مقدمه

سرطان همواره یکی از مشکلات عمده جوامع انسانی محسوب می‏شود.  از بین سرطان‏ها، سرطان پستان شایع‏ترین سرطان در میان زنان می‏باشد (1و2) و اغلب موارد سرطان‏های پستان منجر به مرگ‏، از نوع کارسینومای مجرایی مهاجم است (3). عوامل متعددی فرد را در معرض ابتلا به سرطان قرار می‌دهد که از بین آن‏ها می‏توان به تغییرات ژنتیکی، رژیم غذایی، شیردهی و فاکتورهای محیطی اشاره نمود. بالا بودن آمار مبتلایان به این نوع سرطان در کشورمان ضرورت انجام تحقیقات بیشتر برای پی بردن به مکانیسم‏های ایجاد سرطان و ابداع روش‏های درمانی موثرتر را آشکار می‏سازد. سرطان پستان را می‏توان در رت‏ها توسط انواع مختلفی از عوامل نظیر هورمون‏ها، پرتوهای یونیزان و مواد کارسینوژن ایجاد نمود اما یکی از پرکاربرد‏ترین روش‏های القا سرطان پستان در رت استفاده از نوعی ماده شیمیایی به‏نام 7 و 12 دی متیل بنزانتراسن می‏باشد که یک هیدروکربن آروماتیک چندحلقه‏ای است که به‏وفور در دود تنباکو یافت می‏شود (4). از طرفی پس از سال‏ها پیشرفت در زمینه بهداشت هنوز انواع سرطان و از جمله سرطان پستان از مشکلات اساسی در اغلب کشورهاست (5).

 در این میان مصرف گسترده داروهای رایج ضدسرطان از قبیل تاکسان و آنتراسیکلین‏ها موجب ایجاد مقاومت‏های درمانی نیز می‏شود به‏طوری‏که سایر گزینه‏های درمانی را نیز محدود می‏کنند (6).

مطالعات نشان می‏‏دهد که غذاها به‏خصوص غذاهای با منشا گیاهی، پتانسیل پیشگیری از حدود یک سوم سرطان‏ها را دارند (7). انسان در طی سالیان متمادی به اثرات مختلف درمانی عصاره‏های گیاهی پی برده است. از مزیت‏های شناخته شده این عصاره‏ها عدم وجود عوارض جانبی خطرناک و گستردگی طیف اثر آن‏ها می‌باشد. از جمله این گیاهان می‏توان به اعضای گونه Allium (سیر و پیاز و موسیر) اشاره نمود (8).

گیاه موسیر که گونه مهمی از جنس آلیوم (Allium) محسوب می‌گردد از دیرباز در بسیاری از کشورها از جمله ایران مصارف درمانی سنتی یا غذایی داشته است. این گیاه دارای خواص شناخته شده‌ای مثل اثر بر روی شاخص‏های هماتولوژیکی، پتانسیل آنتى اکسیدانتى، خواص ضد قارچ و ضد باکتریایی بوده که مورد مطالعه قرار گرفته است (12-9). علاوه بر این، ترکیب شیمیایی آن نشان می‏دهد که دارای ترکیبات زیادی مثل ارگانوسولفورها و پلی فنل‏ها بوده که بسیار مشابه ترکیبات موجود در گونه‏های هم خانواده آن می‏باشد (15-13). مطالعات قبلی در رابطه با اثرات ضد تکثیری و سایتوتوکسیک عصاره آبی و الکلی موسیر بر روی رده‏های سلولی سرطانی‏Hela ،MCF-7 و L-929 انجام شده است. نتایج آنها نشان می‏دهد عصاره آبی و الکلی موسیر اثرات سایتوتوکسیک مختلفی را اعمال می‏کند و IC50 عصاره برای هر رده سلولی متفاوت است (16). در مطالعه‏ حاضر اثر سایتوتوکسیسیتی عصاره آبی و الکلی موسیر بر روی رده سلولی 4T1 مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته است.

