سلول و بافت
فصلنامه

اثر اپیوم بر مارکرهای استرس اکسیداتیو در رده سلولی HepG2

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

ابراهیم عباسی 1
مونا پورجعفر 2
فاطمه میرزایی 3
علی قلعه ئی ‫ها 4
مهرداد احمدی 5
سید سمیه میرزاجانی‬‬‬‬ 5

1 دانشیار، گروه بیوشیمی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران

2 محقق، گروه پزشکی مولکولی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران

3 استادیار، گروه آناتومی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران

4 استاد، گروه روانپزشکی، مرکز تحقیقات اختلالات رفتاری و سوء مصرف مواد، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران

5 کارشناس، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران

https://doi.org/10.61186/JCT.15.3.257
چکیده
هدف: بررسی‌ها نشان می‌دهد که تریاک پس از تنباکو پرمصرف‌ترین ماده مخدر در بسیاری از کشورها، به‌ویژه ایران می باشد. قسمت اعظم مواد مخدر توسط کبد متابولیزه می شود. لذا، مصرف تریاک می تواند به‫طور مستقیم سبب آسیب سلول‫های کبدی شود. لذا در این مطالعه اثر تریاک بر سیستم آنتی اکسیدانتی بافت کبد بررسی شد.  مواد و روش‌ها: در این تحقیق از رده‌ سلولی سرطانی کبد انسان (HepG2) استفاده شد. در ابتدا زنده بودن سـلول‫ها با استفاده از روش MTT مورد ارزیـابی قـرار گرفـت. سپس IC50  تعیین شد و همان غلطت و یک غلظت پایین‫تر و یک غلظت بالاتر (در مجموع سه غلظت) برای مطالعات بعدی استفاده شد. سپس پراکسیداسیون لیپیدی، میزان اکسیدانتی تام، و آنتی اکسیدانت تام اندازه گرفته شد. فعالیت آنزیم‫های کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز با استفاده از کیت انجام شد. نتایج:  نتایج آنالیز آماری حاکی از اختلاف معنی‫داری در میزان مارکر های استرس اکسیداتیو بود (p< 0.001).  در گروه دریافت کننده اپیوم با دوز 60 و 70 میکرو گرم در میلی لیتر در مقایسه با گروه کنترل میزان TOS و MDA  افزایش معنی‫داری داشت (p< 0.001)، در حالی‫که میزان TAC  کاهش یافت(p< 0.001).  همچنین فعالیت آنزیم های کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در گروه‫های درمان شده با تریاک کاهش نشان داد (p< 0.001).  نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که تریاک می‫تواند سبب افزایش تولید رادیکال‫های آزاد در کبد شده و فعالیت آنزیم‫های آنتی اکسیدانتی را کاهش دهد.   

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

مالون دی الدهید
کاتالاز
آنتی اکسیدانت
dor -

عنوان مقاله English

Effect of opium on oxidative stress markers in HepG2 cell line

نویسندگان English

E Abbasi 1
M Pourjafar 2
F Mirzaei 3
A Ghaleiha 4
M Ahmadi 5
SS Mirzajani 5
1 Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran
2 Department of Molecular Medicine and Genetics, School of Medicine, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran
3 Department of Anatomical Sciences, School of Medicine, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran
4 Department of Psychiatry, School of Medicine, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran
5 Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran
چکیده English

