فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار فارماکولوژی،گروه فارماکولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی آبادان، آبادان، ایران.h.mojiri@abadanums.ac.ir

2 استاد بیولوژی مولکولی و مهندسی ژنتیک ،گروه بیولوژی دریا، دانشکده علوم دریایی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، خرمشهر، ایران. zolgharnein@kmsu.ac.ir

چکیده

هدف : آستاگزانتین کاروتنویید طبیعی با آثار فارماکولوژیک مختلف می باشد. مکانیسم مولکولی اثر ضد التهاب این ترکیب چندان مشخص نیست. هدف این مطالعه، بررسی نقش TLR4 و سایتوکاین‫های التهابی IL-1, IL-6, TNFα  در بروز اثر ضد التهابی آستاگزانتین در ماکروفاژها می‫باشد. مواد و روشها: سلول‫های ماکروفاژی RAW264.7  با LPS القای التهاب شدند. دوزهای 100،50،25 میکرومولار از آستاگزانتین برای تیمار سلول‫ها به‫کار برده شد. میزان بیان ژن TLR4  به روش RT-PCR در دو زمان 24 و 48 ساعت پس از القا با LPS  اندازه گیری شد. سطح سایتوکاین‫های IL-1, IL-6, TNFα با کیت الایزای ساندویچی اندازه‫گیری شد. از آزمون‫های آماری و تست ANOVA یک طرفه برای آنالیز داده‫ها استفاده شد. نتایج: LPS باعث افزایش میزان بیان ژن TLR4  در هر دو زمان 24و 48 ساعت پس از القا شد p<0.001)) که آستاگزانتین با هر سه دوز به‫طور معنی‫داری آن را کاهش داد (p<0.001). سطح سایتوکاین‫های IL-1, IL-6, TNFα در سلول‫های ماکروفاژی القا شده با LPS افزایش یافته بود (p<0.05) که دوزهای50 و 100 میکرومولار آستاگزانتین باعث کاهش معنی‫دار سطح سایتوکاین‫ها شد.
نتیجه گیری : آستاگزانتین با کاهش میزان بیان TLR 4 که در شرایط التهابی افزایش بیان پیدا می‫کند باعث کاهش تولید سایتوکاین‫های التهابی  IL-1, IL-6, TNFα که در مسیر سیگنالیگ آن قرار دارند، می‫شود. با توجه به اثر ضد التهابی آستاگزانتین و عوارض داروهای ضد التهاب کنونی، آستاگزانتین دارای پتانسیل بالا جهت درمان بیماری‫های التهابی مزمن می‫باشد.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Investigation the Anti-inflammatory Effect of Astaxanthin on Inhibiting TLR4 and Some Inflammatory Cytokines in macrophages cell

نویسندگان [English]

  • H Mojiri-Forushani 1
  • H Zolgharnein 2

1 Dpartment of Pharmacology, School of Medicine, Abadan University of Medical Sciences, Abadan, Iran.

2 Department of Marine Biology, Khorramshahr University of Marine Science and Technology, Khorramshahr, Iran

چکیده [English]

Aim: Inflammation is a protective physiologic response against pathogens, trauma and injury (1, 2). Inflammation pathway are different in human body and some main pro-inflammatory cytokines such as IL-1β, IL-6, and TNF-α have key role in pathogenesis of inflammation (3). Current anti-inflammatory drugs including corticosteroids and non-steroid anti-inflammatory drugs have serious side effects (6), so, research on new compounds with anti-inflammatory property is necessary. Astaxanthin is a natural carotenoid with various pharmacological effects. Haematococcus Algae is one of the marine sources of astaxanthin. Anti-inflammatory and antioxidant effects of astaxanthin were reported in previous studies (8-10), but the molecular mechanism of the anti-inflammatory effect of astaxanthin on the peripheral cells of the immune system is not clear. The aim of this study was to evaluate anti-inflammatory effects of astaxanthin on TLR4 gene expression and secretion of key inflammatory cytokines including IL-1, IL-6, and TNFα in RAW264.7 macrophage cells.
Methods and Material: The RAW264.7 macrophage cells was used in this study. Astaxanthin was extracted from Haematococcus Algae, then different doses of 25, 50, 100 μM of astaxanthin were used to treat the cells. Cells divided to three groups: one group received LPS (1µg/ml), Treatment group received LPS (1µg/ml) in combination to different dose of astaxanthin (25, 50, 100 μM) and control group without LPS astaxanthin. After 24 hour incubation, cell viability was assay with MMT test.TLR4 gene expression was measured by RT-PCR at 24 and 48 hours after induction with LPS. β-actin was considered as housekeeping gene. The levels of IL-1β, IL-6, and TNFα cytokines were measured with a commercial sandwich ELISA kit. The optic absorbance was read at 45 nm. Descriptive statistics and one-way ANOVA test were used to analyze the data. To analysis the fold change of gene expression, formula 2 -ΔΔCT   was used.
Results: None of different doses of astaxanthin (25, 50, 100 μM) and LPS (1µg/ml) had no toxicity effect on macrophages cell. (P>0.05). LPS increased TLR 4 gene expression at both 24 and 48 hours after induction, (P <0.001) in compare to control group. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Astaxanthin
  • Anti-inflammatory
  • TLR4
  • Inflammatory cytokine
  • مقدمه

التهاب یک پاسخ  حفاظتی و فیزیولوژیک در برابر آسیب به سلول و یا بافت می‫باشد و با علایم بالینی گرما، قرمزی، تورم ودرد بروز می‫کند. التهاب در ابتدا باعث التیام و ترمیم مناطق آسیب دیده می‫شود ولی در صورت تداوم پروسه‫های التهابی، منجر به آسیب به بافت‫های بدن و بروز علایم مخصوصا درد می‫شود (1, 2). مسیرهای منجر به التهاب و درد در بدن انسان متنوع می‫باشند و در تمام مسیرها، آنزیم‫ها، فاکتورهای رونویسی کننده‫، تولید و ترشح واسطه‫های شیمیایی التهابی نقش اساسی دارند. ماکروفاژها به‫عنوان یکی از اجزای مهم سیستم ایمنی بدن، نقش کلیدی در شروع و تدام التهاب در بدن دارند. ماکروفاژها از طریق تغییر در میزان ترشح سایتوکاین‫های التهابی و پیش التهابی، باعث پیشرفت پروسه‫های التهابی در بدن می‫شوند. همچنین ماکروفاژها در پاتوژنز بیماری‫های التهابی مزمن، مانند آرتریت روماتویید، بیماری‫های التهابی دستگاه گوارش ، التهاب بافت های کبدی و.... نقش اساسی دارند (3, 4).

سایتوکاین‫های IL-1β( Interlukine 1β)، IL-6 ( Interlukin 6) , TNFα (Tumor necrosis factor α)  از مهم‫ترین سایتوکاین‫های پیش التهابی هستند که افزایش ترشح و غلظت آن‫ها در بیماری‫های التهابی مختلف مانند آرتریت روماتوئید‫، دیده می‫شود (5).

