Cell and Tissue Journal
Quarterly

The effect of iron oxide nanoparticles and BAP on the cultivation of bell pepper anthers (Capsicum annuum L.)

Document Type : Research - Scientific

Authors

maryam mohammadi 1
Raheem Haddad 2
Gasem Ali Garoosi 2

1 Imam Khomeini International University

2 Department of Biotechnology , Faculty of Agricultural and Natural Resources, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran.

10.66224/JCT.17.1.73
Abstract
Introduction: The anther culture technique is used in vitro for many plant species as an effective tool for obtaining haploid and doubled-haploid lines.
Aims: This study aimed to investigate the influence of different concentrations of iron oxide nanoparticles and benzylaminopurine (BAP) on callus formation, embryogenesis, regeneration, and rooting in bell pepper anther culture
Materials and Methods: The experiment was conducted as a factorial experiment in a completely randomized design under in vitro culture conditions. Flower buds of appropriate size (equal sepal to petal ratio or slightly longer petal) were collected from the greenhouse, and acetocarmine solution was used to determine the growth and development stage of microspores. The results showed that the most suitable stages for embryogenesis induction were the late mononuclear and early binuclear stages. In order to sterilize the flower buds, 70% ethanol for 30 seconds and 5% sodium hypochlorite for 20 minutes were used, and after each stage, they were washed three times with sterile distilled water. Then, the anthers were separated from the flower bud and placed in C medium containing 2 mg/L naphthalene acetic acid (NAA), different concentrations of BAP (0, 0.1, 0.5, and 1 mg/L), and different concentrations of iron oxide nanoparticles (0, 1, 10, and 20 mg/L). After that, the explants cultured in C medium were kept at 35°C in a dark place for 8 days in order to apply heat treatment. Then, they were transferred to 25°C in the light for 4 days. After this period, in order to induce embryogenesis, the explants were transferred from C medium to R medium and were subcultured every three weeks until embryos emerged. For further growth and root development, the embryos were transferred to V medium.
Results: The analysis of variance showed that different concentrations of iron oxide nanoparticles had a significant effect on the percentages of embryogenesis, regeneration, and rooting, but had no significant effect on the percentage of callus formation. The results of the mean comparison showed that among the different concentrations of iron oxide nanoparticles, the 1 mg/L treatment produced the highest embryogenesis percentage (11.11%). Furthermore, the mean comparison results for regeneration indicated that the 1 mg/L treatment resulted in the highest regeneration percentage (16.66%). The results of the interaction effects showed that among the different concentrations of iron oxide nanoparticles and BAP, the highest percentage of embryogenesis was observed in the treatment of 20 mg/L iron oxide nanoparticles and 0 mg/L BAP. Also, the treatment of 20 mg/L iron oxide nanoparticles and 0 mg/L BAP had the highest percentage of regeneration (33.33%). After sufficient growth and root formation, the obtained plants were removed from the glass culture containers and transferred to pots containing sterilized culture medium and watered for adaptation. The tops of the pots were covered with plastic cups, and after three days, the cups were pierced, and the plastic was gradually removed from the plant for further adaptation. Ploidy levels were determined by chromosome counting after staining the root tip cells. The results showed that out of the 23 obtained plants, 21 were diploid and had 2n=2x=24 chromosomes, and 2 were haploid and had n=x=12 chromosomes.
Discussion: Applying different concentrations of iron oxide nanoparticles in medium C had a positive effect on the regeneration of bell pepper plants. Iron is a vital micronutrient for several key cellular processes in plants. In addition, iron is essential for ensuring the structural integrity of proteins. Iron nanoparticles positively affect plant growth in tissue culture by increasing morphological parameters. The beneficial effects of nanoparticles on plants are related to their high solubility and reactivity, which affect how they interact with membranes and other cellular components, due to their large specific surface area. The treatment of 20 mg/L of nanoparticles and 0 mg/L of BAP had the highest regeneration percentage. The culture medium containing nano-iron leads to the plant benefiting from the element iron directly at all different stages of growth and its participation with other nutrients, and therefore the production of many nutrients containing it leads to the transfer of their excess to different parts of the plant. The presence of nano iron in the culture medium has led to a nutritional balance in the plant and, as a result, has improved the plant growth process by increasing the amount of nutrients and elements accumulated in the microsample. Cytokinins act as a nutrient reservoir, which leads to an increase in the percentage of elements in the microsample and an increase in the percentage of sugars in the culture medium, which is important in the structural processes in tissues and affects the accumulation of sugars in it, and is reflected in increased vegetative growth.
Conclusion: In bell pepper anther culture, different concentrations of iron oxide nanoparticles, along with plant growth regulators at different concentrations, showed a great effect on embryogenesis, regeneration, and rooting.

