سلول و بافت

فصلنامه

شماره جاری

بر اساس شماره‌های نشریه

بر اساس نویسندگان

بر اساس موضوعات

نمایه نویسندگان

نمایه کلیدواژه ها

درباره نشریه

اهداف و چشم انداز

اعضای هیات تحریریه

اصول اخلاقی انتشار مقاله

بانک ها و نمایه نامه ها

پیوندهای مفید

فرایند پذیرش مقالات

بیانیه حریم خصوصی

بیانیه حق مولف

پرسش‌های متداول

اخبار و اعلانات

اطلاعات آماری نشریه

خط مشی داوری

راهنمای داوران

فهرست داوران

تاثیر همزمان -Azacytidin5 و DMSO در القای تمایز کاردیومیوسیت ها از سلول های کارسینومای جنینی P19 در شرایط آزمایشگاهی

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 گروه آناتومی و بیولوژی سلولی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران

2 مرکز تحقیقات ایمونوژنتیک، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران

3 گروه آناتومی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران

10.52547/JCT.5.3.317

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

The Concurrent Effect of 5-Azacytidin and DMSO on In Vitro Differentiation Induction of Cardiomyocytes from Embryonic Carcinoma cells P19

نویسندگان [English]

  • H Gh 1
  • N R 1
  • R S 1
  • S A 2
  • M L 3
  • M M 1

چکیده [English]

Aim: In current study capability of differentiation of embryonic carcinoma cells P19 to cardiomyocyte through inducing effects of DMSO and 5-Azacytidin individually or in combinative form in laboratory condition were examined. Material and Methods: In order to differentiate induction of P19, Embryoid Bodies (EBs) formed through hanging drops method during two days. Then EBs have induced by 2 μM of 5-Azacytidin (5-Aza group), 0/5% DMSO  (DMSO group) or both 5-Azacytidin and DMSO (Aza+DM Group) during ten more days. During differentiation beating number per minute counted every two days in all groups by invert Microscopy. Gene expression such as:  α-Myosin Heavy Chain (α-MHC) and Myosin Light Chain (MLC) and Connexin-43 have examined by RT-PCR in last day. To more accuracy, F-actin protein expression also illustrated through immunocytochemistry method. Results: Morphological changes in differentiated cardiomyocytes derived from P19 illustrated in all groups. However the most changes such as significant increasing in size and number of process, their branches and attachment between branches happened in Aza+DM group. Daily beating counter per minute revealed increasing in beating number from 2+2 to 2+8 in all groups. RT-PCR analysis also revealed expression of both α-MHC and MLC in Aza+DM Group. However, F-action has expressed only in Aza+DM group. Conclusion: The Results have shown combination of two 5-Azacytidin and DMSO inducer caused effective cell culture differentiate of P19 to cardiomyocyte.

کلیدواژه‌ها [English]

  • P19 cells
  • Cardiomyocytes
  • 5-Azacytidin
  • DMSO
اصل مقاله

مقدمه

از جمله مشکلات بزرگی که امروزه جوامعه بشری با آن مواجه‌ است بیماری‌های قلبی ‌ـ عروقی هستند. در مشکلات ایسکمی عضله قلب که متعاقب سکته قلبی رخ می دهد، سلول‏ها دچار آسیب شده و در عمل‏کرد طبیعی کاردیومیوسیت‌ها اختلال ایجاد می‏شود. با توجه به اینکه کاردیومیوسیت‌های بالغ قادر به بازسازی و ترمیم خود نیستند و از سویی مداخلات کلینیکی متداول هم قادر به کاهش عوارض سکته قلبی نیستند میزان مرگ و میر در این دسته از بیماران فوق‌العاده زیاد است، لذا یافتن مخزن سلولی در دسترس که بتواند در صورت نیاز به کاردیومیوسیت‏ها متمایز شود و به محل آسیب دیده تزریق گردد، تحولی شگرف را در درمان این بیماران فراهم خواهد نمود (1-3).

