تنظیم رفتار سلول‌های MCF7با تیمار محیط کاندیشنال سلول‌های بنیادی چربی انسانی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بافت شناسی- جنین شناسی، دانشگاه دامغان، دانشکده زیست شناسی، دامغان، ایران

2 استادیار گروه سلولی و ملکولی، دانشگاه دامغان، دانشکده زیست شناسی و پژوهشکده علوم زیستی، دامغان، ایران

چکیده

هدف:  در این مطالعه اثر ضد سرطانی CM بر سلول‫های MCF7 در شرایط کشت آزمایشگاهی بررسی شد.
مواد و روشها: سلول‫های بنیادی چربی از چربی ناحیه شکم خانم‫های سزارینی بیمارستان ولایت دامغان و با کسب رضایت نامه استخراج شد. CM از کشت پاساژ چهارم hASCs در مدیوم فاقد سرم پس از 72 ساعت، تهیه شد. سلول‫های MCF7 در معرض CM به‫مدت 24 و 48 ساعت قرار گرفتند و سپس سرعت تکثیر و میزان بقای سلول­ها و همچنین بیان ژن­های آپوپتوتیک با روش­های MTT، شمارش سلولی (هموسایتومتر) وRT-PCR  بررسی شد.
 نتایج: سلول­هایی که با CM به‫مدت 24 و 48 ساعت تیمار شده بودند، کاهش معنی­داری در سرعت تکثیر و میزان بقا در مقایسه با سلول­هایی که در محیط حاوی سرم کشت داده شده بودند (کنترل)، نشان دادند. همچنین افزایش معنی­داری در بیان ژن کاسپاز 3، در مقایسه با سلول­هایی که در محیط حاوی سرم کشت داده شده بودند مشاهده شد. در حالی‫که بیان ژن کاسپاز 9 فقط پس از 24 ساعت القا، افزایش معنی­داری را نشان داد.
 نتیجهگیری: محیط ­کاندیشنال از طریق فعال­ کردن کاسپازها،  آپوپتوزیس را در سلول­های سرطانی MCF7 القا کرده، سرعت تکثیر و بقا را نیز کاهش داد. بنابراین محیط­ کاندیشنال به‫عنوان مکمل می‫تواند به‫همراه دیگر روش­های درمانی ضد سرطانی به‫کار برده شود.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سرطان پستان شایع­ترین و دومین سرطان در زنان است، که با متاستاز به نقاط دیگر بدن مثل کبد، مغز، ریه و استخوان منجر به مرگ می­شود (1-2). تحقیقات نشان می­دهد که طی20 سال اخیر بروز سرطان پستان 50 تا 100 درصد افزایش یافته است. هنوز علت سرطان پستان به­طور کامل شناخته نشده اما عوامل گوناگونی مثل فاکتورهای ژنتیکی، محیطی و هورمون­ها در ابتلا به سرطان نقش دارند (3). همچنین چاقی با افزایش خطر سرطان پستان در ارتباط است (4). سلول­هایMCF7  (Michigan Cancer Foundation-7) مخفف از بنیاد سرطان میشیگان 7 است و برای اولین بار در سال 1970 از تومور پستان یک زن 69 ساله استخراج شد (5-6). این سلول­ها، در شرایط کشت آزمایشگاهی ساختار منسجمی داشته و چسبندگی بین سلولی محکمی را نشان می­دهند (2). این سلول­ها دارای گیرنده­های استروژنی و پروژسترونی هستند و از سرعت تکثیر بسیار بالایی برخوردارند. به‫طوری‫که تکثیر سلول­ها می­تواند از طریق تیمار با ضد استروژن‌ها مهار ­شود (2, 6). بیان گیرنده­های استروژنی در سطح سلول­های MCF7، باعث شده که این سلول­ها اغلب به شیمی ­درمانی پاسخ ­دهند (2).  امروزه پس از برداشتن کل پستان، به‌منظور بازگرداندن فرم طبیعی و حفظ آناتومی ارگان از بافت چربی خود بیمار به محل جراحی پیوند زده ­می­شود (7). از آنجاکه بافت پیوند ­شده حاوی سلول­های بنیادی است، مشاهده­ شده ریزمحیطی که این سلول­ها در محل پیوند ایجاد می­کنند می­تواند بر سلول­های سرطانی تاثیر گذاشته و مانع از بدخیم ­شدن آن­ها شود (7).