مواد و روش‏ها

ابتدا رده سلولی 4T1 سرطان پستان موش از انستیتو پاستور ایران خریداری شد و برای تهیه سلول‏های القایی،               پس از پایان دوره تیمار رت با DMBA- 7-12 Dimethylbenz(a)anthracene)) و رسیدن تومور به اندازه‌ی لازم، حیوان با رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی توسط دی‌اتیل‌اتر بی‏هوش شد. سپس موهای ناحیه اطراف تومور با تیغ تراشیده شده و محل تشریح با استفاده از الکل 70 درصد و ساولن رقیق شده استریل شد. پس از شکافتن قسمت مورد نظر تومور به‏طور کامل خارج و به زیر هود لامینار منتقل شد. از قسمت‏های داخلی‏تر تومور قطعاتی بریده شد و به فالکون‏های حاوی 10 میلی‏لیتر (Salt Soution HBSS Hank's Balanced) استریل انتقال داده شد.

سپس نمونه‏ها از HBSS خارج شده و در پتری استریل قرار داده شد و به آن محیط کشت تازه افزوده شد. پس از جدا کردن خون و بافت اضافه، باقیمانده تومور با اسکالپل به ذرات بسیار ریز خرد شد (chopping) و سوسپانسیون حاصله چندین بار از سوزن سرنگ 5 میلی‏لیتر عبور داده شد تا سلول‌ها به‏خوبی از بافت جدا شوند، سپس مخلوط به‏دست آمده به فالکون 15 میلی‏لیتر منتقل شده و با دور rpm2000 به‏مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد، پس از آن محلول رویی دورریخته شد. به‏رسوب ته فالکون 5 میلی‏لیتر محیط کشت DMEM)) Dulbecco's Modification of Eagles Medium کامل حاوی10 درصد FBS (Fetal bovine serum) اضافه گشت. پس از پیپتاژ کردن، 5/1 تا 2 میلی‏لیتر از مخلوط همگن شده به فلاسک‌های T25 منتقل شده و حجم محیط داخل فلاسک به 5 میلی‏لیتر ‌رسانده شد. سپس فلاسک داخل انکوباتور CO₂ دار قرار داده شد. پس از گذشت 24 ساعت محیط رویی فلاسک تخلیه و 5 میلی‏لیتر محیط کشت تازه به فلاسک افزوده گشت.

بعد از تهیه موسیر و  خشک شدن، آن‏را پودر نموده و سه مرتبه با اتانول 95 درصد (به نسبت 1به 5) برای مدت 24 ساعت در دمای اتاق عصاره گیری می‌شود. سپس فیلتر شده و پس از آن حلال جدا و عصاره تغلیظ گشت (17). برای تهیه عصاره آبی موسیر، حدود 100 گرم از پیازچه‏های سالم گیاه موسیر انتخاب و پوسته خارجی آن‏ها جدا شد. سپس پیازچه در یک دستگاه آسیاب برقی به‏صورت ماده نرم درآمده و پس از له شدن کامل بافت موسیر‏، به نسبت 1 به 1 آّب دیونیزه استریل مخلوط و با هم‏زن به آرامی همزده شد. پس از عصاره گیری کامل عصاره جهت صاف شدن تحت شرایط 14000دور در دقیقه به‏مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شده و مایع رویی جدا شد و با استفاده از دستگاه فریز درایر به‏صورت پودر خشک درآمده و در فریزر نگه‏داری شد و برای هر بار استفاده‏، مقدار مورد نیاز از آن وزن و در محیط کشت حل گردید (18). برای سنجش قدرت زیستی سلول‏های تیمار شده با تاکسول‏،کربوپلاتین‏، عصاره آبی و الکلی موسیر، ابتدا سلول‏ها با تریپسین جدا و پس از سانتریفوژ، رسوب سلولی با محیط کشت تازه به حجم یک میلی‏لیتر رسید و سپس مقدار 300 میکرولیتر ازسوسپانسیون سلولی حاصل با حجم مساوی از تریپان بلو مخلوط و به‏مدت 2 دقیقه در انکوباتور قرار داده شد . تعداد سلول‏های زنده و مرده با لام هموسایتومتر بررسی و به‏صورت درصد بیان شد. در این روش، سلول‏های مرده به‏علت نفوذ پذیری به تریپان بلو، به‏رنگ آبی دیده شد. علاوه بر روش تریپان بلو برای بررسی قدرت زیستی سلول‏های تیمار شده از روش (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) MTT assayنیز استفاده شد. در این روش آنزیم سوکسینات دهیدروژناز در میتوکندری توانایی احیای رنگ زرد دی متیل تیازول را به بلورهای ارغوانی و نامحلول فورمازان دارد. سلول‏های سرطانی  به‏مدت 24 ساعت در پلیت 96 خانه کشت و پس از چسبیدن این سلول‏ها به کف پلیت 96 خانه با غلظت‏های مذکور از تاکسول، کربوپلاتین‏، عصاره آبی و الکلی موسیر تیمار و پس از زمان‏های 48 و 72 ساعت 10 میکرولیتر MTT به‏ازای100 میکرولیتر از محیط کشت به چاهک‏ها اضافه و به‏مدت 4 ساعت انکوبه شد سپس بلور‏های فورمازان حاصل درDMSO  حل و جذب آن توسط    (enzyme-linked immunosorbent) ELISA reader (Model Bio-Rad 680) در طول موج 505 نانومتر اندازه‏گیری شد. سلول‏های چسبیده به پلیت 24 خانه با دوز 1/0‏ و 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر به‏ترتیب تاکسول و کربوپلاتین و 04/0 و 03/0 گرم بر لیتر برای عصاره آبی و الکلی به‏مدت 48 ساعت تیمار شد (با توجه به نتایج آماری آزمون‏های تریپان بلو و MTT در مرحله دوزیابی و مدت زمان 48 ساعت برای بررسی‏های مورفولوژی انتخاب شد). رنگ‏آمیزی کروماتین با هوخست برای مطالعه مورفولوژی هسته و پروپیدیم آیوداید همراه با هوخست برای تمایز بین سلول مرده و زنده توسط میکروسکوپ فلورسنس (Olympus, Japan) انجام گردید.