Highlights

-

Keywords

Regeneration
Plant growth regulators
Embryogenesis
Callus formation
Tissue culture
Subjects

مقدمه

فلفل دلمه­ای با نام علمی Capsicum annuum از خانواده Solanacea می­باشد که اهمیت اقتصادی و غذایی بسیار زیادی دارد (1). فلفل دلمه­ای یک گیاه گلد­ار دولپه­ای است که در نواحی معتدله به‫صورت یک ساله ولی در نواحی گرمسیری ممکن است رشد آن تا چند سال تداوم داشته باشد. فلفل گیاهی خودگشن است اما بر اساس تعداد و میزان فعالیت زنبورها در طول دوره گرده­افشانی، دگرگشنی هم در این گیاه دیده شده است (2). گل­های فلفل دوجنسی (Hermaphrodite)، کامل و دارای اندام­های جنسی نر و ماده هستند. کشت بافت گیاهی هسته زیست شناسی گیاهی است که برای حفاظت، تکثیر انبوه، دستکاری ژنتیکی، تولید ترکیبات زیست فعال و بهبود گیاه مهم است. ازجمله روش­های درون شیشه­ای القای هاپلوئیدی می­توان به آندروژنز (کشت بساک و میکرسپور) و ژینوژنز (کشت تخمک و تخمدان) اشاره نمود (3). آندروژنز را می­توان به سه مرحله 1- القای جنین­زایی 2- باززایی هاپلوئیدها و به‫دنبال آن 3- دابلینگ کروموزوم مصنوعی متمایز کرد (4، 5). تکنیک کشت بساک در شرایط آزمایشگاهی در بسیاری از گونه­های گیاهی به‫عنوان ابزاری موثر در به‫دست آوردن خطوط هاپلوئید و دابل هاپلوئید استفاده می­شود (6). بسته به نوع گونه­های گیاهی و تا حدودی محیط کشت، گرده آندروژنی یا مستقیما تبدیل به جنین می­شود و گیاه‫چه را به‫وجود می­آورد یا به‫صورت غیرمستقیم ابتدا کالوس تشکیل می­دهد و بعد جنین را ایجاد می­کند و در نهایت تبدیل به گیاه‫چه می­شود (7). بدین‫ترتیب با دوبرابر کردن کروموزوم­ها در گیاهان هاپلوئید می­توان لاین­های هموزیگوت پایدار ژنتیکی را در زمان کوتاهی به‫دست آورد. چنین گیاهانی در برنامه­های اصلاحی برای تولید واریته­های جدید مورد استفاده قرار گرفته­اند (3). در خانواده سولاناسه، فلفل از نظر پاسخ­دهی به آندروژنز در رتبه سوم قرار دارد. برخی از ژنوتیپ­های فلفل مقاوم هستند و فراوانی جنین­زایی در کشت بساک هنوز کم است و یا اصلا واکنشی مشاهده نمی­شود (8). از جمله مهم‫ترین عوامل تاثیرگذار در کشت بساک گیاه فلفل دلمه­ای می­توان به ژنوتیپ و شرایط فیزیولوژیک گیاهان دهنده بساک، توسعه مرحله میکروسپور و اندزه غنچه، اعمال تیمارهای سرمایی و گرمایی، ترکیبات محیط کشت و تنظیم­کننده­های رشد گیاهی اشاره کرد (9، 10). نانو تکنولوژی به‫عنوان یک فناوری جدید در دهه­های اخیر مورد توجه قرار گرفته است. نانو ذرات، ذراتی به ابعاد 1 تا 100 نانومتر هستند و دارای ویژگی مهمی مانند نسبت سطح به حجم بالا، ویژگی­های نوری، حرارتی و الکتریکی هستند که دارای خواص فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی برجسته­ای از نظر جذب و فعالیت هستند (11). درسال­های اخیر، کاربرد نانوذرات با موفقیت منجر به حذف آلاینده­های میکروبی از ریزنمونه­ها شده و نقش مثبت نانوذرات در القای کالوس، اندام­زایی، جنین­زایی جسمی، تنوع سوماکلونال و تولید متابولیت ثانویه نشان داده شده است (12). در کشت بافت گیاهی گزارش‫های متعدی وجود دارد که نشان دهنده ورودی­های مثبت فناوری نانو است. نانوذرات به‫طور گسترده­ای برای بهبود جوانه­زنی بذر استفاده شده است (13، 14). ادغام نانوذرات طلا در محیط کشت MS باعث بهبود جوانه­زنی بذر و رشد گیاه‫چه در Arabidopsis thaliana شد و طول غلاف و تعداد دانه در گیاهان تیمار شده با 10 میکرو گرم بر میلی‫لیتر نانوذرات طلا بیشتر بود. تیمار با نانوذرات طلا فعالیت آنتی ­اکسیدانتی را بهبود بخشید و منجر به کاهش بیان (miR398 وmiR408) شد. این تغییرات فیزیولوژیکی و مولکولی ممکن است مسئول اثرات مفید نانوذرات طلا باشد (15). در Brassica nigra افزودن نانوذرات اکسیدروی (500 تا 1500 میلی­گرم در لیتر) به محیط کشت MS از جوانه­زنی بذر جلوگیری کرد. در حضور نانوذرات اکسیدروی، طول ساقه و ریشه به‫طور قابل توجهی تحت تاثیر قرار گرفتند. از سوی دیگر، رشد ریز نمونه­های ساقه روی محیط کشت MS حاوی 1 تا 20 میلی­گرم در لیتر نانوذرات اکسیدروی منجر به تشکیل ریشه شد (16). افزودن 5/0 میلی­گرم در لیتر نانوذرات مس و 8/0 میلی­گرم در لیتر کبالت به محیط کشت اصلاح شده MS باعث افزایش تعداد شاخه­ها، طول ساقه و ریشه­زایی در Mentha longifolia شد (17). تاثیر نانو مواد بسته به ترکیب شیمیایی، دوز، اندازه، پایداری و نوع ترکیب محیط کشت، روش کاربرد، نوع ریز نمونه و گونه گیاهی آن­ها متفاوت است (18). هدف از این پژوهش بررسی آندروژنز از طریق کشت بساک در گیاه فلفل دلمه­ای و تاثیر نانوذره اکسید آهن در کالوس­زایی، جنین­زایی، باززایی و تولید گیاهان هاپلوئید می­باشد.

