نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم باغبانی، صندوق پستی 31587، کرج، ایران
2 دانشگاه اراک، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم باغبانی، صندوق پستی 3815688349، اراک، ایران
چکیده
هدف: هدف از این تحقیق شناسایی نشانگرهای مولکولی RAPD و ISSR مرتبط با صفات ریختشناسی مهم میوه در فندق (Corylus avellana) بود. مواد و روش‌ها: در این مطالعه، رابطه بین نشانگرهای ISSR و RAPD با صفات مهم میوه (ابعاد و وزن نات و مغز) در 35 ژنوتیپ فندق از طریق آنالیز رگرسیونی چندمتغیره (MRA) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: برخی از قطعات چندشکل ISSR و RAPD با صفات مورد مطالعه میوه فندق ارتباط و همبستگی نشان دادند. برخی از این نشانگرهای آگاهیبخش با بیش از یک صفت ارتباط نشان دادند که میتواند ناشی از اثرات پلیوتروپیک QTL های مرتبط با هم در صفات مختلف باشد. بهعنوان مثال، برخی از نشانگرهای آگاهی بخش با دو صفت طول نات و طول مغز همبستگی معنیدار نشان دادند که بیانکننده همبستگی مثبت این دو صفت با همدیگر میباشد. همچنین برخی از این نشانگرها با طول و وزن نات و وزن مغز و برخی دیگر با هر دو صفت وزن و طول مغز رابطه نشان دادند. نتیجه‌گیری: نشانگرهای آگاهیبخش شناسایی شده در این مطالعه میتوانند در انتخاب والدین مناسب برای تولید جمعیت جهت نقشهیابی بهکار روند. همچنین برای انتخاب ژنوتیپهای برتر بهخصوص وقتی که اطلاعاتی از پایه ژنتیکی آنها مانند نقشه لینکاژی در دسترس نیست مفید باشد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Study of association between molecular markers and fruit traits in hazelnut using multivariate regression analysis
نویسندگان [English]
- M M 1
- MR F 1
- Z Z 1
- A Kh 2
چکیده [English]
Aim: This study was carried out to evaluate association of ISSR and RAPD markers with fruit traits of hazelnut (Corylus avellana). Material and Methods: In this research, associations between ISSR and RAPD markers with fruit traits were investigated in 35 genotypes of hazelnut by applying multiple regression analysis (MRA). Results: Some ISSR and RAPD fragments were found to be associated with seven of affecting fruit traits. Some of ISSR and RAPD markers were associated with more than one fruit trait in multiple regression analysis. Such an association may arise due to pleiotropic effect of the linked quantitative trait locus (QTL) on different traits. For example, some informative markers were associated with both nut length and kernel weight traits. Also, some informative markers showed association with all nut length and weight and kernel weight. Also, some markers had correlation with both kernel length and weight, indicating a significant correlation among these traits. Conclusion: It is possible to use these markers along with morphological traits in hazelnut breeding programs for identification of suitable parents to produce mapping populations and hybrid cultivars. Also, these results could be useful in marker-assisted breeding programs when no other genetic information is available.
کلیدواژه‌ها [English]
- Fruit characters
- Hazelnut
- Molecular markers
- Regression Analysis
مقدمه
گونه فندق (Corylus avellana) از خانواده Betulaceae
میباشد. جنس Corylus دارای 25 گونه بوده که تنها نُه گونه آن از نظر اقتصادی و بهنژادی اهمیت دارند. اکثر گونههای فندق بهصورت درختچه بوده و بهندرت به صورت درختی دیده
میشوند. تاریخچه کشت آن به 5000 تا6000 سال قبل از میلاد برمیگردد. در اروپا، فندق از پوششهای گیاهی غالب بوده ولی منشا دقیق آن مشخص نشده است. از نظر جغرافیایی دامنه پراکنش آن بسیار وسیع بوده و از سواحل پرتغال، ایرلند، جزایر آرکنیتا و قسمت غربی کوههای اورال و گسترش شمالی آن از نروژ تا روسیه میباشد ولی مناطق عمده کشت فندق در نزدیکی حوزههای بزرگ آبی که دارای زمستان های ملایم و تابستانهای خنک میباشند، قرار دارد (1). مناطق عمده کشت فندق ترکیه، ایتالیا، اسپانیا و آمریکا میباشند که این کشورها از نظر تولید فندق در رتبههای برتر جهان قرار دارند (1). با وجود این که تنوع ژنتیکی فندق در ایران بالا میباشد، لیکن منشا اصلی آن در ایران چندان روشن نمیباشد. هر چند رویشگاه اصلی آن در منطقه حیران تا دیناچال در استان گیلان قرار دارد ولی مناطق عمده فندقکاری در ایران به حاشیه دریای خزر و نواحی کوهستانی محدود میشود. هنوز مجموعه جامع و کاملی مبنی بر جمعآوری ارقام و ژنوتیپهای فندق در ایران تاسیس نشده است. ایران با تولید بالغ بر 14 هزار تن میوه فندق در رتبه هشتم دنیا قرار گرفته است ولی میتواند با اقدامات بهنژادی و بهزراعی به یکی از کشورهای عمده تولیدکننده فندق تبدیل شود. استان گیلان با بیش از 12 هزار تن تولید فندق در صدر قرار دارد و پس از آن استانهای قزوین با 1780 تن، مازندران با 1320 تن و اردبیل با 500 تن قرار دارند. عملکرد فندق در ایران پایین بوده و به حداکثر یک تن در هکتار میرسد، در حالیکه در کشورهای اصلی تولیدکننده این مقدار 5/4 تا 5 تن در هکتار میباشد (2).