بررسی آپوپتوزیس و تغییرات مورفولوژیک سلول: در این مطالعه تغییرات آپوپتوزیس و مورفولوژیک سلول‏ها با استفاده از رنگ‏آمیزی فلورسانت هوخست و پروپیدیوم یدید بررسی شد. جهت بررسی وقوع مرگ سلولی و تشخیص آنکه مرگ سلولی از نوع آپوپتوزیس می‏باشد، از میکروسکوپ فلورسنس و رنگ‏آمیزی هوخست 33285 استفاده شد. در این رنگ‏آمیزی سلول‏های طبیعی به‏صورت رنگ آبی یکنواخت دیده می‏شوند، در صورتی‏که هسته سلول‏های دستخوش آپوپتوزیس به‏واسطه متراکم شدن کروماتین و قطعه قطعه شدن هسته، به‏طور غیر منظم و به‏صورت نقاط آبی درخشان قابل مشاهده خواهد بود. رنگ‏آمیزی با پروپیدیوم یدید نیز تخریب غشا و چروکیدگی سیتوپلاسم را نشان خواهد داد.

آنالیز آماری: با استفاده از نرم افزار آماری SPSS آنالیز واریانس یک‏طرفه ، آزمون Tukey بر روی داده‏ها انجام شد و 05/0 P < معنی‏دار تلقی گردید.

نتایج

در این پژوهش به‏منظور یافتن غلظتی از عصاره و دارو که بتواند زیستایی سلول‏ها را تا 50 درصد کاهش دهد، دوره تیمار 48 و 72 ساعته و محدوده‏های دوز از عصاره‏ها و داروها با توجه به مطالعات مشابه انتخاب شد (جدول 1). بعد از انجام آزمایش‏ها، داد‏ه‏های به‏دست آمده از این آزمون‏ها نشان داد که عصاره آبی و الکلی موسیر‏، تاکسول و کربوپلاتین موجب کاهش چشم‏گیر توانایی زیستی سلول‏های سرطانی شدند.

جدول1: غلظت‏های مختلف تاکسول، کربوپلاتین، عصاره آبی و الکلی موسیر و غلظت‏های هم‏زمان

در آزمون‏های بعدی تاکسول و کربوپلاتین را به‏صورت هم‏زمان با عصاره آبی و الکلی گیاه موسیر به‏صورت تیمارهای 48 و 72 ساعته بر روی سلول‏ها اثر داده (نمودار 1) و مشاهده شد که تاثیر هم‏زمان عصاره الکلی موسیر با داروی تاکسول به‏صورت وابسته به دوز باعث مهار بیشتر این سلول‏ها می‏شود و این عصاره باعث افزایش تاثیر تاکسول بر روی سلول‏های سرطانی می‏گردد. در حالی‏که تاثیر هم‏زمان عصاره آبی موسیر و تاکسول باعث کاهش سایتوتوکسیسیتی تاکسول شده و در تاثیر هم‏زمان عصاره  آبی و الکلی موسیر با کربوپلاتین‏، تاثیر هم‏زمان این عصاره‏ها با کربوپلاتین، باعث افزایش سایتوتوکسیسیتی کربوپلاتین شده است.

