نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
- هاتف قاسمی حمیدآبادی 1
- نورا... رضایی 1
- رها سترگ 1
- سعید عابدیان کناری 2
- مصطفی لطیفپور 3
- مجید ملک زاده شفارودی 1
1 گروه آناتومی و بیولوژی سلولی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران
2 مرکز تحقیقات ایمونوژنتیک، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران
3 گروه آناتومی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
The Concurrent Effect of 5-Azacytidin and DMSO on In Vitro Differentiation Induction of Cardiomyocytes from Embryonic Carcinoma cells P19
نویسندگان [English]
- H Gh 1
- N R 1
- R S 1
- S A 2
- M L 3
- M M 1
چکیده [English]
Aim: In current study capability of differentiation of embryonic carcinoma cells P19 to cardiomyocyte through inducing effects of DMSO and 5-Azacytidin individually or in combinative form in laboratory condition were examined. Material and Methods: In order to differentiate induction of P19, Embryoid Bodies (EBs) formed through hanging drops method during two days. Then EBs have induced by 2 μM of 5-Azacytidin (5-Aza group), 0/5% DMSO (DMSO group) or both 5-Azacytidin and DMSO (Aza+DM Group) during ten more days. During differentiation beating number per minute counted every two days in all groups by invert Microscopy. Gene expression such as: α-Myosin Heavy Chain (α-MHC) and Myosin Light Chain (MLC) and Connexin-43 have examined by RT-PCR in last day. To more accuracy, F-actin protein expression also illustrated through immunocytochemistry method. Results: Morphological changes in differentiated cardiomyocytes derived from P19 illustrated in all groups. However the most changes such as significant increasing in size and number of process, their branches and attachment between branches happened in Aza+DM group. Daily beating counter per minute revealed increasing in beating number from 2+2 to 2+8 in all groups. RT-PCR analysis also revealed expression of both α-MHC and MLC in Aza+DM Group. However, F-action has expressed only in Aza+DM group. Conclusion: The Results have shown combination of two 5-Azacytidin and DMSO inducer caused effective cell culture differentiate of P19 to cardiomyocyte.
کلیدواژهها [English]
- P19 cells
- Cardiomyocytes
- 5-Azacytidin
- DMSO
مقدمه
از جمله مشکلات بزرگی که امروزه جوامعه بشری با آن مواجه است بیماریهای قلبی ـ عروقی هستند. در مشکلات ایسکمی عضله قلب که متعاقب سکته قلبی رخ می دهد، سلولها دچار آسیب شده و در عملکرد طبیعی کاردیومیوسیتها اختلال ایجاد میشود. با توجه به اینکه کاردیومیوسیتهای بالغ قادر به بازسازی و ترمیم خود نیستند و از سویی مداخلات کلینیکی متداول هم قادر به کاهش عوارض سکته قلبی نیستند میزان مرگ و میر در این دسته از بیماران فوقالعاده زیاد است، لذا یافتن مخزن سلولی در دسترس که بتواند در صورت نیاز به کاردیومیوسیتها متمایز شود و به محل آسیب دیده تزریق گردد، تحولی شگرف را در درمان این بیماران فراهم خواهد نمود (1-3).
مطالعات متعددی ثابت کردهاند که یک منبع سلولی مناسب جهت درمان این دسته از بیماران بایستی برخی از ویژگیها نظیر دسترسی آسان، تکثیر بالا، مقاوم در برابر شرایط ایسکمیک، عدم برانگیختن پاسخهای ایمنی و قابلیت تمایز یافتن به کاردیومیوسیتها را داشته باشد. هر چند که تا بهحال منبع سلولی مناسب برای درمان موفق این دسته از بیماران شناخته نشده است (4-6). برای مثال علیرغم دسترسی راحت سلولهای آلوژن مشخص شده است که در صورت پیوند سبب ایجاد واکنشهای ایمونولوژیک میشود. در این بین بهنظر میرسد که بهکاربردن سلولهای کارسینومای جنینی(Embryonic Carcinoma cells, ECs) مناسب باشد (5 و7).
سلولهای کارسینومای جنینی یکی از انواع سلولهای بنیادی هستند. این سلولها همانند سایر سلولهای بنیادی نامیرا بوده و قدرت تکثیر بالایی در محیط کشت دارند. یکی از انواع سلولهای کارسینومای جنینی، P19 میباشد که از تراتو کارسینومای القا شده در موش تهیه میشود و دارای کاریوتیپ طبیعی هستند .در همین ارتباط، گزارشهای متعددی وجود دارند مبنی بر اینکه سلولهایP19 قابلیت تمایز به انواع سلولها از جمله کاردیومیوسیتها را در شرایط آزمایشگاهی دارا هستند و تا حدودی مشکلات موجود را میتواند مرتفع کند (5 و 8).