سلول­های بنیادی چربی انسانی  Adipose-derived stem cells(ASCs) اولین بار توسط Zuk و همکارانش  شناسایی شدند (8). فراوان­ترین و در دسترس­ترین سلول‫های ASCs، از چربی شکم و از طریق لیپوساکشن به‫دست می­آید که بسیار آسان، امن و بی­خطر است و مشکلات اخلاقی و عفونتی را ایجاد نمی­کند (7, 9-10). مطالعات اخیر نشان ­داده هر گرم بافت چربی، ظرفیت تولید سلول­های بنیادی بیشتری در مقایسه با همان میزان از مغزاستخوان یا بند ناف را دارد (1, 11). ASCها به آسانی استخراج می­شوند و سرعت تکثیر بالایی دارند، درحالی­که پتانسیل تمایزی­شان را حفظ می­کنند و چندتوان هستند (1, 11-12) و همچنین خاصیت چسبندگی به کف ظرف کشت را دارند (13). Chen و همکارانش، وجود سیتوکین­ها در محیط کاندیشنال جمع‌آوری‌ شده از سلول­های بنیادی مزانشیمی در شرایط هیپوکسی را گزارش دادند. مطالعات نشان داده در محیط ­­کاندیشنال فاکتورهای زیادی ازجمله VEGF، bFGF، EGF، TGF-b، HGF، HGF، PDGF، KGF، TNF و IL-6 وجود دارند (14). این فاکتورها که میکرووزیکول (Microvesicles)، سکروتوم (Secretome) یا اگزوزوم (Exosome) نام دارند، در محیط کشت سلول­های بنیادی شناسایی شده اند که به این محیط، محیط­ کاندیشنال (CM مخفف Conditioned Medium) میگویند. از آنجا که محیط­ کاندیشنال فاقد سلول است، از وقوع واکنش­های ایمنی جلوگیری می­کند و مشکل رد پیوند نیز وجود ندارد. همچنین محیط کاندیشنال دارای اثر آنتی ­اکسیدانتی و ضد توموری است (7, 15-16). تعداد سلول، نوع سلول، شرایط کشت، نوع محیط کشت و تعداد پاساژها بر کیفیت محیط ­کاندیشنال تاثیر می‫گذارند. محیط­ کاندیشنال مزیت­های زیادی دارد از جمله اینکه به‫راحتی تولید،  فریز، بسته­ بندی شده و قابل انتقال است که به‫خاطر این­ ویژگی­ها، از محیط­ کاندیشنال برای تولید دارو استفاده می­شود و همچنین نیاز به حفاظت ویژه مثل آنچه که در مورد سلول­های بنیادی باید رعایت­ شود، را ندارد (16). از طرفی برخلاف سلول­های بنیادی که جوش خورد نشان در محل پیوند، بسیار پایین بوده و احتمال خطر گسترش سرطان در آن‫ها بالاست، محیط­ کاندیشنال این مشکل­ها را ندارد. همچنین برای درمان بیماران سریعا در دسترس بوده، بدون آنکه نیازی به جداسازی سلول­های بنیادی از بیمار باشد. البته برای به‫دست آوردن محیط­ کاندیشنال بهتر است از محیط­ کشت مناسب حاوی ویتامین­ها، آمینواسیدها، گلوکز و سرم انسانی که از خون انسان به‫دست می­آید استفاده شود، که در موارد بالینی مناسب‫تر است (17). تنها نقص محیط­کاندیشنال طول عمر کوتاه آن است (16).  از کاربردهای درمانی محیط ­کاندیشنال می­توان به ترمیم زخم (14)، بهبود چین ­و چروک و پیری زودرس پوست در اثر اشعه ماوراء ­بنفش (9)، آلوپسی، رشد مو، بهبود اختلالات عصبی، نقص­های دستگاه اسکلتی و ریه، بیماری­های کلیوی، آسیب­های مربوط به کبد، التهاب­ نورونی (16)، سکته­های مغزی (10) و قلبی (18) اشاره نمود و همچنین بهعنوان محیط مناسبی در بلوغ اووسیت (19) و درمان برخی سرطان­ها از جمله سرطان پستان اشاره نمود. تحقیقات دیگری نیز نشان داده در سرطان پانکراس، که یک بیماری بسیار تهاجمی و کشنده است، تیمار با محیط کاندیشنال از طریق مهار بقای سلول­های سرطانی و توقف سلول­ها در مرحله G0/G1 باعث بهبود بیماری می­شود. همچنین محیط کاندیشنال توانست میزان بقای سلول­های سرطان کولون و پروستات را نیز مهار ­کند (20).  تیمار با محیط کاندیشنال به‫طور موثر تکثیر و بقای سلول­های سرطانی کبد را مهار کرده و باعث آپوپتوزیس می‫شود (20-21).

محیط ­کاندیشنال چربی، تکثیر
سلول­های سرطان پستان MCF7 را نسبت به  محیط کاندیشنال بند ناف، با سرعت بیشتری مهار می­کند (22). گزارش دیگر مبنی بر آن است که محیط­ کاندیشنال مغزاستخوان، سرعت تکثیر را در سلول­های MCF7 افزایش می­دهد (23). در رابطه با تاثیر محیط کاندیشنال سلول­های ASC انسانی بر سلولهای سرطانی MCF7 گزارشات ضد و نقیضی وجود دارد و هنوز مکانیسم دقیق آن مشخص نشده. لذا در این تحقیق از محیط­ کاندیشنال سلول­های بنیادی چربی انسانی، به‫منظور کاهش سرعت تکثیر، بقا استفاده شد و همچنین تاثیر محیط کاندیشنال بر بیان ژنهای کاسپاز 3 و 9 در سلول­های MCF7 مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد و روش‌ها

کشت سلول­های سرطانیMCF-7 : سلول­های سرطانی از انستیتو پاستور تهران خریداری شد و در محیط کشت  DMEM-F12 حاوی سرم 10 درصد و در انکوباتور (دمای 37 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 95 درصد و CO2 پنج درصد) نگهداری شدند (24-25). زمانیکه تراکم­ سلول­ها به 80 درصد می­رسید، پاساژ سلولی انجام می­شد. زمان تقریبی دو برابر شدن جمعیت این رده از سلول­های سرطانی حدود 38 ساعت بود.

