مقدمه

فعالیت سیستم تولید مثلی تحت کنترل مرکزی محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- گنادی (HPG) قرار دارد و توسط برهم کنش مجموعه‌ی پیچیده­ای از پپتیدهای مرکزی و محیطی تنظیم می­شود. از بین نوروپپتیدهای مرکزی موثر بر فعالیت محور تولید مثلی می‏توان به ارکسین اشاره کرد. ارکسین A پپتید هیپوتالاموسی با 33 اسید آمینه است که به‏طور عمده در هیپوتالاموس جانبی و نواحی مجاور آن سنتز شده و از طریق اتصال به گیرنده شماره 1 ارکسین (OX1R)  در تنظیم دریافت غذا و تعدیل فعالیت محور هیپوتالاموس-‌‌ هیپوفیز- گنادی و ترشح گنادوتروپین ها نقش ایفا می­کند (4-1). تحقیقات نشان داده است که ارکسین در سرکوب عمل‏کردهای تولید مثلی نقش دارد و سبب کاهش آزادسازی هورمون­های جنسی می­شود (5 و ‌6). پروتئین موسوم به گیرنده بنزودیازپینی محیطی (PBR) که امروزه به پروتئین ترانسلوکاتور (TSPO) معروف است پروتئینی 18 کیلو دالتونی است که به‏طور عمده در غشای خارجی میتوکندری یافت می­شود. پروتئین TSPO به‏طور عمده در غشای میتوکندریایی بافت­های استروئیدوژنز نظیر تخمدان­ها، بیضه­ها و سایر بافت­ها بیان می‏شود و در انتقال کلسترول به‏داخل میتوکندری سلول­های سازنده استروئیدها نقش مهمی ایفا می­کند (9-7). تحقیقات پیشین نشان داده­اند که در فولیکول‏های در حال تکوین، TSPO سلول‏های گرانولوزا تحت تحریک FSH بیان می‏شود. همچنان که بلوغ فولیکولی پیشرفت می‏کند سلول‏های گرانولوزا گیرنده LH را بیان می‏کنند و فعالیتTSPO  تحت تحریک هر دو هورمونLH  و FSH افزایش می‏یابد (10 و 11). همچنین مشخص شده است که تیمار موش‏های صحرایی ماده با آندروژن پس از تولد منجر به افزایش بسیار سطوح فعالیت TSPO در تخمدان شده و در نتیجه سیکل تولید مثلی و رفتار تولیدمثلی جنس ماده را مختل می‏کند و باعث عدم تخمک‏گذاری، عدم رهاسازی سرژ (اوج رهایش هورمون)LH ، کاهش پاسخ‏دهی هیپوفیز به GnRH و نازایی می‏شود (12 و 13). یافته‏ها ثابت کرده­اند که توزیع نورون­های­ارکسین با نورون‏های تولید کنندهGnRH  در ناحیه برجستگی میانی و هسته آرکوئت (ARC) هم‏پوشانی داشته و ارکسین در مهار آزادسازی هورمون‌هایGnRH، LH و FSH دخالت دارد (14). هورمون­های LH و FSH هر دو در کنترل بیان پروتئین TSPO نقش دارند و هر عامل تغییردهنده ترشح هورمون­های FSH و LH ممکن است در کاهش فعالیت استروئیدوژنز نقش داشته باشد. از آنجا که ارکسین در تنظیم فعالیت محور تولیدمثلی نقش داشته و تاکنون گزارشی درباره اثرات ارکسین بر میزان بیان ژن­های دخیل در استروئیدوژنز در هیچ یک از گونه­های جانوری آندروژنه وجود ندارد در این مطالعه، اثرات تزریق مرکزی ارکسینA  بر میزان بیان ژن TSPO در تخمدان موش­های ماده بالغ آندروژنه بررسی می­شود تا مشخص شود که پپتیدهای مهارکننده آزادسازی GnRH/LH و FSH در تنظیم بیان ژن­های دخیل در استروئیدوژنز که در چرخه جنسی موجود ماده و امر تولید مثل موثرند؛ نقش داشته باشند.