در طی سالهای گذشته نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA بهطور گستردهای برای اهداف مختلف در گیاهان مورد استفاده قرار گرفتهاند (3). پیشرفت دائمی در بهبود اصلاح گونههای گیاهی به تنوع ژنتیکی گیاهان بستگی دارد. بنابراین شناسایی و مدیریت این تنوع برای برنامههای اصلاحی لازم میباشد. بهعلاوه، آگاهی از تنوع ژنتیکی مدیریت حفاظت از ژرمپلاسم گیاهی را راحتتر مینماید. اگر چه نقشهیابی بر پایه مکانهای صفات کمی (Quantitative trait loci, QTL) برای ردیابی ژنهای وابسته به این صفات مناسب میباشد اما این عمل
وقتگیر و پرزحمت میباشد (4). برای غلبه بر این محدودیتها، شناسایی نشانگرهای وابسته به صفت از طریق رگرسیون مناسب بهنظر میرسد. آنالیز رگرسیونی چندمتغیره (Multiple regression analysis, MRA) بر پایه رابطه بین نشانگرهای مولکولی (بهعنوان متغیر مستقل) و صفات ریختشناسی (بهعنوان متغیر وابسته) روش مناسبی برای شناسایی نشانگرهای وابسته به صفت میباشد. این آنالیز ضریب تبیین (R2) را تعیین میکند که این ضریب میزان رابطه صفت ریختشناسی را با نشانگر مولکولی نشان میدهد (5).
در دسترس بودن تعداد زیادی از نشانگرهای مولکولی و صفات ریختشناسی میتواند به مطالعه آنالیز رگرسیونی بین این نشانگرها و صفات ریختشناسی کمک نماید. اکثر مطالعات تجزیه ارتباطی مبتنی بر پیوستگی، امکان ردیابی نشانگرهای مختلف مرتبط با صفات ریختشناسی را مقدور نموده است، ولی اغلب بهدلیل فاصله زیاد بین نشانگر و صفت ریختشناسی، انتخاب با کمک نشانگر همراه و همچنین جداسازی و
همسانهسازی ژن مورد نظر را مشکل ساخته است و بهعلاوه فقط از تعداد کمی ژنوتیپ بهعنوان والد برای نقشهیابی ژنها استفاده شده است. در سالهای اخیر برای فائق آمدن بر این مشکل از آنالیز رگرسیونی بین نشانگرها و صفات ریختشناسی استفاده شده است که نه تنها نقشهیابی ژنها را با درجه اطمینان بالاتری ممکن میسازد، بلکه شناسایی نشانگرهایی که در نقشهیابی مبتنی بر لینکاژ قابل ردیابی نبودند را مقدور میسازد (3، 6 و 7).
استفاده از نشانگرهای مولکولی در تعیین نشانگرهای وابسته به صفت در برخی از گیاهان استفاده شده است و نتایج خوبی نیز گزارش شده است. بهعنوان مثال رابطه بین دادههای حاصل از تکنیکهای مولکولی مختلف با صفات بیوشیمیایی در گونههای جنس Morus (8) و گونه Valeriana jatamansi (9) بررسی شده است. همچنین رابطه این نشانگرها با صفات ریختشناسی در گونههایی مانند کتان (10 و 11)، گندم (12)، ذرت (13)، Morus laevigata (14)، انار (15) و گیلاس (16) بررسی شده است. تکنیک RAPD (Random amplified polymorphic DNA) بر مبنای تکثیر قطعات تصادفی DNA انجام میشود و نیازی به آگاهی و اطلاع از توالی DNA الگو ندارد. از مزایای دیگر این تکنیک میتوان به هزینه کم، سادگی، سرعت بالا و نیاز به مقدار کم DNA اشاره کرد (14). بهعلاوه، تکنیک ISSR (Inter simple sequence repeat) شامل کاربرد توالی ریزماهواره بهعنوان پرایمر در واکنش زنجیرهای پلیمراز بهمنظور تکثیر نشانگرهای چندآللی میباشد. این تکنیک روشی ساده، سریع و سودمند بوده و قابلیت تکرارپذیری بالایی دارد (16).
نتایج تحقیقات بینالمللی بیانگر تنوع وسیع ژرم پلاسم فندق از نظر خصوصیات کمی و کیفی میباشد (2، 17، 18 و 19). ایران نیز دارای تنوع بالایی از فندق میباشد ولی تاکنون رابطه رگرسیونی صفات ریختشناسی با نشانگرهای مولکولی برای این گونه بررسی نشده است. بنابراین، هدف از این تحقیق شناسایی نشانگرهای RAPD و ISSR مرتبط با صفات ریختشناسی مهم میوه در 35 ژنوتیپ فندق با استفاده از آنالیز رگرسیونی چندمتغیره (MRA) میباشد. نتیجه این مطالعه به شناسایی ژنهای مسئول بروز صفات مهم کمک مینماید که میتواند در برنامههای اصلاحی بهکار رود.
