نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه نشاندار سازی سیپروفلوکساسین با تکنسیومm99 و توزیع بیولوژیکی رادیو دارو در بافتهای مختلف حیوانات آزمایشگاهی سالم و عفونی جهت تشخیص مکان عفونت بود.
مواد و روشها: نشاندار سازی سیپروفلوکساسین با تکنسیوم با غلظت بهینه سیپروفلوکساسین(2 میلی گرم) و غلظتهای 600-50 میکروگرم کلرید قلع در دما و pH متفاوت، با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک در حلالهای مختلف مورد بررسی قرار گرفت. بافتهای قلب، ریه، معده، روده، کبد، کلیه، خون، طحال و ماهیچه جدا و توسط دتکتورHPGe (ژرمانیوم فوق خالص) بررسی گردیدند.
نتایج: خلوص رادیو شیمیایی بیش از90 درصد, پایداری رادیو دارو در سرم تا 1 ساعت نیز (90 درصد) مشاهده و توزیع بیولوژیکی رادیو دارو نیز انجام پذیرفت.
نتیجه گیری: مطالعه توزیع بیولوژیکی رادیو دارو بیشترین جذب را در کبد و کلیه و طحال و ماهیچه عفونی نشان داد. نشاندار سازی سیپروفلوکساسین به روش مستقیم با خلوص رادیو شیمیایی بالا میتواند به عنوان یک ترکیب فرموله شده برای تشخیص مکان عفونت در حیوانات آزمایشگاهی مورد استفاده قرار گیرد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Ciprofloxacin labeling by Technetium99m and its bio distributionin normal and infected animals
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to ciprofloxacin labeling by technetium99m and its bio distribution in normal and infected laboratory animals for the site of infection detection.
Material and Methods: labeling of ciprofloxacin by 99mTecnhetium at best concentration (2mg) and tin chloride at 50-600 micrograms concentration at different temperatures as well as pH using thin layer chromatography and different solvents were evaluated. Heart, lung, stomach, intestine, kidney, blood, spleen and muscle tissues separated and counted by HPGe.
Results: Radiochemical purity found to be not less than 90% and serum stability was the same at least for 1hr bio distribution studies showed the muscle at 1 and 4 hrs. Were observed after injection.
Conclusion: Ciprofloxacin labeling by direct method in high radiochemical purity may be used as a formulated compound for the site of infection diagnosis in experimental animals.
کلیدواژه‌ها [English]
- Ciprofloxacin
- Infection
- Infection diagnosis
- Technetium99m
مقاله پژوهشی مجله علمی پژوهشی سلول و بافت
جلد 1، شماره 2، زمستان 1389، 35-29
نشاندار سازی سیپروفلوکساسین باTechnetium99m و توزیع بیولوژیکی آن در حیوانات سالم و عفونی
سعید رجبی فر Ph.D.1*، رضا پورایمانی Ph.D.2، مهدیه غفوری M.Sc.2، فاطمه بلوری نوین M.Sc.1،
صدیقه مراد خانی B.Sc.1، امیررضا جلیلیان Ph.D.1
1- گروه پزشکی هستهای- پژوهشکده کشاورزی، پزشکی و صنعتی کرج, کدپستی3153695685
2- دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه فیزیک، کد پستی 8349-8-38156
* پست الکترونیک نویسنده مسئول: srajabifar@nrcam.org
تاریخ دریافت: 17/11/ 1389 تاریخ پذیرش: 25/2/1390
چکیده
هدف: هدف از این مطالعهنشاندار سازی سیپروفلوکساسین با تکنسیومm99 و توزیع بیولوژیکی رادیو دارو در بافتهای مختلف حیوانات آزمایشگاهی سالم و عفونی جهت تشخیص مکان عفونت بود.
مواد و روشها: نشاندار سازی سیپروفلوکساسین با تکنسیوم با غلظت بهینه سیپروفلوکساسین(2 میلی گرم) و غلظتهای 600-50 میکروگرم کلرید قلع در دما و pH متفاوت، با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک در حلالهای مختلف مورد بررسی قرار گرفت. بافتهای قلب، ریه، معده، روده، کبد، کلیه، خون، طحال و ماهیچه جدا و توسط دتکتورHPGe (ژرمانیوم فوق خالص) بررسی گردیدند.
نتایج: خلوص رادیو شیمیایی بیش از90 درصد, پایداری رادیو دارو در سرم تا 1 ساعت نیز (90 درصد) مشاهده و توزیع بیولوژیکی رادیو دارو نیز انجام پذیرفت.