 

تهیه و جمع­آوری محیط کاندیشنال سلول­های بنیادی چربی انسانی: سلول­های بنیادی چربی از بافت چربی زیر جلدی شکم خانمهای سزارینی و با کسب رضایت نامه کتبی تهیه شد. محیط­ کاندیشنال، از پاساژ چهارم سلول­های بنیادی چربی انسانی جدا شد. با این روش که تعداد 105×5 سلول در یک فلاسک­ کشت داده شد و پس از آن­که سلو­ل­ها 70 درصد فلاسک را پر کردند، محیط­­ رویی خارج و دو مرتبه با PBS شستشو داده شد، سپس حدود 5/1 تا 2 میلی­لیتر محیط   DMEM تازه و فاقد سرم روی سلول­ها ریخته شد و مجددا فلاسک­ها به انکوباتور انتقال داده شدند. پس از گذشت 72 ساعت محیط ­رویی سلول­ها جمع­آوری و به‫مدت 5 دقیقه با دور rpm2000 سانتریفوژ شد. سپس محیط­ به‫دست آمده را با فیلتر سرنگی 22/0 میکرومتر فیلتر کرده تا عاری از هرگونه سلول مرده یا قطعات سلولی باشد و به‫منظور استفاده بعدی در فریزر 70- درجه سانتی‫گراد ذخیره شد (13).

 

ارزیابی زمان دو برابر شدن سلول­ها با نشانگر MTT: سلول­ها با تراکم 104×2 در هر خانه پلیت­ 96 خانه و در 200 میکرولیتر محیط کشت حاوی سرم 10 درصد کشت داده شدند. زمانیکه تراکم سلولی به 70 درصد رسید، سرعت تکثیر سلول­ها در زمان­های 24 ، 48 و 72 ساعت با روش MTT بررسی شد. در این روش، محیط قبلی خارج شده و به‫هر کدام از خانه­ها 100 میکرولیتر محیط کشت به‫همراه 10 میکرولیتر محلول MTT , Sigma) mg/ml5( افزوده و به‫مدت 4 ساعت در شرایط 37 درجه سانتی‫گراد انکوبه شد. سپس 85 میکرولیتر از محیط رویی برداشته شده و 50 میکرولیتر  DMSO اضافه شد و به‫مدت 10 دقیقه انکوبه شده و در نهایت میزان جذب، در طول موج  540 نانومتر با دستگاه ELIZA reader (BioTek) اندازه­گیری شد.

گروه­­های آزمایشی مورد مطالعه در این تحقیق به قرار زیر بود:

محیط کشت: سلول­های MCF7 که در محیط ­کشت اختصاصی DMEM-F12 و در غیاب سرم کشت داده شدند.

محیط کشت و سرم: سلول­های MCF7 که در محیط کشت اختصاصی و حاوی سرم 10درصد کشت داده شدند.

محیط کاندیشنال: سلول­های MCF7 که در محیط کاندیشنال سلول­های بنیادی چربی انسانی قرار گرفته بودند.

محیط کاندیشنال و سرم: سلول­های MCF7 که در محیط­ کاندیشنال حاوی سرم  10درصد کشت داده شدند.

 

ارزیابی میزان بقا سلول­های MCF7  با روش هموسایتومتری: سلول‌های MCF7 تریپسینه شده و با تراکم 104 سلول در میلی‌لیتر در هر خانهی پلیت 96 خانه‌‌ای کشت داده شد. انکوباسیون در 37 درجه سانتی‌گراد صورت گرفت، تا جایی که میزان تراکم سلولی به حدود 80 درصد رسید. سوسپانسیون سلولی به نسبت مساوی با رنگ تریپان بلو مخلوط شد (ده میکرولیتر سوسپانسیون سلولی و ده میکرولیتر تریپان بلو) و شمارش سلولی به‫وسیله میکروسکوپ نوری انجام شد. تریپان بلو با تخریب غشا در سلول­های مرده نفوذ می­کند. از این­رو سلول­های مرده به رنگ آبی و سلول­های زنده بی­رنگ دیده می­شوند. سپس میزان حیات سلولی بر اساس فرمول (میانگین سلول­های رنگ نشده × 10000 × درجه رقت = تعداد کل سلول­های زنده) محاسبه شد.

 

بررسی بیان ژن­ها با روش  RT-PCR 

استخراج RNA: ابتدا استخراج RNA بر اساس کیت RNAX Plus صورت گرفت. غلظت RNA به‫دست آمده با استفاده از جذب نوری در طول موج 260 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد. هم چنین کیفیت RNA نیز با الکتروفورز ژل آگارز بررسی شد.

 

سنتز DNAمکمل (cDNA): این مرحله با توجه به دستورالعمل کیت ساخت cDNA نوع Fermentas-K1622 انجام شد. ابتدا یک میکروگرم  RNA (معادل 10 میکرولیتر) به‫همراه یک میکرولیتر الیگوپرایمر در میکروتیوپ ریخته و به‫مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی‫گراد قرار داده شد. سپس با افزودن بافر واکنش X5، dNTP و مهارکننده ریبونوکلئاز به محلول فوق، به‫مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. با اضافه کردن آنزیم Reverse transcriptase 60 دقیقه در دمای 42 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد و درنهایت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت.

 

بررسی بیان ژن ها با روشPCR: واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر انجام شد. برای اطمینان از توزیع یکسان مواد، ابتدا مخلوط مستر همه­ی اجزا آماده شد و سپس همراه با الیگوپرایمر و cDNA به میکروتیوپ منتقل شد. PCR در دستگاه ترمال سایکلر به این‫صورت انجام شد: 2 دقیقه در 94 درجه، دمای 94 و 72 درجه سانتی‫گراد هر کدام 30 ثانیه. پس از اتمام 30 سیکل، 10 دقیقه در 72 درجه سانتی‫گراد قرار گرفت.

