فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد، ژنتیک، گروه زیست شناسی، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران

2 استاد، زیست شناسی-سلولی تکوینی ، گروه زیست شناسی و مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران

3 استادیار، ژنتیک، گروه زیست شناسی، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران

4 Department of Biology and Research Center for Animal Development Applied Biology, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran

چکیده

هدف: در مطالعه حاضر، تغییرات سطح بیان ژن­های کلاژن، اگریکان و فاکتور نکروز دهنده تومور- آلفا  در سلول­هایNP التهابی تیمار شده با اگزوزوم و اثربخشی اگزوزوم بر کاهش آپوپتوزیس سلول­هایNP ملتهب بررسی شد. مواد و روش‏ها: اگزوزوم­ها با روش اولتراسانتریفیوژ جداسازی و با کمک میکروسکوپ الکترونی عبوری، میکروسکوپ نیروی اتمی و روش پراکندگی نور پویا شناسایی شدند. زیستایی سلول­ها با آزمون MTTو رنگ­آمیزی DAPI مورد بررسی قرار گرفت. سنجش بیان ژن­های کلاژن، اگریکان و TNF-α با روش Real-time PCR صورت گرفت. نتایج: MSC-Exo، وزیکول‌هایی با قطر 5/35 تا 100 نانومتر می­باشند. بر اساس آزمون MTT، میزان زیستایی سلول­های ملتهب تیمار شده با اگزوزوم تفاوت معناداری نسبت به گروه التهابی بدون تیمار داشت(05/0*P< در دوز 100 میکروگرم بر میلی­لیتر، 01/0**P< دوزهای 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر). نتایج DAPI نشان­دهنده کاهش آپوپتوزیس در گروه تیمار شده با اگزوزوم بود. نتایج Real time PCR، افزایش بیان ژن­های کلاژن (05/0*P<) و اگریکان (001/0***P<) و کاهش بیان ژن TNF-α(01/0**P<) در سلول­های التهابی تیمار شده با اگزوزوم را نشان داد. نتیجه‏گیری: اگزوزوم­های مشتق از سلول­های بنیادی مزانشیمی می­توانند باعث افزایش بیان ژن­های کلاژن و اگریکان و کاهش بیان ژن TNF-α در سلول­های تیمار شده شوند و لذا ضرورت مطالعات کلینیکی کمردرد کاملا محسوس و پیشنهاد می­شود.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Effect of exosomes derived from rabbit bone marrow mesenchymal stem cells on the expression of collagen, aggrecan, and tumor necrosis factor-alpha genes in nucleus pulposus cells

نویسندگان [English]

  • F Sheikhi 1
  • J Baharara 2
  • KH Nejad Shahrokhabadi 3
  • M Lotfi 4

1 Department of biology, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran

2 Department of Biology and Research Center for Animal Development Applied Biology, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran

3 Department of biology, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran

4 دانشجوی دکتری، زیست‌شناسی-سلولی تکوینی ، گروه زیست شناسی و مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران

چکیده [English]

Aim: Low back pain (LBP) is one of the most common musculoskeletal diseases in the world. Apoptosis of nucleus pulposus (NP) cells and structural changes in the intervertebral disc (IVD) matrix cause its degeneration and are directly related to LBP. Because of exosomes derived from mesenchymal stem cells (MSC-Exo) are high therapeutic potential and may be valuable options for decreasing intervertebral disc degeneration (IDD). 
The present study evaluates changes in the expression level of genes responsible for repairing NP cells (collagen and aggrecan) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gene and the effectiveness of exosomes in inhibiting excessive apoptosis of NP cells under inflammation.
Material and Methods: Exosomes were separated by ultracentrifuge. They were identified with the help of transmission electron microscopy (TEM), atomic force microscope (AFM), and dynamic light scattering (DLS). Cell viability was evaluated by MTT assay and DAPI staining. Real-time PCR measured the expression of collagen, aggrecan, and TNF-α genes.
Results: Exosomes are vesicles with a diameter of about 35.5 to 100 nm. Based on the findings of the MTT assay, the survival rate of the inflammatory cells treated with exosomes was significantly different from the inflammation group without treatment (*P<0.05 at the dose of 100 μg/ml, **P<0.01 at the doses of 25 and 50 μg/ml). DAPI results showed a decrease in cell death in the exosome-treated group. Real-time PCR results showed increased expression of collagen (*P<0.05) and aggrecan (***P<0.001) genes and decreased the TNF-α (**P<0.01) gene in inflammatory cells treated with exosomes.
Conclusion: Exosomes derived from mesenchymal stem cells can increase collagen and aggrecan gene expression and decrease TNF-α gene expression in treated cells.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Nucleus pulposus cells
  • Exosomes derived from mesenchymal stem cells
  • Collagen
  • Aggrecan
  • Tumor necrosis factor-alpha
  • مقدمه