مطالعات متعددی ثابت کرده‏اند که یک منبع سلولی مناسب جهت درمان این دسته از بیماران بایستی برخی از ویژگی‏ها نظیر دسترسی آسان، تکثیر بالا، مقاوم در برابر شرایط ایسکمیک، عدم برانگیختن پاسخ‏های ایمنی و قابلیت تمایز یافتن به کاردیومیوسیت‏ها را داشته باشد. هر چند که تا به‏حال منبع سلولی مناسب برای درمان موفق این دسته از بیماران شناخته نشده است (4-6). برای مثال علیرغم دسترسی راحت سلول‏های آلوژن مشخص شده است که در صورت پیوند سبب ایجاد واکنش‏های ایمونولوژیک می‏شود. در این بین به‏نظر می‏رسد که به‏کاربردن سلول‏های کارسینومای جنینی‏(Embryonic Carcinoma cells, ECs) مناسب باشد (5 و7).

سلول‏های کارسینومای جنینی یکی از انواع سلول‏های بنیادی هستند. این سلول‏ها همانند سایر سلول‏های بنیادی نامیرا بوده و قدرت تکثیر بالایی در محیط کشت دارند. یکی از انواع سلول‏های کارسینومای جنینی، P19 می‏باشد که از تراتو کارسینومای القا شده در موش تهیه می‏شود و دارای کاریوتیپ طبیعی هستند .در همین ارتباط، گزارش‏های متعددی وجود دارند مبنی بر اینکه سلول‏هایP19  قابلیت تمایز به انواع سلول‏ها از جمله کاردیومیوسیت‏ها را در شرایط آزمایشگاهی دارا هستند و تا حدودی مشکلات موجود را می‏تواند مرتفع کند (5 و 8).

فاکتورهایی مختلفی در فرآیند القای کاردیومیوژنیک طی دوران جنینی وجود دارند از جمله Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) که متعلق به ابرخانواده Transforming Growth Factor β (TGF-β) می‏باشند که به‏واسطه فاکتورهایی نسخه‏برداری خاص قلبی در فرآیند قلب‏زایی نقش دارند (9).

در همین ارتباط Makino S و همکاران (10) گزارش کردند که در صورتی‏که سلول‏های استرومایی مغز استخوان موش تحت القای ماده محرک -Azacytidin5 قرار گیرند به سلول‏های قلبی ضربان‏دار تمایز می یابند و در ادامه مشخص شده که پیوند سلول‏های مذکور به جایگاه سکته قلبی، روند بهبودی قلب را افزایش چشمگیری می بخشد. علاوه بر این مطالعات مشابهی توسط Shim W و همکاران (11) بر روی سلول‏های استرومایی مغز استخوان انسان صورت پذیرفته است که نشان می‏دهد که نه تنها -Azacytidin5 بلکه برخی از فاکتورهای رشد نیز می‏توانند سبب تمایز کاردیومیوسیت ها گردند.

با توجه به مجموع مطالعاتی که قبلا در این باره صورت گرفته معلوم شده که هم سلول‏های بنیادی قلبی و هم سلول‏های بنیادی غیرقلبی می‏توانند بعد از پیوند به قلب و یا کشت در شرایط آزمایشگاهی شبیه محیط قلب، به کاردیومیوسیت تبدیل شوند. پیشنهاد شده است که سلول‏های بنیادی، آنژیوژنز را توسط کاردیومیوسیت‏های ایسکمیک شده با ترشح IL6,TNF,CRP تحریک و از مرگ آپوپتیتک کاردیومیوست‏ها جلوگیری می کنند و به‏علاوه کاردیومیوسیت‏ها را تحریک به تکثیر می‏کنند (12و13).

تا به حال فاکتورهای کاردیومیوژنیک متعددی به‏واسطه مطالعه تکوین قلب در موش شناخته شده است. به‏منظور بهبود بخشیدن به کارایی تمایز کاردیومیوسیت‏ها از برخی از فاکتورها استفاده می‏شود که از جمله این فاکتورها -Azacytidin5 و DMSO می‏باشند که عمدتا جهت تمایز در شرایط آزمایشگاهی کاردیومیوسیت‏ها شناخته می‏شود. علاوه بر این گزارشات متعددی ثابت می‏کند که تمایز کاردیومیوسیت ها به‏مدت زمان القا و غلظت بستگی دارد. از آنجائی‏که توانایی تمایز کاردیومیوژنیک هر یک از این ترکیبات به‏صورت جداگانه به اثبات رسیده است و با توجه به اینکه تا به حال گزارشی مبنی بر آثار ترکیبی این فاکتورها مشاهده نشده است، به‏نظر می‏رسد که استفاده هم‏زمان از این ترکیبات می‏تواند تاثیر به‏سزایی در القای تمایز کاردیومیوسیت‏ها از سلول‏های P19 در شرایط آزمایشگاهی داشته باشد.