دمای Annealing بر اساسTm  پرایمرها تعیین می­شود. (Tm پرایمر ژن­های کاسپاز 3 و کاسپاز 9 به‫ترتیب 60 و 56 درجه سانتی‫گراد تعیین شد. از ژن GAPDH به‫عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. برای مشخص شدن تکثیر قطعه مورد نظر و بیان ژن، محصول PCR به‫روش الکتروفورز با ژل آگارز 5/1 درصد بررسی شد. تمامی ژل‫های آگارز تهیه شده با استفاده از دستگاه نمایشگر ژل بررسی شدند. تصویر  ژل‫های محصولاتPCR  با نرم افزار ImageJ بررسی شد (26-27).

پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق، در جدول1 آورده شده است. پرایمرها به‌صورت لیوفلیزه از شرکت سیناژن تهیه گردید و براساس دستور ساخت شرکت سازنده تهیه شدند. به‌منظور آماده­سازی پرایمرها برای استفاده در واکنش به غلظت 10 پیکومولار به‫ترتیب زیر عمل شد:

1-  افزودن مقدار آب تزریقی ذکرشده در چارت پرایمرها به‫هر تیوپ حاوی پرایمر

2-  اسپین به‫مدت چند دقیقه تا کاملا حل شود.

3-  افزودن آب تزریقی تا غلظت نهایی به 10 پیکومولار برسد.

 

 

جدول 1: مشخصات پرایمر­های مورد استفاده برایPCR

Gene size

Sequence

Primer

 

100 bp

5´-TCTCATGCTGCAGAGGGTAC-3´

CAspAse3-f

5´-TAATTCAATTGCAACTACCTGAC-3´

CAspAse3-r

 

113 bp

5´-CTGCTTAGGGTCGCTAATGC-3´

CAspAse9-f

5´-GGGCCCTGGCCTTATGATG-3´

CAspAse9-r

 

258 bp

5´-   GCTGGGGCTCATTTGCAGG-3´

GAPDH-f

5´   –CGGAGGGGCCATCCACAGT-3´

GAPDH-r

 

 


نتایج

مورفولوژی سلول­ها در شرایط کشت آزمایشگاهی:

سلول­هایMCF7  در محیط کشت ظاهری چندوجهی و یا تقریبا کروی داشته، به شکل کلونی­هایی که از تراکم سلولی بالایی برخوردار می­باشند رشد می­کنند. سلول­ها از سرعت تکثیر بسیار بالایی برخوردار بودند، به‫طوری‫که هسته سلول­ها و حتی تقسیم هسته­ها به‌وضوح در آن­ها مشاهده می­شد (شکل 1-الف).

 

 

در (شکل 1-ب) نیز پاساژ چهارم سلول­های ASCs انسانی مشاهده می­شود که ظاهر دوکی شکلی دارند و کاملا به کف ظرف کشت چسبیده­اند و سلول­های شناور به شکل کروی می­باشند.

 

 

 

 

                       

 

 

 

 

 

 

شکل1: بررسی سلول­ها در شرایط کشت آزمایشگاهی با میکروسکوپ اینورت. سلول­ها را در پاساژهای بالا نشان می­دهد که به شکل کلونی­هایی متشکل از سلول­های چندوجهی و یا کروی شکل می­باشند و به کف فلاسک کشت چسبیده اند (فلش)، سلول­های مرده نیز به صورت شناور می­باشند (سر فلش).

 

 

بررسی میانگین سلول­های MCF7 زنده پس از القا با محیط ­کاندیشنال

در این تحقیق میانگین سلول­های MCF7 زنده، پس از القا با محیط ­کاندیشنال در زمان­های 24، 48 و 72 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به (نمودار 1)، میانگین تعداد سلول­های MCF7 زنده که به‫مدت 24 ساعت در معرض محیط ­کاندیشنال قرار گرفته بودند، کاهش معنیداری را در مقایسه با سلول­هایی که در محیط DMEM حاوی سرم 10 درصد کشت داده ‌شده بودند، نشان داد. به­طوری­که اختلاف معنی­داری بین سلول­هایی که در معرض محیط کاندیشنال بودند و سلول­هایی که در محیط کشت فاقد سرم بودند، مشاهده نشد. تعداد سلول‫های MCF7 زنده که در محیط­ کاندیشنال، مدت 48 ساعت قرار گرفته بودند، کاهش معنی­داری را نسبت به سلول‫هایی که در محیط حاوی سرم بودند نشان داد. درحالی­که در این گروه تعداد سلول­های زنده در محیط کاندیشنال نسبت به سلول­هایی که در محیط بدون سرم کشت داده‌ شده بودند، افزایش معنی­داری را نشان داد.  همچنین افزایش معنی­داری در تعداد سلول­های MCF7 زنده­ای که در محیط ­کاندیشنال به‫مدت 72 ساعت کشت داده ‌شده بودند در مقایسه با سلول­هایی که در محیط بدون سرم بودند مشاهده شد. همچنین در این گروه اختلاف معنی­داری بین دو گروه CM و سلول­های کشت‌ شده در محیط حاوی سرم مشاهده نشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1: میانگین سلول­های MCF7 زنده­ پس از القا با محیط­ کاندیشنال (حروف غیر مشابه، معنیدار بودن و حروف مشابه غیر معنیدار بودن را نشان می­دهند.)

 

محیط کشت: سلول­های سرطانی که در محیط کشت بدون سرم قرار داده شدند.

محیط کشت و سرم: سلول­های سرطانی که در  محیط کشت حاوی سرم بودند.

