مقدمه

بیماری‏های استخوانی ایجاد شده توسط هومئوستازی غیر طبیعی استخوان می‏توانند از طریق القا عمل‏کرد اوستئوبلاستی درمان شوند. از این رو شناسایی داروهایی که موجب تسریع شکل‏گیری استخوان شوند، ابزار کلیدی در درمان بیماری‏های استخوانی به‏شمار می‏رود (1). سلول‏های بنیادی مزانشیمی چند توان به‏دلیل دارا بودن ظرفیت بالای تکثیر و تمایز منبع سلولی ارزشمندی در پزشکی ترمیمی به‏شمار رفته و می‏توانند به چند نوع سلول از جمله اوستئوبلاست، آدیپوسیت و کندروسیت تمایز یابند (2). مطالعات نشان داده‏اند این سلول‏ها به‏عنوان منبع سلول‏های پیش ساز استخوانی می‏باشند و تمایز اوستئوبلاستی توسط فاکتورهای مختلفی از جمله(bone morphogenetic proteins) BMPs،(transforming growth factor ß) TGFβ،(fibroblast growth factor-2) FGF-2 ،(insulin growth factor-1) IGF-1 و برخی عوامل دیگر تنظیم می‏شود (3).

تمایز اوستئوبلاستی رویداد کلیدی در شکل‏گیری استخوان است و می‏تواند به سه مرحله تکثیر، مرحله بلوغ و سنتز ماتریکس خارج‏سلولی و مرحله معدنی شدن تقسیم شود که نشان‏گر‏های فنوتیپی به‏طور متمایزی در هر مرحله بیان می‏شوند، به‏عنوان مثال اوستئوبلاست‏های فعال، مارکرهای اولیه تمایز اوستئوبلاستی یعنی بیان فراوان آلکالین فسفاتاز و کلاژن نوع ׀ را نشان می‏دهند، این در حالی است که به‏نظر می‏رسد اوستئوکلسین و اوستئوپونتین در مراحل دیرتر همزمان با معدنی شدن بیان می‏شوند (4).

تا به امروز داروهای فراوانی در درمان بیماری‏های استخوانی گزارش شده‏اند که در هر حال اکثر این داروها متوقف کننده بازجذب استخوان هستند و اثرات جانبی زیادی دارند، برای مثال درمان جایگزینی استروژن که از دژنره شدن توده استخوان در زنان، پس از دوره یائسگی پیشگیری می‏نماید، علی‏رغم وجود فواید بسیار موجب افزایش بروز سرطان تخمدان و پستان می‏شود، از این‏رو پژوهشگران سعی دارند ترکیباتی را شناسایی کنند که بتوانند بدون ایجاد عارضه جانبی خاص، شکل‏گیری استخوان را افزایش دهد (5).

سلول‏های بنیادی مزانشیمی پتانسیل قابل توجه درمانی زیادی را در زمینه درمان بیماری‏های مختلف دارا هستند (6)، از طرفی با توجه به توان بالای سلول‏های مزانشیمی مشتق از مغز استخوان در تمایز به رده‏های سلولی متفاوت و استفاده از این رده‏های سلولی در درمان بسیاری از بیماری‏ها از جمله نقایص استخوانی و غضروف، فراهم نمودن شرایطی که روند تمایز و ترمیم بافت‏های سخت و اسکلتی بهبود یا تسهیل یابد از اهمیت ویژه‏ای برخوردارند (7). یکی از غنی‏ترین منابع حاوی چنین ترکیباتی اکوسیستم‏های آبی است که در آنها گونه‏های مختلفی از جانوران، گیاهان و میکروارگانیسم‏ها زیست می‏نمایند، این اکوسیستم‏ها به‏دلیل وجود تنوع بالای مواد طبیعی دارای فعالیت بیولوژیک منحصر به‏فرد هستند و توجه دانشمندان را در  دهه‏های اخیر به‏شدت معطوف خود کرده‏اند، به‏عنوان مثال فراورده‏های طبیعی نظیر عصاره‏های استخراج شده از جلبک‏های دریایی دارای ترکیباتی هستند که می‏توان آن‏ها را برای سنتز داربست‏ها و نیز تمایز استفاده نمود (1). موجودات دریایی همچون اسفنج‏ها، مرجان‏های دریایی، تونیکات‏ها، نرم‏تنان دریایی و میکروارگانیسم‏های دریایی امروزه برای مطالعه و جستجوی کاندیداهای دارویی جدید مورد توجه قرار گرفته‏اند و بسیاری از ترکیبات مشتق شده از موجودات زنده دریایی دارای فعالیت‏های بیولوژیک امید بخشی در زمینه درمان بیماری‏ها هستند (8).

