نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه اراک دانشکده علوم پایه گروه زیست شناسی کدپستی 8349-8-38156
چکیده
هدف: مطالعه حاضر با هدف بررسی اثر عصاره آبی و الکلی موسیر بر سلولهای سرطان پستان و مقایسه آن با داروهای کربوپلاتین و تاکسول انجام شده است. مواد و روشها: ابتدا عصاره آبی و الکلی موسیر و غلظتهای متفاوت داروهای تاکسول و کربوپلاتین تهیه شد. سپس با استفاده از روشهای تریپان بلو و MTT، سیتوتوکسیسیتی آنها در غلظت و زمانهای مختلف بر روی سلولهای سرطان پستان بررسی گردید و توسط رنگآمیزی فلورسانت هوخست و پروپیدیوم یدید تغییرات مورفولوژیک و آپوپتوزیس در سلولها بررسی شد. دادهها با روش آماری آنالیز واریانس یک طرفه تجزیه و تحلیل و تفاوت میانگینها درسطح 05/0 p < معنیدار در نظر گرفته شد. نتایج: عصاره موسیر در دامنه غلظتی (01/0 تا 05/0 گرم بر لیتر) اثر مهارکنندگی بر روی سلولهای سرطانی داشت و تاثیر عصاره الکلی بیشتر از عصاره آبی بود. همچنین تاثیر همزمان عصاره با کربوپلاتین، باعث افزایش سیتوتوکسیسیتی کربوپلاتین شده در حالیکه ترکیب عصاره آبی و تاکسول، باعث کاهش سایتوتوکسیسیتی تاکسول شده است. نتیجهگیری: این مطالعه نشان داد که عصاره آبی و الکلی موسیر دارای اثر سیتوتوکسیسیتی بر روی سلولهای سرطان پستان موش صحرایی میباشد و ترکیب عصاره آبی و الکلی با کربوپلاتین و همچنین ترکیب عصاره الکلی با تاکسول باعث افزایش سیتوتوکسیسیتی این داروها میشود. بدینترتیب این گیاه میتواند بهعنوان یک گیاه دارویی بر علیه سرطان پستان موضوع تحقیقات بیشتر قرار گیرد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Evaluation of Cytotoxicity effect of aqueous and alcoholic total extract of shallot (Allium ascalonicum)on cancer cells derived from mammary tumors in rat and cell line (4T1) in mouse ,and comparison with Taxol and carboplatin chemotherapy drugs
نویسندگان [English]
- A H
- SMA Sh
- M S
- M T
چکیده [English]
Aim: The present study aimed to investigate the effects of aqueous and alcoholic extracts of shallot on breast cancer cells compared to carboplatin and taxol treatments. Material and methods: Different concentrations of drugs taxol and carboplatin and aqueous and alcoholic extracts of shallots were prepared. Using Trypan blue and MTT, cytotoxicity on breast cancer cells, in different times and concentrations were evaluated. Utilized Hoechst and propidum iodide staining morphological changes and possible apoptosis of cells were determined. The data statistically analyzed using one-way analysis of variance and the mean level of P Results: The results indicate that shallot alcoholic extract has more inhibitory effects on cancer cells than aqueous extract at concentration range (0.01 to 0.05 g/L). Also, the simultaneous effect of shallot’s extract, accompaniment with carboplatin, caused enhancement in cytotoxicity of carboplatin. On the other hand, accompaniment of aqueous extract with taxol led to reduction of taxol cytotoxicity. Conclusions: This study showed aqueous and alcoholic extracts of shallots has cytotoxicity effects on breast cancer cells on rats affected by breast cancer. This plant is a herb which can be used against breast cancer can be subjects for further research.