مواد و روش‌ها
مواد گیاهی مورد آزمایش و ارزیابیهای ریختشناسی: در این مطالعه 35 رقم و ژنوتیپ فندق (29 ژنوتیپ ایرانی و شش رقم خارجی) مورد مطالعه قرار گرفتند (جدول 1). اکثر ژنوتیپهای ایرانی در مناطق فندقکاری ایران مانند استانهای اردبیل و گلستان مورد استفاده قرار میگیرند. این ژنوتیپها از نظر ویژگیهای مهم گل (زمان باز شدن گل نر و ماده، طول شاتون و مقدار دانه گرده) و میوه (طول، عرض، وزن و شکل نات، طول، عرض، وزن، رنگ و شکل مغز) تفاوتهای بارزی با یکدیگر دارند. این درختان هشتساله و در مراحل باردهی کامل بودند. برداشت میوهها به شکل تصادفی از قسمتهای مختلف درختان صورت گرفت. صفات مورد ارزیابی شامل صفات مربوط به نات (طول، عرض و وزن) و صفات مربوط به مغز (طول، عرض، وزن و درصد) بود. ارزیابی صفات در طی دو سال روی 50 عدد میوه از هر ژنوتیپ انجام شد. صفات مربوط به ابعاد نات و مغز با استفاده از کولیس دیجیتالی اندازهگیری شدند. همچنین اندازهگیری صفات مربوط به وزن نات و مغز با استفاده از ترازوی الکترونیکی (Lutron, GM-500) با دقت یکصدم گرم انجام گرفت (جدول 1). مقایسه میانگینها با استفاده از نرمافزار SAS و آزمون دانکن انجام شد.
مطالعات مولکولی: استخراج DNA از نمونه های برگی بالغ و تازه با استفاده از روش Doyle و Doyle (20) صورت گرفت. کمیت و کیفیت DNA بهدست آمده با استفاده از روش اسپکتروفتومتری در طول موجهای 260 و 280 نانومتر و الکتروفورز DNA در ژل آگارز با غلظت یک درصد مشخص گردید و به کمک آنها غلظت یکسان از DNA (5 نانوگرم در میکرولیتر) آماده شد. برای رقیق سازی از آب مقطر دوبار تقطیر استریل استفاده شد. واکنش PCR برای تکنیک RAPD بر اساس روش تشریح شده توسطKhadivi-Khub و همکاران (21) صورت گرفت و این واکنش برای تکنیک ISSR بر اساس روش بکار برده شده توسطThimmappaiah و همکاران (22) انجام شد. برای هر مخلوط واکنش، مقدار یک میکرولیتر از DNA تهیه شده با غلظت 5 نانوگرم بر میلیلیتر به 24 میکرولیتر از مخلوط واکنش PCR شامل dNTPS، PCR buffer، Taq DNA polymerase، primer و MgCl2 (شرکت سیناژن، ایران) و آب دوبار تقطیر استریل اضافه گردید که در نهایت حجم محلول واکنش PCR به 25 میکرولیتر رسید و مخلوط حاصله تحت واکنش زنجیرهای پلیمراز در دستگاه ترمال سایکلر Bio-Rad مدل I-Cycler قرار گرفت. برای تکنیک ISSR، واکنش زنجیرهای پلیمراز با واسرشتسازی اولیه DNA ژنومی در دمای 94 درجه سانتیگراد بهمدت چهار دقیقه آغاز و با 35 چرخه شامل دمای 92 درجه سانتیگراد بهمدت یک دقیقه برای واسرشتسازی، اتصال پرایمرها به رشته الگو به مدت 50 ثانیه (دمای اتصال پرایمرها از 48 تا 57 درجه سانتیگراد متناسب با پرایمر متغیر بود)، گسترش (بسط) رشته جدید بهمدت یک دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد و گسترش نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد بهمدت 10 دقیقه دنبال شد. برای تکنیک RAPD، چرخههای حرارتی شامل 94 درجه سانتیگراد بهمدت چهار دقیقه برای واسرشتسازی اولیه، تعداد 35 چرخه با دمای 92 درجه سانتیگراد بهمدت یک دقیقه برای واسرشتسازی، دمای اتصال 37 درجه سانتیگراد بهمدت یک دقیقه و دمای تکثیر قطعات 72 درجه سانتیگراد بهمدت دو دقیقه و در نهایت یک چرخه دمایی 72 درجه سانتیگراد بهمدت پنج دقیقه برای تکمیل بسط بود. الکتروفورز محصول PCR در ژل آگاروز با غلظت 5/1 درصد مورد بررسی قرار گرفت.