نتیجه گیری: مطالعه توزیع بیولوژیکی رادیو دارو بیشترین جذب را در کبد و کلیه و طحال و ماهیچه عفونی نشان داد. نشاندار سازی سیپروفلوکساسین به روش مستقیم با خلوص رادیو شیمیایی بالا میتواند به عنوان یک ترکیب فرموله شده برای تشخیص مکان عفونت در حیوانات آزمایشگاهی مورد استفاده قرار گیرد.
واژگان کلیدی: عفونت، سیپروفلوکساسین، تکنسیومm99، تشخیص عفونت
مقدمه
عفونت از بیماریهای بسیار شایع در کشورهای در حال توسعه میباشد و دستیابی به یک روش دقیق و سریع جهت تشخیص صحیح و به موقع آن کمک بسیاری در درمان آن میباشد. رادیو داروی تشخیصی 99mTc-Ciprofloxacin به طور گستردهای در مطالعات پزشکی استفاده میشود و بحثهای زیادی روی آن صورت گرفته است) 8-1).
سیپروفلوکساسین آنتی بیوتیکی از دسته فلوروکینولونها است که جذب خوب و سریعی از دستگاه گوارش دارد و دارای نیمه عمر در حدود 5/3 تا 5/4 ساعت بوده و میزان اتصال سیپروفلوکساسین به پروتئینهای پلاسما از 20 تا 40 درصد متغیر است . این دارو به طور گستردهای در بدن توزیع شده و نفوذ خوبی در بافتها دارد. سیپروفلوکساسین عمدتا از طریق ادرار دفع میشود اما حدود یک سوم دفع آن با مکانیسمهای غیرکلیوی شامل متابولیسم کبدی٬ دفع صفراوی و احتمالا ترشح از طریق مخاط روده صورت میگیرد. به دلیل دارا بودن گروههای عاملی مناسب میتوان از این ترکیب برای ایجاد کمپلکس با 99mTc استفاده کرد. 99mTechnetiumبه دلیل انرژی گامای KeV 140 و نیمه عمر01/6 ساعت برای بسیاری از مطالعات پزشکی هستهای مناسب میباشد. جذب سیپروفلوکساسین نشاندار شده به طور ویژه به وسیله باکتری زنده توسط محققین اثبات و به وسیله تستهای آزمایشگاهی روی مدلهای حیوانی تایید شده است (9). جهت نشاندار سازی سیپرو فلوکساسین، کلرید قلع دی هیدراته (SnCl2.2H2O) مورد استفاده قرار گرفته و عامل کاهش فوری عدد اکسایش 99mTc در دمای اتاق میباشد و این علت انتخاب آن برای استفاده در فرآیند نشاندار سازی تکنسیوم99m میباشد.
هدف این مطالعه نشاندارسازی سیپروفلوکساسین با 99mTc با استفاده از SnCl2.2H2O به عنوان عامل کاهش دهنده میباشد.
مواد و روشها
سیپرو فلوکساسین از شرکت دارویی تماد، ژنراتور تکنسیوم از پژوهشگاه علوم و فنون هستهای ودیگر مواد مورد استفاده از مرک تهیه گردیدند.