مواد و روش­ها

آزمایش انجام شده یک مطالعه تجربی است و در آن تمام اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی مصوب انجمن آمریکایی SPCA (Society for the Prevention of Cruelty to Animals) در سال 2006، رعایت شده است.

واحدهای آزمایشی: موش‏های صحرایی ماده تازه متولد شده      (24سر) از نژاد ویستار (Wistar) (تهیه شده از مرکز تحقیقات علوم اعصاب دانشگاه شهید بهشتی) 50 میکروگرم تستوسترون پروپیونات (Sigma, USA) (15) را در حجم 100 میکرولیتر روغن زیتون (16) در روز سوم بعد از تولد از طریق زیر پوستی دریافت کردند. شش سر موش صحرایی نیز با تزریق روغن زیتون به‏عنوان گروه کنترل انتخاب شدند. حیوانات در شرایط استاندارد (دمای 2±22 و چرخه 12 ساعت روشنایی/ تاریکی با شروع روشنایی در ساعت 7 صبح) نگه‏داری شدند و در تمام مدت آزمایش دسترسی آزاد به آب و غذا داشتند.

کانول گذاری داخل بطنی و عمل تزریق: حیوانات بعد از بلوغ در محدوده وزنی 180 تا 220 گرم،  با تزریق داخل صفاقی مخلوطی از کتامین و زایلزین ((Alfasan Company, Holand به‏ترتیب به مقدار (80 میلی گرم به‏ازای هر کیلوگرم وزن بدن) و (10میلی گرم به ازای هر کیلو گرم وزن بدن) (Alfasan-Holland) بی‏هوش شدند. کانول ساخته شده از سرسرنگ تزریقی gauge 22 با استفاده از دستگاه استریوتاکسیک (Stoelting U.S.A.) و با کمک دو عدد پیچ عینک و سیمان دندانپزشکی در سطح جمجمه تثبیت شد. بر اساس اطلس واتسون و پاکسینوس، میله مربوط به دندان پیشین فوقانی، 3/3 میلی‏متر پایین تر از خط مربوط به میله‏های گوشی و نوک کانول در مختصات بطن سوم (5/6=DV،0/0=ML،3/2=AP) قرار گرفت. حیوانات بعد از جراحی به قفس­های انفرادی برگردانده شدند و به آن‏ها  یک هفته اجازه بهبودی داده شد. پس از یک هفته دوره بهبودی 24 سرموش صحرایی درچهارگروه (در هر گروه 6=n) به‏ترتیب تزریق درون بطن سوم مغزی سالین یا مقادیر مختلف ارکسین (2، 4 یا 8 میکروگرم) را در حجم چهار میکرولیتر با استفاده از سرسرنگ دندانپزشکی gauge 27 که از طریق لوله رابط پلی اتیلنی به سرنگ هامیلتون 5 میکرولیتر وصل شده بود در ساعت 10تا 12 صبح دریافت کردند. پپتید ارکسین (Anaspec Co, USA) در آب مقطر حل شد. همچنین برای حصول اطمینان از اینکه ارکسین وارد بطن سوم شده است تصاویر بطن سوم مغز بعد از کانول گذاری و برش گیری با مختصات و تصویر بطن سوم مغز از اطلس Paxinos & Watson انطباق داده شد. شش سر موش صحرایی گروه کنترل نیز بعد از بلوغ در محدوده وزنی 180 تا 220 گرم چهار میکرولیتر سالین را از طریق تزریق درون بطن سوم مغزی دریافت کردند. بعد از دریافت مواد مورد نظر حیوانات بی‏هوش شدند و تخمدان‏ها به‏صورت دو طرفه خارج و  بلافاصله در نیتروژن مایع فریز و در دمای 80- درجه سانتی‏گراد تا زمان استخراج RNA نگه‏داری شدند.