کمردرد (LBP) یک مشکل بالینی شایع و یکی از علل اصلی ناتوانی جسمی است که هزینه­های اجتماعی و اقتصادی زیادی را بر خانواده و جامعه تحمیل می­کند. بر اساس مطالعات، 80 درصد از بزرگسالان LBP را در مقطعی از زندگی خود تجربه می‫کنند (1-2). سازمان بهداشت جهان (WHO)، LBP را به‫عنوان ششمین بیماری سنگین در جهان معرفی کرده است (3). یکی از مهم­ترین عللLBP، دژنراسیون دیسک بین مهره­ای (IDD) است که عوامل متعددی از جمله تغییر بار مکانیکی، انحطاط ماتریکس خارج سلولی (ECM(، استرس اکسیداتیو، پیری بیش از حد، آپوپتوزیس سلول های نوکلئوس پولپوزوس (NP) و التهاب، به پیشرفت آن کمک می­کنند (4-5). IDD یک فرآیند پیچیده با واسطه سلولی است که منجر به تغییرات در ساختار و عملکرد دیسک بین مهره­ای )IVD ( می‫شود (6). از نظر بالینی، IDD  یک بیماری پیشرونده و مزمن است که باعث درد پا، بی حسی و ناراحتی در ناحیه کمر می­شود (7). کاهش کلاژن نوع II و پروتئوگلیکان­ها در سلول­های NP از عوامل ایجاد IDD می باشد (8). IVD از سه بخش متمایز سلول­های NP، آنولوس فیبروزوس (AF) و صفحات انتهایی غضروفی هیالین ((CEP تشکیل شده است (9). بافت NP یک بافت ژل مانند و هیدراته غنی از پروتئوگلیکان و کلاژن نوع II است که دارای خواص هیدرواستاتیکی برای خنثی کردن بار مکانیکی روی ستون فقرات است. NP در فرآیند دژنراتیو IVD نقش دارد؛ همچنین توانایی بازسازی NP حداقل است (10-11). AF که از 15 تا 25 لاملا متحدالمرکز حاوی رشته های کلاژن نوع I و IIو فیبرهای الاستین تشکیل شده است، سلول­های NP را احاطه می­کند. همچنین سلول­های NP و AF در IVD توسط صفحات CEP از بالا و پایین محصور می­شوند (12). اگریکان و کلاژن در سلول­هایNP، ماتریکس خارج سلولی (ECM) پیچیده­ای را تشکیل می­دهند. هموستاز مناسب ECM در سالم نگه داشتن دیسک نقش دارد (13). تغییرات دژنراتیو اولیه در سلول‌­های NP با تخریب کلاژن نوع II و اگریکان توسط متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMPs) و دیس­اینتگرین­ها همراه است. علاوه بر این، سنتز و هیدراتاسیون ECM کاهش می­یابد و تخریب سلول­های NP را تشدید می­کند (14). یکی از دلایل اصلی بروز IDD، فرآیندهای التهابی است که توسط سایتوکین­هایی مانند فاکتور نکروز تومور-آلفا (TNF-α) و اینترلوکین-1 (IL-1) ایجاد می شود (15). TNF-α در IVD دژنره شده به شدت بیان شده و باعث افزایش پاسخ­های التهابی می­شود. بیان بیش از حد آن ممکن است یک عامل ایجاد کننده IDD  باشد. TNF-α تخریب ECM را افزایش می­دهد، پیری سلول را تسریع می­کند و باعث آپوپتوزیس و پیروپتوز سلول­های IVD می­شود (16). الگوهای درمانی فعلی در پزشکی استفاده از سلول­های بنیادی از جمله سلول­های بنیادی مزانشیمی (MSC) می­باشد که از مغز استخوان جدا می­شوند. این سلول­ها جمعیتی از سلول­های پیش­ساز چند توان هستند که می­توانند بافت­های مختلف را بازسازی کنند (17). ارتباط بین سلولی سلول­های بنیادی و سلول­های آسیب دیده از طریق آزاد شدن وزیکول­ها از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان تنظیم می­شود که سیگنال­های سلولی را منتقل می­کنند (18). سلول­های بنیادی مزانشیمی می­توانند از طریق عوامل پاراکرین خود مانند اگزوزوم­ها در برابر مرگ سلولی در IVD محافظت کنند. به همین دلیل، اگزوزوم­ها می­توانند جایگزینی برای درمان­های مبتنی بر سلول­های بنیادی باشند (19). اگزوزوم­ها دارای ساختار وزیکولی بین 30 تا 150 نانومتر هستند که توسط اکثر سلول­ها به مایعات بدن آزاد می شوند. اگزوزوم­ها شامل پروتئین­ها، DNA، mRNA، microRNA و RNA طولانی غیر کدکننده هستند (20). اگزوزوم­ها با تعدیل سیستم ایمنی، تحریک تکثیر سلولی، افزایش رگ­زایی، جلوگیری از آپوپتوزیس و سرکوب استرس اکسیداتیو اثرات درمانی دارند و با انتقال آنزیم­های فعال به بازگرداندن فعالیت طبیعی سلول به هومئوستازی و ترمیم سلول کمک می­کنند (21). استفاده از اگزوزوم­ها یکی از درمان­های مفیدی است که می­تواند IDD را کاهش و یا از ایجاد آن جلوگیری کند، بازسازی سلول­های NP را تسریع و استرس شبکه آندوپلاسمی و مرگ سلول­های نوکلئوس پولپوزوس را کنترل کند (22). با توجه به اثر مثبت اگزوزوم در ترمیم و بازسازی بافت­ها، در مطالعه حاضر اثر اگزوزوم­های مشتق از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان خرگوش بر تغییرات سطح بیان ژن­های مسئول ترمیم سلول­هایNP (کلاژن و اگریکان) و ژن التهابی TNF-α در سلول­های التهابی تیمار شده با اگزوزوم و سلول­های التهابی بدون تیمار بررسی و نقش محافظتی اگزوزوم­ها بر کاهش آپوپتوزیس سلول­هایNP تحت التهاب ارزیابی شد.

2- مواد و روش‌ها

کلیه روش­های مورد استفاده در این پژوهش بر طبق مصوبات کمیته اخلاق در پژوهش­های زیست پزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد با شناسه اخلاق IR.IAU.MSHD.REC.1401.149 انجام شد.

روش تحقیق: این تحقیق در سال 1401 در مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد جهت "بررسی بیان ژن­های کلاژن، اگریکان و فاکتور نکروز دهنده تومور- آلفا در سلول­های نوکلئوس پولپوزوس تیمار شده توسط اگزوزوم­های مشتق از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان خرگوش" انجام شد.