کلیدواژهها [English]
- Cytotoxicity
- Extract of shallot
- Breast cancer
- DMBA
- Taxol
- Carboplatin
مقدمه
سرطان همواره یکی از مشکلات عمده جوامع انسانی محسوب میشود. از بین سرطانها، سرطان پستان شایعترین سرطان در میان زنان میباشد (1و2) و اغلب موارد سرطانهای پستان منجر به مرگ، از نوع کارسینومای مجرایی مهاجم است (3). عوامل متعددی فرد را در معرض ابتلا به سرطان قرار میدهد که از بین آنها میتوان به تغییرات ژنتیکی، رژیم غذایی، شیردهی و فاکتورهای محیطی اشاره نمود. بالا بودن آمار مبتلایان به این نوع سرطان در کشورمان ضرورت انجام تحقیقات بیشتر برای پی بردن به مکانیسمهای ایجاد سرطان و ابداع روشهای درمانی موثرتر را آشکار میسازد. سرطان پستان را میتوان در رتها توسط انواع مختلفی از عوامل نظیر هورمونها، پرتوهای یونیزان و مواد کارسینوژن ایجاد نمود اما یکی از پرکاربردترین روشهای القا سرطان پستان در رت استفاده از نوعی ماده شیمیایی بهنام 7 و 12 دی متیل بنزانتراسن میباشد که یک هیدروکربن آروماتیک چندحلقهای است که بهوفور در دود تنباکو یافت میشود (4). از طرفی پس از سالها پیشرفت در زمینه بهداشت هنوز انواع سرطان و از جمله سرطان پستان از مشکلات اساسی در اغلب کشورهاست (5).
در این میان مصرف گسترده داروهای رایج ضدسرطان از قبیل تاکسان و آنتراسیکلینها موجب ایجاد مقاومتهای درمانی نیز میشود بهطوریکه سایر گزینههای درمانی را نیز محدود میکنند (6).
مطالعات نشان میدهد که غذاها بهخصوص غذاهای با منشا گیاهی، پتانسیل پیشگیری از حدود یک سوم سرطانها را دارند (7). انسان در طی سالیان متمادی به اثرات مختلف درمانی عصارههای گیاهی پی برده است. از مزیتهای شناخته شده این عصارهها عدم وجود عوارض جانبی خطرناک و گستردگی طیف اثر آنها میباشد. از جمله این گیاهان میتوان به اعضای گونه Allium (سیر و پیاز و موسیر) اشاره نمود (8).
گیاه موسیر که گونه مهمی از جنس آلیوم (Allium) محسوب میگردد از دیرباز در بسیاری از کشورها از جمله ایران مصارف درمانی سنتی یا غذایی داشته است. این گیاه دارای خواص شناخته شدهای مثل اثر بر روی شاخصهای هماتولوژیکی، پتانسیل آنتى اکسیدانتى، خواص ضد قارچ و ضد باکتریایی بوده که مورد مطالعه قرار گرفته است (12-9). علاوه بر این، ترکیب شیمیایی آن نشان میدهد که دارای ترکیبات زیادی مثل ارگانوسولفورها و پلی فنلها بوده که بسیار مشابه ترکیبات موجود در گونههای هم خانواده آن میباشد (15-13). مطالعات قبلی در رابطه با اثرات ضد تکثیری و سایتوتوکسیک عصاره آبی و الکلی موسیر بر روی ردههای سلولی سرطانیHela ،MCF-7 و L-929 انجام شده است. نتایج آنها نشان میدهد عصاره آبی و الکلی موسیر اثرات سایتوتوکسیک مختلفی را اعمال میکند و IC50 عصاره برای هر رده سلولی متفاوت است (16). در مطالعه حاضر اثر سایتوتوکسیسیتی عصاره آبی و الکلی موسیر بر روی رده سلولی 4T1 مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته است.
مواد و روشها
ابتدا رده سلولی 4T1 سرطان پستان موش از انستیتو پاستور ایران خریداری شد و برای تهیه سلولهای القایی، پس از پایان دوره تیمار رت با DMBA- 7-12 Dimethylbenz(a)anthracene)) و رسیدن تومور به اندازهی لازم، حیوان با رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی توسط دیاتیلاتر بیهوش شد. سپس موهای ناحیه اطراف تومور با تیغ تراشیده شده و محل تشریح با استفاده از الکل 70 درصد و ساولن رقیق شده استریل شد. پس از شکافتن قسمت مورد نظر تومور بهطور کامل خارج و به زیر هود لامینار منتقل شد. از قسمتهای داخلیتر تومور قطعاتی بریده شد و به فالکونهای حاوی 10 میلیلیتر (Salt Soution HBSS Hank's Balanced) استریل انتقال داده شد.