 

مواد و روش‏ها

کشت و تکثیر سلول‏های P19: در این تحقیق از سلول‏های P19 (خریداری شده از انیستیتو پاستور تهران) استفاده شد. محیط کشت این سلول‏ها شامل High Glucose (Gibco)-DMEM که حاوی 15 درصد سرم جنین گاوی (FBS, Gibco)، 0.1 Mm بتامرکاپتواتانول (Sigma)، 1 درصد پنی‏سیلین/استرپتومایسین(Gibco)  و 1 درصد اسید های آمینه غیر ضروری (Sigma) و 1 درصد گلوتامین (Gibco) کشت داده شدند. سلول‏ها در انکوباتور Сº 37 با فشار 5 درصد  CO2و رطوبت 95 درصد انکوبه شدند. تعویض محیط کشت به‏صورت روزانه صورت گرفته شد.

شکل گیری اجسام شبه جنینی و القائ تمایز کاردیوژنیک (Induction of cardiogenic differentiation): شکل‏گیری اجسام شبه جنینی (Embryoid Bodies,EBs) بر مبنای روش قطرات آویزانHanging Drops  انجام شد (14). بدین ترتیب سوسپانسیونی از سلول‏های P19  ایجاد شد و با شمارش سلولی، تعداد 2000 سلول در هر قطره 20 میکرولیتری            cells/drop) 2000( از محیط کشت بر روی درپوش پتری دیش به‏صورت آویزان به‏مدت 48 ساعت در انکوباتور کشت داده شدند. سپس اجسام شبه جنینی توسط میکروسکوپ معکوس (Invert microscope) مورد ارزیابی شدند و اجسام شبه جنینی با ویژگی‏های مناسب جهت ادامه تمایز در نظر گرفته شدند. ضمنا به‏منظور جلوگیری از خشک شدن قطرات، کف دیش‏ها توسط PBS پوشیده شدند. سپس اجسام شبه جنینی به‏مدت 10 روز در محیط های القایی مختلف به پلیت باکتریایی که با ژلاتین 1/0 درصد (Sigma) ژلاتینه شده، منتقل و در انکوباتور کشت داده شدند. جهت القای تمایز سلول‏ها، از 2 میکرومولار (5-Aza group, Sigma) 5-Azacytidin، (DMSO group, Sigma) DMSO،  5/0 درصد و ترکیب DMSO  و 5-Azacytidin (Aza+DM group) استفاده شد. علاوه بر این به برخی چاهک‏های پلیت باکتریایی هیچگونه عامل القای اضافه نشد و به‏عنوان گروه کنترل (Co group) در نظر گرفته شد.

ارزیابی ضربان کاردیومیوسیت‏های تمایز یافته: پس از شکل‏گیری اجسام شبه جنینی تعداد ضربان در دقیقه طی روزهای 2+2، 4+2، 6+2، 8 +2 و10+2 در گروه‏های مختلف به‏وسیله میکروسکوپ معکوس مشاهده و شمارش شدند.

ارزیابی ایمونوسیتوشیمی :(Immunocytochemistry) در ابتدا کاردیومیوسیت‏های مشتق شده از سلول‏های P19 در گروه‏های مختلف توسط  PBSسه مرتبه شستشو شدند. سلول‏های مذکور در محلول پارافرمالدئید 4 درصد در دمای اتاق به‏مدت یک شب تثبیت شدند. به‏دنبال شستشوی مجدد سلول‏ها با PBS، سلول‏ها به‏مدت 60 دقیقه در دمای اتاق با سرم بز (Goat serum) پوشانده شدند. سپس در محلول 2O2H، 3 درصد قرار داده شدند. آنتی‏بادی اولیه F-actin (Dako) با رقت 1:400 به‏مدت 45 دقیقه به نمونه‏ها افزوده شد و به‏دنبال آن آنتی‏بادی ثانویه EnVision TM (Dako) به‏مدت 30 دقیقه به نمونه‏ها اضافه شد. در نهایت سلول‏ها توسط میکروسکوپ نوری بررسی شدند (15).