2- مواد و روش‌ها

مواد گیاهی: در این مطالعه از یک نوع ژنوتیپ فلفل دلمه­ای (Nirvin) استفاده شد. جوانه­های گل در اندازه مناسب (نسبت بین کاسبرگ و گلبرگ برابر و یا گلبرگ کمی بلندتر) از گلخانه جمع آوری شده و به آزمایشگاه کشت بافت دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) انتقال یافتند.

تعیین مرحله رشد و نمو میکروسپورها: به‫منظور تعیین مرحله رشد و نمو میکروسپورها، بساک­ها از جوانه­های گل جدا و برای رنگ­آمیزی از محلول استوکارمین استفاده شد. بدین‫صورت که یک گرم پودر کارمن در 45 میلی­لیتر اسید استیک گلاسیال حل شد. سپس 55 میلی­لیتر آب مقطر به آن اضافه و به‫مدت 5 دقیقه جوشانده شد. برای تشدید رنگ 1 تا 2 قطره هیدروکسید آهن به آن اضافه شد. بساک­ها پس از رنگ­آمیزی روی لام آزمایشگاهی له و میکروسپورهای آن­ها زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شدند (19). در بسیاری از گونه­ها مناسب­ترین مرحله برای القای جنین­زایی، اواخر تک­هسته­ای تا اوایل دوهسته­ای (پس از اولین میتوز دانه گرده) است (شکل 1 ب و ت).‌

ضدعفونی جوانه­های گل: به‫منظور ضدعفونی سطحی، ابتدا جوانه­های گل به‫مدت یک ساعت زیر آب شهری قرار گرفتند. سپس در داخل هود لامینار ایرفلو سه بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. در ادامه به‫مدت 30 ثانیه با اتانول 70 درصد (حجم به حجم) و پس از آن به‫مدت 20 دقیقه با هیپوکلریت سدیم 5 درصد (وزن به حجم) ضدعفونی شدند. پس از هر مرحله 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند (20).

کشت بساک: پس از مراحل استریل، بساک­ها از جوانه­های گل جدا و در محیط کشت C (Dumas de Valux, 1981) حاوی 2 میلی­گرم در لیتر NAA، غلظت‌های مختلف BAP (0، 1/0، 5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر) و غلظت‌های مختلف نانوذره اکسید آهن (0، 1، 10 و 20 میلی­گرم در لیتر) قرار گرفتند (21، 22). ریزنمونه­های کشت شده در محیط کشت C (جدول1) به‫مدت 8 روز در تاریکی و دمای 35 درجه سانتی­گراد جهت اعمال تیمار گرمایی در آون نگه‫داری شدند. پس از آن به‫مدت 4 روز به روشنایی و دمای 25 درجه­ سانتی­گراد در اتاقک رشد انتقال داده شدند. به‫منظور القای جنین­زایی، ریزنمونه­ها از محیط کشت C به محیط کشت R (جدول1) حاوی 2 میلی­گرم در لیتر NAA، چهار غلظت BAP  (0، 1/0، 5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر) و چهار غلظت نانوذره اکسید آهن (0، 1، 10 و 20 میلی­گرم در لیتر) انتقال یافتند و هر سه هفته یک بار واکشت شدند. پس از ظهور جنین­ها در محیط کشت R، آن­ها به محیط کشت V (جدول1) که فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی است جهت توسعه ریشه و رشد بیشتر گیاه انتقال داده شدند.