 TLR (Toll like receptor)ها نقش مهمی در عملکرد سیستم ایمنی بدن در شرایط مواجه با عوامل بیماری زا و به‫ویژه التهاب دارند. این گیرنده‫ها به‫طور وسیعی در سلول‫های ایمنی در شرایط التهاب زا بیان می‫شوند و باعث فعال کردن برخی  سلول‫های وابسته به سیستم ایمنی، آنزیم‫ها و سایتوکاین‫های التهابی می‫شوند. از بین آن‫ها TLR4  در بروز پاسخ های التهابی القا شده توسط لیپوپلی ساکاریدها نقش دارد و از طریق فعال کردن NF-ƙB (Nucleular factor kappa B) باعث افزایش ترشح سایتوکاین‫های التهابی IL-1β, IL-6,TNFα می شود. لذا مداخله در مسیر ترشح سایتوکاین‫های التهابی می‫تواند منجر به بروز اثرات ضد التهابی شود (6, 7).

درمان‫های رایج برای کنترل درد و التهاب در سه دسته‫ی اصلی قرار می‫گیرند: داروهای ضد التهاب غیر استروئیدی که از پرمصرف ترین داروهای ضد درد و ضد التهاب می‫باشند ولی عارضه‫ی جانبی مهم آن بروز مشکلات گوارشی جدی می‫باشد. داروهای کورتیکوستروئیدها نیز خواص ضد التهاب قوی دارند ولی گسترده‫ی از عوارض جانبی این ترکیبات مصرف آن‫ها را محدود کرده است. افزایش بروز پوکی استخوان، افزایش سطح لیپیدها و گلوکز خون و کاهش سطح ایمنی بدن از مهم‫ترین عوارض جانبی آن‫ها می‫باشد. داروهای مخدر با اثر ضد دردی قوی، جایگاه ویژه ای در درمان ضد درد دارند ولی مهم‫ترین چالش آن‫ها ایجاد تحمل دارویی و بروز وابستگی های جسمی و روانی می‫باشد، به‫همین دلیل مصرف این دسته از ترکیبات در شرایط خاص و با احتیاط انجام می‫شود (8).

از این‫رو همواره یافتن داروهای ضد التهاب جدید با اثر بخشی مناسب و کم بودن عوارض جانبی مورد توجه محققین بوده است. اقیانوس‫ها به‫عنوان منبع منشا حیات، دارای گنجینه ای ارزشمند از ترکیبات غنی و زیستی فعال می‫باشند. انواع موجودات دریایی با داشتن ترکیباتی مانند کاروتنوئیدها، ترپن‫ها، تری ترپن‫ها، آلکالوییدها، سزکویی ترپن‫ها و......  دارای خواص فارماکولوژیک متنوعی مانند ضد باکتری، ضد قارچ، ضد سرطان، ضد درد و التهاب و.... می‫باشند (9). آستاگزانتین ترکیب کاروتنوئیدی گزانتوفیلی طبیعی می‫باشد که در منابع مختلفی مانند آبزیان‫، ماهی سالمون ، جلبک و......یافت می‫شود. این ترکیب دارای خواص ضد التهاب، آنتی اکسیدانتی، ضد دیابت، محافظت کننده‫ی بیماری‫های قلبی و عروقی و اثرات ضد سرطان می‫باشد. اثرات ضد التهابی این ترکیب و مفید بودن آن در برخی بیماری‫های التهابی  عصبی مخصوصا بیماری‫های نورودژنراتیو  مانند پارکینسون و مولتیپل اسکلروزیس بررسی شده است (10-12). مطالعات بر روی  مدل های حیوانی و مطالعات درون تنی، اثرات ضد التهابی این ترکیب را نشان داده اند (13, 14). همچنین بررسی  مولکولی آستاگزانتین بر روی سلول‫های دندریتیک دستگاه ایمنی‫، حاکی از اثر محافظتی و ضد التهابی این ترکیب می‫باشد (15).  با این وجود بررسی‫های مولکولی اثر ضد التهابی این ترکیب بر روی سلول‫های ماکروفاژی به‫عنوان یکی از مهم‫ترین سلول‫های دستگاه ایمنی بدن که نقش مهم و کلیدی در بروز پاسخ‫های التهابی دارند،  محدود می‫باشد. آستاگزانتین به‫همراه ترکیب طبیعی توکوترینول  با کاهش سطح اینترلوکین 6 و 12 باعث مهار و کاهش التهاب  در سلول‫های ماکروفاژی می‫شود (16). همچنین مهار فعال شدن NF-ƙB و کاهش تولیدNO (Nitric oxide), PGE2(Prostaglandin E2)  و مهار آنزیم سیکلواکسیژناز از مکانیسم های اثرضد التهابی آستاگزانتین بر روی سلول‫های ماکروفاژی RAW264.7  بیان شده است (17).

با این وجود نقش سایر واسطه‫های التهابی و سایتوکاین‫های پیش التهابی و التهابی بر روی سلول‫های ماکروفاژی در بروز اثر ضد التهابی آستاگزانتین چندان مشخص نیست، لذا با توجه به نقش TLR4  در ترشح سایتوکاین‫های التهابی و پیش التهابی و مطالعات محدود در زمینه ی اثرات ضد التهابی آستاگزانتین در ماکروفاژها و نقش آن‫ها در التهاب مزمن، هدف این مطالعه، بررسی اثرات ضد التهابی ترکیب طبیعی آستاگزانتین بر میزان ترشح سایتوکاین‫های التهابی و بیان ژن TLR4  بر سلول‫های ماکروفاژی می باشد.

2- مواد و روش‌ها

آستاگزانتین از  Haematococcus Algae  توسط پژوهشکده اکولوژی خلیج فارس و دریای عمان استخراج شد. رده سلولی ماکروفاژ  RAW 264.7از بانک سلولی موسسه انیستیتو پاستور ایران خریداری شد. متانول، استونیتریل از شرکت مرک آلمان، دی میتل سولفوکساید DMSO (Dimethyl sulfoxide) و LPS ( Lipopolysaccharide)  (لیپوپلی ساکارید استخراج شده از باکتری   Escherichia coli 0127:B8) از شرکت سیگما آلدریچ  آمریکا تهیه شد.PRMI و محیط کشت DMEM، سرم جنین گاوی FBS(Fetal bovine serum )  از شرکت ایده زیستی ایران خریداری شد. پلیت‫های کوت شده با فیبرونکتین و کلاژن از شرکت پادگین طب در ایران تهیه شد. کیت اندازه گیری IL-1, IL-6, TNF-α از شرکت  کارمانیا پارس ژن ایران  خریداری شد. کیت استخراج RNA ازشرکت سیناژن ایران و کیت سنتز cDNA از شرکت TAKARAژاپن تهیه شد. سایر مواد و معرف ها از منابع معتبر خریداری شدند.