آنالیز نسخه برداری معکوس واکنش زنجیره‏ای پلی مراز (RT-PCR): با استفاده از RT-PCR میزان بیان ژن‏های ویژه کاردیومیوسیت‏ها در گروه‏های ذکر شده مورد ارزیابی قرار گرفته شد. بدین ترتیب زنجیره سنگین میوزین α  (α-Myosin Heavy Chain, α-MHC)، زنجیره سبک میوزین (Myosin Light Chain, MLC)   و کانکسین 43- (Connexin-43) در روز 10 پس از القا بررسی شدند. علاوه بر این ژن –actinβ نیز به‏عنوان کنترل داخلی در نظر گرفته شد. همچنین از قلب نوزادان موش صحرایی به‏عنوان کنترل مثبت استفاده شد.  RNA کل با استفاده از کیت  (Fermentas)  RNX Plus استخراج شده و با به‏کارگیری پرایمر الیگو dt و آنزیم نسخه‏بردار معکوس MMULV،cDNA  ساخته شد. سپس با استفاده از پرایمر‏های اختصاصی کاردیومیوسیت‏ها، واکنش PCR انجام شد. (جدول 1). در نهایت به‏منظور الکتروفور محصولات PCR بروی ژل آگارز 2 درصد منتقل شده  و با دستگاه ترانس لومیناتورUV  مشاهده شدند.


 

جدول 1: ویژگی‏ها و توالی پرایمر‏های ذکر شده در تحقیق حاضر.

Primer (Forward/Reverse)                                                                   Length (bp)

Gene

F 5'-CTGCTGGAGAGGTTATTCCTCG -3'                                                 301

R 5'- GGAAGAGTGAGCGGGGCATCAAGG-3'

F 5'-TGTGGGTCACCTGAGGCTGTGGTTCAG -3'                                    189

R 5'-GAAGGCTGACTATGTGTCCGGGAGATGC -3'

F 5'-AGCGCCTTAGGCAAACTCCTT -3'                                                    298

R 5'- TCTTCCTTTCGCATCACATAGA-3'

F 5'- CTTCTTGGGTATGGAATCCTG -3'                                                    317

R 5'- GTGTTGGCATAGAGGTCTTTAC -3'

α-MHC

 

MLC

 

Connexin-43

 

β- actin

 


آنالیز آماری: تعداد ضربان کاردیومیوسیت‏ها در گروه‏های مختلف با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک‏طرفه           One Way ANOVA و نرم افزار آماری SPSS ارزیابی شد 05/0  P<معنی‏دار در نظر گرفته شد.

نتایج

تمایز سلول‏های P19 به کاردیومیوسیت‏ها

تعداد ضربان در دقیقه در تمامی گروه‏ها از روز 2+2 مشاهده شده و تا روز 8+2 به‏تدریج افزایش یافته اما در روز 10+2 از میزان تعداد ضربانات کاسته شده است به استثنای گروه 5-Aza که از روز 2+2 تا روز 10+2 بر میزان تعداد ضربانات آن افزوده شد. یافته‏ها نشان داد که تعداد ضربان در کاردیومیوسیت‏های تمایز یافته در گروه Aza+DM نسبت به سایر گروه‏ها بیشتر بود به‏طوری‏که حداکثر ضربان در روز 8+2 با میزان 87  ضربان در دقیقه مشاهده شد و با روزهای 2+2 و 4+2 اختلاف معنی‏داری دارد (05/0P<). علاوه بر این در گروه 5-Aza اختلاف معنی‏داری در فرکانس ضربان در روزه‏های 2+2 و 10+2 وجود داشت (05/0P<). حداکثر تعداد ضربان در گروه DMSO در روز 8+2  مشاهده شد که فقط با روز 2+2 اختلاف معنی‏داری دارد (05/0P<) (نمودار1).


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1: تعداد ضربان در دقیقه در گروه‏های کنترل (Co)، 5-Aza، DMSO و Aza+DM (05/0P<)*.