سازگار کردن گیاهان حاصل از کشت بساک: گیاه‫چه­های به‫دست آمده پس از رشد کافی و تشکیل ریشه، از ظروف کشت شیشه­ای خارج و ابتدا ریشه­ها با آب مقطر شسته شدند. سپس به گلدان­های کوچک حاوی بستر کشت ضدعفونی شده با اتوکلاو (پرلیت، پیت ماس، کوکوپیت و خاک مزرعه به نسبت 25 درصد) منتقل و آبیاری شدند و درشرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در ژرمیناتور قرار گرفتند. گلدان حاوی گیاهچه برای این‫که رطوبت نسبی در حد بالایی حفظ شود، بوسیله نایلون یا لیوان پلاستیکی پوشانده شدند. پس از گذشت سه روز، پلاستیک­ها سوراخ گردید و به‫تدریج پلاستیک از روی گیاه برداشته شد تا سازگاری کامل گیاه انجام شود (شکل 2 پ و ت).

 

 

 

جدول 1: عناصر تشکیل دهنده محیط کشت C، R و V

MediumV

(mg/L)

Medium R

(mg/L)

Medium C

(mg/L)

 

 

1900

1650

370

440

170

-

-

-

-

 

2150

1238

412

313

142

50

38

34

7

 

2150

1238

412

313

142

50

38

34

7

Macroelements

KNO3

NH4NO3

MgSO4.7H2O

CaCl2.2H2O

KH2PO4

Ca(NO3)2.4H2O

NaH2PO4.H2O

(NH4)2SO4

KCl

 

0/076

1/000

1/000

0/010

-

0/030

-

0/050

0/030

 

20/130

3/225

1/550

0/330

0/138

0/011

0/011

-

-

 

22/130

3/625

3/150

0/695

0/188

0/016

0/016

-

-

Microelements

MnSO4.H2O

ZnSO4.7H2O

H3BO3

KI

Na2MoO4.2H2O

CuSO4.5H2O

CoCl2.6H2O

AlCl3.6H2O

NiCl2.6H2O

 

100/00

5/500

0/700

0/600

0/500

-

0/005

0/100

 

100/00

5/500

0/700

0/600

0/500

-

0/005

0/100

 

100/00

5/500

0/700

0/600

0/500

0/030

0/005

0/100

Vitamin and amino acid

Myo-inositol

Pyridoxine HCl

Nicotinic acide

Thiamine HCl

Calcium pantothenate

Vitamin B12

Biotin

Glycine

 

37/30

27/28

 

18/65

13/90

 

18/65

13/90

Chelated iron

Na2 EDTA

FeSO4.7H2O

 

آزمایش سیتولوژیکی برای شمارش تعداد کروموزوم­ها: ریشه­های جوان به‫طول 1 تا 2 سانتی­متر جدا و به‫مدت 3 ساعت در داخل کلشی­سین 05/0 درصد قرار گرفتند. سپس سه بار با آب مقطر شسته شده و به‫مدت 24 ساعت در محلول تثبیت­کننده لویتسکی (فرمالدهید 10 درصد و اسید کرومیک 1 درصد به نسبت 1:1) در دمای 4 درجه منتقل شدند. پس از آن به‫مدت 3 ساعت زیر آب شهری قرار گرفتند و در دمای 20- درجه سانتی­گراد در اتانول 70 درصد نگه‫داری شدند. هیدرولیز ریشه­ها در NaOH یک نرمال به‫مدت 20 دقیقه در دمای 60 درجه سانتی­گراد انجام شد. به‫منظور رنگ آمیزی ریشه­ها از محلول هماتوکسیلین به‫مدت 14 ساعت در تاریکی استفاده شد.  در نهایت برای نرم شدن کامل بافت ریشه و تهیه لام، نوک ریشه­ها به‫مدت 2 ساعت در آنزیم سیتاز قرار گرفت (23).

3- آنالیز آماری

آزمایش به‫صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در 3 تکرار برای تیمارها انجام شد. مقایسه میانگین داده­ها با استفاده از آزمون چند دامنه­ای دانکن صورت گرفت و برای تجزیه آماری داده­های حاصل از پژوهش از نرم افزار SPSS استفاده شد.

 

 

4- نتایج

نتایج آزمایش­ تعیین مرحله رشد و نمو میکروسپورهای فلفل نشان داد که در اکثر موارد جوانه­هایی از گل مناسب هستند که اندازه گلبرگ و کاسبرگ با هم برابر و یا گلبرگ کمی بلندتر باشد و نیمی از بساک­ها بنفش رنگ باشند (شکل1 الف و ب). جوانه­هایی که در این مرحله از رشد قرار دارند عمدتا حاوی میکروسپورهایی در انتهای مرحله تک هسته­ای یا ابتدای مرحله دوهسته­ای هستند (شکل 1 پ و ت). ریز نمونه­ها پس از انتقال به محیط کشت C  و اعمال تیمار گرمایی در دمای 35 درجه سانتی­گراد به‫مدت 8 روز متورم شدند. پس از گذشت 14 تا 20 روز، بساک­ها شروع به کالوس­زایی کردند و پس از گذشت 40 تا 50 روز در محیط کشت R، جنین­ها بر روی کالوس القا شدند. مراحل جنین­زایی کروی، قلبی، اژدری و کوتیلدونی در شکل 1 نشان داده شده است. به‫منظور رشد جنین­ها و تولید گیاهچه، آن­ها به محیط کشت V بدون تنظیم کننده­های رشد گیاهی منتقل شدند.