جدول 1: میانگین صفات میوه در ژنوتیپهای فندق مورد مطالعه
|
درصد مغز (%) |
وزن مغز (g) |
عرض مغز (mm) |
طول مغز (mm) |
وزن نات (g) |
عرض نات (mm) |
طول نات (mm) |
منشاء |
ژنوتیپ یا رقم |
|
15/32 |
33/0 |
95/8 |
42/8 |
93/0 |
15/15 |
93/13 |
آذربایجان شرقی |
فندقلو1 |
|
75/18 |
40/0 |
66/13 |
97/5 |
90/0 |
03/13 |
14/20 |
آذربایجان شرقی |
فندقلو2 |
|
64/13 |
31/0 |
80/8 |
20/9 |
93/0 |
50/17 |
88/15 |
آذربایجان شرقی |
فندقلو3 |
|
09/30 |
37/0 |
83/8 |
88/10 |
00/2 |
17 |
34/15 |
اردبیل |
فندقلو4 |
|
78/15 |
26/0 |
85/8 |
25/11 |
95/1 |
52/17 |
51/15 |
اردبیل |
فندقلو5 |
|
28/24 |
42/0 |
36/10 |
59/10 |
37/1 |
78/16 |
45/15 |
اردبیل |
فندقلو6 |
|
15/36 |
30/0 |
65/8 |
70/11 |
90/1 |
20/18 |
93/16 |
اردبیل |
فندقلو7 |
|
33/33 |
20/0 |
74/9 |
04/11 |
40/1 |
41/15 |
74/16 |
آذربایجان شرقی |
کلیبر1 |
|
31/25 |
21/0 |
50/10 |
76/14 |
30/1 |
39/16 |
22/19 |
آذربایجان شرقی |
کلیبر2 |
|
94/17 |
31/0 |
64/8 |
62/10 |
96/0 |
38/15 |
38/15 |
آذربایجان شرقی |
کلیبر3 |
|
83/14 |
25/0 |
03/10 |
58/11 |
58/1 |
43/16 |
28/17 |
آذربایجان شرقی |
کلیبر4 |
|
47/21 |
28/0 |
23/11 |
01/12 |
56/1 |
33/16 |
55/17 |
آذربایجان شرقی |
کلیبر5 |
|
24/24 |
23/0 |
23/11 |
66/14 |
55/1 |
99/15 |
33/18 |
آذربایجان شرقی |
کلیبر6 |
|
07/19 |
32/0 |
13/11 |
21/15 |
49/1 |
65/17 |
87/19 |
آذربایجان شرقی |
کلیبر7 |
|
00/20 |
32/0 |
15/10 |
35/11 |
32/1 |
21/15 |
32/16 |
آذربایجان شرقی |
کلیبر8 |
|
64/69 |
29/0 |
23/10 |
65/11 |
52/1 |
54/16 |
56/17 |
آذربایجان شرقی |
کلیبر9 |
|
17/30 |
32/0 |
90/11 |
39/12 |
60/1 |
65/17 |
99/18 |
آذربایجان شرقی |
کلیبر10 |
|
87/46 |
86/0 |
06/13 |
79/12 |
81/1 |
04/17 |
74/16 |
گیلان |
اشکورات1 |
|
59/45 |
75/0 |
04/12 |
40/12 |
63/1 |
16/16 |
49/16 |
گیلان |
اشکورات2 |
|
15/46 |
90/0 |
60/12 |
53/13 |
92/1 |
62/16 |
47/18 |
گیلان |
اشکورات3 |
|
24/43 |
88/0 |
25/13 |
57/13 |
93/1 |
19/17 |
13/17 |
گیلان |
اشکورات4 |
|
91/45 |
90/0 |
11/13 |
75/13 |
95/1 |
94/16 |
46/17 |
گیلان |
اشکورات5 |
|
42/50 |
96/0 |
40/13 |
10/14 |
22/2 |
52/17 |
06/18 |
گیلان |
اشکورات6 |
|
66/41 |
90/0 |
09/13 |
09/14 |
96/1 |
55/16 |
60/16 |
گیلان |
اشکورات7 |
|
33/83 |
60/0 |
12/10 |
28/14 |
19/1 |
48/13 |
50/17 |
کرج |
دانشکده1 |
|
54/54 |
50/0 |
80/7 |
37/15 |
20/1 |
09/15 |
80/20 |
کرج |
دانشکده2 |
|
54/51 |
00/1 |
31/10 |
82/21 |
20/1 |
99/13 |
33/22 |
کرج |
دانشکده3 |
|
64/13 |
60/0 |
56/12 |
89/18 |
10/1 |
25/14 |
32/20 |
کرج |
دانشکده4 |
|
33/83 |
50/0 |
13/9 |
08/14 |
97/0 |
06/12 |
35/16 |
کرج |
دانشکده5 |
|
35/31 |
17/1 |
04/12 |
31/12 |
68/1 |
14/18 |
36/17 |
اسپانیا |
نگرت |
|
67/40 |
70/0 |
47/11 |
55/14 |
32/2 |
31/18 |
80/20 |
اسپانیا |
مرویله |
|
12/52 |
90/0 |
26/11 |
63/15 |
87/2 |
73/19 |
12/22 |
اسپانیا |
لونگ |
|
45/45 |
72/0 |
47/12 |
38/11 |
77/1 |
68/18 |
15/17 |
اسپانیا |
سگوربه |
|
51/47 |
86/0 |
23/13 |
53/12 |
65/1 |
04/16 |
38/16 |
ایتالیا |
رُند |
|
01/46 |
05/1 |
42/13 |
41/14 |
31/2 |
94/17 |
79/18 |
اسپانیا |
فرتیل |
آنالیز آماری: پس از انجام آزمایشات ISSR و RAPD، برای بررسی چندشکلی ژنتیکی بین ارقام، به حضور یک باند خاص عدد یک و به عدم حضور آن عدد صفر داده شد. اندازه باندهای تکثیر شده بهوسیله نرمافزار کوانتیتی وان (Quantity One) تخمین زده شد. برای هر پرایمر، تعداد کل باندهای تولید شده، تعداد باندهای چندشکل، درصد چندشکلی و قدرت تفکیک یا Rp (Resolving power) محاسبه شد. این ضریب بیانگر میزان کارآیی هر نشانگر برای جداسازی و تفکیک نمونههای مورد مطالعه میباشد. این شاخص بر اساس فرمول زیر محاسبه میشود:
در فرمول بالا Ib میزان آگاهی بخش بودن هر باند یک پرایمر میباشد. این مقدار طبق فرمول بالا برای هر کدام از باندهای تولید شده میتواند بین یک تا صفر متغیر باشد و p نسبتی از ژنوتیپها که دارای باند مورد نظر میباشند، میباشد.