روش استخراج آستاگزانتین از  Haematococcus Algae: استخراج آستاگزانتین از میکروجلبک هماتوکوکوس به‫روش  استخراج توسط حلال‫های اسیدکلریدریک و استون انجام شد، در این روش حدود 10 میلی‫گرم از پودر هماتوکوکوس در یک میلی‫لیتر حلال اسیدکلریدریک 4 نرمال  قرار گرفت  و این مخلوط به‫مدت یک ساعت در بن ماری با دمای 70 درجه سانتی‫گراد  قرار داده شد. پس از خنک شدن، به‫مدت 5 دقیقه   با دور  5000   سانتریفوژ گردید. سپس با آب مقطر شستشو انجام شد و این مراحل دو بار تکرار شد. رسوب به‫دست آمده با 4 میلی لیتر استون سوسپانسیون شده و پس از یک ساعت هم زدن در دمای اتاق، توسط امواج فراصوت، فرآیند سونیکاسیون در فرکانس 20  کیلوهرتز انجام شد، این مراحل دو بار تکرار شد. سپس سانتریفیوز با دور 3500 به  مدت  6 دقیقه انجام شد و استون حاوی محلول رویی جدا سازی شد. از محلول رویی  برای شناسایی آستاگزانتین توسط HPLC (High performance liquid chromatography)   استفاده شد. در این روش میزان 15 میکرولیتر از محلول  به دستگاه تزریق شد،  فاز متحرک شامل متانول و استونیتریل به نسبت حجمی/حجمی 70 به 30 در نظر گرفته شد (18, 19).

کشت سلولی: سلول‫های  RAW264.7 در محیط DMEM ،  و 10 درصد سرم جنین گوساله غیرفعال شده با حرارت و 1 درصد  پنی سیلین / استرپتومایسین کشت داده شدند. سلول‫ها در دمای 37 درجه سانتی‫گراد و هوا ی مرطوب با 5 درصد CO2 و  95 درصد هوا در دستگاه کشت سلولی نگه‫داری شدند.

تست   MMTتوان حیاتی سلولها:تست سنجش میزان زنده ماندن سلول‫ها در حضور LPS و غلظت‫های مختلف آستاگزانتین به‫منظور بررسی سمیت   LPS  و آستاگزانتین انجام شد. در این تست برای ارزیابی سلول‫های زنده از پودر MTT استفاده می‫شود MTT، توسط سلول‫ها جذب شده و سپس توسط دهیدروژناز میتوکندری به فورمازان تبدیل می‫شود. تجمع فورمازان منعکس کننده فعالیت میتوکندری به‫طور مستقیم و زنده ماندن سلول به‫طور غیر مستقیم است. در این تست محلول زرد رنگ تهیه شده از پودرMTT، توسط سلول‫های زنده و فعال از نظر متابولیکی در طی مدت تقریبی 4 ساعت به بلورهای ارغوانی رنگ فورمازان تبدیل می‫شود. کریستال‫های فورمازان ساخته شده به‫کمک حلال DMSO  حل شده و جذب نوری محلول ارغوانی رنگ به‫وسیله الایزا ریدر در طول موج 570 نانومتر خوانده می‫شود.

در ابتدا، سوسپانسیون‫های سلولی تهیه شد و با استفاده از لام نیوبار ، شمارش سلولی انجام شد. سپس از پلیت‫های 96 خانه‫ای  ته صاف  با محیط کشت کامل استفاده شد و سلول‫ها به‫میزان 104در هر چاهک قرار داده شد.

در این مطالعه 3 نوع تیمار سلولی انجام شد :

الف. سلول‫های ماکروفاژی 264.7 RAW ( به‫عنوان کنترل)

ب. سلول‫های ماکروفاژی رده 264.7 RAW کشت داده شده در حضور LPS به‫عنوان ماده القا کننده التهاب

ج. سلول‫های ماکروفاژی رده 264.7 RAW کشت داده شده در حضور LPS به‫عنوان ماده القا کننده التهاب که غلظت‫های متفاوت آستاگزانتین  (25، 50 و 100 میکرومولار ) به آن‫ها اضافه شد. آزمایش‫ها سه بار به‫طور مجزا انجام شد و در هر بار برای هر بررسی سه بار تکرار انجام شد.

به‫جز سلول‫هایی که به‫عنوان کنترل در نظر گرفته شده بودند، در هر چاهک LPS  به میزان 1µg/ml  اضافه شد  و در گروه تیمار شده با آستاگرانتین، غلظت‫های  مختلف آستاگزانتین (25، 50 و 100 میکرومولار)  اضافه شدند سپس  سلول‫ها به‫مدت 24 ساعت  و ۴۸ ساعت در انکوباتور CO2  انکوبه شدند. پس از آن محیط کشت تعویض شد و 10میکرولیتر از محلول MMT با غلظت ۱۲ میلی مولار در تاریکی به هر چاهک اضافه شد و پلیت با فویل پوشیده شد و در دمای ۳۷ درجه سانتی‫گراد به‫مدت ۴ ساعت انکوبه شد.  پس از این مدت  ۵۰ میکرولیتر محلول DMSO  به‫منظور حل کردن کریستال های فوروزمان به‫هر چاهک اضافه شد و در نهایت میزان  جذب نوری در طول موج 570 نانومتر با دستگاه الایزا ریدر خوانده شد.

محاسبه درصد سلولهای زنده در تست سمیت سلول: درصد سلول‫های زنده یا میزان بقای سلولی در بررسی سمیت سلولی، بر اساس رابطه زیرمحاسبه می‫شود.

  100×جذب متوسط نمونه های کنترل / جذب متوسط نمونه‫های تیمار شده = درصد سلول‫های زنده

اندازه گیری غلظت سایتوکاینهای IL-1β, IL6, TNFα در سلول RAW264.7: سلول‫های ماکروفاژی RAW264.7  به‫میزان 104در هر چاهک قرار داده شد. یک ساعت قبل از اضافه کردن) µg/ml LPS(1 به هر سلول، غلظت‫های مختلف آستاگزانتین ( 25، 50 و 100 میکرومولار) به‫هر چاهک اضافه شد و به‫مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه  سانتی‫گراد انکوبه شدند. سپس محیط کشت جمع آوری شد و سلول‫ها با دور 800 سانتریفوژ شدند و محلول رویی جدا شد و طبق دستورالعمل کیت‫ها  و با تکنیک الایزا انجام شد و جذب نوری  چاهک ها در طول موج 450نانومتر  به‫دست آمد.

RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction): این تست جهت بررسی میزان بیان ژن به‫کار برده می شود. ابتدا در هر چاهک به‫میزان ۵*۱۰5سلول قرار داده شد و سلول‫ها برای ۱۲ ساعت انکوبه شدند. سپس سه مرتبه با محیط شستشو داده شد و بعد از آن LPS به‫میزان   1µg/ml به تنهایی یا در ترکیب با غلظت‫های مختلف آستاگزانتین   (25، 50 و 100  میکرومولا ) به‫مدت ۲۴ ساعت و ۴۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‫گراد انکوبه شدند. سپس با بافر PBS شتستو داده شدند و RNA  با استفاده از کیت استخراج RNA  شرکت سیناکلون و طبق دستورالعمل استخراج شدند و در دمای ۸۰- نگه‫داری شدند. برای تعیین غلظت و کیفیت  RNA های استخراج شده از اسپکتروفوتومتر در طول موج 210تا 280 نانومتراستفاده شد.‫

برای تهیه cDNA  از RNA از کیت سنتز cDNA ساخت شرکت Takara و طبق پروتکل انجام شد و در دمای ۲۰- نگه‫داری شدند. درمرحله ی بعد cDNA  جهت تکثیر  توسط RT-PCR در شرایط 42 درجه به‫مدت 60 دقیقه و حرارت 94 به‫مدت 5 دقیقه انجام شد. در این مطالعه پرایمرهای اختصاصی که قبلا سکانس آن‫ها مشخص و تایید شده بود (جدول شماره ۱) مورد استفاده قرار گرفت. همچنین از  βactin به‫عنوان ژن کنترل استفاده شد. اندازه گیری میزان بیان نسبی mRNA  ژن‫های مورد نظر با استفاده از مقایسه CT(Threshold cycle)  بین ژن مورد نظر و ژن کنترل  انجام شد.