محیط کاندیشنال: سلول­های سرطانی که در محیط کاندیشنال فاقد سرم قرار گرفته بودند.

 محیط کاندیشنال و سرم: سلول­های سرطانی که در محیط کاندیشنال حاوی سرم کشت داده شدند.

 

سرعت تکثیر سلول­های MCF7 پس از القا با محیط کاندیشنال بهمدت 24، 48 و 72 ساعت

سرعت تکثیر سلول­های MCF7 القاء شده با محیط­ کاندیشنال با روش MTT بررسی شد.

همانطور که در (نمودار 2) مشاهده می­شود،­ کاهش معنی­دار میزان OD در سلول­های MCF7 تحت القا با محیط­ کاندیشنال در مقایسه با سلول­های کشت داده شده در محیط حاوی سرم در زمان­های 24 و 48 ساعت مشاهده شد که نشان­دهنده سرعت تکثیر پایین سلول­ها در محیط کاندیشنال است. در حالیکه، اختلاف معنی­داری بین دو گروه­ مذکور و سلول­هایی که در محیط بدون سرم کشت داده شده بودند، مشاهده نشد. از طرفی پس از 72 ساعت، افزایش معنی­داری در سلول­هایی که در محیط کاندیشنال بودند در مقایسه با سلول­هایی که در محیط بدون سرم و محیط حاوی سرم کشت داده شده بودند، مشاهده شد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 2: بررسی سرعت تکثیر در MCF7 پس از القا  با محیط­ کاندیشنال پس از 24 ، 48 و 72 ساعت با روشMTT . بررسی میزان بیان ژن­های کاسپاز 3 و 9 با استفاده از تکنیک PCR. بیان ژن کاسپاز 3، پس از القا  با محیط ­کاندیشنال در زمان­های 24 ، 48 و 72 ساعت

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: تصویر ژل آگارز محصول PCR ژن کاسپاز 3 در گروه­های مورد مطالعه. اندازه محصول PCR ژن کاسپاز 3،bp  100 است. ژن GAPDH به‌عنوان رفرنس داخلی جهت نرمال کردن به کار رفت.  اندازه ژن bp 258 است.

 

 

  با آزمون آنالیز واریانس یک طرفه و تست Tukey بیان ژن کاسپاز 3 در گروه­های مورد مطالعه مقایسه شد.

همانطور که در (نمودار 3) مشاهده می­شود، افزایش معنی­دار در بیان ژن کاسپاز 3 در سلول­هایی که در معرض محیط­ کاندیشنال به‫مدت 24 ساعت قرار گرفتند نسبت به سلول­هایی که در محیط حاوی سرم کشت داده شده بودند مشاهده شد. در حالی­که اختلاف معنی­داری بین دو گروه  محیط کشت و محیط کاندیشنال مشاهده

 

نشد. افزایش معنی­داری در بیان ژن کاسپاز 3 در سلولهایی که  به‫مدت 48 ساعت درمعرض محیط کاندیشنال قرار گرفتند نسبت به سلول­هایی که در محیط­ کشت حاوی سرم کشت داده شده بودند، مشاهده شد. از طرفی بیان ژن مربوطه کاهش معنی­داری در سلول­هایی که در معرض محیط ­کاندیشنال بودند نسبت به سلولهایی که در محیط ­کشت بدون سرم بودند نشان داد. همچنین کاهش معنی­داری در بیان ژن کاسپاز 3 در سلول­هایی که درمعرض محیط­ کاندیشنال به‫مدت 72 ساعت قرار گرفتند نسبت به سلول­هایی که در محیط فاقد سرم بودند، مشاهده شد. درحالی­که اختلاف معنی­داری بین سلول­هایی که در محیط ­کاندیشنال و سلول­هایی که در محیط ­کشت حاوی سرم بودند، مشاهده نشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 3: مقایسه بیان ژن کاسپاز 3 در سلول­های تحت القا محیط ­کاندیشنال پس از 24 ، 48 و 72 ساعت

 

 

 

 

بیان ژن کاسپاز 9،  پس از القاء با محیط­ کاندیشنال در زمان­های 24، 48 و 72 ساعت اندازه محصول PCR ژن کاسپاز 9،bp  113 است.

ژن GAPDH به‌‫عنوان رفرنس داخلی جهت نرمالایز کردن به کار رفت.  اندازه ژن bp 258 است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: تصویر ژل آگارز محصول PCR ژن کاسپاز 9 در گروه­های مورد مطالعه

 

 

 

افزایش معنی­داری در بیان ژن کاسپاز 9 در سلول­هایی که درمعرض محیط ­کاندیشنال به‫مدت 24 ساعت قرار گرفتند نسبت به سلول­هایی که در محیط حاوی سرم بودند، مشاهده شد. در حالی­که اختلاف معنی­داری در بین گروه­های محیط کاندیشنال و محیط کشت مشاهده نشد. همانطور که در (نمودار 4) مشاهده می­شود، اختلاف معنی­داری در بیان ژن کاسپاز 9 در سلول­هایی که درمعرض محیط­ کاندیشنال به‫مدت 48 و 72 ساعت قرار گرفته بودند، بین هیچکدام از گروه­ها مشاهده نشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 4: مقایسه بیان ژن کاسپاز 9 در سلول­های تحت القا محیط­ کاندیشنال. پس از 24 ، 48 و 72 ساعت

 


بحث

سرطان با ترکیبی از روش­های شیمی‌درمانی، رادیوتراپی، ایمونوتراپی و جراحی درمان می­شود. اما این درمان­ها محدودیت­های خودشان را دارند و نمی­توانند به­طور اختصاصی سلول­های سرطانی را هدف قرار دهند و همچنان میزان مرگ ‌و میر در بیماران مبتلا به سرطان بالا می­باشد که خود حکایت از ناکارآمدی این راهکارهای درمانی است (28).