تجزیه رگرسیونی گام به گام (Stepwise) برای ردیابی رابطه بین صفات ریختشناسی مورد آزمایش (بهعنوان متغیرهای وابسته) و نشانگرهای RAPD و ISSR (بهعنوان متغیرهای مستقل) با استفاده از نرم افزار SPSS ver. 16 انجام شد. دو ضریب R2 و β با استفاده از آنالیز رگرسیونی محاسبه شدند و برای نشانگرهای مختلف وابسته به صفات، مورد بررسی قرار گرفتند. R2 ضریب همبستگی توجیه شده چندگانه بوده که برای هر نشانگر محاسبه میشود و نشاندهنده میزان همبستگی نشانگر با صفت ریختشناسی میباشد. همچنین، β ضریب رگرسیون استاندارد شده میباشد که برای هر نشانگر مرتبط به صفت بهوسیله MRA محاسبه میشود (8).
نتایج
صفات ریختشناسی
نتایج آنالیز واریانس (ANOVA) نشان داد که ارقام مورد بررسی از نظر صفات مورد اندازهگیری با یکدیگر تفاوت معنیداری نشان میدهند و بههمین دلیل در مراحل بعدی وارد تجزیه و تحلیل آماری برای تعیین رابطه آنها با نشانگرهای مولکولی گردیدند. صفاتی که دارای ضریب تغییرات بالایی میباشند محدوده وسیعتری از کمیت صفت را دارا بوده که دامنه انتخاب وسیعتری برای آن صفت محسوب میشود.
تکنیک مولکولی ISSR
پس از غربالگری، در مجموع 10 پرایمر ISSR برای انجام واکنش PCR انتخاب شد و برای تمام ژنوتیپها بهکار رفتند. پرایمرهای مورد استفاده در مجموع 150 باند در ژرمپلاسم مورد مطالعه تولید کردند که از این تعداد 140 باند چندشکلی نشان دادند. همچنین میانگین چندشکلی ردیابی شده توسط پرایمرهای مورد استفاده برابر با 14/92 درصد بود که نشاندهنده تنوع ژنتیکی بالا در ژرمپلاسم مورد آزمایش بود (جدول 2).
جدول 2: پرایمرهای ISSR مورد استفاده برای مطالعه ژرمپلاسم فندق مورد مطالعه و خصوصیات آنها
|
قدرت تفکیک (Rp) |
درصد چندشکلی (b/a×100) |
تعداد قطعات چندشکل (b) |
تعداد کل قطعات تکثیر شده (a) |
پرایمر |
|
88/3 |
31/92 |
12 |
13 |
UBC-810 |
|
42/1 |
43/71 |
10 |
14 |
UBC-813 |
|
42/5 |
75/93 |
15 |
16 |
UBC-816 |
|
77/5 |
100 |
20 |
20 |
UBC-849 |
|
77/3 |
100 |
16 |
16 |
UBC-850 |
|
28/6 |
100 |
17 |
17 |
UBC-866 |
|
02/3 |
75 |
9 |
12 |
UBC-868 |
|
97/2 |
100 |
12 |
12 |
UBC-873 |
|
54/7 |
100 |
21 |
21 |
UBC-880 |
|
94/1 |
89/88 |
8 |
9 |
UBC-881 |
|
- |
- |
140 |
150 |
کل |
|
20/4 |
14/92 |
14 |
15 |
میانگین |
اندازه باندهای تشکیل شده از 250 تا 2000 جفت باز متغیر بود. بیشترین باند چندشکل تکثیر شده 21 عدد (برای پرایمر UBC-880) و کمترین آن 8 عدد (برای پرایمر UBC-881) بود. قدرت تفکیک (Rp) پرایمرها نیز در محدوده 42/1 (برای پرایمر UBC-813) تا 54/7 (برای پرایمر UBC-880) بود. میانگین قدرت تفکیک (Rp) برای تمامی پرایمرهای مورد استفاده به مقدار 20/4 بهدست آمد. میزان تشابه بین ژنوتیپها در دامنه 18/0 تا 76/0 بود که نشان دهنده تنوع بالا در ژرمپلاسم مورد مطالعه بود.
آنالیز رگرسیونی چندمتغیره (MRA) بین باندهای چندشکل و صفات ریختشناسی مورد بررسی نشان داد که برخی از نشانگرهای ISSR همبستگی معنیداری با این صفات دارند (جدول 3). بیشترین تعداد نشانگر برای صفت طول مغز (34 نشانگر) و کمترین تعداد نشانگر (12 نشانگر) برای عرض مغز بود. تعداد 31 نشانگر با طول نات همبستگی نشان دادند که 24 نشانگر همبستگی مثبت و 7 نشانگر همبستگی منفی داشتند. مجموع کل R2 توجیه شده توسط آنها 100 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، نشانگر UBC868300 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β بود (β =0.53 و R2 =0.23). همچنین تعداد 14 نشانگر با عرض نات همبستگی نشان دادند که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آنها 99 درصد بود. از این تعداد 12 نشانگر دارای همبستگی مثبت و 2 نشانگر دارای مبستگی منفی با صفت عرض نات بودند. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β مربوط به نشانگر UBC8101720 بود (β =-0.70 و R2 =0.48). بعلاوه، تعداد 32 نشانگر با وزن نات همبستگی نشان دادند که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آنها 100 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، نشانگر UBC8101720 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β بود (β =-0.75 و R2 =0.43).