روشهای متعددی جهت نشاندار سازی سیپروفلوکساسین ارائه شده است(11-10). در این تحقیق از روشهای متعددی استفاده شده از جمله روش سون جون: mg/ml2 سیپروفلوکساسین با .2H2O SnCl2 با غلظت gµ 100 به همراه تکنسیم99m در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه. روش لیماجت: mg/ml2 سیپروفلوکساسین با .2H2O SnCl2 با غلظتgµ 400 همراه تکنسیم99m در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه.روش سولانکی: در این روشmg/ml 2 سیپروفلوکساسین با .2H2O SnCl2 با غلظت 400 میکروگرم همراه تکنسیم99m در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه. روش باردواج: mg/ml4 سیپروفلوکساسین با .2H2O SnCl2 با غلظت 400-100 میکروگرم همراه تکنسیم99m در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد. روش بویرمن و رودریگز: mg/ml 4/0 سیپروفلوکساسین با 500 میکروگرم.2H2O SnCl2 همراه تکنسیم99m در دمای 60 درجه سانتیگراد برای 10 دقیقه. در این تحقیق ابتدا 5 میلیگرم کلراید قلع دی هیدراته در اسید کلریدریک 01/0 نرمال حل شد به طوری که حجم آن 1 میلیلیتر گردد. سپس با گاز نیتروژن موجود در آزمایشگاه اکسیژن زدایی و از نمونه فوق غلظتهای 600-50 میکروگرم (12 غلظت) تهیه گردید. در مرحله بعد 20میلیگرم از سیپروفلوکساسین با اسید کلریدریک 01/0 نرمال مخلوط شده و حجم آن را به 10 میلیلیتر رسید(6pH=). پس از اکسیژن زدایی با گاز نیتروژن، بهترین غلظت SnCl2.2H2O انتخاب گردید و با 1 میلیلیتر از محلول سیپروفلوکساسین مخلوط شد(6PH=) و بار دیگر با گاز نیتروژن این ترکیب اکسیژن زدایی گردید. برای نشاندارکردن کیت Ciprofloxacin مقدار اکتیویته MBq 185 به ترکیب تهیه شده افزوده شد و پس از تنظیم pH روی 3 و اکسیژن زدایی محلول نهایی، کمپلکس تهیه شده 10 دقیقه در دمای آزمایشگاه (25-20 درجه سانتیگراد) باقی ماند و کنترل کیفی روی آن انجام گردید. یکی از مراحل کنترل کیفی رادیو دارو، بررسی خلوص رادیو شیمیایی آن است که از دستگاه TLC اسکنر AR-2000 Bioscan برای خوانش کاغذهای TLC مورد استفاده قرار گرفت. سیستم طیف سنجی جهت شمارش بافتهای مختلف دارای آشکار ساز ژرمانیوم فوق خالص (HPGe) با بازده نسبی10 درصد، ساخت شرکت Canberra میباشد.
کشت باکتری: سوش Staphylococcus aureus در محیط کشت به مدت 24 ساعت تکثیر گردید و سپس مقدار یکصد میکرولیتر از این محلول که حاوی 108-106 باکتری بود و توسط کدورت سنجی تایید گردید به موش آزمایشگاهی تزریق گردید. سپس موشها در خانه حیوانات٬ پژوهشکده تحقیقات کشاورزی پزشکی و صنعتی کرج ایزوله و تحت تغذیه عادی و درجه حرارت حدود 22 درجه سانتیگراد طبق استاندارد NIH (National Institute of Health ) قرار گرفتند و به مدت 48 ساعت نگهداری تا باکتریها به اندازه کافی تکثیر گردیده و تورم ایجاد گردد.
کنترل رادیو شیمیایی: خلوص رادیو شیمیایی کمپلکس تشکیل شده Ciprofloxacin با 99mTc به روش کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) تعیین گردید. برای اینکه تفاوتی بین مقدار نشاندار و مقدار کلوئیدی تکنسیم احیا شده و تکنسیم-کلراید قلع که به همراه مجموعه نشاندار (کمپلکس) باقی می ماند مشخص گردد از حلال آب و اتانول و آمونیوم هیدروکسید با نسبت (5:2:1) استفاده گردید.
کنترل رادیو نوکلئیدی: خلوص رادیو نوکلئیدی توسط دستگاه گاما اسپکتروسکوپی با قرار دادن 1 میکروکوری از99mTc در دستگاه مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی پایداری رادیو دارو: برای بررسی پایداری کمپلکس در دمای اتاق، از رادیو داروی تهیه شده در زمانهای متفاوت بعد از نشاندار سازی TLC استفاده شد. بدین منظور٬ رادیو داروی سیپروفلوکساسین -تکنسیوم-m99 در زمانهای متفاوت در دمای اتاق قرار داده و در این زمان ها از آن TLC گرفته شد. برای انجام TLC٬ مقدار 5 میکرولیتر از رادیو دارو روی صفحه سلیکاژل قرار داده شد و سپس در داخل تانک TLC که یکی حاوی حلال آمونیوم هیدروکسید٬ اتانول و آب مقطر (5:2:1) و دیگری استون بود قرار گرفت.
توزیع بیولوژیکی رادیودارو: پس از تزریق 99mTc-Ciprofloxacin با اکتیویته (200-300 میکروکوری) به سیاهرگ دمی موش سالم و عفونی و پس از گذشت 1و4 ساعت، حیوان تشریح و بافتهایی مانند خون، کلیه، کبد، طحال، ماهیجه، قلب، روده، ریه، معده، پای عفونی و غیرعفونی مورد استفاده قرار گرفت. تعیین مقدار جذب رادیو دارو در هر اندام به وسیله دستگاه گاما اسپکتروسکوپی ( HPGe ) انجام گرفت.