Aim: Addiction is an important social and health problem in many Middle Eastern countries. Studies show that opium is the most commonly used substance after tobacco in many countries, especially in Iran. Opium is obtained from the seeds of the Papaver somniferum plant and contains more than 40 different alkaloids, the most important of which are morphine, codeine, papaverine, noscapine, and thebaine. Various studies show that morphine, which is one of the most important substances in opium, increases the production of free radicals in the body and reduces the antioxidant capacity. Opium consumption has various adverse health effects on the body. Therefore, long-term use of this combination can be related to some pathological consequences, including neurological disorders, liver toxicity, kidney dysfunction, oxidative stress, and apoptosis. Most drugs are metabolized by liver hepatocytes and excreted by kidney cells. Therefore, opium consumption can directly cause damage to liver cells. Free radicals play an important role in liver diseases. The increase of free radicals and on the other hand the decrease of antioxidants in the body caused liver toxicity. Oxidative stress is caused by an imbalance between the production of free radicals and their neutralization inside the body by antioxidant defense mechanisms. Oxidative stress is produced in various diseases, consumption of toxic substances, and old age, since it is not possible to investigate the effect of opium on human liver cells, and no study has been conducted in this field. The liver is the most important organ that is directly responsible for the metabolism and excretion of opium. Therefore, in this study, the effects of opium on oxidative stress markers in HepG2 cell line were determined.
Material and methods: Human liver cancer cell lines (HepG2) were used in this experimental study. At first, the cell line was placed in a 25 ml flask in the culture medium. DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 10% FBS (Fetal bovine serum), and 1% penicillin and streptomycin antibiotics were incubated in a 37°C incubator with 5% CO2 . The cells were treated with different concentrations of opium (0-100ug/ml) for 24 hours. Then IC50 was determined and then a lower concentration, IC50, and a higher concentration (three concentrations in total) were used for further studies.
The lipid peroxidation was measured by thiobarbituric acid method. The total oxidant was measured using xylenol orange. The amount of total antioxidants was determined by the FRAP (Ferric Reducing / Antioxidant Power) method. The catalase, glutathione peroxidase, and superoxide dismutase enzyme activities were measured by colorimetry methods. the data was entered into SPSS software (Version 20)  and analyzed using ANOVA and Tukey statistical tests. P less than 0.05 was considered a significant level. Results: Statistical analysis results indicated a significant difference in the amount of oxidative stress factors compared with control (p<0.001). In the group receiving opium with a dose of 60 and 70 mg/ml compared to the control group, the amount of TOS and MDA increased significantly (p<0.001), while the amount of TAC decreased (p<0.001). Also, the activity of catalase, glutathione peroxidase, and superoxide dismutase enzymes decreased in opium-treated groups (p<0.001). Conclusion: The results of this research showed that opium had a lethal effect on HepG2 cells. Also, opium caused an increase in oxidative stress in this cell line, which indicates the vulnerability of the liver against this compound. The results of this study show that although opium has analgesic effects, it can seriously damage the liver tissue. 

کلیدواژه‌ها English

MDA
Catalae
Antioxidant

مقدمه

اعتیاد  یک معضل اجتماعی و بهداشتی مهم در بسیاری از کشورهای خاور میانه می‫باشد. مطالعات نشان می‫دهد که تریاک پس از تنباکو رایج ترین ماده مصرفی در  بسیاری از کشورها به‫ویژه در کشور ایران است. تریاک از دانه‫های گیاه Papaver somniferum به‫دست می‫آید و حاوی بیش از 40 الکالوئید مختلف بوده که مهم‫ترین آن‫ها مورفین، کدئین، پاپاورین، نوسکاپین و تبائین می‫باشد (1). شیوع مصرف مواد مخدر در خاورمیانه و جنوب غربی آسیا 6/2 درصد است که بیشتر از میانگین سایر کشورهای جهان است. تاریخچه اعتیاد به مواد مخدر در ایران به پنج قرن پیش برمی‫گردد و تخمین زده می‫شود که حدود 3/2 درصد از جمعیت بزرگسال ایران معتاد به تریاک هستند. همچنین گزارش شده است که شیوع اعتیاد در مناطق روستایی بیشتر می‫باشد (2).

با وجود اینکه مطالعات گذشته نشان می‫دهند که اعتیاد به مواد مخدر در ارتباط با بسیاری از بیماری‫ها می‫باشد، اما در برخی جوامع، به‫ویژه در آسیا و خاورمیانه، این باور وجود دارد که تریاک در مقابل بیماری‫های عروق کرونر، اختلالات لیپیدی، پرفشاری خون و دیابت اثر پیشگیرانه دارد. لذا، بسیاری از افراد تمایل بالایی به مصرف مواد مخدر دارند (3).

مطالعات مختلف نشان می‫دهند که مورفین، که یکی از مهم‫ترین مواد موجود در تریاک است، سبب افزایش تولید رادیکال‫های آزاد در بدن شده و ظرفیت آنتی اکسیدانتی را کاهش می دهد(4). مصرف تریاک داری اثرات نامطلوب مختلفی بر سلامت بدن است.  لذا استفاده طولانی مدت از این ترکیب می‫تواند با برخی از پیامدهای آسیب شناختی از جمله اختلالات عصبی، سمیت کبدی، اختلال عملکرد کلیه، استرس اکسیداتیو و آپوپتوز در ارتباط باشد (4).  Bhat  و همکاران (5) نشان دادند که مورفین سبب القاء استرس اکسیداتیو و همچنین افزایش آپوپتوزیس در ماکروفاژها می‫شود. 