جدول 3: نتایج حاصل از آنالیز رگرسیونی گام به گام بین باندهای چندشکل نشانگر ISSR با صفات مهم میوه فندق
|
نشانگر دارای بیشترین β |
نشانگر دارای بیشترین R2 |
بیشترین β |
بیشترین R2 توجیه شده (%) |
R2 کل (%) |
تعداد نشانگر آگاهیبخش |
صفت |
|
UBC868300 |
UBC868300 |
53/0 |
23 |
100 |
31 |
طول نات |
|
UBC8101720 |
UBC8101720 |
70/0- |
48 |
99 |
14 |
عرض نات |
|
UBC8101720 |
UBC8101720 |
75/0- |
43 |
100 |
32 |
وزن نات |
|
UBC868300 |
UBC868300 |
94/0 |
25 |
100 |
34 |
طول مغز |
|
UBC810475 |
UBC810475 |
71/0 |
31 |
95 |
12 |
عرض مغز |
|
UBC810735 |
UBC810735 |
78/0- |
24 |
100 |
32 |
وزن مغز |
|
UBC880845 |
UBC8801115 |
64/0- |
33 |
95 |
13 |
درصد مغز |
در مورد صفات مربوط به مغز، تعداد 34 نشانگر با طول مغز همبستگی نشان دادند که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آنها 100 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β مربوط به نشانگر UBC868300 بود (β =0.94 و R2 =0.25). عرض مغز با 12 نشانگر رابطه داشت که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آنها 95 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β مربوط به نشانگر UBC810475 بود (β =0.71 و R2 =0.31). تعداد 32 نشانگر با وزن مغز همبستگی نشان دادند که مجموع کل R2توجیه شده توسط آنها 100 درصد بود. در بین نشانگرهای
وابسته به این صفت، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β مربوط به نشانگر UBC810735 بود (β =-0.78 و R2 =0.24). شکل 1 پروفایل پرایمرUBC810 را نشان میدهد که نشانگر UBC810735 روی آن مشخص شده است. همچنین شکل 2 رابطه رگرسیونی بین نشانگر UBC810735 و صفت وزن مغز را نشان میدهد.
درصد مغز با تعداد 13 نشانگر ارتباط داشت که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آنها 95 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، نشانگر UBC8801115 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده (R2 =0.33) و UBC880845 دارای بیشترین مقدار β بود (β =-0.64).
شکل 1: پروفایل پرایمر UBC810 ISSR که نشانگر UBC810735 آن بیشترین R2 و β را برای صفت وزن مغز داشته است. این نشانگر با علامت فلش مشخص شده است.
|
UBC810735 |
شکل 2: پلات رابطه رگرسیونی بین نشانگر UBC810735و صفت وزن مغز
تکنیک مولکولیRAPD
از تعداد 100 پرایمر آزمایش شده، در مجموع 15 پرایمر RAPD برای انجام واکنش PCR انتخاب شدند و برای تمام ژنوتیپها بهکار رفتند. این تعداد پرایمر در مجموع 201 قطعه DNA تولید کردند که از بین آنها 188 قطعه در بین ژنوتیپها چندشکلی نشان دادند. همچنین میانگین چندشکلی ردیابی شده توسط پرایمرهای مورد استفاده برابر با 94/97 درصد بود که نشاندهنده تنوع ژنتیکی بالا در ژرمپلاسم مورد آزمایش بود(جدول 4). اندازه قطعات در تمام پرایمرها در محدوده 300
تا3000 جفت باز تخمین زده شد. بیشترین باند چندشکل تکثیر
شده 20 عدد (برای پرایمر TIBMBC-17) و کمترین آن 3 عدد (برای پرایمر OPN-08) بود. قدرت تفکیک (Rp) پرایمرها نیز در محدوده 42/1 (برای پرایمر OPN-08) تا 28/6 (برای پرایمر OPAB-04) بود. میانگین قدرت تفکیک (Rp) برای تمامی پرایمرهای استفاده شده 71/3 بدست آمد (جدول 4). میزان تشابه بین ژنوتیپها در دامنه 27/0 تا 75/0 بود که نشاندهنده تنوع بالا در ژرمپلاسم مورد مطالعه بود.
جدول 4: پرایمرهای RAPDمورد استفاده برای مطالعه ژرمپلاسم فندق مورد مطالعه و خصوصیات آنها
|
قدرت تفکیک (Rp) |
درصد چندشکلی (b/a×100) |
تعداد قطعات چندشکل (b) |
تعداد کل قطعات تکثیر شده (a) |
پرایمر |
|
88/3 |
33/93 |
14 |
15 |
TIBMBC-07 |
|
74/4 |
47/89 |
17 |
19 |
TIBMBC-04 |
|
77/5 |
100 |
20 |
20 |
TIBMBC-17 |
|
88/3 |
31/92 |
12 |
13 |
TIBMBC-08 |
|
94/1 |
62/84 |
11 |
13 |
TIBMBC-19 |
|
62/1 |
50/87 |
7 |
8 |
TIBMBC-15 |
|
48/3 |
78/77 |
7 |
9 |
TIBMBC-18 |
|
48/1 |
33/83 |
5 |
6 |
TIBMBC-03 |
|
14/3 |
100 |
19 |
19 |
OPE-13 |
|
51/4 |
67/86 |
13 |
15 |
OPN-13 |
|
28/6 |
100 |
17 |
17 |
OPAB-04 |
|
48/5 |
100 |
15 |
15 |
OPE-11 |
|
20/3 |
100 |
12 |
12 |
OPN-01 |
|
77/3 |
100 |
16 |
16 |
OPE-17 |
|
42/1 |
75 |
3 |
4 |
OPN-08 |
|
- |
- |
188 |
201 |
کل |
|
71/3 |
94/97 |
53/12 |
40/13 |
میانگین |
با استفاده از روش رگرسیونی گام به گام بین هر یک از صفات ریختشناسی با 188 باند چندشکل RAPD، نشانگرهای گروه RAPD مرتبط با هر یک از صفات ریختشناسی میوه شناسایی شدند (جدول 5). گروه نشانگرهای RAPDبرای صفات ریختشناسی طول نات، عرض نات و وزن نات بهترتیب دارای 28، 32 و 27 نشانگر RAPD بودند که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آنها برای صفات ذکر شده 100 درصد بود. همچنین تعداد نشانگرهای وابسته به صفات طول مغز، عرض مغز، وزن مغز و درصد مغز بهترتیب 32، 28، 32 و 34 نشانگر بودند که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آنها برای صفات ذکر شده 100 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به طول نات، نشانگر TIBMBC191545 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده بود (R2 =0.30) و بیشترین مقدار β مربوط به TIBMBC04330 بود (β =0.63). در بین نشانگرهای وابسته به عرض نات، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین β مربوط به TIBMBC081765 بود (β =-0.79 و R2 =0.48). همچنین در بین نشانگرهای وابسته به وزن نات، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین β مربوط به TIBMBC081765 بود (β =-0.89 و R2 =0. 42).