جدول 1: توالی ژن‫های مورد بررسی

نام ژن

توالی

β-actin  F

5′-ATCACTATTGGCAACGAGCG-3′

β-actin  R

 5′-TCAGCAATGCCTGGGTACAT-3′

TLR-4  F

5′-CGATTCTAGAACAAAACCAA-3′

TLR-4 R

5′-CTGGAAAGGAAGGTGTCA-3′

 

3- آنالیز آماری

داده‫ها با استفاده از نرم افزار 22 SPSS تجزیه و تحلیل شدند. داده‫های این مطالعه به‫صورت میانگین ± انحراف استاندارد بیان گردید . آزمون کولموگروف–اسمیرنف جهت تعیین طبیعی بودن توزیع داده‫ها استفاده شد. از آزمون‫های One way ANOVA  و تست تعقیبی TUKEY  برای مقایسه‫ی بین گروه‫ها استفاده شد. جهت بررسی میزان بیان نسبی ژن از فرمول  ΔΔCT - 2استفاده شد. سطح معنی‫داری کمتر یا مساوی 05/0 در نظر گرفته شد.

4- نتایج

اثرات آستاگزانتین و LPS بر زنده ماندن سلولهای ماکروفاژی

نتایح بررسی سمیت سلولی نشان داد که LPS  با غلظت 1µg/ml  به تنهایی و در ترکیب با غلظت‫های 25، 50 و100 میکرومولار آستاگزانتین در زمان‫های 24 و 48 ساعت اثر سمیت بر سلول‫های ماکروفاژی RAW264.7 نسبت به گروه کنترل که فاقد LPS و آستاگزانتین بوده است، نداشته است ( p>0.05)، (نمودار شماره 1).

 

 

نمودار : درصد زنده ماندن سلول‫های RAW246.7 با  و بدون حضور لیپوپلی ساکارید وآستاگزانتین

سلول‫های دریافت کننده ی لیپوپلی ساکارید به تنهایی و در ترکیب  با غلظت‫های 25،50 و 100 میکرومولار آستاگزانتین، نسبت به سلول‫های کنترل که فاقد لیپوپلی ساکارید و آستاگزانتین هستند، تفاوتی در میزان زنده ماندن سلول‫ها نشان ندادند (p>0.05).

اثر آستاگزانتین بر سطح سایتوکاین IL-1β  در سلول ماکروفاژی

 همان‫گونه که در نمودار شماره 2 نشان داده شده است. LPS  باعث افزایش غلظت IL-1β  به‫طور معنی‫داری نسبت به گروه کنترل  شده است )p<0.05(. آستاگزانتین  با غلظت50 میکرومولار، باعث کاهش معنی‫داری در سطح  IL-1βنسبت به گروه دریافت کننده ی  LPS  شده است)p<0.05(. همچنین غلظت بالای آستاگزانتین 100 میکرومولار نیز باعث کاهش در میزان سطح  IL-1β شده است. غلظت 25 میکرومولار آستاگزانتین قادر به کاهش سطح IL-1β نبوده است.

 

 

نمودار ۲: اثر لیپوپلی ساکارید و غلظت‫های مختلف آستاگزانتین بر سطح سایتوکاین اینترلوکین ۱ بتا بر سلول‫های RAW 246.7

در سلول‫های دریافت کننده لیپوپلی ساکارید (1µg/ml) ، نسبت به سلول‫های کنترل که فاقد  لیپوپلی ساکارید و آستاگزانتین بودند، افزایش سطح در میزان اینترلوکین ۱ بتا مشاهده شد *)p<0.05(. سلول‫های دریافت کننده لیپوپلی ساکارید و غلظت‫های 50 و 100 میکرومولار از آستاگرانتین، سطح افزایش یافته‫ی سایتوکاین اینترلوکین ۱ بتا را  در مقایسه با سلول‫های دریافت کننده‫ی لیپوپلی ساکارید به تنهایی، کاهش داده است## )p<0.01(. سلول‫های تیمار شده با  غلظت ۲۵ میکرومولارآستاگزانتین، غلظت سایتوکاین اینترلوکین 1بتا را در مقایسه با سلول‫های دریافت کننده‫ی لیپوپلی ساکارید به‫تنهایی،کاهش نداده است.

اثر آستاگزانتین بر سطح سایتوکاین IL-6  در سلول ماکروفاژی

لیپوپلی ساکارید باعث افزایش معناداری در سطح سایتوکاین  IL-6 نسبت به گروه کنترل شده است P<0.05)  .(این افزایش  در سطح  IL-6 با غلظت 50 و 100 میکرومولار آستاگزانتین  به‫طور معنی‫داری کاهش یافته است. در حالی‫که غلظت ۲۵ میکرومولار آستاگزانتین ، سطح سایتوکاین  IL-6را کاهش نداده است (نمودار 3 ).

 

نمودار 3: اثر لیپوپلی ساکارید و غلظت های مختلف آستاگزانتین بر سطح سایتوکاین اینترلوکین 6  بر سلول‫های RAW246.7

 

در سلول‫های دریافت کننده لیپوپلی ساکارید (1µg/ml) ، نسبت به سلول‫های کنترل که  فاقد لیپوپلی ساکارید و آستاگزانتین بودند ، افزایش سطح در میزان اینترلوکین ۶ مشاهده شد (p<0.05*). سلول‫های دریافت کننده‫ی لیپوپلی ساکارید و غلظت‫های 50 و 100 میکرومولار از آستاگرانتین، سطح افزایش یافته ی سایتوکاین اینترلوکین ۶ را  در مقایسه با سلول‫های دریافت کننده ی لیپوپلی ساکارید به تنهایی، کاهش داده است (##p<0.01). سلول‫های تیمار شده با  غلظت ۲۵ میکرومولارآستاگزانتین، غلظت سایتوکاین اینترلوکین ۶ را در مقایسه با سلول‫های دریافت کننده‫ی لیپوپلی ساکارید به تنهایی،کاهش نداده است.

 

اثر آستاگزانتین بر سطح سایتوکاین TNFα در سلول ماکروفاژی

لیپوپلی ساکارید سطح TNFα را به طور معناداری افزایش داده است (p<0.05). غلظت ۲۵ میکرومولار کاهش معنی‫داری را نسبت به گروه القا شده با LPS ایجاد نکرده است. آستاگزانتین  با غلظت های 50 و 100 میکرومولار باعث کاهش معنی‫داری در سطح TNFα  نسبت به گروه  LPS  شده است(p<0.001) ( نمودار 4).