استخراج سلول­های نوکلئوس پولپوزوس: در این مطالعه تجربی آزمایشگاهی از خرگوش نژاد سفید نیوزلندی استفاده شده است. خرگوش با تزریق عضلانی کتامین و زایلازین کشته شد. ستون فقرات تحت شرایط استریل خارج شد و عضلات از دیسک جدا شدند. آنولوس فیبروزوس دیسک بین مهره­ای برش داده شد و بافت ژلاتینی داخل دیسک به طور کامل جمع­آوری شد. پس از برش به قطعات، بافت مورد نظر در 2/0 درصد کلاژناز II به‫مدت 2 ساعت در انکوباتور شیکردار هضم شد. سوسپانسیون در g1200 برای 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. پلیت سلولی در محیط کشت DMEM-LG به همراه 10 درصد FBS و 1 درصد آنتی بیوتیک کشت و در دمای 37 درجه سانتی‫گراد و 5 درصد CO2 انکوبه شدند (شکل 1) (23).

 

شکل 1: تصویر میکروسکوپی سلول های NP - درشت نمایی 100×

استخراج سلول­های بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان: استخوان ران بدون بافت اضافی جدا شد، انتهای استخوان­ها بریده شد و با استفاده از سرنگ، مغز استخوان از استخوان ران خرگوش آسپیره و سپس به‫مدت 10 دقیقه در g 1500 سانتریفیوژ شد. پلیت سلولی در محیط  DMEM-LG، 15درصد FBS و 10درصد آنتی بیوتیک کشت داده شدند (شکل 2) (24).

 

 

شکل 2: تصویر میکروسکوپی سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان- درشت نمایی 100×

 

استخراج اگزوزوم از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان با روش اولتراسانتریفیوژ: برای جداسازی اگزوزوم­ها، بعد از 3 تا 5 پاساژ، محیط کشت رویی سلول­ها جمع­آوری شد. سپس سه دور سانتریفیوژ متوالی به‫ترتیب با دور g 300 ، g 2000 و g 10000 انجام شد. پس از سانتریفیوژ، مایع رویی نهایی از فیلتر 2/0 میکرون عبور داده شد و در نهایت اولتراسانتریفیوژ به‫مدت 60 دقیقه در g 100000 انجام  شد تا اگزوزوم­ها رسوب کنند. سپس اگزوزوم­ها در 500 میلی­لیتر PBS سرد، معلق شد و غلظت کل پروتئین توسط کیت سنجش پروتئین BCA تشخیص داده شد و سپس تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگه‫داری شدند (25).

شناسایی اگزوزوم مشتق از سلول­های بنیادی مزانشیمی

شناسایی اگزوزوم توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM): از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) (شرکت TESCAN BRNO- Mira3 LMU، آمریکا) برای تعیین مورفولوژی اگزوزوم­ها استفاده شد. اگزوزوم­ها با استفاده از پارافرمالدهید 4 درصد به‫مدت 30 دقیقه فیکس شده و مخلوط روی صفحه­ی پوشیده شده از مس قرار گرفت و به‫مدت 10 دقیقه در دمای اتاق خشک شد. سپس محلول خشک شده توسط 1 درصد اورانیل استات، لکه دار شده و در نهایت توسط میکروسکوپ TEM بررسی شد.

شناسایی اگزوزوم توسط میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM): ساختار سه بعدی اگزوزوم با استفاده از میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) (شرکت JPK، آلمان) مورد مطالعه قرار گرفت. برای آماده سازی، نمونه­ها در دستگاه سونیکاتور قرار گرفتند. پس از خروج از دستگاه سونیکاتور نمونه­ها فیکس شدند سپس یک قطره­ کوچک روی لام قرار داده شد و پس از حدود 15 دقیقه، زمانی که نمونه­ها خشک گردید بررسی توسط میکروسکوپ نیروی اتمی صورت گرفت.

شناسایی اگزوزوم توسط روش پراکندگی نور پویا (DLS): از پراکندگی نور پویا (DLS) برای اندازه­گیری قطر ذرات استخراج شده از سلول­های بنیادی مغز استخوان استفاده شد. نمونه­ها با استفاده از دستگاه Zetasizer Nano  (شرکت HORIBA، فرانسه) و تکنیک DLS بررسی شدند.  

 

گروه های آزمون

سلول­ها در گروه­های شاهد و تجربی زیر بررسی شدند:

گروه شاهد: سلول­هایNP سالم(شرایط طبیعی کشت و فاقد تیمار). گروه شاهد آزمایشگاهی: سلول­های NP التهابی بدون تیمار (برای ایجاد التهاب در سلول­های NP، سلول­ها تحت تأثیر عامل التهابی LPS  قرار گرفتند.). گروه تجربی 1: تیمار سلول­های NP التهابی با غلظت 15 میکروگرم بر میلی­لیتر اگزوزوم. گروه تجربی2 : تیمار سلول­های NP التهابی با غلظت 25 میکروگرم بر میلی­لیتر اگزوزوم. گروه تجربی3 : تیمار سلول­های NP التهابی با غلظت 50 میکروگرم بر میلی­لیتر اگزوزوم. گروه تجربی4 : تیمار سلول­های NP  التهابی با غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر اگزوزوم.

 

بررسی زیستایی سلول­ها با  MTT :  اثر اگزوزوم­ها بر زیستایی سلول­ها با استفاده از روش MTT بررسی شد. 24 ساعت پس از کشت سلول­ها، گروه­های شاهد آزمایشگاهی، تجربی1، تجربی 2، تجربی 3 و تجربی 4، با غلظت 5 میکروگرم بر میلی­لیتر  LPS  ملتهب شدند. پس از 24 ساعت، به گروه­های تجربی به‫ترتیب غلظت­های 10، 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر اگزوزوم اضافه شد. پس از 24 ساعت تیمار، میزان زیستایی سلول­ها با روش MTT بررسی شد. برای بررسی اثر اگزوزوم، محلول MTT به محیط کشت سلول‫ها اضافه و به‫مدت چهار ساعت انکوبه شدند. سپس محیط رویی خارج وDMSO  به سلول­ها اضافه شد. جذب نوری در 570 نانومتر با استفاده از اسپکترومتر خوانده شد (26).