 


در گروه کنترل کاردیومیوسیت‏های مشتق شده از P19 شکل فیبروبلاستی خود را حفظ کرده بودند (شکل1، A). در حالی‏که تغییرات مورفولوژیکی زیادی در کاردیومیوسیت‏های مشتق شده از P19 ایجاد شد به‏طوری‏که طی روزهای 2+2 تا 4+2 افزایش

 

مشخصی در اندازه سیتوپلاسم و زواید سیتوپلاسمی آن‏ها دیده شد و به‏تدریج تا روز 10+2 اندازه سلول‏ها و شاخه شاخه شدنآن‏ها افزایش یافت و به‏صورت گرد یا چندوجهی ظاهر گردیده و با سلول‏های مجاور ارتباط برقرار کردند (شکل1،B).

 

شکل 1: A) تغییرات مورفولوژیکی حاصله در کاردیومیوسیت‏های مشتق شده از P19، در گروه کنترل به شکل فیبروبلاستی مشاهده می‏شوند (سر پیکان‏ها)، B) بزرگنمایی 10×. در گروه Aza+DM سلول‏ها عمدتا به‏صورت چندوجهی ظاهر گردیده (سر پیکان‏ها) و با سلول‏های مجاور ارتباط تنگاتنگی برقرار کردند (پیکان‏های کوتاه)‏، بزرگنمایی ×20.

 


علاوه بر این نتایج جاصل از ارزیابی ایمونوسیتوشیمی ثابت کرد که کاردیومیوسیت‏های مشتق شده از P19 که تحت القای هم‏زمان DMSO و  5-Azacitidin قرار گرفته‏اند قادر به بیان پروتئین اختصاصی قلبی F-actin می‏باشند و سلول‏های F-actin مثبت با ظاهری مشخص و سیتوپلاسم واضح از سلول‏های F اکتین منفی مشخص هستند (شکل2).


 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: سلول‏های بیان کننده F اکتین (سر پیکان ها)، بزرگنمایی ×20.

 


آنالیز نتایج RT-PCR نشان داد که در سلول‏های P19 که به‏وسیله 5-Aza تیمار شده‏اند ژن‏های Connexin-43 و MLC بیان شدند. اما در گروهی که به‏وسیله DMSO تیمار شده ژن MLC بروز یافت. سلول‏های P19 که تحت القای هم‏زمان DMSO و 5-Aza بودند ژن‏های ویژه بافت قلبی را نظیر MLC و α-MHC بیان کردند (شکل 3). 


 

 

شکل 3: ارزیابی بیان ژن‏های اختصاصی قلبی در گروه‏های 5-Aza، DMSO، Aza+DM و کنترل (Co) با روش RT-PCR.   ژن β- actin به‏عنوان کنترل داخلی در نظر گرفته شد.


 


 

بحث

با توجه به اینکه تمایز کاردیومیوسیت‏ها از سلول‏های سرطانی P19 اهمیت ویژه‏ای در شناخت مکانیسم‏های دخیل در بیولوژی تکاملی، پیوند سلولی و درمان دارد لذا دانستن شرایط کشت مطلوب این سلول‏ها جهت القای تمایز به رده سلولی خاص از جمله کاردیومیوسیت‏ها ضروری می‏باشد. در مطالعه حاضر با به‏کارگیری عوامل القاگر مختلف سعی شده تا ویژگی‏های کاردیومیوسیت‏های تمایز یافته معین گردد (6، 16-19). 

به‏منظور ایجاد تمایز در سلول‏های P19 از غلظت 2 میکرومولار 5-Azacytidin استفاده شد نتایج نشان داد که سلول‏های تمایز یافته از لحاظ مورفولوژیکی مشابه کاردیومیوسیت‏ها هستند و برخی از ژن‏ها نظیر Connexin-43 و MLC را بروز دادند در‏حالی‏که هیچ سلول بیان کننده F اکتین مشاهد نشد. همچنین تعداد ضربان به‏تدریج از روز 2+2 تا 10+2 افزایش یافته است. در مطالعه‏ای که Wang و همکارانش (13) به‏منظور تمایز دادن سلول‏های ماتریکس بند ناف انسان انجام دادند توانستند بعد از انکوبه کردن این سلول‏ها با 5-Azacytidin برای 3 هفته، مارکرهای کاردیومیوسیتی را شامل تروپونین  Iقلبی،  کانکسین43 و دسمین را بیان کنند و مورفولوژی میوسیت قلبی را مشاهده کنند.

