فصلنامه
نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)
2 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه بین المللی امام خمینی(ره)، قزوین، ایران
3 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاوری و منابع طبیعی، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)، قزوین، ایران
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Introduction: The anther culture technique is used in vitro for many plant species as an effective tool for obtaining haploid and doubled-haploid lines.
Aims: This study aimed to investigate the influence of different concentrations of iron oxide nanoparticles and benzylaminopurine (BAP) on callus formation, embryogenesis, regeneration, and rooting in bell pepper anther culture
Materials and Methods: The experiment was conducted as a factorial experiment in a completely randomized design under in vitro culture conditions. Flower buds of appropriate size (equal sepal to petal ratio or slightly longer petal) were collected from the greenhouse, and acetocarmine solution was used to determine the growth and development stage of microspores. The results showed that the most suitable stages for embryogenesis induction were the late mononuclear and early binuclear stages. In order to sterilize the flower buds, 70% ethanol for 30 seconds and 5% sodium hypochlorite for 20 minutes were used, and after each stage, they were washed three times with sterile distilled water. Then, the anthers were separated from the flower bud and placed in C medium containing 2 mg/L naphthalene acetic acid (NAA), different concentrations of BAP (0, 0.1, 0.5, and 1 mg/L), and different concentrations of iron oxide nanoparticles (0, 1, 10, and 20 mg/L). After that, the explants cultured in C medium were kept at 35°C in a dark place for 8 days in order to apply heat treatment. Then, they were transferred to 25°C in the light for 4 days. After this period, in order to induce embryogenesis, the explants were transferred from C medium to R medium and were subcultured every three weeks until embryos emerged. For further growth and root development, the embryos were transferred to V medium.
Results: The analysis of variance showed that different concentrations of iron oxide nanoparticles had a significant effect on the percentages of embryogenesis, regeneration, and rooting, but had no significant effect on the percentage of callus formation. The results of the mean comparison showed that among the different concentrations of iron oxide nanoparticles, the 1 mg/L treatment produced the highest embryogenesis percentage (11.11%). Furthermore, the mean comparison results for regeneration indicated that the 1 mg/L treatment resulted in the highest regeneration percentage (16.66%). The results of the interaction effects showed that among the different concentrations of iron oxide nanoparticles and BAP, the highest percentage of embryogenesis was observed in the treatment of 20 mg/L iron oxide nanoparticles and 0 mg/L BAP. Also, the treatment of 20 mg/L iron oxide nanoparticles and 0 mg/L BAP had the highest percentage of regeneration (33.33%). After sufficient growth and root formation, the obtained plants were removed from the glass culture containers and transferred to pots containing sterilized culture medium and watered for adaptation. The tops of the pots were covered with plastic cups, and after three days, the cups were pierced, and the plastic was gradually removed from the plant for further adaptation. Ploidy levels were determined by chromosome counting after staining the root tip cells. The results showed that out of the 23 obtained plants, 21 were diploid and had 2n=2x=24 chromosomes, and 2 were haploid and had n=x=12 chromosomes.
Discussion: Applying different concentrations of iron oxide nanoparticles in medium C had a positive effect on the regeneration of bell pepper plants. Iron is a vital micronutrient for several key cellular processes in plants. In addition, iron is essential for ensuring the structural integrity of proteins. Iron nanoparticles positively affect plant growth in tissue culture by increasing morphological parameters. The beneficial effects of nanoparticles on plants are related to their high solubility and reactivity, which affect how they interact with membranes and other cellular components, due to their large specific surface area. The treatment of 20 mg/L of nanoparticles and 0 mg/L of BAP had the highest regeneration percentage. The culture medium containing nano-iron leads to the plant benefiting from the element iron directly at all different stages of growth and its participation with other nutrients, and therefore the production of many nutrients containing it leads to the transfer of their excess to different parts of the plant. The presence of nano iron in the culture medium has led to a nutritional balance in the plant and, as a result, has improved the plant growth process by increasing the amount of nutrients and elements accumulated in the microsample. Cytokinins act as a nutrient reservoir, which leads to an increase in the percentage of elements in the microsample and an increase in the percentage of sugars in the culture medium, which is important in the structural processes in tissues and affects the accumulation of sugars in it, and is reflected in increased vegetative growth.
Conclusion: In bell pepper anther culture, different concentrations of iron oxide nanoparticles, along with plant growth regulators at different concentrations, showed a great effect on embryogenesis, regeneration, and rooting.