شکل1: مراحل مختلف کشت بساک فلفل، القا کالوس و جنین­زایی. (الف) جوانه گل فلفل در اندازه مناسب جهت کشت بساک، (ب) بساک فلفل (نوک بساک­ها بنفش رنگ است)، (پ) میکروسپورهای فلفل دلمه­ای در مرحله­ تک هسته­ای، (ت) میکروسپورهای فلفل دلمه­ای در مرحله ابتدای دوهسته­ای، (ث و ج) جنین­های کروی شکل، (چ و ح) جنین قلبی شکل، (خ) جنین اژدری شکل، (د، ذ و ر) جنین کوتیلدونی.

 

در این مطالعه، 31 گیاهچه حاصل گردید و 23 گیاه رشد خود را کامل نمودند (شکل 2 الف و ب). با شمارش تعداد کروموزوم‫ها مشخص شد که 21 عدد از گیاهان دیپلوئید و دارای 2n=2x=24 کروموزوم و 2 عدد از گیاهان هاپلوئید و دارای n=x=12  کروموزوم هستند (شکل2 ث و ج).

شکل 2: سازگاری گیاهان و تعیین سطوح پلوئیدی آن‌ها. (الف و ب) گیاهان کامل و احیا شده داخل شیشه، (پ) افزایش رطوبت نسبی محیط توسط پوشش پلاستیکی شفاف، (ت) برداشتن پوشش پلاستیکی برای سازگاری کامل گیاه، (ث) تصویری از کروموزوم یک گیاه دیپلوئید، (ج) تصویری از کروموزوم یک گیاه هاپلوئید.

 

نتایج حاصل از تجزیه واریانس اثر اصلی و متقابل سیتوکینین و نانوذره اکسید آهن برای صفات مورد مطالعه (درصد کالوس­زایی، جنین­زایی، باززایی و ریشه­زایی) در جدول 2 نشان داده شده است. اثر اصلی و متقابل سیتوکینین و نانوذره اکسید آهن بر درصد جنین­زایی، باززایی و ریشه­زایی از نظر آماری در سطح احتمال یک درصد معنی­دار شد ولی بر درصد کالوس­زایی از نظر آماری تفاوت معنی­داری را نشان نداد.

جدول 2: جدول تجزیه واریانس اثر اصلی و متقابل سیتوکینین و نانوذره اکسید آهن بر درصد کالوس­زایی، جنین­زایی، باززایی و ریشه­زایی

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

درصدکالوس­زایی

درصد جنین­زایی

درصد باززایی

درصد ریشه­زایی

سیتوکینین

3

ns 104/52

** 935/1033

** 882/437

** 536/523

نانوذره اکسید آهن

3

ns 666/36

** 255/509

** 155/268

** 922/204

سیتوکینین × نانوذره اکسید آهن

9

ns 250/57

** 036/216

** 262/309

** 171/115

خطا

32

894/57

182/21

602/1

362/5

ضریب تغییرات (%)

 

93/7

49/25

75/11

08/18

**و ns : به‫ترتیب نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح احتمال 1  درصد و غیر معنی­دار می­باشد.

 

نتایج مقایسه میانگین درصد جنین­زایی بر غلظت‌های مختلف BAP نشان داد که تیمار 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP دارای بیشترین درصد جنین­زایی (38/26 درصد) و تیمار 1 میلی­گرم در لیتر BAP دارای کم‫ترین درصد جنین­زایی (94/6 درصد) است که از نظر آماری دارای تفاوت معنی­دار بودند (شکل 3).

 

شکل3: مقایسه میانگین درصد جنین‌زایی در غلظت‌های مختلف هورمونBAP

تیمار 1 میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید آهن بیشترین درصد جنین­زایی (38/26 درصد) و تیمار 10 میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید آهن کم‫ترین درصد جنین­زایی (11/11 درصد) را نشان دادند که از نظر آماری دارای اختلاف معنی­دار بودند (شکل 4).