ارزیابی زیستایی سلول­ها توسط رنگ­آمیزی DAPI : رنگ­آمیزی DAPI برای مشاهده هسته سلول­ها و بررسی مرگ سلولی استفاده شد. ابتدا سلول­ها در یک پلیت 6 خانه به‫مدت 24 ساعت کشت داده شدند. سپس دو گروه سلولی به‫مدت 24 ساعت با غلظت 5 میکروگرم بر میلی­لیتر LPS تحت التهاب قرار گرفتند. پس از گذشت زمان، یک گروه سلول‫های التهابی به‫مدت 24 ساعت تحت تیمار با اگزوزوم قرار گرفت. سپس سلول­ها با رنگ DAPI به‫مدت 10 دقیقه تیمار شدند. در نهایت سلول­ها با میکروسکوپ فلورسنت بررسی شدند (27).

بررسی بیان ژن­های کلاژن، اگریکان و  TNF-α : پس از تیمار سلول­ها، استخراج RNA در شرایط عاری از DNase  و  RNase طبق پروتکل کیت شرکت  pars tous انجام شد. غلظت کمی RNAبه روش نانودراپ توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 260 نانومتر تعیین شد. سنتزcDNA، بر اساس پروتکل کیت سنتز شرکت pars tous و با استفاده از دستگاه ترموسایکلر انجام شد. همچنین یک جفت پرایمر برای هر یک از ژن­های مورد مطالعه و ژن کنترل داخلی(GAPDH) طراحی شد. در نهایت، بیان ژن­های کلاژن، اگریکان و TNF-α در پاسخ به تیمار اگزوزوم در سلول­های التهابی با استفاده از تکنیک Real-time PCR با استفاده از رنگ فلورسنت سایبرگرین و پرایمرهای اختصاصی تعیین شد (28). توالی پرایمرهای  مورد استفاده در این مطالعه در زیر فهرست شده اند (جدول1).

Genes

Sequence (5′ - 3′)

Tm

TNF Forward primer

5′-CCTCTTCTCTTTCCTGCTC-3′

60

TNF Reverse primer

5′-GCGGGTTTGCTACTACG-3′

60

ACAN Forward primer

5′-CAACAACAACGCTCAGGA-3′

60

ACAN Reverse primer

5′-AGGTGAAGGGTAGGTGGTAA-3′

60

COL2A1 Forward primer

5′-TGCGACGACATAATCTGTG-3′

60

COL2A1 Reverse primer

5′-TCCTTTCTGCCCCTTTG-3′

60

Real-time PCR جدول 1: مشخصات پرایمرهای مورد استفاده در

3- آنالیز آماری

آنالیز آماری توسط نرم افزار Prism نسخه 8، آزمون One-way ANOVA به منظور مقایسه­ی داده­ها صورت گرفته و سطح معناداری P<0.05 در نظر گرفته شد. کلیه­ی نمودارها با استفاده از نرم­افزار Excel ترسیم شده­اند.

4- نتایج

شناسایی اگزوزوم توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)

از میکروسکوپ TEM برای مشاهده مورفولوژی اگزوزوم­های مشتق شده از سلول­های بنیادی مزانشیمی استفاده شد. وزیکول‫های کوچک با مورفولوژی دایره­ای، ساختار غشایی دو لایه و اندازه حدود 100 نانومتر با میکروسکوپ TEM قابل مشاهده بودند (شکل 3).

 

شکل3: مورفولوژی اگزوزوم با میکروسکوپ TEM

شناسایی اگزوزوم توسط میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM)

ساختار اگزوزوم در توپوگرافی سه بعدی با استفاده از میکروسکوپ AFM مشاهده شد. نتایج تجزیه و تحلیل AFM وزیکول­های گرد با ابعاد 84/85 نانومتر را نشان داد که مشخصه اگزوزوم­ها هستند (شکل 4).

 

شکل 4: ساختار اگزوزوم با میکروسکوپ AFM

 

شناسایی اگزوزوم توسط روش پراکندگی نور پویا (DLS)

نتایج به‌دست‌آمده از DLS نشان داد که قطر ذرات استخراج‌شده از سلول­های بنیادی مزانشیمی بین 30 تا 100 نانومتر، با پیک ذرات در 5/35 نانومتر است که دقت جداسازی اگزوزوم را نشان می‌دهد (شکل 5).

 

شکل5: توزیع اندازه اگزوزوم ها توسط DLS

 

 

نتایج حاصل از روش BCA

محلول تهیه شده از اگزوزوم­های جدا شده از مایع رویی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان حاوی 700 میکروگرم بر میلی­لیتر پروتئین بود که با استفاده از روش BCA تایید شد.

بررسی اثر اگزوزوم بر بهبود التهاب ناشی از LPS

نتایج آزمون MTT

بررسی اثر درمانی دوزهای مختلف اگزوزوم بر روی سلول‌های NP التهابی با آزمون MTTانجام شد. طبق نتایج، تفاوت معناداری در زیستایی سلول­های التهابی تیمار شده با دوزهای 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی­لیتر اگزوزوم، در مقایسه با سلول های التهابی با LPS بدون تیمار مشاهده شد (05/0*P< در دوز 100 میکروگرم بر میلی­لیتر، 01/0**P< دوزهای 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر). نتایج آزمون MTT نشان می­دهد که 50 میکروگرم در میلی­لیتر دوز بهینه برای تیمار سلول­های NP التهابی است (نمودار1).

 

 

 

نمودار 1: بررسی اثر LPS و درمان با دوزهای مختلف اگزوزوم بر زیستایی سلول­های NP با آزمون سمیت سلولی (MTT). مقدار 05/0*P< در دوز 100 میکروگرم بر میلی­لیتر و 01/0**P< در دوزهای 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر، اختلاف معناداری را در مقایسه با گروه سلول­های التهابی با LPS بدون تیمار نشان می دهد.