کلیدواژهها English
مقدمه
فلفل دلمهای با نام علمی Capsicum annuum از خانواده Solanacea میباشد که اهمیت اقتصادی و غذایی بسیار زیادی دارد (1). فلفل دلمهای یک گیاه گلدار دولپهای است که در نواحی معتدله بهصورت یک ساله ولی در نواحی گرمسیری ممکن است رشد آن تا چند سال تداوم داشته باشد. فلفل گیاهی خودگشن است اما بر اساس تعداد و میزان فعالیت زنبورها در طول دوره گردهافشانی، دگرگشنی هم در این گیاه دیده شده است (2). گلهای فلفل دوجنسی (Hermaphrodite)، کامل و دارای اندامهای جنسی نر و ماده هستند. کشت بافت گیاهی هسته زیست شناسی گیاهی است که برای حفاظت، تکثیر انبوه، دستکاری ژنتیکی، تولید ترکیبات زیست فعال و بهبود گیاه مهم است. ازجمله روشهای درون شیشهای القای هاپلوئیدی میتوان به آندروژنز (کشت بساک و میکرسپور) و ژینوژنز (کشت تخمک و تخمدان) اشاره نمود (3). آندروژنز را میتوان به سه مرحله 1- القای جنینزایی 2- باززایی هاپلوئیدها و بهدنبال آن 3- دابلینگ کروموزوم مصنوعی متمایز کرد (4، 5). تکنیک کشت بساک در شرایط آزمایشگاهی در بسیاری از گونههای گیاهی بهعنوان ابزاری موثر در بهدست آوردن خطوط هاپلوئید و دابل هاپلوئید استفاده میشود (6). بسته به نوع گونههای گیاهی و تا حدودی محیط کشت، گرده آندروژنی یا مستقیما تبدیل به جنین میشود و گیاهچه را بهوجود میآورد یا بهصورت غیرمستقیم ابتدا کالوس تشکیل میدهد و بعد جنین را ایجاد میکند و در نهایت تبدیل به گیاهچه میشود (7). بدینترتیب با دوبرابر کردن کروموزومها در گیاهان هاپلوئید میتوان لاینهای هموزیگوت پایدار ژنتیکی را در زمان کوتاهی بهدست آورد. چنین گیاهانی در برنامههای اصلاحی برای تولید واریتههای جدید مورد استفاده قرار گرفتهاند (3). در خانواده سولاناسه، فلفل از نظر پاسخدهی به آندروژنز در رتبه سوم قرار دارد. برخی از ژنوتیپهای فلفل مقاوم هستند و فراوانی جنینزایی در کشت بساک هنوز کم است و یا اصلا واکنشی مشاهده نمیشود (8). از جمله مهمترین عوامل تاثیرگذار در کشت بساک گیاه فلفل دلمهای میتوان به ژنوتیپ و شرایط فیزیولوژیک گیاهان دهنده بساک، توسعه مرحله میکروسپور و اندزه غنچه، اعمال تیمارهای سرمایی و گرمایی، ترکیبات محیط کشت و تنظیمکنندههای رشد گیاهی اشاره کرد (9، 10). نانو تکنولوژی بهعنوان یک فناوری جدید در دهههای اخیر مورد توجه قرار گرفته است. نانو ذرات، ذراتی به ابعاد 1 تا 100 نانومتر هستند و دارای ویژگی مهمی مانند نسبت سطح به حجم بالا، ویژگیهای نوری، حرارتی و الکتریکی هستند که دارای خواص فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی برجستهای از نظر جذب و فعالیت هستند (11). درسالهای اخیر، کاربرد نانوذرات با موفقیت منجر به حذف آلایندههای میکروبی از ریزنمونهها شده و نقش مثبت نانوذرات در القای کالوس، اندامزایی، جنینزایی جسمی، تنوع سوماکلونال و تولید متابولیت ثانویه نشان داده شده است (12). در کشت بافت گیاهی گزارشهای متعدی وجود دارد که نشان دهنده ورودیهای مثبت فناوری نانو است. نانوذرات بهطور گستردهای برای بهبود جوانهزنی بذر استفاده شده است (13، 14). ادغام نانوذرات طلا در محیط کشت MS باعث بهبود جوانهزنی بذر و رشد گیاهچه در Arabidopsis thaliana شد و طول غلاف و تعداد دانه در گیاهان تیمار شده با 10 میکرو گرم بر میلیلیتر نانوذرات طلا بیشتر بود. تیمار با نانوذرات طلا فعالیت آنتی اکسیدانتی را بهبود بخشید و منجر به کاهش بیان (miR398 وmiR408) شد. این تغییرات فیزیولوژیکی و مولکولی ممکن است مسئول اثرات مفید نانوذرات طلا باشد (15). در Brassica nigra افزودن نانوذرات اکسیدروی (500 تا 1500 میلیگرم در لیتر) به محیط کشت MS از جوانهزنی بذر جلوگیری کرد. در حضور نانوذرات اکسیدروی، طول ساقه و ریشه بهطور قابل توجهی تحت تاثیر قرار گرفتند. از سوی دیگر، رشد ریز نمونههای ساقه روی محیط کشت MS حاوی 1 تا 20 میلیگرم در لیتر نانوذرات اکسیدروی منجر به تشکیل ریشه شد (16). افزودن 5/0 میلیگرم در لیتر نانوذرات مس و 8/0 میلیگرم در لیتر کبالت به محیط کشت اصلاح شده MS باعث افزایش تعداد شاخهها، طول ساقه و ریشهزایی در Mentha longifolia شد (17). تاثیر نانو مواد بسته به ترکیب شیمیایی، دوز، اندازه، پایداری و نوع ترکیب محیط کشت، روش کاربرد، نوع ریز نمونه و گونه گیاهی آنها متفاوت است (18). هدف از این پژوهش بررسی آندروژنز از طریق کشت بساک در گیاه فلفل دلمهای و تاثیر نانوذره اکسید آهن در کالوسزایی، جنینزایی، باززایی و تولید گیاهان هاپلوئید میباشد.