رادیکال‫های آزاد نقش مهمی در بیماری‫های کبدی ایفا می‫کنند. در واقع افزایش رادیکال‫های آزاد و از سوی دیگر کاهش آنتی اکسیدانت‫های بدن، سبب آسیب  کبدی می‫شوند.  استرس اکسیداتیو در اثر عدم تعادل میان تولید رادیکال‫های آزاد و عدم خنثی شدن آن‫ها در داخل بدن به‫واسطه مکانیسم‫های دفاع آنتی اکسیدانتی ایجاد می‫شود. استرس اکسیداتیو در بیماری‫های مختلف، مصرف مواد سمی و در پیری تولید می‫شوند (6). در بدن، استرس اکسیداتیو سبب پراکسیداسیون لیپید ها و همچنین آسیب پروتئین‫های موجود در دیواره سلول‫های کبد می‫شوند که نتیجه آن التهاب و آسیب بافتی می‫باشد. در این شرایط نه تنها ساختن دیواره و عملکرد آن تحت تآثیر قرار می‫گیرد، بلکه برخی از محصولات ناشی از اکسیداسیون به‫عنوان نمونه مالون دی آلدهید می‫تواند با بیومولکول‫ها واکنش نشان داده و اثرات سمی از خود نشان دهد (7).

با توجه به این که قسمت اعظم مواد مخدر، توسط هپاتوسیت های کبدی متابولیزه و به وسیله سلول های کلیوی دفع می گردد. مصرف تریاک می‫تواند به‫طور مستقیم سبب آسیب سلول های کبدی شود. از آن‫جا که مطالعه‫ای در این زمینه انجام نشده است، لذا در این مطالعه از رده سلولی HEPG2  جهت ارزیابی اثرات مصرف تریاک بر بافت کبد به‫عنوان مهم‫ترین اندامی که مستقیما مسئول متابولیسم و دفع تریاک می باشد، انجام شد.

 

2- مواد و روش‌ها

رده سلولی: در مطالعه تجربی  از رده‌ سلولی سرطانی کبد انسان (HepG2) استفاده شد. ابتدا رده سلولی در فلاسک 25 میلی‫لیتر در محیط کشت DMEM  (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) حاوی 10 درصد  FBS، (Fetal bovine serum) و یک درصد آنتی بیوتیک­های پنی‫سیلین و استرپتومایسین کشت شده در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد با 5 درصد CO2  انکوبه شدند.

بررسی زنده بودن سلو‫‫ل‫ها:  زنده بودن سـلول‫ها با استفاده از روش MTT (2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) مورد ارزیـابی قـرار گرفـتند. ابتدا سلول‫ها در پلیت 96 تـایی (با غلظت 5 هزار سلول در هر چاهک) به‫مدت 24 ساعت کشت داده شدند. پس از 24 ساعت تریاک با غلظت‫های مختلف (0 تا 100 میکروگرم/میلی‫لیتر) به سلول‫ها اضافه شد. تریاک ابتدا با غلظت 5 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر با استفاده از DMEM   استریل تهیه و فیلتر شدو طی چند مرحله رقیق‫سازی و در نهایت به سلول‫ها اضافه شد. بعد از گذشت 24 ساعت، محـیط کـشت رویـی دور ریخته شد و سلول‫ها در محلول  MTT (5 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر) به‫مدت 4 ساعت  در انکوباتور 37 درجه سانتی‫گراد قرار گرفت. سپس 100 میکرولیتر از محلولDMSO  (Dimethylsulfoxid)  به‫هر چاهک اضافه شد و میزان جذب نوری در طول موج  570 نانومتر توسط الایزا ریدر خوانش شد. سپس IC50  تعیین شد و همان غلطت و یک غلظت پایین‫تر و یک غلظت بالاتر ( در مجموع سه غلظت) برای مطالعات بعدی استفاده شد.

اندازه گیری مارکرهای استرس اکسیداتیو: رده سلولی در محیط کشت DMEM  (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) که حاوی 10 درصد  FBS (Fetal bovine serum)، و یک درصد آنتی بیوتیک­های پنی‫سیلین و استرپتومایسین کشت شده در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد با 5 درصد CO2  به‫مدت 24 ساعت انکوبه شدند.  تریاک با غلظت‫های مختلف به سلول‫ها اضافه شد و پس از 24 ساعت سلول‫ها ترپسینه و جدا شدند. رسوب سلولی سانتریفیوژ شد و در مرحله دوم با PBS شستشو و مجدد سانتریفیوژ شد.  رسوب حاصله به‫مدت 45 دقیقه  بر روی یخ همراه با 250 میکرولیتر بافر لیز انکوبه شد و سپس با rpm 10000 در دمای 4- درجه سانتی گراد  به‫مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای اندازه‫گیری آنزیم‫های آنتی اکسیدانتی استفاده شد (8).