 

 

نمودار 4: اثر لیپوپلی ساکارید و غلظت های مختلف آستاگزانتین بر سطح سایتوکاینTNFα بر سلول‫های RAW246.7

در سلول‫های دریافت کننده لیپوپلی ساکارید (1µg/ml) ، نسبت به سلول‫های کنترل که فاقد لیپوپلی ساکارید و آستاگزانتین بودند ، افزایش سطح در میزان سایتوکاینTNFα مشاهده شد (*p<0.05). سلول‫های دریافت کننده لیپوپلی ساکارید و غلظت‫های 50 و 100 میکرومولار از آستاگرانتین، سطح  افزایش یافته‫ی سایتوکاین سایتوکاینTNFα را  در مقایسه با سلول‫های دریافت کننده‫ی لیپوپلی ساکارید به تنهایی، کاهش داده است (###p<0.01). سلول‫های تیمار شده با غلظت ۲۵ میکرومولار آستاگزانتین، غلظت سایتوکاینTNFα را در مقایسه با سلول‫های سلول‫های دریافت کننده‫ی لیپوپلی ساکارید به تنهایی، کاهش نداده است.

اثر آستاگزانتین بر میزان بیان ژن TLR4  در سلول ماکروفاژی

نتایج بررسی میزان بیان نسبی ژن در نمودار 5 نشان داده شده است.  LPS باعث افزایش میزان بیان ژن TRL4  نسبت به گروه کنترل در زمان‫های 24 ساعت و 48 ساعت پس از انکوباسیون شده است (p<0.001)

تیمارسلول‫ها با غلظت‫های مختلف آستاگزانتین (25و50 و 100 میکرومولار) ، در هر دو زمان 24 و 48 ساعت ، باعث کاهش معنی‫داری در میزان بیان ژن  TLR4 نسبت به گروه  LPS شده است (p<0.001).

 

نمودار ۵: اثر لیپوپلی ساکارید و غلظت های مختلف آستاگزانتین بر میزان بیان ژن TLR4  بر سلول‫های RAW246.7

در سلول‫های دریافت کننده لیپوپلی ساکارید ( 1 µg/ml) ، نسبت به سلول‫های کنترل که فاقد لیپوپلی ساکارید و آستاگزانتین بودند ، افزایش در میزان بیان ژن TLR4 مشاهده شد (***p<0.05). سلول‫های دریافت کننده لیپوپلی ساکارید و غلظت‫های25، 50 و 100 میکرومولار از آستاگرانتین، سطح افزایش یافته ی  بیان ژن TLR4را  در مقایسه با سلول‫های دریافت کننده ی لیپوپلی ساکارید به تنهایی،  کاهش داده است (###p<0.01).

5- بحث

بیماری‫های التهابی سیستمیک و موضعی مانند آرتریت روماتویید، استوآرتریت، بیماری‫های التهابی دستگاه گوارش و..... از مهم‫ترین بیماری‫های التهابی با نسبت شیوع نسبتا بالا می‫باشند (20). همچنین التهاب یکی از عوامل بسیار مهم در پاتوژنز بیماری‫های نورودژنرتیو مانند آلزایمر، پارکینسون ، مولتیپل اسکلروزیس و سایر بیماری‫ها مانند دیابت، آترواسکلروزیس و .... می‫باشد (21).

درمان‫های کنونی برای کنترل درد و التهاب همواره با عوارضی همراه هستند که مصرف آن‫ها را به‫دلیل بروز عوارض جانبی محدود کرده است (8). از طرفی برخی از مطالعات، اثرات فارماکولوژیکی متنوعی از ترکیبات استخراج شده از ماهی‫ها ، جلبک‫ها، مرجان‫ها و سایر موجودات دریایی را گزارش کرده اند (9, 22).

در این بررسی، خواص ضد التهابی کاروتنوئید طبیعی استخراج شده از Haematococcus Algae  مورد بررسی قرار گرفت. آستاگزانتین با کاهش میزان بیان ژن TLR 4  و کاهش سطح سایتوکاین‫های التهابی  IL-1β,IL-6,TNFα  بر رده سلولی ماکروفاژی، اثرات ضد التهابی خوبی را نشان داد.

 TLR4به دسته‫ای از خانواده‫های پروتئینی تعلق دارند که بر روی سطح سلول قرار گرفته اند و در ایجاد پاسخ های اولیه‫ی دفاع میزبان در برابر پاتوژن‫ها نقش دارند. TLR4 باعث فعال کردن مسیرهای سیگنالی می‫شوند که در نهایت باعث القای ژن‫های التهابی می‫شود (23).

 LPS به‫عنوان ترکیب اصلی غشای خارجی دیواره سلولی باکتری‫های گرم منفی می‫باشد که توسط TLR4 ‫ها که بر سطح ماکروفاژها قرار دارند، شناسایی می‫شوند. فعال شدن TLR4 منجر به افزایش تولید و ترشح سایتوکاین‫های پیش التهابی  IL-1β ,IL-6,TNFα  می‫شود که نقش اساسی در پاتوژنز بیماری‫های التهابی دارند (24).

مسیر پیام رسانی TLR از دومین های داخل سیتوپلاسمی منشا می‫گیرد که در میان همه TLR ها حفاظت شده است. همه TLR های یک مسیر مشترک پیام رسانی را فعال می‫کند. همه TLR ها از طریق مسیر وابسته به پروتئین88 MyD  پیام رسانی می کنند. در این مسیر چندین واسطه و آنزیم قرار دارند که در نهایت منجر به فعال شدن فاکتورهای رونویسی کننده  JNK (c-Jun N-terminal Kinase)  و   Nuclear Factor  kappa B (NF-ƙB)  می شود که به هسته  سلول وارد شده و روی بیان ژن تاثیر می‫گذارند. فعال شدن   NF-ƙBمنجر به تنظیم  بیان سایتوکاین‫های التهابی مانند اینترلوکین۱، اینترلوکین ۶ و TNFα می شود (23-26).

  در این بررسی نشان داده شد که LPS  منجر به افزایش بیان TLR 4  در سلول‫های ماکروفاژی شده است. این افزایش میزان بیان ژن در 24 ساعت و 48 ساعت پس از القا با LPS، به‫ترتیب  6.7  و 54.8   بوده است. همچنین تیمار سلول‫های ماکروفاژی القا شده با LPS، با آستاگزانتین منجر به کاهش سطح سایتوکاین‫های  IL-1β,IL-6,TNFα  شد. یافته های این  تحقیق  با مطالعات مشابه در بررسی اثرات ضد التهابی آستاگزانتین در ماکروفاژها، همخوانی دارد. نتایج تحقیقات قبلی نشان داد که  آستاگزانتین با مهار NF-ƙB , INOS (Inducible nitric oxide synthase) باعث مهار تولید و ترشح آنزیم‫های التهابی مهم مانند سیکلواکسیژناز و سایتوکاین‫های التهابی مانند   IL-1β ,TNFα می شود (17). همچنین ترکیب آستاگزانتین و توکونرینول با اثر بر سلول‫های ماکروفاژی RAW264.7  و مهار ترشح سایتوکاین‫های التهابی اینترلوکین 6 و اینترلوکین 12، باعث کاهش و مهار التهاب می‫شوند (16). در جدیدترین یافته‫ها اثر ضد التهابی آستاگزانتین در بیماری‫های التهابی استخوان و مفاصل بررسی شده است و اثرات ضد التهابی این ترکیب بر مهار بیان ژن‫های دخیل در مسیر التهابی مانند NF-ƙB و RSPO2( R- spondin 2)   در ماکروفاژها نشان داده شده است (27, 28).