مرحله استخراج RNA: نمونه‏های تخمدانی با استفاده از pureZol و دستگاه هموژنایزر هوموژن شدند. RNA کل نمونه‏ها با استفاده از کلروفرم، ایزوپروپانول و اتانول 75 درصد طبق دستورالعمل کیت (PureZol (Bio  Rad Co, U.S.A استخراج شد. رسوب RNA استخراج شده در آب DEPC (تهیه شده از شرکت سیناژن، ایران) حل شد و تا زمان سنتز cDNA در فریزر 20- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری گردید. غلظت RNA با خواندن میزان جذب RNA در 260 نانومتر تعیین شد. همچنین، میزان خلوص RNA با خواندن میزان جذب در 280 نانومتر و براساس نسبت جذب280A/260A محاسبه گردید.

مرحله سنتز cDNA و واکنش زنجیره ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس RT- PCR)): cDNA تک رشته‏ای با استفاده از 5 میکروگرم از RNA مطلق، پرایمر پلی‏تیمین، آنزیم DNA پلیمراز وابسته به RNA و کیت سنتز cDNA  (vivantis Co, Malaysia)   طبق دستورالعمل کیت به‏وسیله دستگاه ترمال سایکلر (Bio RAD Co, U.S.A) سنتز شد. از آنجا که ژن خانه­دار β- اکتین به‏طور پیوسته در بافت‏های مختلف از جمله تخمدان سنتز می‏شود. تعیین سطح mRNA آن توسط روش RT- PCR نیمه کمی برای نرمال کردن نمونه‏های mRNA TSPO استفاده شد. برای انجام PCR  نمونه‏های cDNA برای 35 چرخه (94 درجه سانتی‏گراد برای 30 ثانیه، 58 درجه سانتی‏گراد برای 30 ثانیه و 72 درجه سانتی‏گراد برای30 ثانیه) در حجم نهایی µl 50  (cDNA template (2µl), 10× PCR buffer (5µl), 50 mM MgCl2(1.5µl), 10mM dNTP Mix(1µl), 100µM of sense and antisense    primers (1µl of each one) and 1.25 U Taq DNA Polymerase (0.25 sterile water(38.25µl) بر حسب دستورالعمل کیتPCR  ( (Bio RAD, Co. U.S.A و با استفاده از دستگاه ترمال سایکلر (Bio RAD, Co. U.S.A)  تشدید ژنی شدند. توالی‏های الیگونوکلئوتیدی ویژه برای پرایمرهای سنس و آنتی سنس استفاده شده برای ژن β- اکتین به ترتیب برابر با 5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′ و5′-   GCTAGAAGCATTTGCGGTGGA -3′  و برای TSPO به‏ترتیب برابر با5′- AAGAGCTGGGAGGTTTCACA -3′  و 5′- CCAGGCCAGGTAAGGATACA -3′ است (17 و 18). محصولات β- اکتین و TSPO حاصل از تکثیر ژنی به‏ترتیب 511 و 223 جفت بازی هستند. محصولات PCR توسط الکتروفورز ژل آگارز 5/1 درصد آنالیز شدند. تراکم باندها با رنگ آمیزی safe view نمایان شده و توسط نرم افزار  ImageJکمی شدند.

تجزیه و تحلیل آماری: نتایج حاصل به‏صورت میانگین±انحراف معیار ارائه شدند. داده‏ها با استفاده از آزمون T- testجفت نشده، آزمون ANOVA یک‏طرفه و نرم افزار  SPSS آنالیز شدند. مقایسه میانگین داده‏ها با آزمون توکی بررسی شد. در تمام آنالیزهای آماری انجام شده نتایج با 05/0P<  معنی‏دار گزارش شدند.

نتایج

فراوانی سطح mRNA‌‌‌ TSPO در تخمدان موش­های صحرایی آندروژنه شده نسبت به موش­های صحرایی کنترل به‏طور معنی‫داری افزایش یافت (شکلA1). سطح  mRNA β-اکتین (که به‏عنوان کنترل داخلی استفاده شده است) به‏میزان نسبتا بالا و سطح یکسانی در تخمدان موش­های صحرایی آندروژنه شده و کنترل مشاهده شد (شکلA1). شکل 1، B آنالیز نیمه کمی تراکم باندهای حاصل از نرم افزار ImageJ (میانگین داده‏های به‏دست آمده از 5 موش صحرایی در هر گروه) را نشان می‏دهد.