اندازه گیری میزان مالون دی الدهید (MDA): پراکسیداسیون لیپیدی به‫روش تیوباربیتوریک اسید اندازه‫گیری شد (9). در این واکنش نمونه هموژن شده و محلول رویی شفاف پس از سانتریفوژ جدا و برای سنجش استفاده شد.  بطور خلاصه به 50 میکرولیتر نمونه مقدار یک میلی‫لیتر معرف تیوباربیتوریک اسید و 4 میلی‫لیتر آب مقطر اضافه شد سپس مخلوط واکنش به‫مدت یک ساعت در حمام آب جوش حرارت داده شد. نمونه‫ها در دمای اتاق خنک شد و سپس 5 میلی لیتر n-بوتانول به لوله نمونه اضافه شد و به‫خوبی تکان داده شد. در مرحله بعد، نمونه ها سانتریفوژ شدند فاز رنگی بوتانل جداسازی شده و جذب نوری با استفاده از اسپکتروفتومتر خوانده شد.  همچنین از تترا اتوکسی پروپان به‫عنوان استاندارد استفاده شد (8).

اندازه گیری وضعیت اکسیدانتی تام (TOS) : در این واکنش آهن فروس به فریک اکسید می‫شود که در مرحله بعدی توسط زایلنول اورنج تولید رنگ می‫کند (9). اندازه گیری رنگ تولید شده نشان دهنده میزان اکسیدانت تام می‫باشد. به‫طور خلاصه، 50 میکرولیتر نمونه را با 95 میکرولیتر معرف (اسیدسولفوریک 25 میلی‫مولار، سوربیتول 100 میلی‫مولار و گزیلیل اورنژ150 میکرومولار) مخلوط و ورتکس شدند. سپس نمونه به‫مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد و جذب آن بعد ازسانتریفوژ در طول موج 560 نانومتر خوانده شد.

 

میزان خاصیت آنتی اکسیدانتی تام(TAC): اندازگیری میزان آنتی اکسیدانت تام به‫روش FRAP (Ferric Reducing / Antioxidant Power) انجام گرفت(9). در این روش ترکیبات آنتی اکسیدانت سبب احیا کمپلکس (Ferric tripyridyltriazine) Fe III TPTZ به فرم فروس Fe II می شوند که جذب ترکیب رنگی حاصله  در طول موج 593 نانومتر نشان دهنده میزان TAC می‫باشد.  به‫طور خلاصه،  10 میکرولیتر از نمونه را به 300 میکرولیتر معرف FRAP (کلرید فریک 20 میلی‫مولار، TPTZ  10میلی‌مولار و بافر استات 300 میلی‌مولار، pH3.6) اضافه و ورتکس شده و به‫مدت 10 دقیقه در  دمای37 درجه سانتی‫گراد انکوبه و سپس  در طول موج 593 نانومتر خوانده شد (8).

 

اندازه گیری فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD): آنزیم سوپراکسید دیسموتاز سبب تبدیل رادیکالهای سوپراکسید سمی (O2◦) به پراکسید هیدرو‍‍‍ژن (H2O2) و مولکول هیدروژن می‫شود. رادیکال‫های O2◦در طی روند اکسیداتیو تولید می‫شوند (10). در ایــن روش در اثـر اکسیداسیون هیدروکسیل آمـین، آنیـون O2◦ تولید می شود که ترکیب NBT بـا O2◦ واکـنش داده و رنـگ قرمـز فورمـازان را تولیـد می‫کنـد. آنزیم سوپراکسید دیسموتاز موجود در نمونه در واکنش با O2◦ و تبدیل آن به هیدورژن پراکسید از واکنش سوپراکسـید بـا NBT و تشکیل رنگ قرمز جلوگیری میکند. لذا فعالیت SOD به‫وسیله اندازه­گیری میزان ممانعت از این واکنش انجام می­شود. سوپراکسید دیسموتاز با استفاده از کیت (ZellBio GmbH, Germany) انجام شد.  

اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتالاز: آنزیم کاتالاز، سبب تجزیه پراکسید هیدروژن می‫شود. در این واکنش پراکسـید هیدروژن  با مولیبـدات آمونیـوم  ترکیب زردرنگی تشکیل می دهد که در طول موج 410 نانومتر جذب دارد. لذا، نمونه در مجاورت پراکسید هیدروژن قرار می‫گیرد و آنـزیم موجـود در نمونـه پراکسید هیدروژن را به آب و اکسیژن تبدیل می‫کند. پراکسید هیدروژن باقی مانـده با آمونیوم مولیبـدات تولیـد رنـگ نموده و شـدت رنـگ تولید شده بـا میـزان فعالیـت آنـزیم رابطـه عکس دارد. کاتالاز با استفاده از کیت (ZellBio GmbH, Germany) انجام شد.