در همین ارتباط گزارش‏های وجود دارد دال بر اینکه القا سلول‏های استرومایی مغز استخوان با استفاده از داروی 5-Azacytidine به غلظت 10 میکرومولار طی دو هفته جهت تمایز به کاردیومیوسیت‏ها کافی نمی‏باشد و در ادامه بررسی‏ها مشخص شد که سلول‏های مذکور هیچگونه ساختارهای سارکومریک که از ویژگی‏های بارز سلول‏های قلبی است را بروز ندادند (20و 21). گزارش مشابهی توسط Martin Rendom و همکاران (15) وجود دارد مبنی بر اینکه تمایز سلول‏های استرومایی مغز استخوان به کاردیومیوسیت‏ها در غلظت‏های مختلف داروی مذکور صورت نمی‏پذیرد. نتایج مطالعات فوق نشان می‏دهد که داروی مذکور به تنهایی جهت القای تمایز سلول‏های P19 به سلول‏های قلبی کافی نیست بنابراین افزودن عامل القاگر دیگر نیز به محیط کشت سلول‏ها ضروری می‏باشد. تحقیقات اخیر نشان داد که اعضای ابر خانواده TGF-β از طریق برخی مسیرهای سیگنالی در القای تمایز کاردیومیوسیت‏ها و فاکتورهای نسخه برداری قلبی نظیر Nkx2.5 نقش به‏سزایی دارند. یکی از شناخته شده ترین مسیرهای سیگنالی به Wntβ catenin بر می‏گردد. در همین ارتباط Cohen و همکاران (9)، Marvin و همکاران (22) و Tzahor و همکاران (23) گزارش کردند که در صورت افزودن DMSO ،‌ 1 درصد به‏همراه Fibroblast Growth Factor 8 (FGF8) به سلول‏های PC19CL6 در روز اول سبب بیان Wnt3A و Wnt8 می‏گردد اما در روز چهارم از میزان بیان پروتئین‏های سیگنالینگ مذکور کاسته شده است به‏نظر می‏رسد که این فرایند جهت مراحل بعدی تمایز کاردیومیوسیت‏ها ضروری باشد.

در تحقیق حاضر علاوه بر این جهت تمایز سلول‏های P19 به کاردیومیوسیت‏ها از غلظت 5/0 درصد DMSO استفاده شد. یافته‏های به‏دست آمده نشان داد که کاردیومیوسیت‏های مشتق شده از لحاظ مورفولوژیک همانند سلول‏های قلبی هستند. آنالیز نتایج RT-PCR نشان داد که سلول‏های تمایز یافته قادر به بیان ژن MLC هستند و حداکثر تعداد ضربان در این گروه در روز 8+2  مشاهده شد که در مقایسه با سایر گروه‏ها از فرکانس کمتری برخوردار بود. 

 در پژوهش حاضر نیز شاید علت بی تاثیر بودن غلظت  DMSO، 5/0 درصد جهت تمایز سلول‏های قلبی از سلول‏های P19 این باشد که DMSO به تنهایی نمی‏تواند در القای فرایند کاردیوژنیک نقش داشته باشد. بنابراین به‏نظر می‏رسد که این فرایند نیاز به همکاری برخی از مسیر‏های سیگنالی باشد که در اثر افزودن ترکیبات مورد نظر به محیط کشت سلول‏ها ایجاد می‏شوند. علاوه بر این گزارشات مشابهی در این زمینه وجود دارد، به‏طوری‏که تیمار سلول‏های کارسینومای جنینی موشی و حتی سلول‏های بنیادی جنینی در حضور هم‏زمان اکسی توسین و DMSO روند تمایز قلبی را تحریک و تسهیل می‏نماید (24 و 25).

در مطالعه حاضر مشخص شده است که هر یک از عوامل القاگر 5-Azacytidine و DMSO به تنهایی قادر به تمایز کاردیومیوسیت‏ها از سلول‏های P19 نیستند. اگر چه که مطالعات پیشین حاکی از آن است که افزودن هر یک از این ترکیبات در شرایط آزمایشگاهی می‏تواند تا حدودی برخی از ویژگی‏های کاردیومیوسیت‏ها را بروز دهند. 