  MSC ها در ریز محیط تومور، در دو نقش سلول­های پیش توموری و سلول­های ضد توموری ظاهر می­شوند. اینکه MSC ها کدام نقش را ایفا کنند بستگی به فاکتورهای بسیاری دارد از آن جمله می­توان به انواع MSC، منبع استخراج آ­ن­ها، نوع رده سلول سرطانی مورد بررسی، داخل بدن یا شرایط آزمایشگاهی، فاکتورهای ترشح شده توسط MSCها، تعاملات بین MSCها، سلول­های ایمنی میزبان و سلول­های سرطانی اشاره نمود

 

(28). MSC ها همچنین می­توانند خاصیت ضد تکثیری و آپوپتوزی را در سلول­های سرطانی القا کنند و مانع تکثیر سلول­های سرطانی شوند (29-30). اگر چه سلول درمانی، تا حدودی علائم بالینی بیمار را بهبود می­بخشد ولی با توجه به از بین رفتن تعداد زیادی از سلول­ها در محل پیوند و به­علاوه، خطر بالقوه ایجاد سرطان بعد از پیوند، توجه بسیاری از محققین به استفاده از محیط­ کاندیشنال (CM) معطوف شد(17).

درک بهتر ویژگی­های محیط کاندیشنال کمک مهمی به انتخاب استراتژی استفاده درمانی از این محیط می­کند. استفاده از CM در مقایسه با سلول­های بنیادی چندین مزیت دارد، به ­طوری­که CM به آسانی تهیه، فریز، بسته‌بندی و حمل‌ونقل می­شود. علاوه بر این به‫دلیل اینکه CM عاری از سلول است نیاز به مطابقت اهدا ­کننده و دریافت­ کننده برای جلوگیری از مشکلات رد پیوند وجود ندارد. همچنینCM  محتوای سیتوکین­ها و فاکتورهای رشد متفاوت و عوامل ترمیم بافتی متنوع است، که بهوسیله سلول­های بنیادی ترشح شده­اند. در نهایت محیط کاندیشنال به‫عنوان کاندید مناسبی برای این تحقیق انتخاب شد.

اخیرا CM در مطالعات پیش ­بالینی به‌عنوان یک جایگزین برای درمان­های متعدد سلولی از جمله بهبود زخم استفاده می­شود (14). به‫همین جهت، دراین پژوهش از محیط کاندیشنال مشتق از سلول­های بنیادی چربی زیر جلدی انسانی استفاده شده است. در این مطالعه تلاش بر این بود که اثر محیط کاندیشنال بر تکثیر، بقا و مرگ و میزان بیان ژن­های کاسپاز 3 و 9 در سلول­های سرطانی MCF7 بررسی شود. 

در تحقیقی که درسال 2015 انجام شد، برای درمان بیماری ملانوما، که یک تومور بدخیم پوستی است، از محیط­ کاندیشنال استفاده گردید، lee و همکاران (13) مشاهده کردند که سرعت تکثیر سلول­های رده B16 تومور ملانوم کاهش ­یافته و سلول­ها در فاز G1 تقسیم سلولی متوقف شدند. همچنین حجم تومور در بیمارانی که با CM تیمار شده بودند نسبت به گروه کنترل کاهش معنی­­داری را نشان‌داد. همچنین yu و همکاران (31) مشاهده کردند که درمان با محیط­ کاندیشنال در سرطان مثانه باعث افزایش آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی شده و مهاجرت و تکثیر سلول­ها را نیز کاهش داد. تحقیقات دیگری نیز توسط کاسین(Cousin) و همکاران (20) انجام شده بود، نشان داد، تیمار با محیط ­کاندیشنال در سرطان پانکراس که یک بیماری بسیار تهاجمی و کشنده است، از طریق مهار بقای سلول­های سرطانی و افزایش تعداد سلول­ها در مراحل G0/G1 باعث بهبود بیماری گردید. همچنین محیط­ کاندیشنال توانست میزان زنده ماندن سلول­های سرطان کولون و پروستات را نیز مهار کند.

 در این تحقیق سلول­های MCF7 در معرض محیط کاندیشنال قرار گرفتند، نتایج حاصل از شمارش سلول‫های MCF7 زنده­ای که در شرایط کشت­ آزمایشگاهی به‫مدت 24 و 48 ساعت در معرض محیط کاندیشنال قرار گرفته بودند، کاهش معنی­داری را در مقایسه با سلول­هایی که در محیط ­کشت DMEM-F12 حاوی سرم کشت داده ‌شده بودند، نشان دادند. به­طور­ی که در زمان 24 و 48 ساعت، محیط­ کاندیشنال توانسته بود میزان سلول­های زنده را به حدی کاهش دهد که دیگر اختلاف معنی­داری با سلول­هایی که در معرض محیط بدون سرم کشت داده‌ شده بودند نشان ندادند­. بنابراین محیط­ کاندیشنال، بدون حضور سرم باعث مرگ سلول­های سرطانی شده بود. ولی در زمان 72 ساعت محیط ­کاندیشنال همانند محیط سرم­دار عمل کرد و نتوانسته بود میزان سلول­های زنده را در مقایسه با سلولهایی که در محیط سرم­دار کشت داده شده بودند، کاهش دهد و همانند سرم عمل کرده بود.