شکل4: مقایسه میانگین درصد جنین‌زایی در غلظت‌های مختلف نانوذره اکسید آهن

مقایسه میانگین اثرات متقابل سیتوکینین و نانوذره اکسید آهن بر درصد جنین­زایی نشان داد که در تیمار 2 میلی­گرم در لیتر NAA، صفر میلی­گرم در لیتر BAP به‫همراه غلظت­های مختلف نانوذره اکسید آهن، تیمار 20 میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید آهن بیشترین درصد جنین­زایی (88/38 درصد) را دارد (شکل 5).

شکل5: مقایسه میانگین اثر متقابل BAP و نانوذره اکسید آهن بر درصد جنین‌زایی

نتایج مقایسه میانگین درصد باززایی در غلظت‌های مختلف BAP در شکل 6 نشان داد که بیشترین درصد باززایی (66/16 درصد) در تیمار صفر میلی­گرم در لیتر BAP و کم‫ترین آن در تیمار 1 میلی­گرم در لیتر BAP حاصل شد که از لحاظ آماری تفاوت معنی­داری را با یکدیگر نشان دادند.


شکل 6: مقایسه میانگین درصد باززایی در غلظت‌های مختلفBAP

 

اثر نانوذره بر درصد باززایی در شکل 7 مشخص کرد که تیمار 1 میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید آهن دارای بیشترین درصد باززایی (66/16 درصد) و تیمار صفر و 10 میلی­گرم در لیتر نانوذره دارای کم‫ترین درصد باززایی (94/6 درصد) است که از نظر آماری تفاوت معنی­داری بین کم‫ترین و بیشترین درصد باززایی مشاهده شد.

شکل 7: مقایسه میانگین اثر نانوذره اکسید آهن بر درصد باززایی

                                                                                                                                               

 مقایسه میانگین اثرات متقابل سیتوکینین و نانوذره اکسید آهن نشان داد که تیمار صفر میلی­گرم در لیتر BAP و 20 میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید آهن دارای بیشترین درصد باززایی (33/33 درصد) است (شکل 8).

 

                                                             

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 8: مقایسه میانگین اثرات متقابل BAP و نانوذره اکسید آهن بر درصد باززایی

نتایج مقایسه میانگین اثر سیتوکینین بر درصد ریشه­زایی نشان داد که بیشترین درصد ریشه­زایی(05/18 درصد) در تیمار 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP و کم‫ترین درصد ریشه­زایی (16/4 درصد) در تیمار 1 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده شد که از نظر آماری دارای تفاوت معنی­دار بودند ( شکل 9).

 

 

 

 

شکل 9: مقایسه میانگین درصد ریشه‌زایی در غلظت‌‌های مختلف BAP

همچنین اثر نانوذره بر درصد ریشه­زایی نشان داد که تیمار 1 میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید آهن دارای بیشترین درصد ریشه­زایی (05/18 درصد) و کم‫ترین آن (33/8 درصد) در تیمار صفر میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید آهن به‫دست آمد که از نظر آماری تفاوت معنی­داری بین آن­ها مشاهده شد (شکل 10).

 

 

 

 

 

شکل 10: مقایسه میانگین درصد ریشه‌زایی در غلظت‌های مختلف نانوذره اکسید آهن

 اثرات متقابل سیتوکینین و نانوذره بر درصد ریشه­زایی نشان داد که تیمار 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP و 20 میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید آهن دارای بیشترین درصد ریشه­زایی است (شکل 11).