2- مواد و روشها
مواد گیاهی: در این مطالعه از یک نوع ژنوتیپ فلفل دلمهای (Nirvin) استفاده شد. جوانههای گل در اندازه مناسب (نسبت بین کاسبرگ و گلبرگ برابر و یا گلبرگ کمی بلندتر) از گلخانه جمع آوری شده و به آزمایشگاه کشت بافت دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) انتقال یافتند.
تعیین مرحله رشد و نمو میکروسپورها: بهمنظور تعیین مرحله رشد و نمو میکروسپورها، بساکها از جوانههای گل جدا و برای رنگآمیزی از محلول استوکارمین استفاده شد. بدینصورت که یک گرم پودر کارمن در 45 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال حل شد. سپس 55 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه و بهمدت 5 دقیقه جوشانده شد. برای تشدید رنگ 1 تا 2 قطره هیدروکسید آهن به آن اضافه شد. بساکها پس از رنگآمیزی روی لام آزمایشگاهی له و میکروسپورهای آنها زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شدند (19). در بسیاری از گونهها مناسبترین مرحله برای القای جنینزایی، اواخر تکهستهای تا اوایل دوهستهای (پس از اولین میتوز دانه گرده) است (شکل 1 ب و ت).
ضدعفونی جوانههای گل: بهمنظور ضدعفونی سطحی، ابتدا جوانههای گل بهمدت یک ساعت زیر آب شهری قرار گرفتند. سپس در داخل هود لامینار ایرفلو سه بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. در ادامه بهمدت 30 ثانیه با اتانول 70 درصد (حجم به حجم) و پس از آن بهمدت 20 دقیقه با هیپوکلریت سدیم 5 درصد (وزن به حجم) ضدعفونی شدند. پس از هر مرحله 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند (20).
کشت بساک: پس از مراحل استریل، بساکها از جوانههای گل جدا و در محیط کشت C (Dumas de Valux, 1981) حاوی 2 میلیگرم در لیتر NAA، غلظتهای مختلف BAP (0، 1/0، 5/0 و 1 میلیگرم در لیتر) و غلظتهای مختلف نانوذره اکسید آهن (0، 1، 10 و 20 میلیگرم در لیتر) قرار گرفتند (21، 22). ریزنمونههای کشت شده در محیط کشت C (جدول1) بهمدت 8 روز در تاریکی و دمای 35 درجه سانتیگراد جهت اعمال تیمار گرمایی در آون نگهداری شدند. پس از آن بهمدت 4 روز به روشنایی و دمای 25 درجه سانتیگراد در اتاقک رشد انتقال داده شدند. بهمنظور القای جنینزایی، ریزنمونهها از محیط کشت C به محیط کشت R (جدول1) حاوی 2 میلیگرم در لیتر NAA، چهار غلظت BAP (0، 1/0، 5/0 و 1 میلیگرم در لیتر) و چهار غلظت نانوذره اکسید آهن (0، 1، 10 و 20 میلیگرم در لیتر) انتقال یافتند و هر سه هفته یک بار واکشت شدند. پس از ظهور جنینها در محیط کشت R، آنها به محیط کشت V (جدول1) که فاقد تنظیم کنندههای رشد گیاهی است جهت توسعه ریشه و رشد بیشتر گیاه انتقال داده شدند.