در مطالعه‫ی کنونی دیده شد که آستاگزانتین  از طریق مهارTLR4  در سلول‫های ماکروفاژی باعث کاهش التهاب شده است. این یافته با مطالعات مشابه تایید می‫شود. آستاگزانتین با مهار TLR4  بر سلول‫های میکروگلیای مغزی از بروز پاسخ های التهابی و پیش التهابی در خونریزی های زیر عنکبوتیه جلوگیری کرده است. کاهش بیان TLR4 و متعاقب آن  NF-ƙB مکانیسم احتمالی این اثر بیان شده است (29). مهار مسیر سیگنالینگ  TLR4/NF-ƙB  توسط آستاگزانتین در بروز اثرات محافظت قلبی این ترکیب نیز دیده شده است (30). اثرات ضد التهابی آستاگزانتین بر سلول‫های کبدی channa argus که با  LPS دچار التهاب شده بودند، نشان می دهد که مهار مسیر TLR4/NF-ƙB  و متعاقب آن کاهش ترشح سایتوکاین‫های التهابی  را در بروز اثرات ضد التهابی این ترکیب نقش دارند (31). در جدیدترین مطالعه، اثر مفید آستاگزانتین بر انتروکولیت نکروزیس در رات بواسطه ی مهار TLR4  گزارش شده است (32).

بر اساس نتایج این مطالعات و مطالعه حاضر، TLR4  به‫عنوان یکی از مهم‫ترین اهداف درمانی در کاهش التهاب در بیماری‫های التهابی می تواند در نظر گرفته شود و بررسی دقیق تر مسیر سیگنالینگ آن و سایتوکاین‫ها کلیدی در این مسیر، اطلاعات دقیق‫تر و جامع‫تری را ارایه خواهد کرد.

همچنین، آستاگزانتین اثر ضد دردی و ضد التهابی بر دردهای نوروپاتیکی در مدل‫های حیوانی دارد. مهار IL-1β و TNFαدر بروز این اثر نقش بسزایی دارد (33). به‫علاوه، آستاگزانتین از طریق اثر مهاری  بر مسیرNR2B(n-methyl-d-aspartate receptor subunit 2B) , p-p38MAPK ( Mitogen-activated protein kinase) و مهار تولید TNFα  اثر ضد التهابی بر دردهای نوروپاتیک دارد (34).

نتایج مطالعه‫ی حاضر با مطالعات بیان شده بر روی اثر ضد التهابی همسویی دارد هر چند که مکانیسم مسئول متفاوتی دارند. در مطالعات پیشین مهار تولید سایتوکاین‫های التهابی به‫عنوان عامل کلیدی در بروز اثر ضدالتهابی بیان شده است ولی درگیری TLR4  و اثر بر ترشح سایتوکاین‫ها در سلول‫های ماکروفاژی به‫عنوان سلول‫های  محیطی سیستم ایمنی بدن بررسی نشده است. در این مطالعه هم‫زمان با کاهش میزان بیان ژنTLR4  در سلول‫های ماکروفاژی تیمار شده با آستاگزانتین ، کاهش سطح سایتوکاین‫های التهابی نیز دیده شد که همراهی و ارتباط بین این عوامل را در بروز اثر ضدالتهابی آستاگزانتین در ماکروفاژها نشان می‫دهد.

داروهای ضد التهاب کنونی با مکانیسم‫هایی مانند مهار آنزیم سیکلواکسیژناز یا آنزیم فسفولیپاز از تولید پروستاگلاندین‫ها و برخی سایتوکاین‫های التهابی جلوگیری می‫کند. ترکیب ضد التهابی که ژن مسئول تولید سایتوکاین‫های التهابی و ترشح آن‫ها را مورد هدف قرار دهد و آن‫ها را مهار کند، نتایج امیدوارکننده‫تری را به‫همراه خواهد داشت (17). چنان‫چه نتایج این مطالعه، نیز همین رویکرد را دنبال می‫کند.

نتایج این مطالعه نشان می‫دهد که احتمالا کاهش میزان بیان ژن TLR4  در سلول‫های ماکروفاژی که توسط LPS القای التهاب شده اند، می‫تواند منجر به کاهش میزان تولید و ترشح سایتوکاین‫های IL-1β,IL-6,TNFα شود هر چند بررسی و اندازه‫گیری  میزان بیان ژن و سطح پروتئین سایر پیام رسان‫ها و واسطه‫های شیمیایی در این مسیر به روشن شدن بهتر مکانیسم دقیق اثر ضد التهابی این ترکیب کمک خواهد کرد.

خواص آنتی اکسیدانتی بسیار بالای آستاگزانتین نیز در بروز اثرات ضد التهابی آن نیز نقش دارد و سرکوب گونه‫های اکسیژن فعالROS ( Reactive oxygen species)   بوسیله آستاگزانتین که القا کننده بیان هسته ای NF-ƙB می باشد، باعث کاهش تولید سایتوکاین‫های التهابی می‫شود (35). این ترکیب  از طریق برقراری تعادل بین عوامل اکسیداننی و آنتی اکسیدانتی قادر به بروز اثرات محافظتی در برابر  عوامل  التهابی می‫باشد (36).

آستاگزانتین به‫عنوان یک ترکیب کاروتنوئیدی طبیعی که آبزیان و به‫ویژه، ماهی سالمون و جلبک و.....از مهم‫ترین منابع آن هستند، نسبت به سایر ترکیبات کاروتنوئیدی دیگر مانند لوتئین و کاروتن، خواص زیستی فعال بیشتری دارد و دارای خواص فارماکولوژیک مختلفی مانند اثرات آنتی اکسیدانتی‫، ضد سرطانی‫، ضد دیابت‫، ضد التهابی و.... می‫باشد (37-39). به‫دلیل ساختار شیمیایی آستاگزانتین و لیپوفیل بودن این ترکیب  و قابلیت عبور آن از سد خونی و مغزی و ورودش به مغز، (40, 41) عمدتا مطالعاتی در خصوص اثرات ضد التهابی این ترکیب بر روی بیماری‫های نورودژنراتیو و سلول‫های دستگاه عصبی بررسی شده است. اسماعیلی و همکاران (42) نشان دادند که اثرات ضد التهابی آستاگزانتین در شرایط برون تنی و درون تنی بر سلول‫های دوپامینرژیک منجر به بهبودی علایم پارکینسون می‫شود.

آستاگزانتین با مهار و کاهش سطح سایتوکاین التهابی  IL-23و افزایش سایتوکاین پیش التهابی IL-4  ، اثرات مفیدی در بهبود علایم مولتیپل اسکلروزیس در مدل های حیوانی دارد (43). آستاگزانتین با مهار سایتوکاین‫های التهابی  IL-1β و IL-6  در هیپوکامپ، اثرات مفیدی در درمان افسردگی نیز داشته است (44).  همچنین، آستاگزانتین با اثر مهاری بر تولید سایتوکاین‫های التهابی IL-6, 1L-17,INFγ  در مدل‫های حیوانی مبتلا به مولتیپل اسکلروزیس، اثر پیشگیری کننده و حتی درمانی بر بیماری مولتیپل اسکلروزیس دارد (45).