شکل 11: مقایسه میانگین اثر متقابل BAP و نانوذره اکسید آهن بر درصد ریشه‌زایی

5- بحث

انتخاب مناسب مرحله رشد میکروسپور عامل مهمی برای شروع کشت است، زیرا فقط مراحل خاصی از رشد و نمو میکروسپور به جنین­زایی پاسخ می­دهند (24، 25). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که مناسب ­ترین مرحله برای رشد جنین آندروژنی در فلفل، میکروسپورهایی که در مرحله تک هسته­ای و ابتدای دو هسته­ای قرار دارند که این نتایج با نتایج سایر پژوهشگران مطابقت دارد (26- 29). بسیاری از محصولات ژنی مخصوص مرحله اسپورفیت، قبل از میوز از سیتوپلاسم حذف می­شوند و این باعث می­شود که سلول در مرحله تک ­هسته­ای، از نظر تمایز آزادانه عمل نماید، در حالی‫که معمولا پس از میتوز دانه گرده، ژن­های مخصوص مرحله گامتوفیتی رونویسی می­شوند. بعد از تقسیم میتوز، سیتوپلاسم حاوی اطلاعات گامتوفیت است، تا در نهایت گامت نر ایجاد شود. وجود برخی عوامل از جمله برخی تنش­ها در این مراحل می­تواند برنامه گامتوفیتی را متوقف کرده و باعث ظهور ژن­های اختصاصی اسپورفیتی شوند که نتیجه آن تغییر مسیر سلول از گامتوفیتی به اسپورفیتی است (30). پیش تیمار دمایی به‫عنوان یکی از موثرترین روش­ها برای القای آندروژنز در کشت بساک فلفل در نظر گرفته می­شود اما نوع پیش تیمار مورد استفاده (دمای پایین یا بالا) و مدت زمان پیش تیمار بسته به واریته یا ژنوتیپ متفاوت است (31، 32). در مطالعه حاضر اعمال تیمار گرمایی به‫مدت 8 روز در دمای 35 درجه سانتی­گراد نقش مثبتی بر آندروژنز گیاه فلفل داشت. طی مطالعه­ای که توسط حیدری و همکاران (33) انجام شد آن­ها نشان دادند که اعمال تیمار حرارتی در کشت بساک فلفل از 4 تا 12 روز پاسخ آندروژنز را تحریک و بهترین نتایج را در هشت روز نشان می‌دهد و تیمار بساک­ها در دمای 25 درجه سانتی­گراد (بدون شوک حرارتی)، باعث عدم تولید جنین شد. همچنین مطالعات آن­ها نشان داد که ژن کد کننده شوک گرمایی موجب تخریب دوک تقسیم و میکروتوبول­ها شده و به این‫ترتیب موجب بازآرایی اسکلت سلولی و در نتیجه تغییر در چرخه سلولی میکروسپورها به‫سمت رویان­زایی می­شوند. استفاده از دوره تنش گرمایی حیاتی است و یک دوره کوتاه تیمار گرمایی نمی­تواند تغییرات فراساختاری کافی را ایجاد کند و میکروسپورها تمایل دارند مسیر گامتوفیتی را دنبال کنند (33). نتایج این مطالعه نشان داد که به‫کارگیری غلظت­های مختلف نانوذره اکسید آهن در محیط کشت C بر جنین­زایی، باززایی و ریشه­­زایی گیاه تاثیر مثبت دارد (جدول2). نتایج مطالعه ایرانبخش و قادری (21) نشان داد که به­‫کارگیری نانواکسید آهن در غلظت­های مناسب می­تواند موجب افزایش راندمان تولید گیاهان به­ویژه در شرایط درون شیشه شود که با نتایج مطالعه فوق مطابقت دارد و به‫کاربردن غلظت­های مختلف نانوذره اکسید آهن در محیط کشت C تاثیر مثبتی در باززایی گیاه فلفل دلمه­ای داشت (شکل 7 و 8). نتایج مطالعات السیه (34) نشان داد که افزودن نانوذرات نقره به محیط کشت در جنین­زایی سوماتیک، طول جنین، تمایز جنین به برگ و طول برگ­ها در درخت خرما تاثیر مثبتی دارد. غلظت­های مختلف نانوذرات نقره در محیط کشت MS تاثیرات متفاوتی را بر جنین­زایی نشان دادند. محیط کشت حاوی 1 میلی­لیتر در لیتر نانوذرات نقره بهترین محیط برای تمایز کالوس جنین­زا بود و بیشترین تعداد جنین سوماتیک را تولید کرد. افزایش غلظت نانوذرات به بالاتر از 1 میلی­لیتر در لیتر باعث کاهش تعداد جنین ­ها و طول آن شد که کم‫تر از تیمار شاهد بود، به این معنی که غلظت­های پایین نانوذرات نقره باعث تکثیر و نمو می­شود درحالی‫که افزایش غلظت نانوذرات نقره (2 و 4 میلی­لیتر در لیتر) مانع از رشد می­شود (34). در مطالعه حاضر افزودن نانوذرات اکسید آهن به محیط کشت C تاثیر مثبتی بر جنین­زایی گیاه فلفل نشان داد که با مطالعه السیه مطابقت دارد (شکل 4 و 5). ولی بیشترین درصد جنین­زایی در غلظت 1 میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید آهن و بعد از آن در غلظت 20 میلی­گرم در لیتر نانوذره اکسید آهن مشاهده شد (شکل 4) که با توجه به نوع نانوذره و غلظت آن، همچنین نوع محیط کشت مورد استفاده، تنظیم کننده­های رشد در غلظت­های متفاوت و