سازگار کردن گیاهان حاصل از کشت بساک: گیاهچههای بهدست آمده پس از رشد کافی و تشکیل ریشه، از ظروف کشت شیشهای خارج و ابتدا ریشهها با آب مقطر شسته شدند. سپس به گلدانهای کوچک حاوی بستر کشت ضدعفونی شده با اتوکلاو (پرلیت، پیت ماس، کوکوپیت و خاک مزرعه به نسبت 25 درصد) منتقل و آبیاری شدند و درشرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در ژرمیناتور قرار گرفتند. گلدان حاوی گیاهچه برای اینکه رطوبت نسبی در حد بالایی حفظ شود، بوسیله نایلون یا لیوان پلاستیکی پوشانده شدند. پس از گذشت سه روز، پلاستیکها سوراخ گردید و بهتدریج پلاستیک از روی گیاه برداشته شد تا سازگاری کامل گیاه انجام شود (شکل 2 پ و ت).
جدول 1: عناصر تشکیل دهنده محیط کشت C، R و V
|
MediumV (mg/L) |
Medium R (mg/L) |
Medium C (mg/L) |
|
|
1900 1650 370 440 170 - - - - |
2150 1238 412 313 142 50 38 34 7 |
2150 1238 412 313 142 50 38 34 7 |
Macroelements KNO3 NH4NO3 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O KH2PO4 Ca(NO3)2.4H2O NaH2PO4.H2O (NH4)2SO4 KCl |
|
0/076 1/000 1/000 0/010 - 0/030 - 0/050 0/030 |
20/130 3/225 1/550 0/330 0/138 0/011 0/011 - - |
22/130 3/625 3/150 0/695 0/188 0/016 0/016 - - |
Microelements MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O AlCl3.6H2O NiCl2.6H2O |
|
100/00 5/500 0/700 0/600 0/500 - 0/005 0/100 |
100/00 5/500 0/700 0/600 0/500 - 0/005 0/100 |
100/00 5/500 0/700 0/600 0/500 0/030 0/005 0/100 |
Vitamin and amino acid Myo-inositol Pyridoxine HCl Nicotinic acide Thiamine HCl Calcium pantothenate Vitamin B12 Biotin Glycine |
|
37/30 27/28 |
18/65 13/90 |
18/65 13/90 |
Chelated iron Na2 EDTA FeSO4.7H2O |
آزمایش سیتولوژیکی برای شمارش تعداد کروموزومها: ریشههای جوان بهطول 1 تا 2 سانتیمتر جدا و بهمدت 3 ساعت در داخل کلشیسین 05/0 درصد قرار گرفتند. سپس سه بار با آب مقطر شسته شده و بهمدت 24 ساعت در محلول تثبیتکننده لویتسکی (فرمالدهید 10 درصد و اسید کرومیک 1 درصد به نسبت 1:1) در دمای 4 درجه منتقل شدند. پس از آن بهمدت 3 ساعت زیر آب شهری قرار گرفتند و در دمای 20- درجه سانتیگراد در اتانول 70 درصد نگهداری شدند. هیدرولیز ریشهها در NaOH یک نرمال بهمدت 20 دقیقه در دمای 60 درجه سانتیگراد انجام شد. بهمنظور رنگ آمیزی ریشهها از محلول هماتوکسیلین بهمدت 14 ساعت در تاریکی استفاده شد. در نهایت برای نرم شدن کامل بافت ریشه و تهیه لام، نوک ریشهها بهمدت 2 ساعت در آنزیم سیتاز قرار گرفت (23).
3- آنالیز آماری
آزمایش بهصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در 3 تکرار برای تیمارها انجام شد. مقایسه میانگین دادهها با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن صورت گرفت و برای تجزیه آماری دادههای حاصل از پژوهش از نرم افزار SPSS استفاده شد.
4- نتایج
نتایج آزمایش تعیین مرحله رشد و نمو میکروسپورهای فلفل نشان داد که در اکثر موارد جوانههایی از گل مناسب هستند که اندازه گلبرگ و کاسبرگ با هم برابر و یا گلبرگ کمی بلندتر باشد و نیمی از بساکها بنفش رنگ باشند (شکل1 الف و ب). جوانههایی که در این مرحله از رشد قرار دارند عمدتا حاوی میکروسپورهایی در انتهای مرحله تک هستهای یا ابتدای مرحله دوهستهای هستند (شکل 1 پ و ت). ریز نمونهها پس از انتقال به محیط کشت C و اعمال تیمار گرمایی در دمای 35 درجه سانتیگراد بهمدت 8 روز متورم شدند. پس از گذشت 14 تا 20 روز، بساکها شروع به کالوسزایی کردند و پس از گذشت 40 تا 50 روز در محیط کشت R، جنینها بر روی کالوس القا شدند. مراحل جنینزایی کروی، قلبی، اژدری و کوتیلدونی در شکل 1 نشان داده شده است. بهمنظور رشد جنینها و تولید گیاهچه، آنها به محیط کشت V بدون تنظیم کنندههای رشد گیاهی منتقل شدند.