در ادامه مطالعه به‏منظور بهینه سازی شرایط محیط کشت تمایزی کاردیومیوژنزیس از تاثیر هم‏زمان ترکیباتDMSO  و  5-Azacytidin استفاده شد. بررسی‏های میکروسکوپی نشان داد که اولا این سلول‏ها بیشتر به کاردیومیوسیت تمایز پیدا کرده‏اند تا سلول‏های عضلانی دیگر ثانیا بیان F اکتین در کاردیومیوسیت‏ها نشانگر این است که سلول‏های تمایز یافته واجد یک الگوی اتصال سلولی مشابه کاردیومیوسیت‏ها می‏باشند. یافته‏های RT-PCR نشان داد که ژن‏های ویژه بافت قلبی نظیر MLC و α-MHC در کاردیومیوسیت‏ها بیان شدند. یکی از ویژگی‏های اصلی کاردیومیوسیت‏ها پیدایش ضربان در آن‏هاست. یافته‏های به‏دست آمده نشان داد که میزان انقباض پایه در دامنه 28 تا 87 ضربان در دقیقه بوده که به‏ترتیب در روزهای 2+2 و 8+2 ‏مشاهده گردید. علاوه بر این مشخص شد که تعداد ضربان در این گروه نسبت به سایر گروه‏ها بیشتر بود که دال بر وجود کانال های کلسیمی نوع L وابسته به ولتاژ (Ica) در کاردیومیوسیت‏های مشتق شده است. نتایج مشابهی در این زمینه وجود دارد مبنی بر اینکه در حضور ایزوپرنالین کاردیومیوسیت های ضربان‏دار مشاهده می‏شود (26). کاردیومیوسیت‏های تمایز یافته دارای الگوی انقباضی پیوسته می‏باشند که به برخی از مولکول‏های چسبنده نظیر N-cadherin، پروتئین‏های اتصالات شکافدار مثل کانکسین 43 و یون کلسیم وابسته است. یکی از دلایل احتمالی در افزایش بیشتر ضربان در گروه Aza+DM نسبت به سایر گروه‏ها به‏حضور DMSO در محیط القایی بر می‏گردد به‏طوری‏که DMSO سبب آزاد شدن ناگهانی یون کلسیم از ذخایر داخل سلولی می‏شود (21). علاوه بر این -Azacytidin5 نیز با ایجاد کمپلکس‏های پایدار سبب دمتیله شدن DNA می‏شود و بدین ترتیب در روند کاردیومیوژنریس نقش دارد  هر چند تمایز سلول‏ها P19 به کاردیومیوسیت‏ها به‏مدت زمان القا و غلظت بستگی دارد. در همین ارتباط مطالعات نشان می‏دهند که اضافه کردن -Azacytidin5 منجر به افزایش بیان ژن‏های زنجیره سنگین میوزین شود که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد (27-29). حتی وجود سرم در محیط کشت بر روی تمایز کاردیومیوسیت‏ها تاثیر می‏گذارد به‏طوری‏که حذف سرم سبب افزایش تعداد نواحی ضربان‏دار در اجسام شبه جنینی می‏گردد (7).

 نتیجه گیری

با توجه به مشاهدات انجام شده در این تحقیق و مقایسه آن با سایر مطالعات می‏توان نتیجه گرفت که سلول‏های کارسینومای P19 یکی از بهترین رده‏ها جهت تمایز کاردیومیوسیت‏ها می‏باشند. به‏طوری‏که کاربرد هم‏زمان ترکیبات DMSO و 5-Azacytidin موجب بهینه سازی محیط کشت تمایزی کاردیومیوسیت‏ها از سلول‏های P19 می‏گردد.

مراجع
1. Rosenstrauch D, Poglajen G, Zidar N, Gregoric ID. Stem cell therapy for ischemic heart failure. Texas Heart Institute Journal. 2005; 32(3): 339-347.
2. Wang J-S, Shum-Tim D, Galipeau J, Chedrawy E, et al. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery 2000; 120(5): 999-1006.
3. Gepstein L, Ding C, Rehemedula D, Wilson EE, et al. In vivo assessment of the electrophysiological integration and arrhythmogenic risk of myocardial cell transplantation strategies. Stem Cells. 2010; 28(12): 2151-2161.
4. Barbash IM, Chouraqui P, Baron J, Feinberg MS, et al. Systemic delivery of bone marrow–derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation 2003; 108(7): 863-868.
5. McBurney MW, Rogers BJ. Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Developmental biology. 1982; 89: 503-508.
6. Zwi-Dantsis L, Huber I, Habib M, et al. Derivation and cardiomyocyte differentiation  of induced pluripotent stem cells from heart failure patients. European Heart Journal . 2012; 10: 1093.
7. Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1981; 78 (12): 7634-7638..
8. Motamedi  R, Azadbakht M, Fathi F, Amini A, et al. In Vitro  Differentiation of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells into Cardiomyocyte- like Cells. Yakhteh. 2010; 12(3): 387-394.
 