سپس نمونهها از HBSS خارج شده و در پتری استریل قرار داده شد و به آن محیط کشت تازه افزوده شد. پس از جدا کردن خون و بافت اضافه، باقیمانده تومور با اسکالپل به ذرات بسیار ریز خرد شد (chopping) و سوسپانسیون حاصله چندین بار از سوزن سرنگ 5 میلیلیتر عبور داده شد تا سلولها بهخوبی از بافت جدا شوند، سپس مخلوط بهدست آمده به فالکون 15 میلیلیتر منتقل شده و با دور rpm2000 بهمدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد، پس از آن محلول رویی دورریخته شد. بهرسوب ته فالکون 5 میلیلیتر محیط کشت DMEM)) Dulbecco's Modification of Eagles Medium کامل حاوی10 درصد FBS (Fetal bovine serum) اضافه گشت. پس از پیپتاژ کردن، 5/1 تا 2 میلیلیتر از مخلوط همگن شده به فلاسکهای T25 منتقل شده و حجم محیط داخل فلاسک به 5 میلیلیتر رسانده شد. سپس فلاسک داخل انکوباتور CO2 دار قرار داده شد. پس از گذشت 24 ساعت محیط رویی فلاسک تخلیه و 5 میلیلیتر محیط کشت تازه به فلاسک افزوده گشت.
بعد از تهیه موسیر و خشک شدن، آنرا پودر نموده و سه مرتبه با اتانول 95 درصد (به نسبت 1به 5) برای مدت 24 ساعت در دمای اتاق عصاره گیری میشود. سپس فیلتر شده و پس از آن حلال جدا و عصاره تغلیظ گشت (17). برای تهیه عصاره آبی موسیر، حدود 100 گرم از پیازچههای سالم گیاه موسیر انتخاب و پوسته خارجی آنها جدا شد. سپس پیازچه در یک دستگاه آسیاب برقی بهصورت ماده نرم درآمده و پس از له شدن کامل بافت موسیر، به نسبت 1 به 1 آّب دیونیزه استریل مخلوط و با همزن به آرامی همزده شد. پس از عصاره گیری کامل عصاره جهت صاف شدن تحت شرایط 14000دور در دقیقه بهمدت 5 دقیقه سانتریفوژ شده و مایع رویی جدا شد و با استفاده از دستگاه فریز درایر بهصورت پودر خشک درآمده و در فریزر نگهداری شد و برای هر بار استفاده، مقدار مورد نیاز از آن وزن و در محیط کشت حل گردید (18). برای سنجش قدرت زیستی سلولهای تیمار شده با تاکسول،کربوپلاتین، عصاره آبی و الکلی موسیر، ابتدا سلولها با تریپسین جدا و پس از سانتریفوژ، رسوب سلولی با محیط کشت تازه به حجم یک میلیلیتر رسید و سپس مقدار 300 میکرولیتر ازسوسپانسیون سلولی حاصل با حجم مساوی از تریپان بلو مخلوط و بهمدت 2 دقیقه در انکوباتور قرار داده شد . تعداد سلولهای زنده و مرده با لام هموسایتومتر بررسی و بهصورت درصد بیان شد. در این روش، سلولهای مرده بهعلت نفوذ پذیری به تریپان بلو، بهرنگ آبی دیده شد. علاوه بر روش تریپان بلو برای بررسی قدرت زیستی سلولهای تیمار شده از روش (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) MTT