 اندازه گیری فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز(GPx): گلوتاتیون پراکسیداز واکنش اکسیداسیون گلوتاتیون و تجزیه H2O2 را کاتالیز می‫کند. گلوتاتیون اکسید شده در حضور گلوتاتیون پراکسیداز و NADPH احیا می‫شود. همچنین در این واکنش NADPH نیز اکسید می‫شود و به فرم NADP+ تبدیل می‫شود که منجر به کاهش جذب در طول موج 340 نانومتر می‫شود. کاهش جذب مستقیما با غلظت گلوتاتیون پراکسیداز متناسب است. میزان فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز با استفاده از کیت (ZellBio GmbH, Germany) انجام شد.

3- آنالیز آماری

ابتدا داده‫ها وارد نرم افزار SPSS (ورژن 20) شد و با استفاده از آزمون‫های آماری ANOVA و Tukey بررسی شد. P کم‫تر از 05/0 به‫عنوان سطح معنی‫داری در نظر گرفته شد.

4- نتایج

درصد زنده‫مانی(viability  )

تجویر اپیوم  به محیط کشت HepG2 سبب کاهش درصد زنده ماندن سلول‫ها به‫صورت وابسته به دوز شد که در  شکل 1 نشان داده شده است (p< 0.001).

 

شکل 1: درصد زنده‫مانی (viability)  در رده سلولی HepG2 تیمار شده با اپیوم. معنی‫داری به‫صورت0.001>p  ** و 0.001>p ***  در مقایسه با گروه کنترل تیمار نشده نمایش داده شده است.

 

میزان آنتی اکسیدانت تام (TAC) و میزان اکسیدانت تام (TOS)

   نتایج آنالیز آماری حاکی از اختلاف معنی‫دار میزان TAC ‏در گروه های مختلف تحت تیمار درمان بود )p<0.001(.  در گروه دریافت کننده اپیوم با دوز 60 و 70 میلی‫گرم در میلی‫لیتر در مقایسه با گروه کنترل میزان TAC کاهش قابل ملاحظه‫ای داشت (p<0.001)(شکل  2 الف).

   نتایج آنالیز آماری حاکی از اختلاف معنی‫داری در میزان TOS ‏در گروه‫های مختلف تحت تیمار بود (p< 0.001). در گروه دریافت کننده اپیوم با دوز 60 و 70 میلی‫گرم در میلی‫لیتر در مقایسه با گروه کنترل میزان TOS کاهش قابل ملاحظه‫ای داشت (p< 0.001)(شکل 2 ب).

 

 شکل 2: الف)  میزان آنتی اکسیدانت تام (TAC) در رده سلولی HepG2 تیمار شده با اپیوم. ب) میزان اکسیدانت تام (TOS)  در رده سلولی HepG2 تیمار شده با اپیوم.  

معنی‫داری به‫صورت0.05 >p*  و 0.001>p ***در مقایسه با گروه کنترل تیمار نشده نمایش داده شده است.

 

 

 

میزان مالون دی الدهید (MDA)

  نتایج آنالیز آماری حاکی از اختلاف معنی‫داری در میزان MDA ‏در گروه‫های مختلف تحت تیمار بود (p< 0.001).  در گروه دریافت کننده اپیوم با دوز 60 و 70 میلی‫گرم در میلی‫لیتر در مقایسه با گروه کنترل میزان MDA افزایش معنی‫داری داشت (p< 0.001)(شکل 3).

 

شکل 3: میزان مالون دی الدهید (MDA) در رده سلولی HepG2 تیمار شده با اپیوم.

معنی‫داری به‫صورت0.05  >*p  و 0.001>*** p در مقایسه با گروه کنترل تیمار نشده نمایش داده شده است.

 

میزان فعالیت کاتالاز(CAT)

  نتایج آنالیز آماری حاکی از اختلاف معنی‫داری در میزان CAT ‏در گروه‫های مختلف تحت تیمار بود )p<0.001(.  در گروه دریافت کننده اپیوم با دوز 60 و 70 میلی گرم در میلی‫لیتر در مقایسه با گروه کنترل میزان CAT افزایش قابل ملاحظه‫ای داشت )p< 0.001( (شکل 4).

 

شکل 4 : میزان فعالیت کاتالاز(CAT) در رده سلولی HepG2 تیمار درمان شده با اپیوم.

معنی‫داری به‫صورت  0.001>p  ** و 0.001>*** p در مقایسه با گروه کنترل تیمار نشده نمایش داده شده است.

 

میزان فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD)

  نتایج آنالیز آماری حاکی از اختلاف معنی‫داری در میزان SOD ‏در گروه‫های مختلف تحت تیمار بود (p< 0.001). در گروه دریافت کننده اپیوم با دوز 60 و 70 میلی‫گرم در میلی‫لیتر در مقایسه با گروه کنترل میزان SOD کاهش قابل ملاحظه‫ای داشت )p< 0.001) (شکل 5).