 

 

 

نتایج رنگ­آمیزی DAPI

 در این مطالعه به‫منظور بررسی اثر اگزوزوم­ها بر هسته سلول­های NP، رنگ­آمیزی DAPI انجام شد. با توجه به تصاویر رنگ آمیزی DAPI، اگزوزوم­ها التهاب ناشی از LPS را کاهش و زیستایی سلول­های التهابی در گروه سلول­های تحت تیمار با اگزوزوم در مقایسه با گروه سلول­های التهابی بدون تیمار افزایش داده­اند. همچنین مشاهده شد که زیستایی سلول­های التهابی تیمار شده با اگزوزوم نزدیک به زیستایی سلول­های گروه شاهد می­باشد (شکل 6).

 

 

 

 

 

 

شکل 6: رنگ­آمیزی DAPI. (الف) گروه شاهد با هسته­های کروی (ب) گروه التهابی تحت تیمار با اگزوزوم با هسته­های کروی (ج) گروه التهابی بدون تیمار با اگزوزوم با هسته­های تخریب شده. ( فلش نارنجی، هسته­ها را نشان می­دهد)

 

اثرات اگزوزوم­ها بر بیان ژن­های کلاژن، اگریکان و TNF-α در سلول­های NP

 بیان ژن‌های کلاژن، اگریکان و TNF-α در پاسخ به تیمار اگزوزوم در سلول‌های NP التهابی با  Real-Time PCRتعیین شد. تغییرات در سطح بیان ژن‌های کلاژن، اگریکان و TNF-α در گروه التهابی بدون تیمار و گروه التهابی تحت تیمار با اگزوزوم مشاهده شد. بر اساس نتایج به‫دست آمده، بیان ژن‌­های کلاژن و اگریکان در گروه تحت تیمار با اگزوزوم نسبت به گروه التهابی بدون تیمار با اگزوزوم افزایش داشته است (نمودار 2و3). همچنین مشاهده شد، سطح بیان ژن TNF-α در گروه تحت تیمار با اگزوزوم به‌طور معنا‌داری کاهش یافت. در گروه التهابی بدون تیمار با اگزوزوم نیز افزایش بیان ژن TNF-α مشاهده شد (نمودار4).

 

 

 

 

 

 

نمودار2: تغییرات بیان ژن کلاژن در گروه شاهد، گروه التهابی با LPS و گروه التهابی تیمار شده با اگزوزوم ( کلیه داده­ها بر مبنای fold change (ΔΔCq) به‫دست آمده است و نرم­افزار دستگاه Real-Time PCR (Bio-Rad). کلیه داده­ها را بر مبنای ΔΔCq آنالیز کرده است. در ضمن کلیه اعداد relative normalized expression می­باشند.)

 

نمودار3: تغییرات بیان ژن اگریکان در گروه شاهد، گروه التهابی با LPS و گروه التهابی تیمار شده با اگزوزوم (کلیه داده­ها بر مبنای fold change (ΔΔCq) بدست آمده است و نرم­افزار دستگاه Real-Time PCR (Bio-Rad). کلیه داده­ها را بر مبنای ΔΔCq آنالیز کرده است. در ضمن کلیه اعداد relative normalized expression می­باشند.)

 

 

نمودار 4: تغییرات بیان ژن­ TNF-α در گروه شاهد، گروه التهابی با LPS و گروه التهابی تیمار شده با اگزوزوم ( کلیه داده­ها بر مبنای fold change (ΔΔCq) به‫دست آمده است و نرم­افزار دستگاه Real-Time PCR (Bio-Rad). کلیه داده­ها را بر مبنای ΔΔCq آنالیز کرده است. در ضمن کلیه اعداد relative normalized expression می­باشند.)