assayنیز استفاده شد. در این روش آنزیم سوکسینات دهیدروژناز در میتوکندری توانایی احیای رنگ زرد دی متیل تیازول را به بلورهای ارغوانی و نامحلول فورمازان دارد. سلولهای سرطانی بهمدت 24 ساعت در پلیت 96 خانه کشت و پس از چسبیدن این سلولها به کف پلیت 96 خانه با غلظتهای مذکور از تاکسول، کربوپلاتین، عصاره آبی و الکلی موسیر تیمار و پس از زمانهای 48 و 72 ساعت 10 میکرولیتر MTT بهازای100 میکرولیتر از محیط کشت به چاهکها اضافه و بهمدت 4 ساعت انکوبه شد سپس بلورهای فورمازان حاصل درDMSO حل و جذب آن توسط (enzyme-linked immunosorbent) ELISA reader (Model Bio-Rad 680) در طول موج 505 نانومتر اندازهگیری شد. سلولهای چسبیده به پلیت 24 خانه با دوز 1/0 و 100 میکروگرم بر میلیلیتر بهترتیب تاکسول و کربوپلاتین و 04/0 و 03/0 گرم بر لیتر برای عصاره آبی و الکلی بهمدت 48 ساعت تیمار شد (با توجه به نتایج آماری آزمونهای تریپان بلو و MTT در مرحله دوزیابی و مدت زمان 48 ساعت برای بررسیهای مورفولوژی انتخاب شد). رنگآمیزی کروماتین با هوخست برای مطالعه مورفولوژی هسته و پروپیدیم آیوداید همراه با هوخست برای تمایز بین سلول مرده و زنده توسط میکروسکوپ فلورسنس (Olympus, Japan) انجام گردید.
بررسی آپوپتوزیس و تغییرات مورفولوژیک سلول: در این مطالعه تغییرات آپوپتوزیس و مورفولوژیک سلولها با استفاده از رنگآمیزی فلورسانت هوخست و پروپیدیوم یدید بررسی شد. جهت بررسی وقوع مرگ سلولی و تشخیص آنکه مرگ سلولی از نوع آپوپتوزیس میباشد، از میکروسکوپ فلورسنس و رنگآمیزی هوخست 33285 استفاده شد. در این رنگآمیزی سلولهای طبیعی بهصورت رنگ آبی یکنواخت دیده میشوند، در صورتیکه هسته سلولهای دستخوش آپوپتوزیس بهواسطه متراکم شدن کروماتین و قطعه قطعه شدن هسته، بهطور غیر منظم و بهصورت نقاط آبی درخشان قابل مشاهده خواهد بود. رنگآمیزی با پروپیدیوم یدید نیز تخریب غشا و چروکیدگی سیتوپلاسم را نشان خواهد داد.
آنالیز آماری: با استفاده از نرم افزار آماری SPSS آنالیز واریانس یکطرفه ، آزمون Tukey بر روی دادهها انجام شد و 05/0 P < معنیدار تلقی گردید.
نتایج
در این پژوهش بهمنظور یافتن غلظتی از عصاره و دارو که بتواند زیستایی سلولها را تا 50 درصد کاهش دهد، دوره تیمار 48 و 72 ساعته و محدودههای دوز از عصارهها و داروها با توجه به مطالعات مشابه انتخاب شد (جدول 1). بعد از انجام آزمایشها، دادههای بهدست آمده از این آزمونها نشان داد که عصاره آبی و الکلی موسیر، تاکسول و کربوپلاتین موجب کاهش چشمگیر توانایی زیستی سلولهای سرطانی شدند.