 

شکل5: میزان فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD) در رده سلولی HepG2 تیمار شده با اپیوم.

معنی‫داری به‫صورت0.001>*** p در مقایسه با گروه کنترل تیمار نشده نمایش داده شده است.

 

میزان فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز (GPx)

   نتایج آنالیز آماری حاکی از اختلاف معنی‫داری در میزان GPx ‏در گروه های مختلف تحت تیمار بود )p< 0.001(.  در گروه دریافت کننده اپیوم با دوز 60 و 70 میلی‫گرم در میلی‫لیتر در مقایسه با گروه کنترل میزان GPx افزایش قابل ملاحظه‫ای داشت )p< 0.001) (شکل 6).

 

شکل 6: میزان فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) در رده سلولی HepG2 تیمار شده با اپیوم.

 معنی‫داری به‫صورت0.001>p ** در مقایسه با گروه کنترل تیمار نشده نمایش داده شده است.

 

5- بحث

مطالعات مختلف نشان می‫دهند که استرس اکسیداتیو با اعتیاد به مواد مخدر از جمله کوکائین، مت آمفتامین و مورفین در ارتباط می‫باشد. به‫عنوان مثال مورفین سبب فعال شدن گیرنده‌های اپیوئیدی می‫شود و مصرف آن تولید رادیکال‌های آزاد از جمله گونه‫های فعال اکسیژن (ROS) یا گونه‌های فعال نیتروژن (RNS) را افزایش داده و همچنین سبب کاهش فعالیت آنزیم‫های آنتی‌اکسیدانتی می‫شوند. گزارش شده است که مورفین تولید ROS را به‫روشی وابسته به زمان و غلظت در سلول‌های SH-SY5Y القا کند و ROS تولید شده متعاقبا از طریق درگیر کردن گیرنده‌های μ-افیونی بر اعتیاد به مورفین تاثیر می‌گذارد (11).

در این مطالعه میزان MDA به مقدار قابل ملاحظه‫ای توسط تریاک افزایش یافت. افزایش این مارکر می تواند نشان دهنده آسیب مستقیم کبد توسط تریاک باشد. نشان داده شده است که MDA به‫عنوان  یک شاخص آسیب بافتی شناخته می‫شود و افزایش آن می‫تواند منجر به اختلال ساختاری و عملکردی و سرانجام مرگ سلولی شود (12). Asgary و همکاران (13) با بررسی اثر تریاک بر شاخص های لیپیدی و قند خون نشان دادند که مصرف تریاک تاثیری برکاهش میزان قند خون و کلسترول، HDL، تری گلیسرید، کلسترول تام و  HbA1C  نداشت، اما میزان MDA  را افزایش داد. 

استفاده سیستمیک مورفین همچنین می‫تواند منجر به استرس اکسیداتیو در حیوانات شود. مطالعه Abdel-Zaher و همکاران (14) نشان داد که سطح گلوتامات و MDA در مغز موش‌های تحت درمان با مورفین افزایش یافت (15). علاوه بر این، مورفین سبب کاهش سطح گلوتاتیون (GSH) و فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز (GSH-Px) در مغز موش شد.

در موش‌های صحرایی، تزریق زیر جلدی مورفین نیز سبب افزایش MDA شد و فعالیت‌های SOD و GSH-Px را کاهش داد (16) . در بیماران سرطانی که مورفین به‫داخل بطن مغزی آن‫ها تزریق شده بود، سطح GSH در مایع مغزی نخاعی کاهش یافت، که این وضعیت می‫تواند سیستم عصبی مرکزی را در برابر آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو آسیب پذیر کند. مورفین می‌تواند سطوح درون سلولی وضعیت ردوکس سلولی را تغییر دهد، متعاقبا بر سطوح S-آدنوزیل متیونین تاثیر بگذارد و در نهایت تغییرات متیلاسیون DNA  را القا کند (17). همچنین نشان داده شده است که مورفین با نیتراسیون SOD سبب کاهش فعالیت این آنزیم می‫شود (11).

علاوه بر این، اپیوم بر سایر پروتئین‌های مرتبط با استرس اکسیداتیو اثر می‌گذارد. در مطالعه حاضر فعالیت کاتالاز، SOD و GPx توسط تریاک کاهش داشت. نشان داده شده است که مصرف مورفین نه تنها سطح MDA را افزایش می‫دهد، بلکه فعالیت‫های SOD، گلوتاتیون-s-ترانسفراز (GST) و کاتالاز (CAT) را در کبد موش‫ها کاهش می‫دهد (18).