شکل1: مراحل مختلف کشت بساک فلفل، القا کالوس و جنینزایی. (الف) جوانه گل فلفل در اندازه مناسب جهت کشت بساک، (ب) بساک فلفل (نوک بساکها بنفش رنگ است)، (پ) میکروسپورهای فلفل دلمهای در مرحله تک هستهای، (ت) میکروسپورهای فلفل دلمهای در مرحله ابتدای دوهستهای، (ث و ج) جنینهای کروی شکل، (چ و ح) جنین قلبی شکل، (خ) جنین اژدری شکل، (د، ذ و ر) جنین کوتیلدونی.
در این مطالعه، 31 گیاهچه حاصل گردید و 23 گیاه رشد خود را کامل نمودند (شکل 2 الف و ب). با شمارش تعداد کروموزومها مشخص شد که 21 عدد از گیاهان دیپلوئید و دارای 2n=2x=24 کروموزوم و 2 عدد از گیاهان هاپلوئید و دارای n=x=12 کروموزوم هستند (شکل2 ث و ج).
شکل 2: سازگاری گیاهان و تعیین سطوح پلوئیدی آنها. (الف و ب) گیاهان کامل و احیا شده داخل شیشه، (پ) افزایش رطوبت نسبی محیط توسط پوشش پلاستیکی شفاف، (ت) برداشتن پوشش پلاستیکی برای سازگاری کامل گیاه، (ث) تصویری از کروموزوم یک گیاه دیپلوئید، (ج) تصویری از کروموزوم یک گیاه هاپلوئید.
نتایج حاصل از تجزیه واریانس اثر اصلی و متقابل سیتوکینین و نانوذره اکسید آهن برای صفات مورد مطالعه (درصد کالوسزایی، جنینزایی، باززایی و ریشهزایی) در جدول 2 نشان داده شده است. اثر اصلی و متقابل سیتوکینین و نانوذره اکسید آهن بر درصد جنینزایی، باززایی و ریشهزایی از نظر آماری در سطح احتمال یک درصد معنیدار شد ولی بر درصد کالوسزایی از نظر آماری تفاوت معنیداری را نشان نداد.
جدول 2: جدول تجزیه واریانس اثر اصلی و متقابل سیتوکینین و نانوذره اکسید آهن بر درصد کالوسزایی، جنینزایی، باززایی و ریشهزایی
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|||
|
درصدکالوسزایی |
درصد جنینزایی |
درصد باززایی |
درصد ریشهزایی |
||
|
سیتوکینین |
3 |
ns 104/52 |
** 935/1033 |
** 882/437 |
** 536/523 |
|
نانوذره اکسید آهن |
3 |
ns 666/36 |
** 255/509 |
** 155/268 |
** 922/204 |
|
سیتوکینین × نانوذره اکسید آهن |
9 |
ns 250/57 |
** 036/216 |
** 262/309 |
** 171/115 |
|
خطا |
32 |
894/57 |
182/21 |
602/1 |
362/5 |
|
ضریب تغییرات (%) |
|
93/7 |
49/25 |
75/11 |
08/18 |
**و ns : بهترتیب نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح احتمال 1 درصد و غیر معنیدار میباشد.
نتایج مقایسه میانگین درصد جنینزایی بر غلظتهای مختلف BAP نشان داد که تیمار 5/0 میلیگرم در لیتر BAP دارای بیشترین درصد جنینزایی (38/26 درصد) و تیمار 1 میلیگرم در لیتر BAP دارای کمترین درصد جنینزایی (94/6 درصد) است که از نظر آماری دارای تفاوت معنیدار بودند (شکل 3).
شکل3: مقایسه میانگین درصد جنینزایی در غلظتهای مختلف هورمونBAP
تیمار 1 میلیگرم در لیتر نانوذره اکسید آهن بیشترین درصد جنینزایی (38/26 درصد) و تیمار 10 میلیگرم در لیتر نانوذره اکسید آهن کمترین درصد جنینزایی (11/11 درصد) را نشان دادند که از نظر آماری دارای اختلاف معنیدار بودند (شکل 4).
شکل4: مقایسه میانگین درصد جنینزایی در غلظتهای مختلف نانوذره اکسید آهن
مقایسه میانگین اثرات متقابل سیتوکینین و نانوذره اکسید آهن بر درصد جنینزایی نشان داد که در تیمار 2 میلیگرم در لیتر NAA، صفر میلیگرم در لیتر BAP بههمراه غلظتهای مختلف نانوذره اکسید آهن، تیمار 20 میلیگرم در لیتر نانوذره اکسید آهن بیشترین درصد جنینزایی (88/38 درصد) را دارد (شکل 5).