فاکتورهایی مختلفی در فرآیند القای کاردیومیوژنیک طی دوران جنینی وجود دارند از جمله Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) که متعلق به ابرخانواده Transforming Growth Factor β (TGF-β) میباشند که بهواسطه فاکتورهایی نسخهبرداری خاص قلبی در فرآیند قلبزایی نقش دارند (9).
در همین ارتباط Makino S و همکاران (10) گزارش کردند که در صورتیکه سلولهای استرومایی مغز استخوان موش تحت القای ماده محرک -Azacytidin5 قرار گیرند به سلولهای قلبی ضرباندار تمایز می یابند و در ادامه مشخص شده که پیوند سلولهای مذکور به جایگاه سکته قلبی، روند بهبودی قلب را افزایش چشمگیری می بخشد. علاوه بر این مطالعات مشابهی توسط Shim W و همکاران (11) بر روی سلولهای استرومایی مغز استخوان انسان صورت پذیرفته است که نشان میدهد که نه تنها -Azacytidin5 بلکه برخی از فاکتورهای رشد نیز میتوانند سبب تمایز کاردیومیوسیت ها گردند.
با توجه به مجموع مطالعاتی که قبلا در این باره صورت گرفته معلوم شده که هم سلولهای بنیادی قلبی و هم سلولهای بنیادی غیرقلبی میتوانند بعد از پیوند به قلب و یا کشت در شرایط آزمایشگاهی شبیه محیط قلب، به کاردیومیوسیت تبدیل شوند. پیشنهاد شده است که سلولهای بنیادی، آنژیوژنز را توسط کاردیومیوسیتهای ایسکمیک شده با ترشح IL6,TNF,CRP تحریک و از مرگ آپوپتیتک کاردیومیوستها جلوگیری می کنند و بهعلاوه کاردیومیوسیتها را تحریک به تکثیر میکنند (12و13).
تا به حال فاکتورهای کاردیومیوژنیک متعددی بهواسطه مطالعه تکوین قلب در موش شناخته شده است. بهمنظور بهبود بخشیدن به کارایی تمایز کاردیومیوسیتها از برخی از فاکتورها استفاده میشود که از جمله این فاکتورها -Azacytidin5 و DMSO میباشند که عمدتا جهت تمایز در شرایط آزمایشگاهی کاردیومیوسیتها شناخته میشود. علاوه بر این گزارشات متعددی ثابت میکند که تمایز کاردیومیوسیت ها بهمدت زمان القا و غلظت بستگی دارد. از آنجائیکه توانایی تمایز کاردیومیوژنیک هر یک از این ترکیبات بهصورت جداگانه به اثبات رسیده است و با توجه به اینکه تا به حال گزارشی مبنی بر آثار ترکیبی این فاکتورها مشاهده نشده است، بهنظر میرسد که استفاده همزمان از این ترکیبات میتواند تاثیر بهسزایی در القای تمایز کاردیومیوسیتها از سلولهای P19 در شرایط آزمایشگاهی داشته باشد.
مواد و روشها
کشت و تکثیر سلولهای P19: در این تحقیق از سلولهای P19 (خریداری شده از انیستیتو پاستور تهران) استفاده شد. محیط کشت این سلولها شامل High Glucose (Gibco)-DMEM که حاوی 15 درصد سرم جنین گاوی (FBS, Gibco)، 0.1 Mm بتامرکاپتواتانول (Sigma)، 1 درصد پنیسیلین/استرپتومایسین(Gibco) و 1 درصد اسید های آمینه غیر ضروری (Sigma) و 1 درصد گلوتامین (Gibco) کشت داده شدند. سلولها در انکوباتور Сº 37 با فشار 5 درصد CO2و رطوبت 95 درصد انکوبه شدند. تعویض محیط کشت بهصورت روزانه صورت گرفته شد.