تهیه کیت :Ciprofloxacinکیت تکنسیوم99m کیتی است که با حداقل زمان آماده و حداکثر بازده نشاندار را داشته باشد. بنابراین باید به صورتی تهیه شود که با افزودن محلول رادیواکتیو پرتکنتات سدیم (Na99mTcO4) در محل مصرف (بیمارستانها) در حداقل زمان ممکن کمپلکس رادیو داروی 99mTc-Ciprofloxacin تشکیل گردد. میزان کلراید قلع نیز بسیار مهم است زیرا به عنوان عامل احیا کننده پرتکنتات((99mTcO4 عمل می کند. این ماده سبب میشود که ابتدا 99mTc از ظرفیت 7 به ظرفیتهای کمتر احیا شود سپس کمپلکس 99mTc-Ciprofloxacin را تشکیل بدهد. کیت نشاندار شده را میتوان تا 1 ساعت بعد از نشاندار کردن مورد استفاده قرار داد.
روش کنترل کیفی رادیوداروی 99mTc-Ciprofloxacin : برای تعیین میزان خلوص رادیو شیمیایی به روش کروماتوگرافی از صفحه سیلیکاژل به ابعاد 10*1 سانتیمتر استفاده شد. حلالهای مورد استفاده استون و محلول آب، اتانول و آمونیوم هیدروکسید به نسبت (5:2:1) جهت تخمین کلوئید استفاده گردید. در حلال استون پرتکنتات آزاد حرکت کرده (نمودار1)، کمپلکس و تکنسیوم هیدرولیز شده در مبدا باقی میماند (نمودار2). در حلال آب، اتانول و آمونیوم هیدروکسید، کمپلکس به بالای صفحه حرکت میکند و تکنسیوم احیا شده در مبدا باقی میماند)نمودار 3).
نمودار 1: تکنسیوم آزاد در حلال استون
نمودار2: سیپروفلوکساسین نشاندار در حلال استون
نمودار3: سیپروفلوکساسین نشاندار در حلال آمونیاک:اتانل: آب
نتایج
بهترین مقادیر بدست آمده(5n= ( در آزمایشهای انجام شده با غلظتهای مختلف کلراید قلع از600-50 میکروگرم، مقدار 300 میکروگرم بود که بهترین بازده نشاندار سازی را در این غلظت نشان داد. مجموع درصد ناخالصی رادیو شیمیایی پرتکنتات آزاد و تکنسیوم هیدرولیز شده نباید بیش از 7-5 درصد باشد. به عبارت دیگر درجه خلوص رادیو شیمیایی کمپلکس 99mTc-Ciprofloxacin بایستی حداقل95-93 درصد باشد. خلوص رادیو نوکلئیدی محصول نهایی تکنسیوم-m99 با استفاده از آشکارساز ژرمانیوم فوق خالص (HPGe) مورد بررسی قرار گرفت و پیک مربوط به 99mTc در انرژی KeV 140مشاهده شد. خلوص رادیو نوکلئیدی محلول نهایی 100درصد بود (نمودار 1). نمودار 2 مقدار نشاندار سازی رادیو دارو را در حلال استون و نمودار شماره 3 مقدار نشاندار سازی در حلال آب، اتانول و آمونیوم هیدروکسید نشان میدهد. بررسی پایداری کمپلکس (نمودار4( نشان دهندهی این است که بهترین زمان جهت تزریق این رادیو دارو تا 60 دقیقه بوده که درصد نشاندار سازی بیش از 90 درصد است و پس از 120 دقیقه به 85 درصد کاهش یافت. در توزیع بیولوژیکی رادیو داروی سیپروفلوکساسین با تزریق، 300-200 میکروکوری از کمپلکس 99mTc -Ciprofloxacin به هر یک از موشهای سالم (جدول1) و موشهای عفونی(جدول2) و گذشت 1و4 ساعت از تزریق نتایج درصد جذب در هر یک از اندامهای خون، کلیه، کبد، طحال، ماهیچه، قلب، روده، ریه، معده، ماهیچه پای عفونی و غیرعفونی در نمودارهای 5 و6 آمده است که با اندازه گیری انحراف معیار محاسبه گردید. نتایج بدست آمده توسط سونگ و همکاران(11) که بیشترین جذب را به ترتیب در کلیه 90/0 ± 6/2 ،کبد 12/0± 59/0، طحال 04/0 ± 45/0 ، وخون 08/0± 18/0 و همینطور گانو وهمکاران(12) که بیشترین جذب را به ترتیب در کبد 8/0± 4/13،کلیه 4/0 ± 9/8 ، خون 1/1± 7/4، ماهیچه عفونی 3/0 ± 4/1 و طحال 0/0 ± 4/0 بدست آوردند که با مقایسه با نتایج بدست آمده در این تحقیق مشابهت زیادی مشاهده میگردد.