بیماری گلیوم یک تومور مغزی شایع است که در حالت بسیار تهاجمی رشد کرده و به بافت مجاور نفوذ می­کند. درمان­های فعلی این بیماری: جراحی، پرتودرمانی و شیمی‌درمانی است اما این­ موارد به‌ندرت دارای خواص درمانی هستند (22, 32). در این تحقیق که توسط یانگ (yang) و همکارانش  (22) انجام شد، استفاده از محیط­ کاندیشنال باعث افزایش کاسپاز­های 3 و 9 شده و درنتیجه باعث افزایش آپوپتوز در این سلول­ها شده است. به‌طوری‌که  تیمار با محیط ­کاندیشنال باعث افزایش تعداد سلول­ها در فاز G0/G1 شد. همچنین در سرطان ریه و رکتوم نیز تیمار با محیط ­کاندیشنال باعث کاهش تکثیر سلول­ها شد.

 سرطان کبد اغلب در مراحل پیشرفته تشخیص داده میشود و بسیار تهاجمی است. کاسین و همکاران (20-21) نشان دادند که تیمار با محیط ­کاندیشنال به­طور مؤثر زنده ماندن، تکثیر و تقسیم سلولی را مهار کرده و باعث القای آپوپتوزیس در سلول­های تومور کبد شد. آپوپتوزیس فرم فعال مرگ سلولی است که نقش اساسی در تکوین و بقا از طریق از بین بردن سلول­های آسیب

 

دیده و یا ناخواسته دارد (33). آپوپتوزیس با فعالیت کاسپازهای آغازگر شروع میشود و متعاقبا کاسپازهای اجرایی را فعال می­کنند (34). اخیرا توجه به اهمیت آپوپتوزیس در پیشرفت تومور و درمان متمرکز شده و گزارش شد، آپوپتوز نقش مهمی در حذف سلول­های تومور اولیه (Pre-neoplastic cells) بازی می­کند و در نتیجه از پیشرفت بیماری جلوگیری می­کند (25).

تحقیقاتی که توسط یانگ و همکاران (22) انجام شد در سرطان پستان مشاهده ‌شده که تیمار با محیط­ کاندیشنال باعث کاهش تکثیر سلول­های سرطانی MCF7 می­شود. محیط­ کاندیشنال حاوی فاکتورهایی است که منجر به افزایش حساسیت شیمیایی سلول­های سرطان پستان نسبت به داروهای شیمیایی می­شود. همچنین اینترفرون موجود در محیط کاندیشنال یک سیتوکین چند منظوره است که فعالیت ضد توموری دارد و رشد تومور را مهار و آپوپتوز را القا کرده و باعث می­گردد سلول­ها در فاز G0/G1 باقی بمانند (35).

نتایج به­دست آمده در این تحقیق نیز نشان داد که، کاهش تعداد سلول­های سرطانی پس از القا با محیط ­کاندیشنال به‫مدت 24 و 48 ساعت احتمال دارد در اثر بیان ژن­های کاسپاز 3 و 9 بوده باشد.

 

نتیجه گیری

سرعت تکثیر و میزان بقای سلول­های سرطانی MCF7 پس از القاء با محیط کاندیشنال سلول­های بنیادی چربی انسانی به‫مدت 24 و 48 ساعت کاهش یافت. همچنین آپوپتوزیس با بیان ژن­های کاسپاز 3و 9 در سلول­های سرطانی القا شده، تحریک شد.

 

تشکر و قدردانی

این مقاله حاصل بخشی از پایان نامه خانم فاطمه متقی مریدانی، کارشناس ارشد بافت شناسی جنین شناسی از دانشگاه دامغان بود. بدین وسیله از دانشکده زیست شناسی و پژوهشکده علوم زیستی دانشگاه دامغان به‫خاطر پرداخت هزینه مواد، وسایل و در اختیار گذاشتن امکانات آزمایشگاهی تشکر وقدردانی می‫شود.

1. Kern S, Eichler H, Stoeve j, Kluter h, et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem cells. 2006; 24(5): 1294-301.

2. Holliday DL, Speirs V . Choosing the right cell line for breast cancer researchBreast Cancer Res. 2011; 13(4): 215.

 

3. Brédart A, Kop JL, De Pauw A, Caron O, et al. Effect on perceived control and sychological distress of genetic knowledge in women with breastcancer receiving a BRCA1/2 test result. Breast. 2017 ;31(2):121-127.

 

4. Kolahdoozan SSadjadi ARadmard ARKhademi H. Five common cancers in Iran. Arch Iran Med. . 2010 ; 13(2): 143-6.

 

5. Ghasemi F, Rostami S, Nabavinia MS, Meshkat Z,  et al. Developing Michigan Cancer Foundation 7 Cells with Stable Expression of E7 Gene of Human Papillomavirus Type 16. Iranian Journal of Pathology, 2016; 11(1):41-6.

6. Lee AV, Oesterreich S, Davidson NE. MCF-7 Cells—Changing the Course of Breast Cancer Research and Care for 45 Years. Journal of the National Cancer Institute. 2015; 107(7): 1-4.

7. Schweizer R, Tsuji W, Gorantla VS, Marra KG, et al. The Role of Adipose-Derived Stem Cells in Breast Cancer Progression and Metastasis. Stem cells international. 2015; 2015) 3): 17-41.

8. Liu G, Chen X. Isolating, Characterizing Adipose-Derived Stem Cells. Methods Mol Biol. 2018;1842:193-201.

 

9. Kim WS, Park BS , Sung JH . Protective role of adipose-derived stem cells and their soluble factors in photoaging. Arch Dermatol Res. 2009; 301(5):329-36.