در بیماری آلزایمر به‫عنوان یک بیماری نورودژنراتیو با پیش زمینه‫ی التهاب و وقایع استرس اکسیداتیو نیز، اثرات آستاگزانتین بر کاهش سطح سایتوکاین‫های التهابی و سطح اکسیدانت‫ها و افزایش فعالیت آنتی اکسیدانتی در بدن‫، نشان داده شده است (46, 47). هر چند این مطالعات نیز بر بروز آثار ضد التهابی آستاگزانتین حکایت دارند ولی محل اثر آستاگزانتین در این بیماری‫ها، سیستم عصبی مرکزی می‫باشد که با توجه به ساختار آستاگزانتین و عبورش از سدخونی-مغزی قابل توجیه و انتظار می باشد. در حالی‫که مطالعات بر روی اثرات آستاگزانتین بر سلول‫های محیطی و التهاب سیستمیک محدود می‫باشد، این مطالعه اثر ضد التهابی آستاگزانتین بر ماکروفاژها به‫عنوان سلول‫های محیطی سیستم ایمنی و موثر بر التهاب مزمن را نشان داد. با این وجود، عدم اندازه گیری میزان سطح پروتئین TLR4 با کمک روش  وسترن بلات و تایید میزان فعالیت این مولکول، از محدودیت‫های این مطالعه در نظر گرفته می‫شود ، لذا پیشنهاد می‫شود که تحقیقات پایه و مولکولی بیشتری بر آستاگزانتین  با تکیه بر اندازه گیری سطح پروتئین ها و واسطه های شیمایی دخیل در مسیر TLR4 ، بر ماکروفاژها و سایر سلول‫های سیستم  ایمنی صورت گیرد.

6- نتیجه­گیری

اثرات مفید ضد التهابی آستاگزانتین در بیماری‫های التهابی عصبی در مقالات متعددی گزارش شده است ولی تحقیقات در زمینه‫ی اثرات ضد التهابی این ترکیب بر سلول‫های محیطی محدود می‫باشد. در این مطالعه اثرات ضد التهابی  بر روی سلول‫های ماکروفاژی به‫عنوان سلول‫های محیطی دستگاه ایمنی بدن، بررسی شد و با توجه به نتایج امیدوار کننده‫ی این مطالعه‫، آستاگزانتین را به‫عنوان ماده ای با پتانسیل بالا برای درمان بیماری‫های التهابی سیتمیک مزمن مانند آرتریت‫ها در آینده معرفی می‫کند، هر چند تحقیقات بیشتر و به‫ویژه مطالعات بالینی جهت مشخص شدن اثرات بالینی این ترکیب پیشنهاد می شود. همچنین نگاهی نو و رویکردی جدید به ترکیبات بسیار ارزشمند که  در دل دریاها و اقیانوس ها قرار گرفته است، چشم انداز جدید و امیدوارکننده ای را در درمان بیماری‫ها و سلامتی انسان پیش روی محقیقن و درمان‫گران قرار می دهد چنانچه تا کنون چندین ترکیب دارویی با منابع دریایی به کلینیک معرفی شده است و برخی ترکیبات دارویی دیگر نیز در حال طی کردن مراحل آخر کارآزمایی بالینی می باشد (9). در نهایت ، با توجه به نقش‫ها و عملکرهای مختلف سایر سلول‫های دستگاه ایمنی، محققین بررسی های مولکولی دقیق تر و تاثیر این ترکیب بر سایر سلول‫های سیستم  ایمنی و همچنین  مطالعات  در مدل‫های حیوانی با تکیه بر مسیرهای التهابی سیستمیک و بر هم کنش عوامل التهابی بر این ترکیب و کارآزمایی‫های بالینی  را در مطالعات آینده پیشنهاد می‫کنند.

7- تشکر و قدردانی

این تحقیق پژوهشی با حمایت مالی دانشگاه علوم پرشکی آبادان  با شماره طرح  1733 انجام شده است این تحقیق دارای  تاییدیه اخلاقی از کمیتهی اخلاق در پژوهش دانشگاه علوم پزشکی آبادان با کد اخلاق  IR.ABADANUMS.REC.1402.118   میباشد.