محققین در حدود 7000 فراورده دریایی را جداسازی نموده‏اند که 20 درصد آن مربوط به جلبک‏ها، 33 درصد اسفنج‏ها، 18 درصد مرجانیان و 24 درصد مربوط به سایر بی‏مهرگان از جمله اکینودرم‏ها می‏باشند (9). کشور ایران از لحاظ دارا بودن چنین منابعی در زمینه فراورده‏های طبیعی غنی به‏شمار می‏آید (10).  بررسی ترکیبات موجود در اکینودرم‏ها نشان می‏دهد که این جانوران حاوی ترکیبات فعال زیستی با خواص دارویی می‏باشند که در بسیاری از فرایند‏های زیستی نقش ایفا می‏کنند (11). خیار دریایی در طب سنتی برای درمان بیماری‏های مختلف  مورد استفاده قرار گرفته است و یکی از ارگانیسم‏های دریایی با ارزش غذایی و درمانی بالا به‏شمار می‏آید که خواص دارویی آن به‏دلیل حضور ترکیبات عمل‏کردی با فعالیت بیولوژیکی چند گانه نسبت داده می‏شود (12).

خیار دریایی به‏عنوان یک بی‏مهره دریازی دارای پروفایل با ارزش منحصر به‏فرد، از مواد مغذی دارای خاصیت دارویی همانند تیامین، ریبوفلاوین، نیاسین و مواد معدنی از جمله کلسیم است که دارای خواص بیولوژیک نظیر مهار رگ‏زایی، ضد سرطان، ضد التهاب، آنتی اکسیدانت است. همچنین این جانور حاوی ترکیبات فعال زیستی نظیر گلیکوزآمینو‏گلیکان، کندروئیتین سولفات، گلیکوزیدهای تری‏ترپنه، ترکیبات فنلی و اسیدهای چرب  می‏باشد و امید می‏رود در جهت تمایز سلول‏ها و تسهیل و پیشبرد این فرایند با هدف تولید رده‏های سلولی گوناگون و استفاده از آن‏ها در درمان بسیاری از بیماری‏ها مفید واقع شود (13). با توجه به رویکرد نو و اقبال جامعه جهانی به فراورده‏های طبیعی و از آنجایی‏که در طب سنتی از موجودات دریایی نظیر خیار دریایی برای التیام دردهای مفصلی و استخوانی استفاده می‏شود و کشور ایران نیز دارای ذخایر دریایی غنی از این گروه جانوری می‏باشد که تا کنون مطالعه‏ای در زمینه اثرات ترکیبات آن‏ها بر تمایز سلول‏های بنیادی و سلول درمانی انجام نشده است لذا در پژوهش حاضراثر عصاره تام الکلی خیار دریایی گونه خلیج فارس در پیشبرد تمایز سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی نژاد ویستار به‏سمت دودمان‏های اوستئوژنیک و آدیپوژنیک بررسی شده است .