 

 

10. Egashira Y, Sugitani, Suzuki Y, Mishiro K, et al. The conditioned medium of murine and human adipose-derived stem cells exerts neuroprotective effects against experimental stroke model. Brain research. 2012; 21)1461(: 87-95 .

11. Nakao N, Nakayama T, Yahata T, Muguruma Y, et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells facilitate hematopoiesis in vitro and in vivo: advantages over bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Am J Pathol. 2010;177(2):547-554.

12. Bunnell BA, Flaat M, Gagliardi CH, Patel B, et al. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 2008;45(2):115-20. 

13. Lee JH, Park CH, Chun KH, Hong SS. Effect of adipose-derived stem cell-conditioned medium on the roliferation and migration of B16 melanoma cells. Oncol Lett. 2015; 10(2): 730-736.

14. Chen LXu YZhao JZhang Z, et al. Conditioned medium from hypoxic bone marrow-derived mesenchymal stem cells enhanceswound healing in mice. PLoS One. 2014;9(4):1-3.

15. Fontanilla CV, Gu H, Liu Q, Zhu TZ, et al. Adipose-derived Stem Cell Conditioned Media Extends Survival time of a mouse model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Sci Rep. 2015;(5): 1-10.

16. Pawitan J. Prospect of Stem Cell Conditioned Medium in Regenerative Medicine. Biomed Res Int. 2014; 2014(2): 1-14.

17. Bhang SH, Lee S, Shin JY, Lee TJ, et al. Efficacious and clinically relevant conditioned medium of human adipose-derived stem cells for therapeutic angiogenesis. Mol Ther. 2014; 22(4): 862–72.

18. Timmers L, Lim SK, Hoefer IE, Arslan F,  et al. Human mesenchymal stem cell-conditioned medium improves cardiac function following myocardial infarction. Stem cell research. 2011; 6(3):206-14. 

19. Ghiasi M, Fazaely H, Asaii E, Sheykhhasan M. In Vitro Maturation of Human Oocytes using Conditioned Medium of Mesenchymal Stem Cells and Formation of Embryo by Use of ICSI. In Vitro. 2014; 41(11):978-85. 

20. Cousin B, Ravet E, Poglio S, De Toni F, et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PloS one. 2009; 4(7): 1-10. 

21. Zhao W, Ren G,  Zhang L,  Zhang Zh,  et al. Efficacy of mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue in inhibition of hepatocellular carcinoma cells in vitro. Cancer Biother Radiopharm. 2012; 27(9):606-13.

22. Yang C, Lei D, Ouyang W, Ren J, et al. Conditioned media from human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells efficiently induced the apoptosis and differentiation in human glioma cell lines in vitro. Biomed Res Int. 2014;2014: 1-13.

23. Zhang C, Zhai W, Xie Y, Chen Q, et al. Mesenchymal stem cells derived from breast cancer tissue promote the proliferation and migration of the MCF‑7 cell line in vitro. Oncol Lett. 2013;6(6):1577-1582.

24. Al-Fatlawi, AA, Rizvi MMA , and Ahmad A. Anticarcinogenic activity of rice bran phytic acid against human breast cancer cell line (MCF-7). Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research. 2014; 7: 151-155.

25. Hashemi M, Karami-Tehrani F, and Ghavami S. Cytotoxicity effect of Cladribine on the MCF-7 human breast cancer cell line. Iran Biomed J. 2004; 8(4): 7-12.

26. Santos CFd, Sakai VT, Machado MAAM, Schippers DN, et al. Reverse transcription and polymerase chain reaction principles and applications in dentistry. J Appl Oral Sci. 2004;12(1):1-11.

27. Freeman WM, Walker SJ, and Vrana KE. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential. Biotechniques. 1999; 26(1):112-22.

 

28. Romeiro MF, de Souza WM, Tolardo AL, Vieira LC, et al.  A real-time RT-PCR for rapid detection and quantification of mosquito-borne alphaviruses.Arch Virol. 2016;161(11):3171-7.

29. Ramdasi SSarang SViswanathan C. Potential of Mesenchymal Stem Cell based application in Cancer. Int J Hematol Oncol Stem Cell Res.  2015; 9(2):95-103.

30. Glavaski-Joksimovic A, Bohn MC. Mesenchymal stem cells and neuroregeneration in Parkinson's disease. Exp Neurol . 2013; 247(3): 25-38.

31. Lee J. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Bone Regeneration. Clin Orthop Surg. 2018; 10(3):271-278.

32. Yu X, Su B, Ge P, Wang Z, et al. Human Adipose Derived Stem Cells Induced Cell Apoptosis and S Phase Arrest in Bladder Tumor. Stem Cells Int. 2015;2015:1-12.

33. Sai K, Yang QY, Shen D, Chen ZP. Chemotherapy for gliomas in mainland China: an overview. Oncol lett, 2013; 5(5):1448-52.

34. Ren W, Qiao Zh, Wang H, Zhu L, et al. Flavonoids: promising anticancer agents. Med Res Rev.  2003; 23(4):519-34.

35. Sylvester PW, and Shah S. Antioxidants in dietary oils: their potential role in breast cancer prevention. Malay J Nutr. 2002; 8(1):1-11. 

 

36. Ryu H, Oh JE, Rhee KJ, Baik SK, et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells cultured at high density express IFN-β and suppress the growth of MCF-7 human breast cancer cells. Cancer letters. 2014; 352(2): 220-7.