نمودار 4: بررسی پایداری رادیو دارو در دمای اتاق
جدول1: توزیع بیولوژیکی رادیوداروی سیپروفلوکساسین در بافتهای مختلف موش سالم (%ID/gram)
|
جدول2: توزیع بیولوژیکی رادیوداروی سیپروفلوکساسین در بافتهای مختلف موشهایعفونی(%ID/gram)
|
نمودار5: مقایسه پراکنش زیستی سیپروفلوکساسینتکنسیوم99m در پیکر موش سالم در ساعتهای مختلف
نمودار6: مقایسه پراکنش زیستی سیپروفلوکساسین تکنسیوم99m در پیکر موش عفونی در ساعتهای مختلف
بحث
روشهای تصویر برداری متنوعی در بررسی بسیاری از عفونتها که نقاط مختلف بدن را درگیر میسازند استفاده میشود. اما هر یک از این روشهای رایج دارای محدودیتهایی هستند که از ارزش آنان در بررسی عفونت میکاهد(15-13). از سال 1996 تاکنون مطالعات گوناگونی در زمینه سیپروفلوکساسین-تکنسیوم99 و عفونتهای گرم منفی اجرا شده و هر چه روش تصویر برداری حساستر و دقیقتر باشد ارزش آن در بررسی عفونت بیشترخواهد گردید (11-5). برای تولید و توسعه رادیو داروی 99mTc-Ciprofloxacin فاکتورهای متعددی مانند اثرات بیولوژیکی و فرمولاسیون کیت٬ مورد نیاز بوده تا به نیازهای کلینیکی دستیابی پیدا کنیم. یک کیت شامل مادهای که باید نشاندار شود و یک ماده احیا کننده مثل کلرید قلع دی هیدراته و یک ماده واسط میباشد. در این کیت به ماده واسط نیاز نیست به دلیل اینکهسیپروفلوکساسین مستقیما به تکنسیم متصل میشود. مقایسه نتایج بدست آمده با نتایج روشهای انجام پذیرفته توسط محققین دیگر این است که نشاندارسازی سیپروفلوکساسین با تکنسیم و همین طور توزیع بیولوژیکی رادیو داروی تولید شده مطلوب بوده و با ایجاد عفونت و سپس نگاره برداری محل بروز عفونت را میتوان شناسایی نمود. سیپروفلوکساسین با موفقیت توسط تکنسیم99m نشاندار گردیده و بهترین غلظت کلریدقلع دی هیدراته 300 میکروگرم در دمای اتاق و 3pH= بدست آمد. با این روش غلظت نشاندارسازی حداقل 90 درصد و درصد کلوئیدی بیش از 5 درصد نمیباشد. مطالعه توزیع بیولوژیکی رادیو دارو بیشترین جذب را در کبد و کلیه و طحال و ماهیچه عفونی نشان داد.
نتیجه گیری
سیپروفلوکساسین با موفقیت توسط تکنسیم99m نشاندار گردیده و بهترین غلظت کلرید قلع دی هیدراته 300 میکروگرم در دمای اتاق و 3pH= بدست آمد. با این روش غلظت نشاندارسازی حداقل 90 درصد و درصد کلوئیدی بیش از 5 درصد نمیباشد. مطالعه توزیع بیولوژیکی رادیو دارو بیشترین جذب را در کبد و کلیه و طحال و ماهیچه عفونی نشان داد.
نشاندارسازی سیپروفلوکساسین به روش مستقیم با خلوص رادیو شیمیایی بالا میتواند به عنوان یک ترکیب فرموله شده برای تشخیص مکان عفونت در حیوانات آزمایشگاهی مورد استفاده قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
این تحقیق بخشی از پروژه مصوب با کد 830005 در پژوهشکده کشاورزی، پزشکی و صنعتی کرج به انجام رسید که بدینوسیله از تمامی عزیزان بدلیل تخصیص بودجه و همینطور از شرکت دارویی تماد بدلیل تامین داروی سیپروفلوکساسین تشکر و قدردانی میگردد.
)