مواد و روش‏ها

جداسـازی و کشت سلـول‏های بنیادی مزانشیمی مغـز استخوان:

موش‏های صحرایی نژاد ویستار با سن تقریبی ٤ تا  ۶ هفته و با وزن تقریبی 100 تا 130 گرم از انستیتو رازی مشهد خریداری و در اتاق حیوانات دانشگاه آزاد اسلامی مشهد، در شرایط طبیعی و با پریود نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی نگه‏داری شدند. برای انجام تجربیات، موش‏ها با استفاده از کلروفرم کشته شدند، استخوان‏های ران و درشت نی آن‏ها جدا گردید و داخل PBS (PAA, Germany) سرد قرار داده شد. پس از پاک‏سازی بافت‏های اطراف و قطع دو سر استخوان، مغز استخوان با روش Flushing از درون استخوان تخلیه گردید. پس از سانتریفیوژ، به پلیت سلولی حاصل ۲ میلی‏لیتر DMEM (Bio idea, Iran) حاوی 15 درصدFBS  (GIBCO, USA) و یک درصد پنی‏سیلین استرپتومایسین  اضافه شده و درون انکوباتور (Memmert, Germany) با دمای ۳۷ درجه سانتی‏گراد و  CO2 پنج درصد قرار داده شدند. بعد از 2 روز محیط رویی تخلیه و هر 3 روز یکبار تعویض محیط صورت گرفت. زمانی‏که تراکم سلول‏ها به  80  درصد رسید، پاساژ سلولی انجام و سلول‏ها پس از پاساژ سوم جهت کشت استفاده شدند. در کلیه مراحل انجام تحقیق، موارد اخلاقی کار با حیوان مطابق مقررات کمیته اخلاق دانشگاه رعایت گردید.

تکنیک ایمنوسیتوشیمی جهت اثبات بنیادی بودن سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان: برای این منظور دو هفته پس از جداسازی و تخلیص سلول‏های مزانشیمی و حذف سایر سلول‏های موجود در مغز استخوان، سلول‏های مزانشیمی در پلیت 96 خانه‏ای کشت داده شد و پس از چسبیدن سلول‏ها به کف فلاسک، سلول‏ها سه مرتبه با PBS سرد شستشو داده شده، سپس در معرض پارافرمالدئید سرد 4 درصد قرار گرفته و با آنتی‏بادی اولیه بر علیه مارکر سطحی سلول‏های بنیادی(Abcam, England) CD44  به‏مدت یک ساعت انکوبه شدند. پس از طی زمان مذکور، سلول‏ها در معرض آنتی‏بادی ثانویه کونژوگه با FITC (Sigma,USA) برای نشان دادن سلول‏ها و همچنین رنگ DAPI (Sigma, USA) جهت رنگ‏آمیزی هسته سلول‏ها قرار داده شدند و سپس با میکروسکوپ فلورسنت(Labomed, Korea)  بررسی انجام شد.

آماده سازی عصاره الکلی خیار دریایی: نمونه‏های خیار دریایی از آب‏های خلیج فارس مجاور جزیره قشم جمع‏آوری و به مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری، دانشگاه آزاد اسلامی مشهد منتقل و پس از بررسی‏های مورفومتریک اولیه محتویات داخلی بدن آن‏ها تخلیه و بخش بیرونی بدن آن‏ها را خشک کردیم، سپس به ازای هر گرم وزن خشک بدن، 10 میلی‏لیتر متانول استفاده شد و به‏مدت سه شبانه روز بر روی شیکر چرخشی قرار داده شد. پس از طی زمان مذکور، عصاره با استفاده از کاغذ واتمن 10صاف گردیده و توسط دستگاه وکیوم تبخیری (Heidolph, Germany) عصاره گیری و تغلیظ انجام و درون آون (Memmert, Germany) 40 درجه سانتی‏گراد خشک و سپس در دمای 20- درجه نگه‏داری شدند.