جدول1: غلظتهای مختلف تاکسول، کربوپلاتین، عصاره آبی و الکلی موسیر و غلظتهای همزمان
- غلظتهای مختلف عصاره آبی موسیر (01/0، 02/0، 03/0، 04/0، 05/0 گرم بر لیتر)
- غلظتهای مختلف عصاره الکلی (01/0، 02/0، 03/0، 04/0، 05/0 گرم بر لیتر)
- غلظتهای مختلف کربوپلاتین (100، 200، 300، 400، 500 میکروگرم بر میلیلیتر)
- ترکیب کربوپلاتین و عصاره: (01/0+100=1)، ( 02/0+200=2),( 03/0+300=3)، ( 04/0+400=4)، ( 05/0+500=5)
- غلظتهای مختلف تاکسول: (001/0، 01/0، 0، 1، 10 میکروگرم بر میلیلیتر)
- ترکیب تاکسول و عصاره: (01/0+001/0=1)، ( 02/0+01/0=2)، ( 03/0+1/0=3)، ( 04/0+1=4)، ( 05/0+10=5)
در آزمونهای بعدی تاکسول و کربوپلاتین را بهصورت همزمان با عصاره آبی و الکلی گیاه موسیر بهصورت تیمارهای 48 و 72 ساعته بر روی سلولها اثر داده (نمودار 1) و مشاهده شد که تاثیر همزمان عصاره الکلی موسیر با داروی تاکسول بهصورت وابسته به دوز باعث مهار بیشتر این سلولها میشود و این عصاره باعث افزایش تاثیر تاکسول بر روی سلولهای سرطانی میگردد. در حالیکه تاثیر همزمان عصاره آبی موسیر و تاکسول باعث کاهش سایتوتوکسیسیتی تاکسول شده و در تاثیر همزمان عصاره آبی و الکلی موسیر با کربوپلاتین، تاثیر همزمان این عصارهها با کربوپلاتین، باعث افزایش سایتوتوکسیسیتی کربوپلاتین شده است.
نمودار1: مقایسه میانگین توانایی زیستی رده سلولی4T1 و سلولهای القایی سرطان پستان پس از تیمار با غلظتهای مختلف عصاره آبی و الکلی، تاکسول،کربوپلاتین، تاثیر همزمان تاکسول و کربوپلاتین با عصارههای آبی و الکلی
1-1: مقایسه ی میانگین درصد حیات سلول های القایی با DMBA و سلول های رده 4T1 در تیمار با عصاره الکلی موسیر |
1-2: مقایسه ی میانگین درصد حیات سلول ها سلول های القایی با DMBAو سلول های رده 4T1 درتیمار با عصاره آبی موسیر |
1-3: تیمار 48 ساعته در رده سلولی4T1 |
1-4: تیمار 48 ساعته در رده سلولی 4T1 |
1-5: .تیمار 48ساعته در سلول های القاییبا DMBA |
1-6: .تیمار 48ساعته در سلول های القاییبا DMBA |
1-7: تیمار 72 ساعته در سلول های القاییبا DMBA |
1-8: تیمار 72 ساعته در سلول های القاییبا DMBA |
1-9: تیمار72 ساعته در سلول های القاییبا DMBA |
1-10: .تیمار 72 ساعته در رده سلولی 4T1 |
جهت بررسی مورفولوژی سلولی، سلولها قبل و بعد از تیمار با عصارهها بهدقت توسط میکروسکوپ اینورت مورد بررسی قرار گرفتند. سلولها قبل از تیمار با عصارهها بهصورت سالم و یکپارچه با هسته کاملا طبیعی ظاهر شدند. در این سلولها پس از تیمار با غلظتهای بالاتر و رنگآمیزی با پروپیدیوم یدید، غشا سیتوپلاسم در مقایسه با سلولهای شاهد تخریب شده بودند و رنگ PI بهدرون سلولهای آسیب دیده (تیمار شده با غلظتهای مختلف عصاره) راه یافته و لذا هسته این سلولها بهرنگ قرمز رنگآمیزی شدند. سلولهای شاهد (شکلهای 1 و 2، A) دارای غشا پلاسمایی سالم بوده و بهرنگ فلورسنت پروپیدیوم پوداید PI غیر قابل نفوذ بودند (شکلهای 1 و 2، B و E) و هسته سلولهای تیمار شده در رنگ آمیزی با هوخست بهصورت متراکم و قطعه قطعه مشاهده گردید (فلشها هستههای تغییر یافته در تیمارهای مختلف را نشان میدهند (شکلهای1 و 2، C و D).
تغییرات مرفولوژیک سلولها پس از تیمار با عصاره و دارو ، در مدت زمان 48 ساعت با استفاده از رنگ فلوروسنت هوخست شامل تغییر شکل هسته در مقایسه با گروه کنترل در زیر نشان داده شده است. (شکلهای 1و2).