شکل گیری اجسام شبه جنینی و القائ تمایز کاردیوژنیک (Induction of cardiogenic differentiation): شکلگیری اجسام شبه جنینی (Embryoid Bodies,EBs) بر مبنای روش قطرات آویزانHanging Drops انجام شد (14). بدین ترتیب سوسپانسیونی از سلولهای P19 ایجاد شد و با شمارش سلولی، تعداد 2000 سلول در هر قطره 20 میکرولیتری cells/drop) 2000( از محیط کشت بر روی درپوش پتری دیش بهصورت آویزان بهمدت 48 ساعت در انکوباتور کشت داده شدند. سپس اجسام شبه جنینی توسط میکروسکوپ معکوس (Invert microscope) مورد ارزیابی شدند و اجسام شبه جنینی با ویژگیهای مناسب جهت ادامه تمایز در نظر گرفته شدند. ضمنا بهمنظور جلوگیری از خشک شدن قطرات، کف دیشها توسط PBS پوشیده شدند. سپس اجسام شبه جنینی بهمدت 10 روز در محیط های القایی مختلف به پلیت باکتریایی که با ژلاتین 1/0 درصد (Sigma) ژلاتینه شده، منتقل و در انکوباتور کشت داده شدند. جهت القای تمایز سلولها، از 2 میکرومولار (5-Aza group, Sigma) 5-Azacytidin، (DMSO group, Sigma) DMSO، 5/0 درصد و ترکیب DMSO و 5-Azacytidin (Aza+DM group) استفاده شد. علاوه بر این به برخی چاهکهای پلیت باکتریایی هیچگونه عامل القای اضافه نشد و بهعنوان گروه کنترل (Co group) در نظر گرفته شد.
ارزیابی ضربان کاردیومیوسیتهای تمایز یافته: پس از شکلگیری اجسام شبه جنینی تعداد ضربان در دقیقه طی روزهای 2+2، 4+2، 6+2، 8 +2 و10+2 در گروههای مختلف بهوسیله میکروسکوپ معکوس مشاهده و شمارش شدند.
ارزیابی ایمونوسیتوشیمی :(Immunocytochemistry) در ابتدا کاردیومیوسیتهای مشتق شده از سلولهای P19 در گروههای مختلف توسط PBSسه مرتبه شستشو شدند. سلولهای مذکور در محلول پارافرمالدئید 4 درصد در دمای اتاق بهمدت یک شب تثبیت شدند. بهدنبال شستشوی مجدد سلولها با PBS، سلولها بهمدت 60 دقیقه در دمای اتاق با سرم بز (Goat serum) پوشانده شدند. سپس در محلول 2O2H، 3 درصد قرار داده شدند. آنتیبادی اولیه F-actin (Dako) با رقت 1:400 بهمدت 45 دقیقه به نمونهها افزوده شد و بهدنبال آن آنتیبادی ثانویه EnVision TM (Dako) بهمدت 30 دقیقه به نمونهها اضافه شد. در نهایت سلولها توسط میکروسکوپ نوری بررسی شدند (15).
آنالیز نسخه برداری معکوس واکنش زنجیرهای پلی مراز (RT-PCR): با استفاده از RT-PCR میزان بیان ژنهای ویژه کاردیومیوسیتها در گروههای ذکر شده مورد ارزیابی قرار گرفته شد. بدین ترتیب زنجیره سنگین میوزین α (α-Myosin Heavy Chain, α-MHC)، زنجیره سبک میوزین (Myosin Light Chain, MLC) و کانکسین 43- (Connexin-43) در روز 10 پس از القا بررسی شدند. علاوه بر این ژن –actinβ نیز بهعنوان کنترل داخلی در نظر گرفته شد. همچنین از قلب نوزادان موش صحرایی بهعنوان کنترل مثبت استفاده شد. RNA کل با استفاده از کیت (Fermentas) RNX Plus استخراج شده و با بهکارگیری پرایمر الیگو dt و آنزیم نسخهبردار معکوس MMULV،cDNA ساخته شد. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی کاردیومیوسیتها، واکنش PCR انجام شد. (جدول 1). در نهایت بهمنظور الکتروفور محصولات PCR بروی ژل آگارز 2 درصد منتقل شده و با دستگاه ترانس لومیناتورUV مشاهده شدند.
جدول 1: ویژگیها و توالی پرایمرهای ذکر شده در تحقیق حاضر.