شکل5: مقایسه میانگین اثر متقابل BAP و نانوذره اکسید آهن بر درصد جنینزایی
نتایج مقایسه میانگین درصد باززایی در غلظتهای مختلف BAP در شکل 6 نشان داد که بیشترین درصد باززایی (66/16 درصد) در تیمار صفر میلیگرم در لیتر BAP و کمترین آن در تیمار 1 میلیگرم در لیتر BAP حاصل شد که از لحاظ آماری تفاوت معنیداری را با یکدیگر نشان دادند.
شکل 6: مقایسه میانگین درصد باززایی در غلظتهای مختلفBAP
اثر نانوذره بر درصد باززایی در شکل 7 مشخص کرد که تیمار 1 میلیگرم در لیتر نانوذره اکسید آهن دارای بیشترین درصد باززایی (66/16 درصد) و تیمار صفر و 10 میلیگرم در لیتر نانوذره دارای کمترین درصد باززایی (94/6 درصد) است که از نظر آماری تفاوت معنیداری بین کمترین و بیشترین درصد باززایی مشاهده شد.
شکل 7: مقایسه میانگین اثر نانوذره اکسید آهن بر درصد باززایی
مقایسه میانگین اثرات متقابل سیتوکینین و نانوذره اکسید آهن نشان داد که تیمار صفر میلیگرم در لیتر BAP و 20 میلیگرم در لیتر نانوذره اکسید آهن دارای بیشترین درصد باززایی (33/33 درصد) است (شکل 8).
شکل 8: مقایسه میانگین اثرات متقابل BAP و نانوذره اکسید آهن بر درصد باززایی
نتایج مقایسه میانگین اثر سیتوکینین بر درصد ریشهزایی نشان داد که بیشترین درصد ریشهزایی(05/18 درصد) در تیمار 5/0 میلیگرم در لیتر BAP و کمترین درصد ریشهزایی (16/4 درصد) در تیمار 1 میلیگرم در لیتر BAP مشاهده شد که از نظر آماری دارای تفاوت معنیدار بودند ( شکل 9).
شکل 9: مقایسه میانگین درصد ریشهزایی در غلظتهای مختلف BAP
همچنین اثر نانوذره بر درصد ریشهزایی نشان داد که تیمار 1 میلیگرم در لیتر نانوذره اکسید آهن دارای بیشترین درصد ریشهزایی (05/18 درصد) و کمترین آن (33/8 درصد) در تیمار صفر میلیگرم در لیتر نانوذره اکسید آهن بهدست آمد که از نظر آماری تفاوت معنیداری بین آنها مشاهده شد (شکل 10).
شکل 10: مقایسه میانگین درصد ریشهزایی در غلظتهای مختلف نانوذره اکسید آهن
اثرات متقابل سیتوکینین و نانوذره بر درصد ریشهزایی نشان داد که تیمار 5/0 میلیگرم در لیتر BAP و 20 میلیگرم در لیتر نانوذره اکسید آهن دارای بیشترین درصد ریشهزایی است (شکل 11).
شکل 11: مقایسه میانگین اثر متقابل BAP و نانوذره اکسید آهن بر درصد ریشهزایی
5- بحث
انتخاب مناسب مرحله رشد میکروسپور عامل مهمی برای شروع کشت است، زیرا فقط مراحل خاصی از رشد و نمو میکروسپور به جنینزایی پاسخ میدهند (24، 25). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که مناسب ترین مرحله برای رشد جنین آندروژنی در فلفل، میکروسپورهایی که در مرحله تک هستهای و ابتدای دو هستهای قرار دارند که این نتایج با نتایج سایر پژوهشگران مطابقت دارد (26- 29). بسیاری از محصولات ژنی مخصوص مرحله اسپورفیت، قبل از میوز از سیتوپلاسم حذف میشوند و این باعث میشود که سلول در مرحله تک هستهای، از نظر تمایز آزادانه عمل نماید، در حالیکه معمولا پس از میتوز دانه گرده، ژنهای مخصوص مرحله گامتوفیتی رونویسی میشوند. بعد از تقسیم میتوز، سیتوپلاسم حاوی اطلاعات گامتوفیت است، تا در نهایت گامت نر ایجاد شود. وجود برخی عوامل از جمله برخی تنشها در این مراحل میتواند برنامه گامتوفیتی را متوقف کرده و باعث ظهور ژنهای اختصاصی اسپورفیتی شوند که نتیجه آن تغییر مسیر سلول از گامتوفیتی به اسپورفیتی است (30). پیش تیمار دمایی بهعنوان یکی از موثرترین