 نتایج آنالیز پروتئومیک نشان می‫دهد مورفین پروتئین‫های مرتبط با استرس اکسیداتیو، مانند پراکسی ردوکسین-2 و پروتئین شوک حرارتی 70 (Hsp70) را به‫طور قابل توجهی کاهش می‫دهد (19).

Lamsal و همکاران (20) گزارش کردند که مصرف مزمن تریاک به مقدار قابل ملاحظه ای میزان GSH را در قلب موش‫ها کاهش می‫دهد، در حالی‫که سبب افزایش گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون اکسید شده، SOD و GPx، شده که منجر به افزایش استرس اکسیداتیو بافت قلبی می‫شود. SOD یکی از مهم‫ترین آنزی‫های آنتی اکسیدانت خط اول دفاعی بدن است که سبب کاتالیز آنیون سوپراکسید به H2O2 می شود که در مرحله بعدی توسط کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز به آب تبدیل می‫شود.  مطالعه قبلی کاهش قابل توجهی در SOD در حیوانات تحت درمان با تریاک در مقایسه با گروه کنترل گزارش کرده است. همچنین مطالعات قبلی نشان داده‫اند که تریاک سبب کاهش GSH می‫شود. مطالعه Zhang  و همکاران (21) نشان داد که تجویز مورفین باعث کاهش سطح گلوتاتیون، گلوتاتیون پراکسیداز، کاتالاز و آنتی اکسیدانت تام شده و باعث افزایش مالون دی الدهید در کبد  موش می‫شود و از این طریق سبب آسیب بافت کبد می شود. Samarghandian و همکاران (22) نیز نشان دادند که تجویز مورفین به رت سبب افزایش سطوح سطح سرمی آسپارتات آمینوترانسفراز (AST)، آلانین آمینوترانسفراز (ALT)،لاکتات دهیدروژناز (LDH) و سطح مالون دی آلدئید کبد (MDA) می شود. آن‫ها همچنین نشان دادند که فعالیت SOD، GST و CAT در گروه مورفین به‫طور معنی‫داری کمتر از گروه کنترل بود.

این طرح همچنین دارای محدودیت‫های متفاوتی بود که یکی از آن‫ها کار با تریاک می‫باشد. از طرف دیگر اگر چه ادعا می‫شود این تریاک خالص می‫باشد اما ممکن است برخی افزودنی‫ها در آن باشد. از دیگر محدودیت‫های این طرح می‫توان به عدم بررسی اثر تریاک در مدل انسانی یا حیوانی باشد.

6- نتیجه‌گیری

نتایج این تحقیق نشان داد که تریاک اثر کشندگی بر سلول های  HepG2داشت. همچنین تریاک سبب افزایش استرس اکسیداتیو در این رده سلولی شد که نشان دهنده آسیب پذیری کبد در برابر این ترکیب می‫باشد. نتایج این مطالعه نشان می‫دهد که اگرچه تریاک دارای اثرات ضد دردی است اما می‫تواند به‫شدت سبب آسیب بافت کبد شود.

7- تشکر و قدردانی

بدین‫وسیله از معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی همدان بابت حمایت از این طرح قدردانی می‫شود (شماره گرنت 9611177326).