5- بحث

بر اساس مطالعات، 80 درصد از افراد در مقطعی از زندگی کمردرد را تجربه می­کنند (29). IDD با درد کمر و گردن همراه است و کیفیت زندگی را کاهش می­دهد (30). سلول­های دیسک بین مهره‌ای به دلیل تغییر ترکیب ماتریکس در طول فرآیند دژنراتیو و از بین رفتن تدریجی کلاژن و پروتئوگلیکان­ها، دچار افزایش آپوپتوزیس می‌شوند (31). IDD با مرگ سلولی NP عمدتا ناشی از TNF-α مرتبط است (32). در حال حاضر، تمرکز تحقیقات بر کاهش یا معکوس کردن آبشار دژنراسیون دیسک بین مهره­ای است. سلول­های بنیادی مزانشیمی MSCs)) به دلیل دسترسی آسان، پایداری ژنتیکی و پتانسیل درمانی برای ترمیم بافت و تنظیم ایمنی، برای کاربردهای درمانی مفید هستند. تحقیقات زیادی نشان داده­اند که اگزوزوم­های ترشح شده توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی به عنوان یک راه جایگزین برای درمان IDD عمل می­کنند (33-34). اگزوزوم­ها وزیکول­های خارج سلولی هستند که در ارتباطات بین سلولی شرکت می­کنند و معمولاً در درمان بیماری­های متعدد استفاده می­شوند (35). MSC-Exo حاوی انواع فاکتورهای تنظیمی است که می­تواند با مهار آپوپتوزیس و افزایش تکثیر سلول­های NP، مهار تخریب ECM و کاهش پاسخ التهابی و استرس اکسیداتیو از پیشرفت IDD جلوگیری کند (36). Wang و همکاران (37) ، اگزوزوم­های مشتق از سلول‫های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان با ساختار گرد و فنجانی و قطر تقریباً 30 تا 100 نانومتر توسط میکروسکوپ TEM شناسایی کردند. در مطالعه ما، با کمک میکروسکوپ TEM، وزیکول­های دایره‌ای به قطر حدود 100 نانومتر مشاهده شد. نتیجه میکروسکوپ AFM در مطالعه باقری و همکاران (38). ، شکل کروی همگن از اگزوزوم­های مشتق از سلول­های بنیادی مزانشیمی با محدوده اندازه 40 تا 80 نانومتر را نشان داد همچنین تصویربرداری AFM در این مطالعه انجام شد و نتایج، نانوذرات کروی در حدود 85 نانومتر را نشان داد. اندازه­گیری اگزوزوم­ها با تکنیک DLS در مطالعه Zhu و همکاران (39) نشان داد که قطر این ذرات عمدتا بین 30 تا 100 نانومتر و پیک آن 51 نانومتر است. در بررسی ساختار اگزوزوم­ها با دستگاه DLS، ذرات بین 30 تا 100 نانومتر با پیک ذرات 5/35 نانومتر مشاهده شد. نتیجه DLS در مطالعه ما با مطالعه Zhu و همکاران (33) مطابقت دارد. در مطالعه Zhu و همکاران (33)، اثر MSC-Exo بر آپوپتوزیس سلولی با استفاده از روش MTT اندازه­گیری شد. با توجه به نتایج، سلول­های NP التهابی شده با IL-1β سطح آپوپتوزیس بالاتر و سطح پایین­تری از زیستایی سلولی را نشان دادند. اگزوزوم­ها باعث کاهش آپوپتوزیس ناشی از IL-1β و افزایش زیستایی در سلول­های NP شده اند. در این مطالعه، اثر التهاب ناشی از LPS بر سلول­های NP و نتایج تیمار سلول­های التهابی با دوزهای مختلف اگزوزوم با روش MTT مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که زیستایی سلول­های التهابی تحت تیمار با دوزهای مختلف اگزوزوم در مقایسه با سلول­های التهابی بدون تیمار افزایش یافته است. سیتوکین­های التهابی تولید شده توسط ماکروفاژها یا سلول­های دیسک در انحطاط دیسک نقش دارند. واسطه­های التهابی مختلف، از جمله TNF-α، نقش مهمی در فرآیندهای کاتابولیک در IVD انسان ایجاد می‌کنند و بیان آن­‌ها را در دژنراسیون IVD افزایش می‌دهند (40). اگزوزوم­های مشتق شده از MCS می­توانند از سلول های NP در برابر آپوپتوزیس و التهاب ناشی از TNF-α محافظت کنند (41). برخلاف گروه شاهد و گروه سلول­های التهابی بدون تیمار، مطالعه حاضر کاهش قابل توجهی را در بیان ژن مرتبط با التهاب (TNF-α) در سلول­های التهابی تیمار شده با اگزوزوم نشان می­دهد. در نتیجه، اگزوزوم­های مشتق شده از سلول­های بنیادی مزانشیمی، التهاب ناشی از IDD را با کاهش بیان ژن TNF-α کاهش می­دهند. یکی از ویژگی­های مهم انحطاط IVD کاهش سلول­های زنده و فعال است. هدف از درمان‌های مبتنی بر سلول‌های بنیادی برای ترمیم دژنراتیو IVD، تقویت سلول‌های زنده با توانایی تولید ماتریکس مناسب و مفید می­باشد. نتایج نشان می‌دهد که با بهبود فعالیت تکثیر سلول‌های NP توسط اگزوزوم‌ها، تولید ECM سالم‌تر بهبود می‌یابد (42). در مطالعه Zhu و همکاران (43)، مشخص شد که در سلول‌های NP تیمار شده با TNF-α، افزایش سطح بیان پروتئینازهای ECM کاتابولیک و کاهش پروتئین‌های آنابولیک ECM (کلاژن II و اگریکان) توسط TNF-α ایجاد شد. بر اساس یافته­ها، MSC-Exo می­تواند با افزایش miR-532-5p در بافت NP از افزایش آپوپتوزیس ناشی از TNF-α، فعال شدن پروتئین­های آپوپتوزیس، عدم تعادل سطوح آنابولیک و کاتابولیک و تخریب سلول­های NP جلوگیری کند. تجزیه و تحلیل ما نشان داد که اگزوزوم­ها به طور قابل توجهی بیان ژن­های اگریکان و کلاژن را در سلول­های التهابی تحت تیمار با اگزوزوم در مقایسه با سلول­های شاهد و سلول­های التهابی بدون تیمار، افزایش می­دهند. همچنین این نتایج نشان می­دهد که سلول­های NP ملتهب تحت تیمار با MSC-Exo می­توانند ماتریکس خارج سلولی سالم تری تولید کنند و ترمیم سلول­های التهابی را بهبود بخشند.

6- نتیجه­گیری

در این مطالعه بیان ژن­های کلاژن، اگریکان و فاکتور نکروز دهنده تومور- آلفا در سلول­های نوکلئوس پولپوزوس تیمار شده توسط اگزوزوم­های مشتق از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بررسی شد. نتایج ما نشان داد که اگزوزوم­های مشتق از سلول­های بنیادی مزانشیمی، التهاب ایجاد شده توسطLPS در سلول­های NP را با کاهش بیان ژن التهابی TNF-α، کاهش می‫دهند. همچنین اگزوزوم­ها با افزایش بیان ژن­های کلاژن و اگریکان، سنتز ماتریکس خارج سلولی را افزایش داده که به بهبود زیستایی سلول­های NP کمک می­کند. بر اساس یافته­های این تحقیق، MSC-Exo می­تواند دژنراسیون IVD را معکوس کرده و به‫عنوان یک کاندید مناسب برای مطالعه بیشتر کلینیکی IDD مورد استفاده قرار گیرد.

7- تشکر و قدردانی

از همکاران مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری دانشگاه آزاد واحد مشهد، صمیمانه سپاسگزاری می­شود.

-

  1. Zhang C, Tong T, Miao D chao, Wang L feng. Vitamin D inhibits TNF-α induced apoptosis of human nucleus pulposus cells through regulation of NF-kB signaling pathway. J Orthop Surg Res. 2021;16(1):1–8.