نوع گیاه مورد مطالعه، پاسخ­های متفاوتی با مطالعات السیه مشاهده شد. طی مطالعه­ای دیگر که بر روی ریز نمونه هیپوکوتیل گیاه کلزا انجام شد، نتایج نشان داد که غلظت 10 میلی­گرم در لیتر نانوذرات اکسیدروی می­تواند باعث ایجاد کالوس و باززایی شاخساره شود، در حالی‫که غلظت­های بالاتر ( 25، 50 و 100 میلی­گرم در لیتر) مانع از باززایی شاخساره شد (35). در مطالعه­ای دیگر مشخص شد که نانوذرات مس و نقره کاندیدای بالقوه برای تقویت جنین­زایی سوماتیک و باززایی ریزنمونه­های جنین بالغ گندم هستند. بیشترین کالوس­های جنین­زا در محیط غنی شده با 3 میلی­گرم در لیتر نانوذرات نقره در مقایسه با شاهد و سایر تیمارها مشاهده شد (36). افزودن نانوذرات به محیط کشت بافت گیاهی با تغییر فعالیت آنزیم­های آنتی ­اکسیدانتی، بیان ژن، مهار تولید اتیلن بر تکثیر کالوس، تکثیر اندام هوایی، جنین­زایی و ریشه­زایی تاثیر می­گذارد (37). در Tecomella unduIata درصد القای شاخساره، تعداد شاخساره و تشکیل کالوس با کشت ریزنمونه­های ساقه در محیط MS  با 10 میلی­گرم در لیتر نانوذره نقره، 5/2 میلی­گرم در لیتر BAP و 1/0 میلی­گرم در لیتر IAA افزایش یافت. اثرات مثبت نانوذرات نقره در اندام­زایی ممکن است به‫دلیل مهار تولید اتیلن باشد. زمانی که ریزنمونه­های گره­ای در محیط کشت MS غنی شده با 60 میلی­گرم در لیتر نانوذره نقره، 5/2 میلی­گرم در لیتر BAP و 1/0 میلی­گرم در لیتر IAA کشت داده شدند، تعداد ساقه، طول شاخه­های القا شده و درصد شاخه­های تولید شده به‫طور قابل توجهی افزایش یافت. با این­حال، در غلظت­های بالاتر (بالاتر از 60 میلی­گرم در لیتر) یک اثر مضری بر روی باززایی شاخساره مشهود بود (38). در تحقیقی دیگر، افزودن نانوذرات نقره در غلظت 50 ppm به محیط پایه MS باعث بهبود ویژگی­های رشد گیاهچه­هایBrassica juncea  با کاهش محتوای پراکسید هیدروژن، مالون دی آلدئید و پرولین از طریق فعال کردن آنزیم­های آنتی اکسیدانتی شد. با این‫حال، غلظت­های بالاتر نانوذرات نقره (100 تا 400ppm ) اثر مضری بر رشد گیاه‫چه­ها داشت (39). در ریز نمونه گیاه موز، حداکثر فراوانی جنین­زایی سوماتیک در محیط MS تقویت شده با 100 میلی­گرم در لیتر نانوذرات روی و سپس نانوذرات اکسید روی مشاهده شد. همچنین طول ساقه و طول ریشه با افزودن هر دو نانوذره به محیط MS  افزایش یافت (40). در Daucus carota تکثیر سلولی و تعداد جنین­های سوماتیک در محیط MS حاوی نانوذرات اکسید آهن کاهش یافت (41). به‫طور کلی نتایج این تحقیق و سایرمحققین نشان داد که استفاده از نانوذرات مختلف و غلظت­های متفاوت آن در محیط کشت­های مختلف همراه با تنظیم کننده­های رشد گیاهی در غلظت­های متفاوت می­توانند تاثیرات متفاوتی را بر جنین­زایی و باززایی گیاهان مختلف با ژنوتیپ­های متفاوت نشان دهند. تاثیر غلظت­ها و ترکیبات مختلف نانوذرات بر روی محیط­های مختلف شایسته ارزیابی است تا به درک روشنی از مکانیسم­های زیر بنایی پشت نقش نانوذرات در کشت بافت گیاهی برسیم. در نتایج مطالعه حاضر در مجموع 288 بساک در شرایط آزمایشگاهی در محیط کشت C کشت شد و 52 جنین و 23 گیاه کامل بدست آمد که در بین آن­ها 2 گیاه هاپلوئید و 21 گیاه دیپلوئید بودند. فراوانی گیاهان آندروژنی به‫دست آمده به‫شدت به ژنوتیپ بستگی دارد. بنابراین نرخ پایین باززایی هاپلوئید، کاربرد کشت بساک در فلفل را محدود می­کند (42).

6- نتیجه‌گیری

غلظت­های مختلف نانوذره اکسید آهن همراه با تنظیم کننده­های رشد گیاهی NAA و BAP  تاثیر مثبتی را بر جنین­زایی و باززایی گیاه فلفل دلمه­ای از طریق کشت بساک در شرایط کشت درون شیشه­ای نشان دادند. با بررسی اثر تنظیم کننده‌های رشد مختلف در باززایی گیاه فلفل، بهترین ترکیب برای باززایی گیاه شامل هورمون NAA با غلظت 2 میلی­گرم در لیتر، BAP با غلظت صفر و 5/0 میلی­گرم در لیتر و نانوذره اکسید آهن با غلظت 1 و 20 میلی­گرم در لیتر بود.

 

-

-
Cell and Tissue Journal
Volume 17, Issue 1
Spring 2026
Pages 73-88

  • Receive Date 24 November 2024
  • Revise Date 08 November 2025
  • Accept Date 09 February 2026

Home

Guide for Authors

Submit Manuscript

Plagiarism Policy

Contact Us