اگر چه نتایج نشان داده شده در شکل B1 تخمین‏های نسبی را نشان می‏دهند ولی همان‏طور که در شکل 1، B ملاحظه می‏شود سطح mRNA TSPO در تخمدان موش­های صحرایی آندروژنه شده نسبت به موش­های صحرایی کنترل به‏طور معنی‏داری بالاتر است (شکلB1).

A                  

 B                                    

شکل 1: فراوانی سطح mRNATSPO در تخمدان مو­ش­های صحرایی آندروژنه شده نسبت به مو­ش­های صحراییکنترل. (A الکتروفورز ژل آگارز برای ژن های β-اکتین و TSPO تشدید شده توسط روش نیمه کمی RT-PCR را نشان می‏دهد. B) میانگین سطح TSPO در هر گروه (6=n) را نشان می‏دهد که توسط نرم افزار ImageJ کمی شده است. cDNA تشدید شده ازβ mRNA -اکتین برای نرمال کردن نتایج  TSPOاستفاده شده است. نتایج به‏صورت واحدهای اختیاریارائه شده است (05/0p<). * نشان دهنده افزایش معنی‏دار سطح mRNATSPO در تخمدان مو­ش­های صحرایی آندروژنه شده نسبت به مو­ش­های صحراییکنترل در سطح احتمال (05/0p<).                                                                                                    

همچنین نتایج حاصل از آنالیز داده ها نشان داد که فراوانی سطح mRNA TSPO در تخمدان موش‏های صحرایی آندروژنه تحت تیمار با مقادیر 2 و 4 و 8 میکروگرم ارکسین A در مقایسه با موش­های صحرایی گروه کنترل آندروژنه به‏ترتیب به‏میزان 42، 60 و 70 درصد کاهش یافت و این میزان کاهش در هر سه گروه در مقایسه با گروه کنترل آندروژنه از نظر آماری معنی­دار است (شکلA2). سطح mRNA β-اکتین (که به‏عنوان کنترل داخلی استفاده شده است) به‏میزان نسبتا بالا و سطح یکسانی در تخمدان موش­های صحرایی تیمار شده  با مقادیر مختلف ارکسین و موش­های صحرایی گروه کنترل آندروژنه مشاهده شد

(شکلA2). شکل B2 آنالیز نیمه کمی تراکم باندهای حاصل از نرم افزار ImageJ (میانگین داده‏های به‏دست آمده از 5 موش صحرایی در هر گروه) را نشان می‏دهد. همان‏طور که از نمودار مشخص است میانگین بیان ژن TSPO در گروه­های دریافت‏کننده مقادیر 2، 4 یا و 8 میکروگرم ارکسین A در مقایسه با موش­های صحرایی گروه کنترل آندروژنه به‏طور معنی­داری پایین­تر است (شکل B2).

A                                                       

                                  B

شکل 2 :فراوانی سطح mRNA TSPOدر تخمدان موش‏های صحرایی آندروژنه تحت تیمار با مقادیر2، 4 یا 8 میکروگرمارکسینA. A) الکتروفورز ژل آگارز برای ژن‏های β-اکتین و  TSPO تکثیر شده توسط روش نیمه کمی  RT-PCRرا نشان می‏دهد. B) میانگین سطح TSPO در هر گروه (6=n) را نشان می‏دهد که توسط نرم افزار ImageJ کمی شده است. cDNA تشدید شده از mRNAβ-اکتین برای نرمال کردن نتایج TSPO استفاده شده است. نتایج به‏صورت واحدهای اختیاری ارائه شده است (05/0p<). * نشان دهنده کاهش معنی‏دار سطح mRNA TSPOدر تخمدان موش‏های صحرایی آندروژنه تحت تیمار با مقادیر2، 4 یا 8 میکروگرمارکسینA نسبت به مو­ش­های صحراییکنترل آندروژنه در سطح احتمال (05/0p<).