 

  1. Zhang F, Wang S, Li B, Tian W, Zhou Z, Liu S. Intradiscal injection for the management of low back pain. JOR Spine [Internet]. 2022 Mar 1 [cited 2022 May 26];5(1):e1186. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jsp2.1186.
  2. Varrassi G, Moretti B, Pace MC, Evangelista P, Iolascon G. Common Clinical Practice for Low Back Pain Treatment: A Modified Delphi Study. Pain Ther. 2021 Jun 1;10(1):589–604.
  3. Zhu H, Chen G, Wang Y, Lin X, Zhou J, Wang Z, et al. Dimethyl fumarate protects nucleus pulposus cells from inflammation and oxidative stress and delays the intervertebral disc degeneration. Exp Ther Med. 2020;20(6):1–1.
  4. Liu H, Kang H, Song C, Lei Z, Li L, Guo J, et al. Urolithin a inhibits the catabolic effect of TNFα on nucleus pulposus cell and alleviates intervertebral disc degeneration in vivo. Front Pharmacol. 2018;9(SEP):1–11.
  5. Zhang GZ, Liu MQ, Chen HW, Wu ZL, Gao YC, Ma ZJ, et al. NF-κB signalling pathways in nucleus pulposus cell function and intervertebral disc degeneration. Cell Prolif. 2021;54(7):1–15.

 

  1. Sun Z, Zhao H, Liu B, Gao Y, Tang WH, Liu ZH, et al. AF cell derived exosomes regulate endothelial cell migration and inflammation: Implications for vascularization in intervertebral disc degeneration. Life Sci [Internet]. 2021;265:118778. Available from: https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118778.

 

  1. Wang X, Meng J, Zhang T, Lv WW, Liang Z, Shi Q, et al. Identifying compositional and structural changes in the nucleus pulposus from patients with lumbar disc herniation using Raman spectroscopy. Exp Ther Med. 2020;20(1):447–53.

 

  1. Harmon MD, Ramos DM, Nithyadevi D, Bordett R, Rudraiah S, Nukavarapu SP, et al. Growing a backbone-functional biomaterials and structures for intervertebral disc (IVD) repair and regeneration: Challenges, innovations, and future directions. Biomater Sci. 2020;8(5):1216–39.

 

  1. Ashinsky BG, Gullbrand SE, Wang C, Bonnevie ED, Han L, Mauck RL, et al. Degeneration alters structure-function relationships at multiple length-scales and across interfaces in human intervertebral discs. J Anat. 2021;238(4):986–98.

 

  1. Xu M, Huang J, Jin M, Jiang W, Luo F, Tan Q, et al. Expansion of FGFR3 ‑ positive nucleus pulposus cells plays important roles in postnatal nucleus pulposus growth and regeneration. Stem Cell Res Ther [Internet]. 2022;1–14. Available from: https://doi.org/10.1186/s13287-022-02903-2.

 

