فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی دریا، دانشکده علوم دریایی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، خرمشهر، ایران

2 گروه علوم درمانگاهی و قطب علمی بهداشت ماهیان گرمابی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

چکیده

هدف: هدف اصلی ارزیابی سلول‌های کلرید آبشش ماهی کپور معمولی در طول سازگاری با شوری‌های مختلف محیطی در یک دوره کوتاه مدت بوده است.
مواد و روشها: ماهی‫ها با وزن میانگین 1±4/41 گرم و طول 1±9/16 سانتی‫متر در چهار گروه با سه تکرار استفاده شد. گروه شاهد در آب شیرین و سه گروه در شوری ppt4، ppt8 و ppt12 با شرایط یکسان نگه‫داری شدند. در ساعات صفر، 6، 12، 24، 48، 72 و 96 از کمان آبششی دوم نمونه‫هایی با ضخامت نیم سانتی‫متر تهیه و در فرمالین بافر 10 درصد و محلول گلوتارآلدئید 5/2 درصد با 4/7=pH قرار داده شدند. روش استاندارد تهیه مقاطع بافتی انجام و برش‫‫های پارافینی به ضخامت 6-4 میکرون با روش‫های هماتوکسیلین - ائوزین رنگ آمیزی شدند. همچنین تغییر ساختار، تعداد سلول‫های غنی از میتوکندری، توزیع و پراکندگی آنزیم Na+/K+-ATPase به‫کمک میکروسکوپ الکترونی روبشی و تکنیک ایمونوهیستوشیمی مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج: تغییرات آشکار در تعداد و توزیع سلول‌های کلرید در دو موقعیت لاملایی و فیلامنتی در زمان‌های مختلف نمونه‌برداری نشان داد. بیش‫ترین تعداد سلول‫های کلراید در فیلامنت و لاملا 33/1±28/26،  27/1±11/19 در شوری ppt12 و کم‫ترین مربوط به گروه کنترل بود. بزرگ‫ترین اندازه سلول‫های کلراید در فیلامنت و لاملا، 46/1±51/22،  23/1±72/12 در شوری ppt12 و کم‫ترین مربوط به گروه کنترل بود.
نتیجه گیری: سلول‫های کلراید آبشش ماهی کپور معمولی در مواجهه با شوری‫های مختلف در مدت زمان کوتاه می‫توانند تعداد و اندازه خود را تغییر داده و با شرایط جدید سازگار شوند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Studying the Effect of Short Time Salinity on the Activity of Chloride Cells by Immunohistochemistry and Scanning Electron Microscopy in, Cyprinus carpio

نویسندگان [English]

  • R Irvani 1
  • R Abdi 1
  • R Peyghan 2
  • B Archangi 2

1 Department of Marine Biology, Faculty of Marine Science, Khorramshahr University of Marine Science and Technology, Khorramshahr, Iran

2 Department of Clinical Sciences and Excellence Center of Warm Water Fish Health and Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran

چکیده [English]

Aim: The main purpose of the recent study was to evaluate gill chloride cells in Cyprinus carpio during adaptation to different environmental salinities over a short period.
Material and Methods: For this research, Cyprinus carpio by an average weight of 41.4±1 g and length of 16.9±1 cm in four groups with three replications was used. The first group as control was located in fresh water and the next three groups respectively were kept in 4 ppt, 8 ppt, and 12 ppt salinity with the exact condition. On 0, 6, 12, 24, 48, 72, and 96 h the second-gill arch with a maximum thickness of 0.5 cm from the left side was prepared and placed in formalin’s buffer 10%, glutaraldehyde 2.5% solution, and pH 7.4. Then the standard method of preparing tissue sections was performed and paraffin sections with a thickness of 4-6 microns were prepared and stained with hematoxylin and eosin methods and examined with a light microscope. Also, changes in the structure and number of mitochondrial-rich cells, distribution, and dispersion of Na+/K+-ATPase enzyme were studied by scanning electron microscope and immunohistochemical technique.
Results: Results showed obvious modifications in the number and distribution of chloride cells in two filament and lamellar positions at different sampling times. The highest number of chloride cells in the filament and lamella, 26.28±1.33; 19.11±1.27 was reported in 12ppt and the lowest number belonged to the control group. The largest size of chloride cells in the filament and lamella, 22.51±1.56; 12.72±1.32 was reported in 12ppt and the lowest size belonged to the control group.
Conclusion: The findings of this study showed that C. carpio gill chloride cells in the face of different salinities in a short period can change the number and size and adapt to the new condition.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Salinity
  • Cyprinus carpio
  • Gill
  • Osmoregulation