جدول 5: نتایج حاصل از آنالیز رگرسیونی گام به گام بین باندهای چندشکل نشانگر RAPD با صفات مهم میوه فندق
|
نشانگر دارای بیشترین β |
نشانگر دارای بیشترین R2 |
بیشترین β |
بیشترین R2 توجیه شده (%) |
R2 کل (%) |
تعداد نشانگر آگاهیبخش |
صفت |
|
TIBMBC04330 |
TIBMBC191545 |
63/0 |
30 |
100 |
28 |
طول نات |
|
TIBMBC081765 |
TIBMBC081765 |
79/0- |
48 |
100 |
32 |
عرض نات |
|
TIBMBC081765 |
TIBMBC081765 |
89/0- |
42 |
100 |
27 |
وزن نات |
|
OPE11440 |
TIBMBC171850 |
72/0 |
41 |
100 |
32 |
طول مغز |
|
TIBMBC191545 |
TIBMBC151435 |
91/0- |
32 |
100 |
28 |
عرض مغز |
|
OPN131215 |
TIBMBC041010 |
78/0 |
32 |
100 |
32 |
وزن مغز |
|
TIBMBC04680 |
OPN131970 |
84/0- |
17 |
100 |
34 |
درصد مغز |
در مورد صفت طول مغز، نشانگر TIBMBC171850 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده (R2 =0.41) و نشانگر OPE11440 دارای بیشترین مقدار β بود (β =0.72). در بین نشانگرهای وابسته به عرض مغز، نشانگر TIBMBC151435 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده (R2 =0.32) و نشانگر TIBMBC191545 دارای بیشترین مقدار β بود (β =-0.91). در بین نشانگرهای وابسته به وزن مغز، نشانگر TIBMBC041010 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده (R2 =0.32) و نشانگر OPN131215 دارای بیشترین مقدار β بود (β =0.78). در مورد صفت درصد مغز؛ نشانگرهای OPN131970 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده (R2 =0.17) و نشانگر TIBMBC04680 دارای بیشترین مقدار β بود (β =-0.84).
بحث
نتایج این مطالعه نشان داد که ژنوتیپهای فندق مورد مطالعه دارای تنوع بالایی از نظر صفات ریختشناسی میوه و جنبههای مولکولی میباشند و در نتیجه این تنوع بالا اجازه ردیابی رابطه بین نشانگرهای مولکولی و صفات میوه را از طریق آنالیز رگرسیونی چندمتغیره را داد. برخی از باندهای تولید شده توسط نشانگرهای ISSR و RAPD با صفات ریختشناسی مورد مطالعه همبستگی نشان دادند. محل قرارگیری این نشانگرها در داخل ژنوم احتمالا مناطقی از ژنوم میباشد که کدکننده ژنهای مربوط به صفات ریختشناسی مورد نظر میباشد (23). با هر صفت چندین نشانگر همبستگی نشان دادند که نشانگری که بالاترین R2 را داشته است بهعنوان موثرترین نشانگر در کد کردن آن صفت محسوب میشود (8).
برخی از نشانگرها با بیش از یک صفت میوه ارتباط نشان دادند که ارتباط یک نشانگر با بیش از یک صفت میتواند ناشی از اثرات پلیوتروپیک (Pleiotropic) QTL های مرتبط با هم در صفات مختلف باشد (24 و 25)، اما برای آگاهی بیشتر از این رابطه، ایجاد یک جمعیت در حال تفرق و نقشهیابی لینکاژی آن میتواند مفید باشد (26). اثر پلیوتروپیک زمانی رخ میدهد که یک ژن بتواند بهطور همزمان در بروز چندین صفت تاثیر داشته باشد. همچنین QTL های مرتبط با همدیگر که صفات مختلف را کنترل میکنند نیز میتوانند منجر به ایجاد یک نشانگر واحد شوند که با بیش از یک صفت همبستگی داشته باشد (25). به عنوان مثال در مطالعه حاضر، در بین نشانگرهای ISSR، نشانگرهای UBC868300، UBC8101340 و UBC8101750 با دو صفت طول نات و طول مغز همبستگی معنیدار نشان دادند که بیانکننده همبستگی مثبت این دو صفت با همدیگر میباشد. همچنین در بین نشانگرهای RAPD، نشانگرهای TIBMBC191545، TIBMBC151435 و OPE111125 با این دو صفت همبستگی مثبت نشان دادند. این نتیجه با نتایج محققان دیگر مطابقت دارد، بهطوریکه گزارش شده است طول نات همبستگی مثبت و معنیدار با طول مغز دارد (27، 28 و 29).