شکل1: رنگآمیزیفلورسنسسلولهای سرطانی القایی با استفاده از DMBA برای مدت زمان 48 ساعت (بزرگنمایی × 40). فلشها هسته سلول های تغییر یافته و غشا سلولی آسیب دیده (هسته قرمز رنگ) بر اثر تیمار را نشان میدهند.A )نمونه شاهد، B) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 100میکرو گرم بر میلیلیتر کربوپلاتین و رنگ آمیزی همزمان هوخست و پروپیدیوم یوداید، C) سلولهای القایی DMBA تیمار شده با غلظت 01/0 میکرو گرو بر میلیلیتر تاکسول، D) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 03/0 گرم بر لیتر عصاره الکلی، E) سلولهای القایی DMBA تیمار شده با غلظت 04/0 گرم بر لیتر عصاره آبی و رنگ آمیزی همزمان هوخست و پروپیدیوم یوداید.
شکل 2: بررسی تغییرات مورفولوژیک و آپوپتوزیس برای مدت زمان 48 ساعت در رده سلولی 4T1 (بزرگنمایی ×40). فلشها هسته سلولهای تغییر یافته و غشا سلولی آسیب دیده (هسته قرمز رنگ) بر اثر تیمار را نشان میدهند. A) نمونه شاهد، B) سلول های 4T1 تیمار شده با غلظت100 میکرو گرم بر میلیلیتر کربوپلاتین، C) سلولهای 4T1 تیمار شده با غلظت 1/0 میکروگرم بر میلیلیتر تاکسول، D) تیمار سلولهای 4T1 با غلظت 04/0 گرم بر لیتر عصاره آبی، E) تیمار سلولهای 4T1 با غلظت 03/0 گرم بر لیتر عصاره الکلی موسیر.
بحث
بررسی توانایی زیستی سلولهای سرطانی با استفاده از دو آزمون تریپان بلو و MTT نشان داد که عصاره آبی و الکلی، تاکسول و کربوپلاتین موجب کاهش چشمگیر توانایی زیستی سلولهای سرطانی شدند. نتایچ بهدست آمده از هر دو آزمون در یک راستا بوده و یکدیگر را تایید نمودند.
سایر مطالعاتی که پیش از این در رابطه با اثرات سایتوتوکسیک تاکسول، کربوپلاتین، عصارهی آبی و الکلی موسیر صورت گرفته است نیز توانایی این ترکیبات در کاهش توانایی زیستی سلو لهای سرطانی را نشان دادهاند. مشخص شده که تاکسول با توقف رونویسی DNA در مرحله G2/M تقسیم میتوز (19) و کربوپلاتین با اتصال به DNA از طریق اتصالات عرضی بین رشتهای و تداخل با عملکرد آن (20) موجب مرگ سلولها میشود. بررسیهای صورت گرفته بر ردههای سلولیU373 ،A549 ، HeLa, MCF- 7, OVG-1,HT-29 ، PC-Sh، PC-Zd(21) NUGC-3، SC-M1(22) U937 ، SKOV3(23) OVCAR-3 و SK-OV-3 (24) همگی سایتوتوکسیسیتی بالای تاکسول و کربوپلاتین را نشان دادهاند.
مطالعاتی که تاکنون در رابطه با اثرات ضد تکثیری و سایتوتوکسیک عصاره آبی و الکلی موسیر برروی ردههای سلولی سرطانی Hela,MCF-7 و L-929 صورت گرفته نشان میدهد که این عصاره بر روی ردههای سلولی مختلف بسته به نوع سلول اثرات سایتوتوکسیک مختلفی اعمال میکند و IC50 عصاره برای هر رده سلولی متفاوت است (16).
تجزیه شیمیایی عصارهی موسیر نشان داده است که از نظر ترکیبات شیمیایی دارای دو ترکیب گوگردی آلیسین - آلیساتین 1و2، فلاونوئیدهایی از قبیل کوئرستین و ساپونینها میباشد که بخشی از خواص ضد سرطانی آن نیز ناشی از وجود همین ترکیبات میباشد (25).