روشها برای القای آندروژنز در کشت بساک فلفل در نظر گرفته میشود اما نوع پیش تیمار مورد استفاده (دمای پایین یا بالا) و مدت زمان پیش تیمار بسته به واریته یا ژنوتیپ متفاوت است (31، 32). در مطالعه حاضر اعمال تیمار گرمایی بهمدت 8 روز در دمای 35 درجه سانتیگراد نقش مثبتی بر آندروژنز گیاه فلفل داشت. طی مطالعهای که توسط حیدری و همکاران (33) انجام شد آنها نشان دادند که اعمال تیمار حرارتی در کشت بساک فلفل از 4 تا 12 روز پاسخ آندروژنز را تحریک و بهترین نتایج را در هشت روز نشان میدهد و تیمار بساکها در دمای 25 درجه سانتیگراد (بدون شوک حرارتی)، باعث عدم تولید جنین شد. همچنین مطالعات آنها نشان داد که ژن کد کننده شوک گرمایی موجب تخریب دوک تقسیم و میکروتوبولها شده و به اینترتیب موجب بازآرایی اسکلت سلولی و در نتیجه تغییر در چرخه سلولی میکروسپورها بهسمت رویانزایی میشوند. استفاده از دوره تنش گرمایی حیاتی است و یک دوره کوتاه تیمار گرمایی نمیتواند تغییرات فراساختاری کافی را ایجاد کند و میکروسپورها تمایل دارند مسیر گامتوفیتی را دنبال کنند (33). نتایج این مطالعه نشان داد که بهکارگیری غلظتهای مختلف نانوذره اکسید آهن در محیط کشت C بر جنینزایی، باززایی و ریشهزایی گیاه تاثیر مثبت دارد (جدول2). نتایج مطالعه ایرانبخش و قادری (21) نشان داد که بهکارگیری نانواکسید آهن در غلظتهای مناسب میتواند موجب افزایش راندمان تولید گیاهان بهویژه در شرایط درون شیشه شود که با نتایج مطالعه فوق مطابقت دارد و بهکاربردن غلظتهای مختلف نانوذره اکسید آهن در محیط کشت C تاثیر مثبتی در باززایی گیاه فلفل دلمهای داشت (شکل 7 و 8). نتایج مطالعات السیه (34) نشان داد که افزودن نانوذرات نقره به محیط کشت در جنینزایی سوماتیک، طول جنین، تمایز جنین به برگ و طول برگها در درخت خرما تاثیر مثبتی دارد. غلظتهای مختلف نانوذرات نقره در محیط کشت MS تاثیرات متفاوتی را بر جنینزایی نشان دادند. محیط کشت حاوی 1 میلیلیتر در لیتر نانوذرات نقره بهترین محیط برای تمایز کالوس جنینزا بود و بیشترین تعداد جنین سوماتیک را تولید کرد. افزایش غلظت نانوذرات به بالاتر از 1 میلیلیتر در لیتر باعث کاهش تعداد جنین ها و طول آن شد که کمتر از تیمار شاهد بود، به این معنی که غلظتهای پایین نانوذرات نقره باعث تکثیر و نمو میشود درحالیکه افزایش غلظت نانوذرات نقره (2 و 4 میلیلیتر در لیتر) مانع از رشد میشود (34). در مطالعه حاضر افزودن نانوذرات اکسید آهن به محیط کشت C تاثیر مثبتی بر جنینزایی گیاه فلفل نشان داد که با مطالعه السیه مطابقت دارد (شکل 4 و 5). ولی بیشترین درصد جنینزایی در غلظت 1 میلیگرم در لیتر نانوذره اکسید آهن و بعد از آن در غلظت 20 میلیگرم در لیتر نانوذره اکسید آهن مشاهده شد (شکل 4) که با توجه به نوع نانوذره و غلظت آن، همچنین نوع محیط کشت مورد استفاده، تنظیم کنندههای رشد در غلظتهای متفاوت و نوع گیاه مورد مطالعه، پاسخهای متفاوتی با مطالعات السیه مشاهده شد. طی مطالعهای دیگر که بر روی ریز نمونه هیپوکوتیل گیاه کلزا انجام شد، نتایج نشان داد که غلظت 10 میلیگرم در لیتر نانوذرات اکسیدروی میتواند باعث ایجاد کالوس و باززایی شاخساره شود، در حالیکه غلظتهای بالاتر ( 25، 50 و 100 میلیگرم در لیتر) مانع از باززایی شاخساره شد (35). در مطالعهای دیگر مشخص شد که نانوذرات مس و نقره کاندیدای بالقوه برای تقویت