تعیین سیتوتوکسیسیته عصاره الکلی خیار دریایی با استفاده از روشMTT: به‏منظور بررسی دوز مناسب عصاره خیار دریایی بر روی سلول‏های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی نژاد ویستار، 24 ساعت پس از کشت سلول‏های مذکور، این سلول‏ها  با دوزهای متفاوت میکروگرم بر میلی لیتر 50، 100، 200، 400 و 800 رقیق شد، در DMSO 10 درصد عصاره تام الکلی خیار دریایی تیمار شد و پس از 24، 48 و 72 ساعت از تیمار، محیط رویی تخلیه و 20 میکرولیتر محلول 5 میلی‏گرم در میلی‏لیتر MTT (Sigma, USA) به سلول‏ها اضافه شده و پس از 4 ساعت انکوباسیون درون انکوباتور، DMSO به سلول‏ها افزوده شده، سپس جذب در560 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر (Epoch, USA) اندازه گیری و طبق فرمول ذیل میزان سمیت سلولی تحت تاثیر تیمار با عصاره خیار دریایی تعیین شد:

القا تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان: جهت القا تمایز، سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی پس از پاساژ سوم به تعداد 103 تا 104 درون پلیت‏های 96 خانه‏ای کشت داده شد و پس از 24 ساعت با دوزهای مختلف عصاره خیار دریایی 5/3، 25/6، 5/12 و 25 میکروگرم بر میلی‏لیتر تیمار گردید و تا 21 روز، هر سه روز یک بار با محیط تیماری تازه تعویض انجام شد.

تعیین تمایز به اوستئوسیت با استفاده از رنگ آمیزی آلیزارین رد: برای رنگ‏آمیزی آلیزارین رد و اندازه گیری سطح ذخایر کلسیمی در ماتریکس خارج سلولی، سلول‏های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی به‏مدت 21 روز با دوزهای 5/3، 25/6، 5/12 و 25  میکروگرم بر میلی لیتر عصاره تام الکلی خیار دریایی تیمار شد و پس از طی زمان مورد نظر، محیط رویی تخلیه و با PBS شستشو داده شد و پس از 5 دقیقه  با فرمالین 4 درصد تثبیت انجام شد،  سپس 30 دقیقه در معرض رنگ‏آمیزی آلیزارین رد(Bio Idea, Iran)   قرار داده شدند.

تعیین تمایز به اوستئوسیت با استفاده از سنجش فعالیت آلکالین فسفاتاز: به‏منظور سنجش فعالیت آلکالین فسفاتاز، سلول‏های بنیادی مغز استخوان به تعداد 104 × 2 در پلیت کشت 96 خانه‏ای کشت داده شده و به‏مدت 14 روز تحت تاثیر محیط کشت DMEM با دوز‏های متفاوت عصاره خیار دریایی 5/3، 25/6، 5/12 و 25 میکروگرم بر میلی لیتر تحت تیمار قرار گرفتند. پس از طی زمان مورد نظر، محیط رویی خارج و دو مرتبه با PBS شستشو شد و توسط تریتون X-100 یک درصد لیز شدند. سپس با استفاده از کیت سنجش آلکالین فسفاتاز (پارس آزمون) فعالیت آنزیمی در طول موج 405 نامتر به‏کمک اسپکتروفتو‏متر مورد بررسی قرار گرفت.

تعیین تمایز به آدیپوسیت توسط رنگ آمیزی اویل رد: جهت بررسی میزان تمایز به آدیپوسیت‏ها تحت تاثیر محیط القایی عصاره تام خیار دریایی، سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان 21 روز پس از تیمار با عصاره تام خیار دریایی، به‏مدت 45 دقیقه  با فرمالین 4 درصد تثبیت شد و در ادامه پس از شستشو با الکل 70 درصد، با محلول اویل رد(Bio Idea, Iran)   رنگ آمیزی شدند. پس از طی این زمان، سلول‏ها سه تا چهار مرتبه  با الکل 70 درصد شستشو و با میکروسکوپ اینورت (Bio Photonic, Brazil) بررسی شدند.