-

  1. Zhang C, Tong T, Miao D chao, Wang L feng. Vitamin D inhibits TNF-α induced apoptosis of human 1. Medzhitov R. Inflammation 2010: new adventures of an old flame. Cell. 2010;140(6):771-6.
  2. Nathan C, Ding A. Nonresolving inflammation. Cell. 2010;140(6):871-82.
  3. Oishi Y, Manabe I. Macrophages in inflammation, repair and regeneration. International immunology. 2018;30(11):511-28.
  4. Ross EA, Devitt A, Johnson JR. Macrophages: the good, the bad, and the gluttony. Frontiers in immunology. 2021;12:708186.
  5. Chen L, Deng H, Cui H, Fang J , et al. Inflammatory responses and inflammation-associated diseases in organs. Oncotarget. 2018;9(6):7204.
  6. Layoun A, Santos MM. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 2012;35:1500-6.
  7. Dearman RJ, Cumberbatch M, Maxwell G, Basketter DA, et al. Toll‐like receptor ligand activation of murine bone marrow‐derived dendritic cells. Immunology. 2009;126(4):475-84.
  8. BERTRAM G KATZUNG K, editor Basic & clinical pharmacology2021: EGC.
  9. Mohebbi GH, Nabipour I, Vazirizadeh A. The Sea, the Future Pharmacy. Iranian South Medical Journal. 2014;17(4):748-88( in persian).
  10. Ekpe L, Inaku K, Ekpe V. Antioxidant effects of astaxanthin in various diseases—A review. J Mol Pathophysiol. 2018;7(1):1-6.
  11. Ambati RR, Phang S-M, Ravi S, Aswathanarayana RG. Astaxanthin: Sources, extraction, stability, biological activities and its commercial applications—A review. Marine drugs. 2014;12(1):128-52.
  12. Mularczyk M, Michalak I, Marycz K. Astaxanthin and other nutrients from Haematococcus pluvialis—Multifunctional applications. Marine drugs. 2020;18(9):459.
  13. Kohandel Z, Farkhondeh T, Aschner M, Pourbagher-Shahri AM, et al. Anti-inflammatory action of astaxanthin and its use in the treatment of various diseases. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2022;145:112179.
  14. Davinelli S, Saso L, D’Angeli F, Calabrese V, et al. Astaxanthin as a modulator of Nrf2, NF-κB, and their crosstalk: molecular mechanisms and possible clinical applications. Molecules. 2022;27(2):502.
  15. Yin Y, Xu N, Shi Y, Zhou B, et al. Astaxanthin protects dendritic cells from lipopolysaccharide-induced immune dysfunction. Marine Drugs. 2021;19(6):346.
  16. Radzun K, Rusmidi M, Norisam I, Iran N, et al. Anti-inflammatory Effects of Astaxanthin Extracted from Microalgae Hematococcus pluvialis and Combinations with Palm Tocotrienol Rich-Fraction in RAW 264.7 Macrophages. Pharmacognosy Journal. 2022;14(1).
  17. Lee S-J, Bai S-K, Lee K-S, Namkoong S, et al. Astaxanthin inhibits nitric oxide production and inflammatory gene expression by suppressing IkappaB kinase-dependent NF-kappaB activation. Molecules and cells. 2003;16(1):97-105.
  18. Dong S, Huang Y, Zhang R, Wang S, et al. Four different methods comparison for extraction of astaxanthin from green alga Haematococcus pluvialis. The Scientific World Journal. 2014;2014.
  19. Krępska M, Sieczyńska K, Lasoń-Rydel M. Determination of astaxanthin and canthaxanthin in food products by HPLC method. Technologia i Jakość Wyrobów. 2022;67.
  20. Radu A-F, Bungau SG. Management of rheumatoid arthritis: an overview. Cells. 2021;10(11):2857.
  21. Freeman LC, Ting JPY. The pathogenic role of the inflammasome in neurodegenerative diseases. Journal of neurochemistry. 2016;136:29-38.
  22. Mohseni R, Zamani Sedehi A, Arab Sadeghabadi Z, Safaei M, et al. Dietary supplement based on microalgae, as a new therapeutic approach in the future. New Cellularand Molecular Biotechnology Journal. 2021;11(42):31-54.(in persian).
  23. Rahimifard M, Maqbool F, Moeini-Nodeh S, Niaz K, et al. Targeting the TLR4 signaling pathway by polyphenols: a novel therapeutic strategy for neuroinflammation. Ageing research reviews. 2017;36:11-9.
  24. Mojiri-Forushani H, Khajehali E, Adelipour M, Mohammadi A. Inhibitory effects of fluoxetine on the secretion of inflammatory mediators and JAK/STAT3 and JNK/TLR4 gene expression. Molecular Biology Reports. 2023;50(3):2231-41.
  25. Bode JG, Ehlting C, Häussinger D. The macrophage response towards LPS and its control through the p38MAPK–STAT3 axis. Cellular signalling. 2012;24(6):1185-94.
  26. Kuzmich NN, Sivak KV, Chubarev VN, Porozov YB, et al. TLR4 signaling pathway modulators as potential therapeutics in inflammation and sepsis. Vaccines. 2017;5(4):34.
  27. Zhu C, Liu G, Cui W, Yu Z, et al. Astaxanthin prevents osteoarthritis by blocking Rspo2-mediated Wnt/β-catenin signaling in chondrocytes and abolishing Rspo2-related inflammatory factors in macrophages. Aging (Albany NY). 2023;15(12):5775.
  28. Mamun-Or-Rashid A, Lucy TT, Yagi M, Yonei Y. Inhibitory Effects of Astaxanthin on CML-HSA-Induced Inflammatory and RANKL-Induced Osteoclastogenic Gene Expression in RAW 264.7 Cells. Biomedicines. 2021;10(1):54.
  29. Zhang X, Lu Y, Wu Q, Dai H, et al. Astaxanthin mitigates subarachnoid hemorrhage injury primarily by increasing sirtuin 1 and inhibiting the Toll‐like receptor 4 signaling pathway. The FASEB Journal. 2019;33(1):722-37.
  30. Zaafan M, Abdelhamid A. The cardioprotective effect of astaxanthin against isoprenaline-induced myocardial injury in rats: involvement of TLR4/NF-κB signaling pathway. European Review for Medical & Pharmacological Sciences. 2021;25(11).
  31. Li M-Y, Sun L, Niu X-T, Chen X-M, et al. Astaxanthin protects lipopolysaccharide-induced inflammatory response in Channa argus through inhibiting NF-κB and MAPKs signaling pathways. Fish & shellfish immunology. 2019;86:280-6.
  32. Zhang X, Luo Y, Gu R, Jiang Z. Astaxanthin Alleviates Inflammatory Response in Neonatal Necrotizing Enterocolitis Rats by Regulating NOD2/TLR4 Pathway. Gastroenterology Research and Practice. 2023;2023.
  33. Jiang X, Yan Q, Liu F, Jing C, et al. Chronic trans-astaxanthin treatment exerts antihyperalgesic effect and corrects co-morbid depressive like behaviors in mice with chronic pain. Neuroscience Letters. 2018;662:36-43.
  34. Fakhri S, Dargahi L, Abbaszadeh F, Jorjani M. Astaxanthin attenuates neuroinflammation contributed to the neuropathic pain and motor dysfunction following compression spinal cord injury. Brain Research Bulletin. 2018;143:217-24.
  35. Speranza L, Pesce M, Patruno A, Franceschelli S, et al. Astaxanthin treatment reduced oxidative induced pro-inflammatory cytokines secretion in U937: SHP-1 as a novel biological target. Marine drugs. 2012;10(4):890-9.
  36. Franceschelli S, Pesce M, Ferrone A, De Lutiis MA, et al. Astaxanthin treatment confers protection against oxidative stress in U937 cells stimulated with lipopolysaccharide reducing O2− production. PLoS One. 2014;9(2):e88359.
  37. Galasso C, Orefice I, Pellone P, Cirino P, et al. On the neuroprotective role of astaxanthin: new perspectives? Marine drugs. 2018;16(8):247.
  38. Davinelli S, Nielsen ME, Scapagnini G. Astaxanthin in skin health, repair, and disease: A comprehensive review. Nutrients. 2018;10(4):522.
  39. Yuan JP, Peng J, Yin K, Wang JH. Potential health‐promoting effects of astaxanthin: a high‐value carotenoid mostly from microalgae. Molecular nutrition & food research. 2011;55(1):150-65.
  40. Ying C-j, Zhang F, Zhou X-y, Hu X-t, et al. Anti-inflammatory effect of astaxanthin on the sickness behavior induced by diabetes mellitus. Cellular and molecular neurobiology. 2015;35:1027-37.
  41. Sarada R, Vidhyavathi R, Usha D, Ravishankar G. An efficient method for extraction of astaxanthin from green alga Haematococcus pluvialis. Journal of agricultural and food chemistry. 2006;54(20):7585-8.
  42. MafyEsmaeili M, khosravi m, Esmaeili MH, Bananej M,et al. In-vitro and in-vivo evaluation of the anti-Parkinson activity of Astaxanthin. medical journal of mashhad university of medical sciences. 2022;65(3):1387-400.( in persian).
  43. Kerishchi Khiabani P, Bidaran S. The effect of natural Astaxanthin on the prevention and treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Developmental Biology. 2022;14(1):39-48.
  44. Zhou X-y, Zhang F, Hu X-t, Chen J, et al. Depression can be prevented by astaxanthin through inhibition of hippocampal inflammation in diabetic mice. Brain research. 2017;1657:262-8.
  45. Bidaran S, Ahmadi A, Yaghmaei P, Sanati M, et al.. Astaxanthin effectiveness in preventing multiple sclerosis in animal model. Bratislavske Lekarske Listy. 2018;119(3):160-6.(in persian).
  46. Taksima T, Chonpathompikunlert P, Sroyraya M, Hutamekalin P, et al. Effects of astaxanthin from shrimp shell on oxidative stress and behavior in animal model of Alzheimer’s disease. Marine drugs. 2019;17(11):628.
  47. Che H, Li Q, Zhang T, Wang D, et al. Effects of astaxanthin and docosahexaenoic-acid-acylated astaxanthin on Alzheimer’s disease in APP/PS1 double-transgenic mice. Journal of agricultural and food chemistry. 2018;66(19):4948-57.