نمودار1: مقایسه میانگین توانایی زیستی رده سلولی4T1 و سلول‏های القایی سرطان پستان پس از تیمار با غلظت‏های مختلف عصاره آبی و الکلی، تاکسول،کربوپلاتین، تاثیر هم‏زمان تاکسول و کربوپلاتین با عصاره‏های آبی و الکلی

جهت بررسی مورفولوژی سلولی، سلول‏ها قبل و بعد از تیمار با عصاره‏ها به‏دقت توسط میکروسکوپ اینورت مورد بررسی قرار گرفتند. سلول‏ها قبل از تیمار با عصاره‏ها به‏صورت سالم و یکپارچه با هسته کاملا طبیعی ظاهر شدند. در این سلول‏ها پس از تیمار با غلظت‏های بالاتر و رنگ‏آمیزی با پروپیدیوم یدید‏، غشا سیتوپلاسم در مقایسه با سلول‏های شاهد تخریب شده بودند و رنگ PI به‏درون سلول‏های آسیب دیده (تیمار شده با غلظت‏های مختلف عصاره) راه یافته و لذا هسته این سلول‏ها به‏رنگ قرمز رنگ‏آمیزی شدند. سلول‏های شاهد (شکل‏های 1 و 2، A) دارای غشا پلاسمایی سالم بوده و به‏رنگ فلورسنت پروپیدیوم پوداید PI غیر قابل نفوذ بودند (شکل‏های 1 و 2، B و E) و هسته سلول‏های تیمار شده در رنگ آمیزی با هوخست به‏صورت متراکم و قطعه قطعه مشاهده گردید (فلش‏ها هسته‏های تغییر یافته در تیمارهای مختلف را نشان می‏دهند (شکل‏های1 و 2، C و D).

تغییرات مرفولوژیک سلول‏ها پس از تیمار با عصاره و دارو ، در مدت زمان 48 ساعت با استفاده از رنگ فلوروسنت هوخست شامل تغییر شکل هسته در مقایسه با گروه کنترل در زیر نشان داده شده است. (شکل‏های 1و2).

شکل1: رنگآمیزیفلورسنسسلول‏های سرطانی القایی با استفاده از DMBA  برای مدت زمان 48 ساعت (بزرگنمایی × 40). فلش‏ها هسته سلول های تغییر یافته و غشا سلولی آسیب دیده (هسته قرمز رنگ) بر اثر تیمار را نشان می‏دهند.A )نمونه شاهد، B) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 100میکرو گرم بر میلی‏لیتر کربوپلاتین و رنگ آمیزی هم‏زمان هوخست و پروپیدیوم یوداید، C) سلول‏های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 01/0  میکرو گرو بر میلی‏لیتر تاکسول، D) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 03/0 گرم بر لیتر عصاره الکلی، E) سلول‏های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 04/0 گرم بر لیتر عصاره آبی و رنگ آمیزی هم‏زمان هوخست و پروپیدیوم یوداید.

شکل 2: بررسی تغییرات مورفولوژیک و آپوپتوزیس برای مدت زمان 48 ساعت در رده سلولی 4T1   (بزرگنمایی ×40). فلش‏ها هسته سلول‏های تغییر یافته و غشا سلولی آسیب دیده (هسته قرمز رنگ) بر اثر تیمار را نشان می‏دهند. A) نمونه شاهد، B)  سلول های 4T1 تیمار شده با غلظت100 میکرو گرم بر میلی‏لیتر کربوپلاتین، C) سلول‏های 4T1 تیمار شده با غلظت 1/0 میکرو‏گرم بر میلی‏لیتر تاکسول، D) تیمار سلول‏های 4T1 با غلظت 04/0 گرم بر لیتر عصاره آبی، E) تیمار سلول‏های 4T1  با غلظت 03/0 گرم بر لیتر عصاره الکلی موسیر.