بهعلاوه، در بین نشانگرهای ISSR، نشانگرهای UBC868330، UBC873755، UBC866775، UBC868950، UBC850410، UBC850825، UBC8812410 و UBC810685 با طول نات، وزن نات و وزن مغز همبستگی مثبت نشان دادند. همچنین در بین نشانگرهای RAPD، نشانگر OPE11740 با این صفات همبستگی نشان داد. گزارش شده است که این صفات با همدیگر همبستگی مثبت دارند و کاهش یا افزایش در هر کدام میتواند باعث کاهش یا افزایش در دیگری شود (27 و 29). در بین نشانگرهای ISSR، نشانگرهای UBC8492335 و UBC8101260 با طول و وزن مغز همبستگی نشان دادند. همچنین در بین نشانگرهای RAPD، نشانگرهای OPAB04380 و OPE11935 با این دو صفت همبستگی نشان دادند. همبستگی مثبت بین این دو صفت با استفاده از مطالعات ریختشناسی گزارش شده است (27 و 28).
تجزیه رگرسیونی چندمتغیره (MRA) یک روش مناسب و سریع برای یافتن رابطه بین صفات و نشانگرها میباشد (30). نشانگرهای شناسایی شده در این مطالعه که با صفات میوه فندق همبستگی نشان دادهاند میتوانند در برنامههای اصلاحی MAS بهکار بروند. مزایای بارز این آنالیز این است که این روش میتواند مکانهای صفات کمی (QTL) را ردیابی کند. همچنین نیاز به زمان و هزینه کمتری داشته (30) و به تشکیل جمعیت جهت نقشهیابی نیاز ندارد (23).
انتخاب اولیه صفات مطلوب مربوط به میوه و گل نیاز به نمو گیاهان و وارد شدن آنها به مرحله بلوغ دارد و یا به عبارت دیگر درختان میوه باید مرحله طولانی نونهالی را طی نمایند و وارد مرحله میوهدهی شوند تا بتوان این صفات را مورد بررسی قرار داد و گیاهان دارای صفات مطلوب از نظر گل و میوه پیدا نمود (23). اما با ردیابی نشانگرهای وابسته به این صفات، نیاز به وارد شدن گیاهان به مرحله بلوغ نمیباشد. بهعبارت دیگر، برای گیاهان چوبی (مانند درختان میوه) دارای دوره طولانی نونهالی، انتخاب نتاج برتر از نظر صفات مهم گل و میوه کاری دشوار
میباشد اما با شناسایی نشانگرهای وابسته به صفت (MAS)، میتوان نتاج برتر را در مراحل اولیه رشد آنها شناسایی کرد (23). روش کار به اینصورت است که میتوان قطعات DNA چندشکل شناسایی شده بهعنوان نشانگر آگاهیبخش برای صفت مورد مطالعه (مانند صفات مربوط به میوه) را از روی ژل جدا کرد و کلون نمود. سپس توالی شناسایی شده را در پایگاه اطلاعاتی NCBI با توالیهای موجود همردیف (Alignment) نمود و
ژنهای کاندید (Candidate genes) که شباهت بالایی به نشانگرهای آگاهیبخش مورد نظر داشتند را مشخص نمود. همچنین میتوان از روی توالی بهدست آمده، پرایمرهای SCAR را طراحی نمود و در انتخاب بهواسطه نشانگر وابسته به صفت (MAS) در برنامههای اصلاحی بهره برد (30).
شناسایی نشانگرهای مولکولی مرتبط با ژنهای اصلی کنترلکننده صفات مورد نظر در سالهای اخیر از طریق ایجاد جمعیتهای در حال تفرق همچونF1 درگیاهان هتروزیگوت و F2 ،RIL وDH در گیاهان هموزیگوت انجام گرفته است. بعضی از این نشانگرها جهت انجام کارهای اصلاحی استفاده شدهاند، اما در دسترس نبودن جمعیتهای در حال تفرق جهت نقشهیابی، در اختیار نبودن زمان کافی و نبود همبستگی کافی بین صفات ریختشناسی و نشانگرهای ملکولی از جمله مهمترین محدودیتها در زمینه شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات ریختشناسی میباشد اما انجام آنالیز همبستگی رگرسیونی فاقد این محدودیتها میباشد (31).
نتیجه گیری
با توجه به نتایج مطالعه حاضر، میتوان نتیجه گرفت که نشانگرهای آگاهیبخش شناسایی شده وابسته به خصوصیات میوه در فندق میتوانند راهنمای خوبی برای شناسایی ژنوتیپهای دارای صفات با ارزش میوه باشد. در برنامههای اصلاحی انتخاب مواد گیاهی با کیفیت معمولاً وقت و هزینه زیادی میطلبد. با اینحال، نشانگرهای آگاهیبخش شناسایی شده در این مطالعه میتوانند در انتخاب ژنوتیپهای برتر بخصوص وقتی که اطلاعاتی از پایه ژنتیکی آنها مانند نقشه لینکاژی در دسترس نیست مفید باشد. همچنین، این نشانگرها میتوانند در انتخاب والدین مناسب برای تولید جمعیت جهت نقشهیابی بهکار بروند.
)