آنالیز آماری: داده های کمی حاصل توسط نرم افزار SPSS، آزمون آماری ANOVA در سطح  05/0 P<تحلیل شد و نمودارها توسط نرم‏افزار EXCEL رسم گردیدند.

نتایج

بنیادی بودن سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی نر نژاد ویستار

بررسی مورفولوژیک سلول‏ها توسط میکروسکوپ فلورسانس نشان داد که وجود مارکر سطحی CD44 بر سطح سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی، دال بر اثبات بنیادی بودن سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی است (شکل 1).

شکل1: A) رنگ‏آمیزیDAPI جهت نشان دادن هسته سلول‏های بنیادی، B) وجود آنتی ژن سطحی CD44 بر سطح سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی

تعیین دوز مناسب عصاره تام الکلی خیار دریایی بر تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی نر نژاد ویستار

یافته‏های حاصل از آزمون MTT  نشان داد که عصاره تام الکلی خیار دریایی گونه خلیج فارس در دوزهای بالاتر از 400 میکروگرم بر میلی لیتر باعث تجزیه سلولی می‏شوند. همچنین در دوزهای 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر تا 200 میکروگرم بر میلی‏لیتر به‏صورت وابسته به دوز منجر به مهار تکثیر سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان موش صحرایی می‏شوند. از این‏رو غلظت مناسب برای بررسی تمایز عصاره الکلی خیار دریایی کمتر از 50  میکروگرم بر میلی‏لیتر تعیین شد (نمودار1).

نمودار 1: اثر عصاره الکلی خیار دریایی خلیج فارس بر روی بقاء سلول‏های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی در ظرف 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار  توسط MTT. ANOVA ، 05/0>P*،01/0>P **،001/0 >P *** Mean±S.E) ). نتایج نشان داد که دوزهای بالاتر از  400 میکروگرم بر میلی‏لیتر عصاره منجر به تجزیه سلول‏ها می‏شود و عصاره الکلی خیار دریایی در دوز میکروگرم بر میلی‏لیتر 50 تا 200 میکروگرم بر میلی‏لیتر مهار تکثیر سلول‏ها را در پی دارد.

اثر عصاره تام الکلی خیار دریایی بر تمایز اوستئوژنیک سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان موش صحرایی نر نژاد ویستار

نتایج حاصل از تست آلکالین فسفاتاز نشان داد که سلول‏های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی نر تیمار شده با عصاره الکلی خیار دریایی پس از طی 14 روز از تمایز، به‏طور چشمگیری نسبت به گروه شاهد افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز و معدنی شدن دارند. رنگ‏آمیزی آلیزارین رد پس از 21 روز از تمایز نیز نشان داد که عصاره خیار دریایی به‏طور چشمگیری در دوزهای بین 25/6  میکروگرم بر میلی‏لیتر تا 25 میکروگرم بر میلی لیتر معدنی شدن و میزان ذخایر کلسیمی سلول‏های مغز استخوان را تحریک نموده است (شکل 2و نمودار2).

شکل2: تصاویر میکروسکوپ معکوس از معدنی شدن سلول‏های مغز استخوان موش صحرایی 21 روز پس از تیمار با

عصاره الکلی خیار دریایی خلیج فارس در غلظت‏های 25/6 تا  25 میکروگرم بر میلی‏لیتر در مقایسه با گروه کنترل.

 A) کنترل، B) 25/6 میکروگرم بر میلی‏لیتر، C) 5/12 میکروگرم بر میلی‏لیتر، D) 25 میکروگرم بر میلی‏لیتر، E)

 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر. ( رنگ‏آمیزی آلیزارین رد، بزرگنمایی ×100 )

نمودار2: نمودار فعالیت آلکالین فسفاتازی عصاره الکلی خیار دریایی خلیج فارس در غلظت های 25/6 تا 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر بر سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی نر در مقایسه با گروه کنترل05/0> P*،01/0>P  ** ،001/0 >P *** Mean±SE))