9. Cohen ED, Tian Y, Morrisey EE. Wnt signaling: an essential regulator of cardiovascular differentiation, morphogenesis and progenitor self-renewal. Development. 2008; 135(5): 789-798.
10. Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, Konishi F, et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. Journal of Clinical Investigation 1999; 103(5): 697-705.
11. Shim WS, Jiang S, Wong P, Tan J, et al. Ex vivo differentiation of human adult bone marrow stem cells into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and biophysical research communications 2004; 324(2): 481-488.
12. Oh H, Bradfute SB, Gallardo TD, Nakamura T, et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences 2003; 100: 12313-12318.
13. Wang HS, Hung SC, Peng ST, Huang CC, et al. Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord. Stem Cells 2004; 22(7): 1330-1337.
14. Hamidabadi HG, Pasbakhsh P, Amidi F, Soleimani M, et al. Functional Concentrations of BMP4 on Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells to Primordial Germ Cells. IJFS. 2011; 5: 104-109.
15. Martin‐Rendon E, Sweeney D, Lu F, Girdlestone J, et al. 5‐Azacytidine‐treated human mesenchymal stem/progenitor cells derived from umbilical cord, cord blood and bone marrow do not generate cardiomyocytes in vitro at high frequencies. Vox sanguinis. 2008; 95: 137-148.
16. Dambrot C, Passier R, Atsma D, Mummery C. Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models. Biochem J. 2011; 434(1): 25-35.
17. Baharvand H, Azarnia M, Parivar K, Ashtiani SK. The effect of extracellular matrix on embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J mol and cell cardiol. 2005; 38(3): 495-503.
18. Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M, Segev H, et al.  Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation 2001; 108: 407-414.
19. Huber I, Itzhaki I, Caspi O, Arbel G, et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. The FASEB Journal 2007; 21: 2551-2563.
20. Antonitsis P, Ioannidou-Papagiannaki E, Kaidoglou A, Papakonstantinou C. In vitro cardiomyogenic differentiation of adult human bone marrow mesenchymal stem cells the role of 5-azacytidine. Interactive cardiovascular and thoracic surgery. 2007;  6(5): 593-597.
21. Balana B, Nicoletti C, Zahanich I, Graf EM, et al. 5-Azacytidine induces changes in electrophysiological properties of human mesenchymal stem cells. Cell Research. 2006; 16: 949-960.
22. Marvin MJ, Di Rocco G, Gardiner A, Bush SM, et al. Inhibition of Wnt activity induces heart formation from posterior mesoderm. Genes & development. 2001; 15: 316-327.
23. Tzahor E, Lassar AB. Wnt signals from the neural tube block ectopic cardiogenesis. Genes & development. 2001; 15: 255-260.
24. Klug MG, Soonpaa MH, Koh GY, Field LJ. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. Journal of Clinical Investigation. 1996; 98(1): 216-224.
25. Segev H, Kenyagin‐Karsenti D, Fishman B, Gerecht‐Nir S, et al. Molecular analysis of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Development, growth & differentiation 2005; 47(5): 295-306.
26. Xu W, Zhang X, Qian H, Zhu W, et al. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro. Experimental Biology and Medicine. 2004; 229: 623-631.
27. Cai C-L, Liang X, Shi Y, Chu P-H, et al. Isl1 identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental cell. 2003; 5: 877-889.
28. Xu C, Police S, Rao N, Carpenter MK. Characterization and enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Circulation research. 2002; 91(6): 501-508.
29. Snir M, Kehat I, Gepstein A, Coleman R, et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 2003; 285(6): H2355-H2363.
 
سلول و بافت
دوره 5، شماره 3 - شماره پیاپی 3
مهر 1393
صفحه 317-324
فایل ها
سابقه مقاله
  • تاریخ دریافت: 09 مهر 1393
  • تاریخ پذیرش: 09 مهر 1393
هم رسانی
ارجاع به این مقاله
آمار