Primer (Forward/Reverse) Length (bp) |
Gene |
F 5'-CTGCTGGAGAGGTTATTCCTCG -3' 301 R 5'- GGAAGAGTGAGCGGGGCATCAAGG-3' F 5'-TGTGGGTCACCTGAGGCTGTGGTTCAG -3' 189 R 5'-GAAGGCTGACTATGTGTCCGGGAGATGC -3' F 5'-AGCGCCTTAGGCAAACTCCTT -3' 298 R 5'- TCTTCCTTTCGCATCACATAGA-3' F 5'- CTTCTTGGGTATGGAATCCTG -3' 317 R 5'- GTGTTGGCATAGAGGTCTTTAC -3' |
α-MHC
MLC
Connexin-43
β- actin |
آنالیز آماری: تعداد ضربان کاردیومیوسیتها در گروههای مختلف با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یکطرفه One Way ANOVA و نرم افزار آماری SPSS ارزیابی شد 05/0 P<معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
تمایز سلولهای P19 به کاردیومیوسیتها
تعداد ضربان در دقیقه در تمامی گروهها از روز 2+2 مشاهده شده و تا روز 8+2 بهتدریج افزایش یافته اما در روز 10+2 از میزان تعداد ضربانات کاسته شده است به استثنای گروه 5-Aza که از روز 2+2 تا روز 10+2 بر میزان تعداد ضربانات آن افزوده شد. یافتهها نشان داد که تعداد ضربان در کاردیومیوسیتهای تمایز یافته در گروه Aza+DM نسبت به سایر گروهها بیشتر بود بهطوریکه حداکثر ضربان در روز 8+2 با میزان 87 ضربان در دقیقه مشاهده شد و با روزهای 2+2 و 4+2 اختلاف معنیداری دارد (05/0P<). علاوه بر این در گروه 5-Aza اختلاف معنیداری در فرکانس ضربان در روزههای 2+2 و 10+2 وجود داشت (05/0P<). حداکثر تعداد ضربان در گروه DMSO در روز 8+2 مشاهده شد که فقط با روز 2+2 اختلاف معنیداری دارد (05/0P<) (نمودار1).
نمودار 1: تعداد ضربان در دقیقه در گروههای کنترل (Co)، 5-Aza، DMSO و Aza+DM (05/0P<)*.
در گروه کنترل کاردیومیوسیتهای مشتق شده از P19 شکل فیبروبلاستی خود را حفظ کرده بودند (شکل1، A). در حالیکه تغییرات مورفولوژیکی زیادی در کاردیومیوسیتهای مشتق شده از P19 ایجاد شد بهطوریکه طی روزهای 2+2 تا 4+2 افزایش
مشخصی در اندازه سیتوپلاسم و زواید سیتوپلاسمی آنها دیده شد و بهتدریج تا روز 10+2 اندازه سلولها و شاخه شاخه شدنآنها افزایش یافت و بهصورت گرد یا چندوجهی ظاهر گردیده و با سلولهای مجاور ارتباط برقرار کردند (شکل1،B).
شکل 1: A) تغییرات مورفولوژیکی حاصله در کاردیومیوسیتهای مشتق شده از P19، در گروه کنترل به شکل فیبروبلاستی مشاهده میشوند (سر پیکانها)، B) بزرگنمایی 10×. در گروه Aza+DM سلولها عمدتا بهصورت چندوجهی ظاهر گردیده (سر پیکانها) و با سلولهای مجاور ارتباط تنگاتنگی برقرار کردند (پیکانهای کوتاه)، بزرگنمایی ×20.
علاوه بر این نتایج جاصل از ارزیابی ایمونوسیتوشیمی ثابت کرد که کاردیومیوسیتهای مشتق شده از P19 که تحت القای همزمان DMSO و 5-Azacitidin قرار گرفتهاند قادر به بیان پروتئین اختصاصی قلبی F-actin میباشند و سلولهای F-actin مثبت با ظاهری مشخص و سیتوپلاسم واضح از سلولهای F اکتین منفی مشخص هستند (شکل2).
شکل 2: سلولهای بیان کننده F اکتین (سر پیکان ها)، بزرگنمایی ×20.
آنالیز نتایج RT-PCR نشان داد که در سلولهای P19 که بهوسیله 5-Aza تیمار شدهاند ژنهای Connexin-43 و MLC بیان شدند. اما در گروهی که بهوسیله DMSO تیمار شده ژن MLC بروز یافت. سلولهای P19 که تحت القای همزمان DMSO و 5-Aza بودند ژنهای ویژه بافت قلبی را نظیر MLC و α-MHC بیان کردند (شکل 3).
شکل 3: ارزیابی بیان ژنهای اختصاصی قلبی در گروههای 5-Aza، DMSO، Aza+DM و کنترل (Co) با روش RT-PCR. ژن β- actin بهعنوان کنترل داخلی در نظر گرفته شد.