-

  1. Bekravi M, Chehreh K, Nazemi S. Investigating the Effect of Opium Addiction on Serum Glucose and Lipid Profiles in Diabetic Patients with Acute Coronary Syndromes. Annals of Military and Health Sciences Research. 2024;22(3).
  2. Najafipour H, Masoumi M, Amirzadeh R, Rostamzadeh F, Foad R, Shadkam Farrokhi M. Trends in the Prevalence and Incidence of Opium Abuse and its Association with Coronary Artery Risk Factors in Adult Population in Iran: Findings from Kerman Coronary Artery Disease Risk Factors Study. Iran J Med Sci. 2022;47(4):328-37.
  3. Mohammadi A, Oshaghi EA, Sorkhani AN, Oubari F, Kia RH, Rezaei A. Effect of opium on lipid profile and expression of liver X receptor alpha (LXRα) in normolipidemic mouse. Food and nutrition sciences. 2012;3(2):249-54.
  4. Skrabalova J, Drastichova Z, Novotny J. Morphine as a potential oxidative stress-causing agent. Mini-reviews in organic chemistry. 2013;10(4):367-72.
  5. Bhat RS, Bhaskaran M, Mongia A, Hitosugi N, Singhal PC. Morphine-induced macrophage apoptosis: oxidative stress and strategies for modulation. Journal of leukocyte biology. 2004;75(6):1131-8.
  6. Kıran TR, Otlu O, Karabulut AB. Oxidative stress and antioxidants in health and disease. Journal of Laboratory Medicine. 2023;47(1):1-11.
  7. Chandra R, Aneja R, Rewal C, Konduri R, Dass SK, Agarwal S. An opium alkaloid-Papaverine ameliorates ethanol-induced hepatotoxicity: diminution of oxidative stress. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 2000;15(2):155-60.
  8. Artimani T, Karimi J, Mehdizadeh M, Yavangi M, Khanlarzadeh E, Ghorbani M, et al. Evaluation of pro-oxidant-antioxidant balance (PAB) and its association with inflammatory cytokines in polycystic ovary syndrome (PCOS). Gynecol Endocrinol. 2018;34(2):148-52.
  9. Salehi I, Zarrinkalam E, Mirzaei F, Oshaghi EA, Ranjbar K, Asl SS. Effects of resistance, endurance, and concurrent exercise on oxidative stress markers and the histological changes of intestine after morphine withdrawal in rats. Avicenna Journal of Medical Biochemistry. 2018;6(2):44-9.
  10. Abbasi-Oshaghi E, Khodadadi I, Mirzaei F, Ahmadi M, Tayebinia H, Goodarzi MT. Alleviates Sperm‎ Damage by Limiting Oxidative Stress‎ and Insulin‎ Resistance‎ in‎ Diabetic Rats‎. The Open Medicinal Chemistry Journal. 2020;14(1).
  11. Zeng XS, Geng WS, Wang ZQ, Jia JJ. Morphine Addiction and Oxidative Stress: The Potential Effects of Thioredoxin-1. Front Pharmacol. 2020;11:82.
  12. Rauen U, Viebahn R, Lauchart W, De Groot H. The potential role of reactive oxygen species in liver ischemia/reperfusion injury following liver surgery. Hepato-gastroenterology. 1994;41(4):333-6.
  13. Asgari S, Naderi G, Shahrezaei J, Ahmad P. Comparison of plasma level of lipid peroxidation, lipids & blood sugar in opium addicted & control groups. ARYA Journal, 2005, 1(2): 72-74
  14. Abdel-Zaher AO, Mostafa MG, Farghaly HS, Hamdy MM, Abdel-Hady RH. Role of oxidative stress and inducible nitric oxide synthase in morphine-induced tolerance and dependence in mice. Effect of alpha-lipoic acid. Behav Brain Res. 2013;247:17-26.
  15. Abdel-Zaher AO, Mostafa MG, Farghly HM, Hamdy MM, Omran GA, Al-Shaibani NK. Inhibition of brain oxidative stress and inducible nitric oxide synthase expression by thymoquinone attenuates the development of morphine tolerance and dependence in mice. Eur J Pharmacol. 2013;702(1-3):62-70.
  16. Motaghinejad M, Karimian SM, Motaghinejad O, Shabab B, Asadighaleni M, Fatima S. The effect of various morphine weaning regimens on the sequelae of opioid tolerance involving physical dependency, anxiety and hippocampus cell neurodegeneration in rats. Fundam Clin Pharmacol. 2015;29(3):299-309.
  17. Trivedi M, Shah J, Hodgson N, Byun HM, Deth R. Morphine induces redox-based changes in global DNA methylation and retrotransposon transcription by inhibition of excitatory amino acid transporter type 3-mediated cysteine uptake. Mol Pharmacol. 2014;85(5):747-57.
  18. Asadi Akbarabadi E, Rajabi Vardanjani H, Molavinia S, Pashmforoosh M, Khodayar MJ. PMSF Attenuates Morphine Antinociceptive Tolerance and Dependence in Mice: Its Association with the Oxidative Stress Suppression. Iran J Pharm Res. 2021;20(3):300-9.
  19. Bu Q, Yang Y, Yan G, Hu Z, Hu C, Duan J, et al. Proteomic analysis of the nucleus accumbens in rhesus monkeys of morphine dependence and withdrawal intervention. J Proteomics. 2012;75(4):1330-42.
  20. Lamsal M, Gautam N, Bhatta N, Toora BD, Bhattacharya SK, Baral N. Evaluation of lipid peroxidation product, nitrite and antioxidant levels in newly diagnosed and two months follow-up patients with pulmonary tuberculosis. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2007;38(4):695-703.
  21. Zhang YT, Zheng QS, Pan J, Zheng RL. Oxidative damage of biomolecules in mouse liver induced by morphine and protected by antioxidants. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 2004;95(2):53-8.
  22. Samarghandian S, Afshari R, Farkhondeh T. Effect of long-term treatment of morphine on enzymes, oxidative stress indices and antioxidant status in male rat liver. Int J Clin Exp Med. 2014;7(5):1449-53.
سلول و بافت
دوره 15، شماره 3
پاییز 1403
صفحه 257-268

  • تاریخ دریافت 21 آذر 1403

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما