایی در گندم زراعی بین 85-82 تا 85 درصد  و در گندم دوروم بین 77 تا 79 درصد% می­باشد(29).

در پژوهشی دیگر مشخص شد که نوع ترکیبات محیط کشت MS و برش طولی (نصف کردن) جنین گندم رسیده در باززایی مؤثر است. 70% القای کالوس اولیه در تمام ارقام مورد آزمایش در محیط کشت حاوی  mg/l 2, 4-D2 به دست آمد (30). در آزمایشی، از 39 رقم گندم زمستانه برای القای کالوس و باززایی استفاده کردند. برخی از ارقام درصد باززایی خوبی نشان دادند آن­ها گزارش کردند که درصد القای کالوس و درصد باززایی کاملاً به رقم وابسته است (22). برای باززایی از کالوس­های به‌دست‌آمده از جنین­های بالغ حمایت ‌شده با آندوسپرم از هورمون BAP به میزان 5/0 میلی‌گرم در لیتر به همراه 1/0 میلی‌گرم در لیتر IAA استفاده کردند که حداکثر تشکیل گیاهچه بعد از چهار هفته 35 تا 40 درصد بود (31).

در مطالعه­ای که بر روی کالوس­زایی از جنین­های بالغ گندم صورت گرفت درصد کالوس­زایی در محیط کشت حاوی 2، 3 و 4 میلی‌گرم در لیتر 2, 4-D ، به ترتیب 67/86 درصد، 86/87 درصد و 85 درصد به‫دست آمد(27). در مطالعه­ای درصد کالوس­زایی ژنوتیپ­های مختلف گندم در محیط کشت حاوی 8 میلی‌گرم در لیتر 2, 4-D مشاهده کردند که درصد کالوس­زایی از 6/11 تا 6/89 بین ارقام متفاوت بود (32). در آزمایشی از 2 میلی‌گرم در لیتر 2, 4-D برای القای کالوس استفاده کردند و مشاهده شد که درصد کالوس­زایی در گندم زراعی بین 82 تا 85 درصد و در گندم دوروم بین 77 تا 79 درصد می­باشد (29).

در پژوهشی دیگر اثر dicamba در کشت جنین بالغ هفت رقم گندم نان را بررسی شد. مشخص شد که پاسخ کشت بافت به ژنوتیپ و غلظت دیکامبا بستگی دارد (33). بالاترین نرخ رشد کالوس 1/63 درصد در محیط کشت Linsmaier Skoog حاوی  mg/l dicamba5 مشاهده شد (24).

 

نتیجه‌گیری

ریزنمونه جنین نابالغ، بیشترین میزان کالوس­زایی مربوط به ارقام فلات و چمران با 4/93 و 2/93 در 15 روز بعد از کشت  بود. همچنین در بین محیط کشت­های متفاوت القای کالوس،  محیط کشت B2 کمترین درصد القای کالوس با متوسط 92/76 و محیط‌های B3 و B1 به‫ترتیب با متوسط 67/91 و  48/91 بیشترین درصد القاء کالوس 15 روز بعد از کشت جنین نارس در محیط کالوس­زایی داشته است. بیشترین میزان باززایی مربوط به رقم چمران و آزادی به‫ترتیب با 78/18 و 90/3 درصد از بیشترین و کمترین درصد تشکیل ساقه‎چه برخوردار بودند. همچنین رقم چمران و الوند به ترتیب با 5/82 و 3/70 درصد بیشترین و رقم آزادی با 5/49 درصد کمترین فراوانی باززایی را داشتند و همچنین در بین محیط کشت­های متفاوت باززایی محیط کشت C3  با تولید 9/14 درصد ساقه‎چه و 6/72 درصد فراوانی باززایی نسبت به سایر محیط‎ها برتری دارد.

ریزنمونه جنین بالغ، بیشترین میزان کالوس­زایی مربوط به لاین C-D-9  به میزان (55/79 درصد( و همچنین در سطوح مختلف هورمون 2, 4-D بیشترین میزان کالوس­زایی مربوط به سطح 4/2 میلی­گرم در لیتر با میانگین (77/58 درصد) بود. بیشترین میزان باز­زایی مربوط به لاین C-D-9  با میانگین (66/20%( و همچنین در محیط­های کشت متفاوت بیشترین میزان میانگین باز­زایی مربوط به محیط کشت 2 میلی­گرم در لیتر (Kin) با میانگین (22/27 درصد) بود.

ریزنمونه قطعات برگی، بیشترین میزان کالوس­زایی مربوط به لاین C-D-9 (82%( و همچنین در سطوح مختلف هورمون 2, 4-D بیشترین میزان کالوس­زایی مربوط به سطح 4/2 میلی­گرم در لیتر با میانگین (6/59 درصد) بود. بیشترین درصد شاخه­زایی 62/29% برای لاین C-D-9 در محیط کشت N6(6) حاوی mg/l IAA 1 به‫همراه mg/l BA 1  به دست آمد.

1. Kazemi Arbath, H .2005. Cereal morphology and physiology. Tabriz University Press.104.

2. Bushuk W. 1998. Wheat breeding for end product use. Euphytica 100(1): 137-145.

3. Carman JG, Jefferson NE, Campbell WF .1988. Induction of embryogenic (Triticum aestivum L.) calli: I. Quantification of genotype and culture medium effects, Plant Cell Tiss. Org. Cult. 10: 101-106.

4. Chowdhury SH, Kato K, Yamamoto Y , Hayashi K .1991. Varietal variation in plant regeneration capacity from immature embryos among common wheat cultivars, Jpn. J. Breed. 41: 443-450.