بحث
با توجه به اینکه تمایز کاردیومیوسیتها از سلولهای سرطانی P19 اهمیت ویژهای در شناخت مکانیسمهای دخیل در بیولوژی تکاملی، پیوند سلولی و درمان دارد لذا دانستن شرایط کشت مطلوب این سلولها جهت القای تمایز به رده سلولی خاص از جمله کاردیومیوسیتها ضروری میباشد. در مطالعه حاضر با بهکارگیری عوامل القاگر مختلف سعی شده تا ویژگیهای کاردیومیوسیتهای تمایز یافته معین گردد (6، 16-19).
بهمنظور ایجاد تمایز در سلولهای P19 از غلظت 2 میکرومولار 5-Azacytidin استفاده شد نتایج نشان داد که سلولهای تمایز یافته از لحاظ مورفولوژیکی مشابه کاردیومیوسیتها هستند و برخی از ژنها نظیر Connexin-43 و MLC را بروز دادند درحالیکه هیچ سلول بیان کننده F اکتین مشاهد نشد. همچنین تعداد ضربان بهتدریج از روز 2+2 تا 10+2 افزایش یافته است. در مطالعهای که Wang و همکارانش (13) بهمنظور تمایز دادن سلولهای ماتریکس بند ناف انسان انجام دادند توانستند بعد از انکوبه کردن این سلولها با 5-Azacytidin برای 3 هفته، مارکرهای کاردیومیوسیتی را شامل تروپونین Iقلبی، کانکسین43 و دسمین را بیان کنند و مورفولوژی میوسیت قلبی را مشاهده کنند.
در همین ارتباط گزارشهای وجود دارد دال بر اینکه القا سلولهای استرومایی مغز استخوان با استفاده از داروی 5-Azacytidine به غلظت 10 میکرومولار طی دو هفته جهت تمایز به کاردیومیوسیتها کافی نمیباشد و در ادامه بررسیها مشخص شد که سلولهای مذکور هیچگونه ساختارهای سارکومریک که از ویژگیهای بارز سلولهای قلبی است را بروز ندادند (20و 21). گزارش مشابهی توسط Martin Rendom و همکاران (15) وجود دارد مبنی بر اینکه تمایز سلولهای استرومایی مغز استخوان به کاردیومیوسیتها در غلظتهای مختلف داروی مذکور صورت نمیپذیرد. نتایج مطالعات فوق نشان میدهد که داروی مذکور به تنهایی جهت القای تمایز سلولهای P19 به سلولهای قلبی کافی نیست بنابراین افزودن عامل القاگر دیگر نیز به محیط کشت سلولها ضروری میباشد. تحقیقات اخیر نشان داد که اعضای ابر خانواده TGF-β از طریق برخی مسیرهای سیگنالی در القای تمایز کاردیومیوسیتها و فاکتورهای نسخه برداری قلبی نظیر Nkx2.5 نقش بهسزایی دارند. یکی از شناخته شده ترین مسیرهای سیگنالی به Wntβ catenin بر میگردد. در همین ارتباط Cohen و همکاران (9)، Marvin و همکاران (22) و Tzahor و همکاران (23) گزارش کردند که در صورت افزودن DMSO ، 1 درصد بههمراه Fibroblast Growth Factor 8 (FGF8) به سلولهای PC19CL6 در روز اول سبب بیان Wnt3A و Wnt8 میگردد اما در روز چهارم از میزان بیان پروتئینهای سیگنالینگ مذکور کاسته شده است بهنظر میرسد که این فرایند جهت مراحل بعدی تمایز کاردیومیوسیتها ضروری باشد.
در تحقیق حاضر علاوه بر این جهت تمایز سلولهای P19 به کاردیومیوسیتها از غلظت 5/0 درصد DMSO استفاده شد. یافتههای بهدست آمده نشان داد که کاردیومیوسیتهای مشتق شده از لحاظ مورفولوژیک همانند سلولهای قلبی هستند. آنالیز نتایج RT-PCR نشان داد که سلولهای تمایز یافته قادر به بیان ژن MLC هستند و حداکثر تعداد ضربان در این گروه در روز 8+2 مشاهده شد که در مقایسه با سایر گروهها از فرکانس کمتری برخوردار بود.