جنینزایی سوماتیک و باززایی ریزنمونههای جنین بالغ گندم هستند. بیشترین کالوسهای جنینزا در محیط غنی شده با 3 میلیگرم در لیتر نانوذرات نقره در مقایسه با شاهد و سایر تیمارها مشاهده شد (36). افزودن نانوذرات به محیط کشت بافت گیاهی با تغییر فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانتی، بیان ژن، مهار تولید اتیلن بر تکثیر کالوس، تکثیر اندام هوایی، جنینزایی و ریشهزایی تاثیر میگذارد (37). در Tecomella unduIata درصد القای شاخساره، تعداد شاخساره و تشکیل کالوس با کشت ریزنمونههای ساقه در محیط MS با 10 میلیگرم در لیتر نانوذره نقره، 5/2 میلیگرم در لیتر BAP و 1/0 میلیگرم در لیتر IAA افزایش یافت. اثرات مثبت نانوذرات نقره در اندامزایی ممکن است بهدلیل مهار تولید اتیلن باشد. زمانی که ریزنمونههای گرهای در محیط کشت MS غنی شده با 60 میلیگرم در لیتر نانوذره نقره، 5/2 میلیگرم در لیتر BAP و 1/0 میلیگرم در لیتر IAA کشت داده شدند، تعداد ساقه، طول شاخههای القا شده و درصد شاخههای تولید شده بهطور قابل توجهی افزایش یافت. با اینحال، در غلظتهای بالاتر (بالاتر از 60 میلیگرم در لیتر) یک اثر مضری بر روی باززایی شاخساره مشهود بود (38). در تحقیقی دیگر، افزودن نانوذرات نقره در غلظت 50 ppm به محیط پایه MS باعث بهبود ویژگیهای رشد گیاهچههایBrassica juncea با کاهش محتوای پراکسید هیدروژن، مالون دی آلدئید و پرولین از طریق فعال کردن آنزیمهای آنتی اکسیدانتی شد. با اینحال، غلظتهای بالاتر نانوذرات نقره (100 تا 400ppm ) اثر مضری بر رشد گیاهچهها داشت (39). در ریز نمونه گیاه موز، حداکثر فراوانی جنینزایی سوماتیک در محیط MS تقویت شده با 100 میلیگرم در لیتر نانوذرات روی و سپس نانوذرات اکسید روی مشاهده شد. همچنین طول ساقه و طول ریشه با افزودن هر دو نانوذره به محیط MS افزایش یافت (40). در Daucus carota تکثیر سلولی و تعداد جنینهای سوماتیک در محیط MS حاوی نانوذرات اکسید آهن کاهش یافت (41). بهطور کلی نتایج این تحقیق و سایرمحققین نشان داد که استفاده از نانوذرات مختلف و غلظتهای متفاوت آن در محیط کشتهای مختلف همراه با تنظیم کنندههای رشد گیاهی در غلظتهای متفاوت میتوانند تاثیرات متفاوتی را بر جنینزایی و باززایی گیاهان مختلف با ژنوتیپهای متفاوت نشان دهند. تاثیر غلظتها و ترکیبات مختلف نانوذرات بر روی محیطهای مختلف شایسته ارزیابی است تا به درک روشنی از مکانیسمهای زیر بنایی پشت نقش نانوذرات در کشت بافت گیاهی برسیم. در نتایج مطالعه حاضر در مجموع 288 بساک در شرایط آزمایشگاهی در محیط کشت C کشت شد و 52 جنین و 23 گیاه کامل بدست آمد که در بین آنها 2 گیاه هاپلوئید و 21 گیاه دیپلوئید بودند. فراوانی گیاهان آندروژنی بهدست آمده بهشدت به ژنوتیپ بستگی دارد. بنابراین نرخ پایین باززایی هاپلوئید، کاربرد کشت بساک در فلفل را محدود میکند (42).
6- نتیجهگیری
غلظتهای مختلف نانوذره اکسید آهن همراه با تنظیم کنندههای رشد گیاهی NAA و BAP تاثیر مثبتی را بر جنینزایی و باززایی گیاه فلفل دلمهای از طریق کشت بساک در شرایط کشت درون شیشهای نشان دادند. با بررسی اثر تنظیم کنندههای رشد مختلف در باززایی گیاه فلفل، بهترین ترکیب برای باززایی گیاه شامل هورمون NAA با غلظت 2 میلیگرم در لیتر، BAP با غلظت صفر و 5/0 میلیگرم در لیتر و نانوذره اکسید آهن با غلظت 1 و 20 میلیگرم در لیتر بود.
-