5. NouriDelavar MZ, Arzani A. 2000. Analysis of callus induction and plant regeneration from immature embryo of rice cultivars. Journal of Science and Technology of Agriculture and Natural Resources 4(4): 57-71.

6. Ozgen M, Turet M, Ozcan S, Sancak C. 1996. Callus induction and plant regeneration from immature and mature embryos of winter wheat genotypes. Plant Breeding 115(6): 4555-458.

7. Ichihashi S, Kato S. 1986. Clonal Propagation of Iris kaempferi by means of flower organ culture. Bulltein Aichi University Edu 35: 135-143.

8. Hagio T, Ichiri SS, Yamada T. 2002. Efficient plant regeneration through morphogenesis in Japanese commercial variety of wheat, In Vitro Cell. Dev. Biol. 38: 1394-1396.

9. Bhaskaran S, Smith RH. 1990. Regeneration in cereal tissue culture: a review, Crop Sci. 30(6): 1328-1336.

10. Jun ying C, Run qing Y, Hai xian Xin jian C. 2006.  Study on plant regeneration of wheat mature embryo under endosperm-supported culture. Agricultural Sciences in China. 5(8): 572-578.

11. Hess JR,  Carman G .1998. Embryogenic competence of immature wheat embryos:genotype, donor plant, environment, and endogenous hormone levels. Crop Sci. 38: 249-253.

12. Yu Y, Wang J, Zhu ML, Wei ZM. 2008. Optimization of mature embryobased high frequency callus induction and plant regeneration from elite wheat cultivars grown in China. Plant Breeding 127: 249-255.

 13. Filippov M, Miroshnichenko D, Vernikovskaya D, Dolgov S .2006. The effect of auxins, time exposure to auxin and genotypes on somatic embryogenesis from mature embryos of

 

wheat. Plant Cell, Tiss. and Org. Cult.  84(2): 213-222.

14. Patnaik D, Khurana P. Genetic transformation of Indian bread (Triticum aestivum) and pasta (Triticum durum) wheat by particle bombardment of mature embryo derived calli. BMC Plant Biology. 2003; 3: 1-11.

15.  Delporte F, Mostade O, Jacquemin JM .2001. Plant regeneration through callus initiation from thin mature embryo fragments of wheat. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 67: 73-80.

16. Ahmadabadi M, Ruf S, Bock R. 2007. A leaf-based regeneration and transformation system for maize (Zea mays L). Transgenic Res 16(4): 437-448.

17. Bohorova N.E Fennell S. McLean S.D. Pellegrineschi A.  1999. Laboratory protocols-CIMMYT Applied Genetic Engineering Laboratory. CIMMYT Applied Biotechnology Center, International maize and wheat improvement center.

18. Alexander, P.S., Xia-Yi, K., Dong– Fang, C., and Malcolm, C.E. 2000. Production of fertile transgenic wheat plants via tissue electroporation. Plant Sci., 156: 227-233.

19. Murashige,T. and Skoog, F.1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15:473-497.

20. Mathias R J, Simpson ES. 1986. The interaction of genotype and culture medium on the tissue culture responses of wheat (Triticum aestivum L. em. thell) callus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 7(1): 31-37.

21. Przetakiewicz A, Orczyk W, Nadolska-Orczyk A. 2003. The effect of auxin on plant regeneration of wheat, barley and triticale. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 73: 245-256.

22. Sears RG, Decard EL. 1982. Tissue culture variability in wheat: Callus induction and plant regeneration. Crop Sci 22: 546-550.

23. Tarinejad A, Toorchi M, Habashi A,  Pellegrineschi A. 2007. Optimization of gene transfer in Iranian bread wheat cultivars by biolistic bombardment. Journal of Food Agriculture and Environment, 5(3&4): 237-241.

24. Kilinc M. 2004.  Effects of Dicamba concentration on the embryo cultures of some bread wheat (Triticum aestivum L.) genotypes. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 18(2): 58-61.

249-253.

25. Wang CT, Wei ZM. 2004. Embryogenesis and regeneration of green plantlets from wheat(Triticum aestivum L.) leaf base. Plant Cell, Tiss. and Org. Cult 77: 149-156.

26. O'Hara JF, Street HE. 1978. Wheat callus culture: the initiation, growth and organogenesis of callus derived from various explant sources. Annals of Botany 42: 1029-1038.

27. Bi RM, Kou M, Chen LG, Mao SR, Wang HG. 2007. Plant regeneration through callus initiation from mature embryo of Triticum. Plant Breeding 126(1): 9- 12.

28. Bi R, Wanh H. 2008. Primary studies on tissue culture from mature embryos in diploid and tetraploid wheat. Front. Agric. China 2(3): 262-265.

29. Chauhan H, Desai SA, Khurana P. 2007. Comparative analysis of the differential regeneration response of various genotypes of Triticum aestivum, Triticum durum and Triticum dicoccum. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 91(3): 191-199.

30. Yu Y, Wei ZM. 2007. Factors affecting efficient plant regeneration from wheat mature embryos. Journal of Molecular Cell Biology 40(6): 443-450.

31. Rashid A, Qureshi RH, Hollington PA, Jones RGW. 1999. Comparative response of wheat (Triticum aestivum L.) cultivars to salinity at seedling stage. Agron. Crop Sci. 182: 199-207.

32. Chen J, Yue R, Xu H, Chen X. 2006. Study on Plant Regeneration of Wheat Mature Embryos Under Endosperm- Supported Culture. Agricultural Sciences in China 5(8): 572-578.

33. Turhan H, Baser I. 2003. Callus induction with mature embryo culture technique in winter wheat (Triticum aestivum L.). Indian Journal of Agricultural Sciences 73: 399-401.