  1. Croft AS, Guerrero J, Oswald KAC, Häckel S, Albers CE, Gantenbein B. Effect of different cryopreservation media on human nucleus pulposus cells’ viability and trilineage potential. JOR Spine. 2021;4(1).
  2. Sun J, Zheng B, Sun R, Meng Y, Wang S. Biomedicine & Pharmacotherapy MiR-499a-5p suppresses apoptosis of human nucleus pulposus cells and degradation of their extracellular matrix by targeting SOX4. Biomed Pharmacother [Internet]. 2019;113(February):108652. Available from: https://doi.org/10.1016/j.biopha.2019.108652.
  3. Zhang Z, Huang Y, Xu N, Wang J, Yao T, Xu Y, et al. PLK1 Mitigates Intervertebral Disc Degeneration by Delaying Senescence of Nucleus Pulposus Cells. Front cell Dev Biol [Internet]. 2022 Mar 14 [cited 2022 Jul 3];10. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35372354/
  4. Huang L, Chen J, Wu D, Wang K, Lou W, Wu J. Berberine Attenuates IL-1 β -Induced Damage of Nucleus Pulposus Cells via Activating the AMPK/mTOR/Ulk1 Pathway. Biomed Res Int. 2022;2022.
  5. Wang Y, Che M, Xin J, Zheng Z, Li J, Zhang S. The role of IL-1β and TNF-α in intervertebral disc degeneration. Biomed Pharmacother [Internet]. 2020;131(August):110660. Available from: https://doi.org/10.1016/j.biopha.2020.110660.
  6. Babenko VA, Silachev DN, Danilina TI, Goryunov K V., Pevzner IB, Zorova LD, et al. Age-related changes in bone-marrow mesenchymal stem cells. Cells. 2021;10(6):1–19.
  7. Otero-ortega L, Laso-garcía F, Frutos MG, Fuentes B, Diekhorst L. Role of Exosomes as a Treatment and Potential Biomarker for Stroke. 2018;
  8. Liao Z, Luo R, Li G, Song Y, Zhan S, Zhao K, et al. Exosomes from mesenchymal stem cells modulate endoplasmic reticulum stress to protect against nucleus pulposus cell death and ameliorate intervertebral disc degeneration in vivo. Theranostics. 2019;9(14):4084–100.
  9. Zhang J, Rong Y, Luo C, Cui W. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes prevent osteoarthritis by regulating synovial macrophage polarization. Aging (Albany NY) [Internet]. 2020 Dec 12 [cited 2022 Jul 30];12(24):25138. Available from: /pmc/articles/PMC7803581/
  10. Malekpour K, Hazrati A, Zahar M, Markov A, Olegovna A. The Potential Use of Mesenchymal Stem Cells and Their Derived Exosomes for Orthopedic Diseases Treatment. Stem Cell Rev Reports [Internet]. 2022;933–51. Available from: https://doi.org/10.1007/s12015-021-10185-z
  11. Álvarez-Viejo M. “Mesenchymal stem cells from different sources and their derived exosomes: A pre-clinical perspective,” World J. Stem Cells, vol. 12, no. 2, pp. 100–109, 2020, doi: 10.4252/wjsc.v12.i2.100.
  12. Ukeba D, Sudo H, Tsujimoto T, Ura K, Yamada K, Iwasaki N. “Bone marrow mesenchymal stem cells combined with ultra-purified alginate gel as a regenerative therapeutic strategy after discectomy for degenerated intervertebral discs,” EBioMedicine, vol. 53, p. 102698, 2020, doi: 10.1016/j.ebiom.2020.102698.
  13. Safitri E. Effect of low oxygen tension on transcriptional factor OCT4 and SOX2 expression in New Zealand rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Vet World. 2020;13(11):2469–76.
  14. Xiang HF, Su WL, Wu XL, Chen WJ, Cong W Bin, Yang S, et al., “Exosomes Derived from Human Urine-Derived Stem Cells Inhibit Intervertebral Disc Degeneration by Ameliorating Endoplasmic Reticulum Stress,” Oxid. Med. Cell. Longev., vol. 2020, 2020, doi: 10.1155/2020/6697577.
  15. Dong J, Li L, Fang X, Zang M. Exosome-Encapsulated microRNA-127-3p Released from Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Alleviates Osteoarthritis Through Regulating CDH11-Mediated Wnt / β - Catenin Pathway. 2021;297–310.
  16. Zhang N, Li L, Luo J, Tan J, Hu W, Li Z, et al. “Inhibiting microRNA-424 in bone marrow mesenchymal stem cells-derived exosomes suppresses tumor growth in colorectal cancer by upregulating TGFBR3,” Arch. Biochem. Biophys., p. 108965, 2021, doi: 10.1016/j.abb.2021.108965.
  17. Luo Z, Wu F, Xue E, Huang L, Yan P, Pan X, et al. “Hypoxia preconditioning promotes bone marrow mesenchymal stem cells survival by inducing HIF-1 α in injured neuronal cells derived exosomes culture system,” Cell Death Dis., 2019, doi: 10.1038/s41419-019-1410-y.
  18. Liu C, Liang G, Deng Z, Tan J, Zheng Q, Lyu FJ. “The Upregulation of COX2 in Human Degenerated Nucleus Pulposus: The Association of Inflammation with Intervertebral Disc Degeneration,” Mediators Inflamm., vol. 2021, 2021, doi: 10.1155/2021/2933199.
  19. Croft AS, Illien-Jünger S, Grad S, Guerrero J, Wangler S, Gantenbein B. The application of mesenchymal stromal cells and their homing capabilities to regenerate the intervertebral disc. Int J Mol Sci. 2021;22(7).
  20. Dai X, Guan Y, Zhang Z, Xiong Y, Liu C, Li H, et al. Comparison of the differentiation abilities of bone marrow‑derived mesenchymal stem cells and adipose‑derived mesenchymal stem cells toward nucleus pulposus‑like cells in three‑dimensional culture. Exp Ther Med. 2021;22(3).
  21. Zhang Y, Yang J, Zhou X, Wang N, Li Z, Zhou Y, et al. Knockdown of miR-222 inhibits inflammation and the apoptosis of LPS-stimulated human intervertebral disc nucleus pulposus cells. Int J Mol Med. 2019;44(4):1357–65.
  22. Zhu L, Shi Y, Liu L, Wang H, Shen P, Yang H. Mesenchymal stem cells-derived exosomes ameliorate nucleus pulposus cells apoptosis via delivering miR-142-3p: therapeutic potential for intervertebral disc degenerative diseases. Cell Cycle. 2020 Jul 17;19(14):1727–39.
  23. Naji A, Eitoku M, Favier B, Deschaseaux F, Rouas-Freiss N, Suganuma N. Biological functions of mesenchymal stem cells and clinical implications. Cell Mol Life Sci [Internet]. 2019;76(17):3323–48. Available from: https://doi.org/10.1007/s00018-019-03125-1.
  24. Luo L, Jian X, Sun H, Qin J, Wang Y, Zhang J, et al. Cartilage endplate stem cells inhibit intervertebral disc degeneration by releasing exosomes to nucleus pulposus cells to activate Akt/autophagy. Stem Cells. 2021;39(4):467–81.
  25. Liang W, Han B, Hai Y, Sun D, Yin P. Mechanism of Action of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes in the Intervertebral Disc Degeneration Treatment and Bone Repair and Regeneration. Front Cell Dev Biol. 2022;9(January):1–10.
  26. Wang Y, Zhao R, Liu D, Deng W, Xu G, Liu W, et al. Exosomes Derived from miR-214-Enriched Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Regulate Oxidative Damage in Cardiac Stem Cells by Targeting CaMKII. Oxid Med Cell Longev. 2018;2018.
  27. Bagheri E, Abnous K, Farzad SA, Taghdisi SM, Ramezani M, Alibolandi M. Targeted doxorubicin-loaded mesenchymal stem cells-derived exosomes as a versatile platform for fighting against colorectal cancer. Life Sci [Internet]. 2020;261(July):118369. Available from: https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118369.
  28. Zhu J, Liu B, Wang Z, Wang D, Ni H, Zhang L, et al. Exosomes from nicotine-stimulated macrophages accelerate atherosclerosis through miR-21-3p/PTENmediated VSMC migration and proliferation. Theranostics. 2019;9(23):6901–19.

 

  1. Miguélez-Rivera L, Pérez-Castrillo S, González-Fernández ML, Prieto-Fernández JG, López-González ME, García-Cosamalón J, et al. Immunomodulation of mesenchymal stem cells in discogenic pain. Spine J [Internet]. 2018;18(2):330–42. Available from: https://doi.org/10.1016/j.spinee.2017.09.002.

 

  1. Lu L, Xu A, Gao F, Tian C, Wang H, Zhang J, et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes as a Novel Strategy for the Treatment of Intervertebral Disc Degeneration. Front Cell Dev Biol. 2022;9(January):1–22.
  2. Lu K, Li H yin, Yang K, Wu J long, Cai X wei, Zhou Y, et al. Exosomes as potential alternatives to stem cell therapy for intervertebral disc degeneration: in-vitro study on exosomes in interaction of nucleus pulposus cells and bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 2017;8(1):1–11.
  3. Zhu G, Yang X, Peng C, Yu L, Hao Y. Exosomal miR-532–5p from bone marrow mesenchymal stem cells reduce intervertebral disc degeneration by targeting RASSF5. Exp Cell Res [Internet]. 2020;393(2):112109. Available from: https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2020.112109.