هر چند که مکانیسم مهاری موسیر بهخوبی روشن نیست، اما نتایج برخی مطالعات نشان داده است که کوئرستین موجود در آن، اثرات ضد تکثیری خود را از طریق افزایش القای p53 و کاهش پروتئین های آنتیآپوپتوزی Survivin و Bcl-2 اعمال میکند (16) و همچنین آلیسین موجود در موسیر باعث تحریک تشکیل جسم آپوپتوتیک، توقف سیکل سلولی، متراکم شدن هسته، نردبانی شدن DNA و همچنین فعال شدن کاسپاز 3 ، 8 و 9 می شود (26). بههرحال نیاز به مطالعات بیشتر برای شناسایی اثر موسیر بر روی سلولهای سرطانی ضروری بهنظر میرسد.
در این مطالعه مشخص شد که تاکسول بهصورت وابسته به غلظت دارای اثر مهاری بر روی سلولهای سرطانی است ولی با افزایش تیمار از 48 به 72 ساعت، سایتوتوکسیسیتی تاکسول کاهش مییابد. اختلاف در نتایج مطالعه حاضر و تحقیق انجام شده بر روی سلولهای سرطانی MCF-7، HeLa ، A549، U373، HT-29، OVG-1، PC-Sh و PC-Zd (21)، ممکن است بهدلیل اختلاف در نوع سلول و غلظتهای تاکسول باشد.
بر اساس نتایج بهدست آمده از دو آزمون رنگ آمیزی تریپان بلو و رنگ سنجی MTT مشخص شد که استفاده همزمان تاکسول و عصاره آبی، باعث کاهش سایتوتوکسیسیتی تاکسول شده است در حالیکه درمورد تاثیر همزمان تاکسول و عصاره الکلی اینچنین نبوده است.
در طی یک بررسی نشان داده شد که فلاونوئید کوئرستین فعالیت تاکسول و نوکودازول را از طریق مداخله با سیکل سلولی مهار میکند (27). بنابراین شاید بتوان یکی از دلایل کاهش اثر سمیت تاکسول توسط عصاره آبی موسیر را ناشی از وجود کوئرستین در این عصاره دانست. همچنین در این بررسی مشخص شد که با افزایش تیمار از 48 به 72 ساعت، سایتوتوکسیسیتی کربوپلاتین نیز کاهش مییابد و استفاده همزمان کربوپلاتین و عصاره آبی والکلی، اثرات سایتوتوکسیک کربوپلاتین را در سطح معنیداری افزایش میدهد.
با این وجود انجام آزمایشات بیشتری جهت آنالیز ترکیبات شیمیایی موجود در هر یک از عصارهها و نوع تاثیرشان بر سلولهای سرطانی و برهم کنش آنها با داروهایی نظیر تاکسول و کربوپلاتین مورد نیاز میباشد.
از طرفی بهدنبال تیمار سلول های سرطانی با عصاره موسیر در مدت زمان 48 ساعت تغییرات مورفولوژیک از قبیل تغییر شکل و حبابدار شدن هسته و همچنین افزایش تعداد سلولهای مرده نیز مشاهده شد که میتواند علت آن، فعالیت آنزیمی درون سلولی باشدکه موجب تغییر شکل سلولهای تیمار شده باشد.