در پژوهش حاضر نیز شاید علت بی تاثیر بودن غلظت DMSO، 5/0 درصد جهت تمایز سلولهای قلبی از سلولهای P19 این باشد که DMSO به تنهایی نمیتواند در القای فرایند کاردیوژنیک نقش داشته باشد. بنابراین بهنظر میرسد که این فرایند نیاز به همکاری برخی از مسیرهای سیگنالی باشد که در اثر افزودن ترکیبات مورد نظر به محیط کشت سلولها ایجاد میشوند. علاوه بر این گزارشات مشابهی در این زمینه وجود دارد، بهطوریکه تیمار سلولهای کارسینومای جنینی موشی و حتی سلولهای بنیادی جنینی در حضور همزمان اکسی توسین و DMSO روند تمایز قلبی را تحریک و تسهیل مینماید (24 و 25).
در مطالعه حاضر مشخص شده است که هر یک از عوامل القاگر 5-Azacytidine و DMSO به تنهایی قادر به تمایز کاردیومیوسیتها از سلولهای P19 نیستند. اگر چه که مطالعات پیشین حاکی از آن است که افزودن هر یک از این ترکیبات در شرایط آزمایشگاهی میتواند تا حدودی برخی از ویژگیهای کاردیومیوسیتها را بروز دهند.
در ادامه مطالعه بهمنظور بهینه سازی شرایط محیط کشت تمایزی کاردیومیوژنزیس از تاثیر همزمان ترکیباتDMSO و 5-Azacytidin استفاده شد. بررسیهای میکروسکوپی نشان داد که اولا این سلولها بیشتر به کاردیومیوسیت تمایز پیدا کردهاند تا سلولهای عضلانی دیگر ثانیا بیان F اکتین در کاردیومیوسیتها نشانگر این است که سلولهای تمایز یافته واجد یک الگوی اتصال سلولی مشابه کاردیومیوسیتها میباشند. یافتههای RT-PCR نشان داد که ژنهای ویژه بافت قلبی نظیر MLC و α-MHC در کاردیومیوسیتها بیان شدند. یکی از ویژگیهای اصلی کاردیومیوسیتها پیدایش ضربان در آنهاست. یافتههای بهدست آمده نشان داد که میزان انقباض پایه در دامنه 28 تا 87 ضربان در دقیقه بوده که بهترتیب در روزهای 2+2 و 8+2 مشاهده گردید. علاوه بر این مشخص شد که تعداد ضربان در این گروه نسبت به سایر گروهها بیشتر بود که دال بر وجود کانال های کلسیمی نوع L وابسته به ولتاژ (Ica) در کاردیومیوسیتهای مشتق شده است. نتایج مشابهی در این زمینه وجود دارد مبنی بر اینکه در حضور ایزوپرنالین کاردیومیوسیت های ضرباندار مشاهده میشود (26). کاردیومیوسیتهای تمایز یافته دارای الگوی انقباضی پیوسته میباشند که به برخی از مولکولهای چسبنده نظیر N-cadherin، پروتئینهای اتصالات شکافدار مثل کانکسین 43 و یون کلسیم وابسته است. یکی از دلایل احتمالی در افزایش بیشتر ضربان در گروه Aza+DM نسبت به سایر گروهها بهحضور DMSO در محیط القایی بر میگردد بهطوریکه DMSO سبب آزاد شدن ناگهانی یون کلسیم از ذخایر داخل سلولی میشود (21). علاوه بر این -Azacytidin5 نیز با ایجاد کمپلکسهای پایدار سبب دمتیله شدن DNA میشود و بدین ترتیب در روند کاردیومیوژنریس نقش دارد هر چند تمایز سلولها P19 به کاردیومیوسیتها بهمدت زمان القا و غلظت بستگی دارد. در همین ارتباط مطالعات نشان میدهند که اضافه کردن -Azacytidin5 منجر به افزایش بیان ژنهای زنجیره سنگین میوزین شود که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد (27-29). حتی وجود سرم در محیط کشت بر روی تمایز کاردیومیوسیتها تاثیر میگذارد بهطوریکه حذف سرم سبب افزایش تعداد نواحی ضرباندار در اجسام شبه جنینی میگردد (7).
نتیجه گیری
با توجه به مشاهدات انجام شده در این تحقیق و مقایسه آن با سایر مطالعات میتوان نتیجه گرفت که سلولهای کارسینومای P19 یکی از بهترین ردهها جهت تمایز کاردیومیوسیتها میباشند. بهطوریکه کاربرد همزمان ترکیبات DMSO و 5-Azacytidin موجب بهینه سازی محیط کشت تمایزی کاردیومیوسیتها از سلولهای P19 میگردد.