نتیجه گیری
سلولهای سرطانی القایی با استفاده از 4T1 و سلولهای القایی سرطان پستان پس از تیمار با غلظتهای مختلف عصاره آبی و الکلی، تاکسول،کربوپلاتین، تاثیر همزمان تاکسول و کربوپلاتین با عصارههای آبی و الکلی PI بهدرون سلولهای آسیب دیده (تیمار شده با غلظتهای مختلف عصاره) راه یافته و لذا هسته این سلولها بهرنگ قرمز رنگآمیزی شدند. سلولهای شاهد (شکلهای 1 و 2، A) دارای غشا پلاسمایی سالم بوده و بهرنگ فلورسنت پروپیدیوم پوداید PI غیر قابل نفوذ بودند (شکلهای 1 و 2، B و E). و هسته سلولهای تیمار شده در رنگ آمیزی با هوخست بهصورت متراکم و قطعه قطعه مشاهده گردید (فلشها هستههای تغییر یافته در تیمارهای مختلف را نشان میدهند (شکلهای1 و 2، C و D: DMBA برای مدت زمان 48 ساعت (بزرگنمایی × 40). فلشها هسته سلول های تغییر یافته و غشا سلولی آسیب دیده (هسته قرمز رنگ) بر اثر تیمار را نشان می دهند.A )نمونه شاهد، B) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 100میکرو گرم بر میلیلیتر کربوپلاتین و رنگ آمیزی همزمان هوخست و پروپیدیوم یوداید، C) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 01/0 میکرو گرو بر میلیلیتر تاکسول، D) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 03/0 گرم بر لیتر عصاره الکلی، E) سلول های القایی DMBA MTT نشان داد که عصاره آبی و الکلی، تاکسول و کربوپلاتین موجب کاهش چشمگیر توانایی زیستی سلولهای سرطانی شدند. نتایچ بهدست آمده از هر دو آزمون در یک راستا بوده و یکدیگر را تایید نمودند.
DNA در مرحله G2/M تقسیم میتوز (19) و کربوپلاتین با اتصال به DNA از طریق اتصالات عرضی بین رشتهای و تداخل با عملکرد آن (20) موجب مرگ سلولها میشود. بررسیهای صورت گرفته بر ردههای سلولیU373 ،A549 ، HeLa, MCF- 7, OVG-1,HT-29 ، PC-Sh،PC-Zd (21) NUGC-3، SC-M1 (22) U937 ، SKOV3 (23) OVCAR-3 و SK-OV-3 (24) همگیسایتوتوکسیسیتی بالای تاکسول و کربوپلاتین را نشان دادهاند.
سرطانی Hela, MCF-7 و L-929 صورت گرفته نشان میدهد که این عصاره بر روی ردههای سلولی مختلف بسته به نوع سلول اثرات سایتوتوکسیک مختلفی اعمال میکند و IC50 تجزیه شیمیایی عصارهی موسیر نشان داده است که از نظر ترکیبات شیمیایی دارای دو ترکیب گوگردی آلیسین - آلیساتین 1و2، فلاونوئیدهایی از قبیل کوئرستین و ساپونینها میباشد که بخشی از خواص ضد سرطانی آن نیز ناشی از وجود همین ترکیبات میباشد (25). هر چند که مکانیسم مهاری موسیر بهخوبی روشن نیست، اما نتایج برخی مطالعات نشان داده است که کوئرستین موجود در آن، اثرات ضد تکثیری خود را از طریق افزایش القای p53 و کاهش پروتئین های آنتی آپوپتوزی Survivin و Bcl-2 اعمال میکند (16) و همچنین آلیسین موجود در موسیر باعث تحریک تشکیل جسم آپوپتوتیک، توقف سیکل سلولی، متراکم شدن هسته، نردبانی شدن DNA و همچنین فعال شدن کاسپاز 3 ، 8 و 9 می شود (26). بههرحال نیاز به مطالعات بیشتر برای شناسایی اثر موسیر بر روی سلولهای سرطانی ضروری بهنظر میرسد.
Hela,MCF-7 و L-929 صورت گرفته نشان میدهد که این عصاره بر روی ردههای سلولی مختلف بسته به نوع سلول اثرات سایتوتوکسیک مختلفی اعمال میکند و IC50 بر اساس نتایج بهدست آمده از دو آزمون رنگ آمیزی تریپان بلو و رنگ سنجی MTT مشخص شد که استفاده همزمان تاکسول و عصاره آبی، باعث کاهش سایتوتوکسیسیتی تاکسول شده است در حالیکه درمورد تاثیر همزمان تاکسول و عصاره الکلی اینچنین نبوده است.
تشکر و قدردانی