مقدمه
   کپور معمولی (Cyprinus carpio) یکی از مهم‫ترین گونه های پرورشی می‫باشد که در بسیاری از مناطق مختلف ایران به‫ویژه در نواحی مختلف خوزستان پرورش داده می‫شود (1). آبشش‫ها در ماهی نقش‫های مختلفی از جمله تبادل گاز، تنظیم یونی اسید-باز و دفع مواد زائد نیتروژنی را ایفا کرده و برای عمل‫کرد تنظیم اسمزی اختصاصی هستند (2). در اپی‫تلیوم آبشش سلول‫های کلراید یا سلول‫های غنی از میتوکندری یا یونوسیت‫ها که دارای تراکم بالایی از آنزیم‫های Na+/K+-ATPase هستند دارای مهم‫ترین نقش برای انجام این فرایند می‫باشند. همه انواع سلول‌های بافت آبشش محل بیان ژن این آنزیم می‫باشند اما چگالی این آنزیم در سلول‌های کلراید از دیگر سلول‌ها بیشتر می‫باشد. بنابراین مکان یابی این آنزیم با استفاده از آنتی‌بادی‌های خاص زیر واحدهای آنزیمی روشی قابل اعتماد برای تشخیص دقیق محل سلول‌های کلرید می‫باشد (3، 4)، زیرا این سلول‫های نقش مهمی در تنظیم اسمزی که وظیفه تبادل و دفع یون‫ها در محیط هیپراسموتیک و جذب یون‫ها در محیط هیپواسموتیک بر عهده دارند (5). تنظیم اسمزی چگونگی تنظیم جریان آب در سرتاسر بدن ماهی را روشن می‫کند که شامل ترکیبی از بافت‫های بدن، آبشش و عمل‫کرد کلیه هاست. میزان نمک در بافت‫های بدن ماهی آب شور کمتر از آبی است که در آن زندگی می‫کنند و محیط شورتر بیرون به‫طور مداوم آب را از بافت های بدن و پوست ماهی جذب می‫کند. برای جبران آب از دست رفته و جلوگیری از کم آبی بدن، ماهی آب شور مقدار زیادی از آب شور را می‫نوشد  و ادرار کمی هم تولید می‫کند. در نقطه مقابل میزان نمک بافت بدن یک ماهی آب شیرین بیشتر از آبی است که در آن زندگی می‫کند و در نتیجه آب به‫طور مداوم به بدن ماهی آب شیرین از طریق پوست و آبشش‫های آن جریان می‫یابد و  ماهی هیچ دلیلی برای نوشیدن آب اضافه ندارد. وحتی برای جلوگیری از انباشت آب در بدن ادرار زیادی تولید می‌کند. به‫طور کلی، تحمل ماهی کپور و سازگاری با تغییرات شوری محیط بسیار بالاست که به‫دلیل تغییرات سریع در سلول‫های غنی از میتوکندری برای تنظیم ورود و خروج آب و الکترولیت‫ها است (6). در آبزی پروری تغییرات شوری آب یکی از رایج‫ترین موارد می‫باشد که می‫تواند منجر به کاهش تولید و تولید مثل یا مرگ ماهی شود.  به‫طور معمول شوری آب شیرین کمتر از 1 گرم در لیتر می‫باشد و ماهیان آب شیرین ممکن است در معرض شوری بالاتر از حد طبیعی قرار گیرند (7). در سال‫های اخیر در مزارع پرورش ماهی به‫دلیل خشک سالی و کاهش بارندگی، شوری آب افزایش یافته است. بنابراین، بررسی اثرات نامطلوب این فرآیند بر روی ماهیان پرورشی ضروری می‫باشد (8، 9). این مطالعه با هدف تعیین تغییرات و سازگاری سلول‫های کلراید به‫عنوان یک سلول بسیار مهم در پاسخ به این تغییرات تحت تاثیر شوری های محیطی مختلف در ماهی کپور معمولی انجام شد که به‫روش بافت شناسی، فراساختاری و مکان یابی آنزیم Na+-K+ ATPase در بافت اپی‫تلیال آبشش طی فرآیند سازگاری با روش ایمونوهیستوشیمی با استفاده از آنتی بادی IgGα5 قابل ردیابی می‫باشد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
2- مواد و روش‫ها‬‬‬‬‬‬‬
جمع آوری نمونه‫ها و بافت شناسی معمولی‬‬‬‬‬‬‬
تمام آزمایش‫ها بر روی موجود زنده در این تحقیق بر اساس رویه ای که توسط آژانس سلامت حیوانات دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر پذیرفته شده است انجام گرفت. در این مطالعه ماهیان کپور معمولی جوان از هر دو جنس که بر اساس ویژگی‫های مورفومتری انجام پذیرفت و با میانگین وزن 1±4/41 گرم و طول 1±9/16 سانتی‫متر در شوری‫های مختلف مورد ارزیابی قرار گرفتند. برای این منظور آکواریوم‌های 500 لیتری شامل گروه شاهد و تیمار شوری ppt4، ppt8 و ppt12 با سه تکرار که با افزودن مقدار مناسب NaCl خالص به آب لوله‌کشی کلرزدایی شده شهر اهواز انجام گرفت. ماهی‫ها با رژیم غذایی تجاری بیومار (43 درصد پروتئین، 18 درصد چربی، 30 درصد کربوهیدرات و  9 درصد فیبر) دو بار در روز با نسبت 5/1 درصد وزن بدن تغذیه شدند (10). در طول دوره پارامترهای فیزیکوشیمیایی آب شامل دما، pH، اکسیژن محلول و سختی به‫وسیله دستگاه ارزیاب آب (Horiba U-10، ژاپن) پایش و آکواریوم‫ها در دمای 1±20 درجه سانتی‫گراد تحت دوره نوری طبیعی نگه‫داری شدند. برای جلوگیری از افزایش آمونیاک و حفظ شوری، روزانه یک سوم آب آکواریوم تخلیه و به همان میزان آب شور آماده شده به‫هر آکواریوم اضافه می شد (10). نمونه آبشش 3 ماهی بی‫هوش شده به‫وسیله پودر گل میخک نیم گرم بر لیتر با ضخامت نیم سانتی‫متر در زمان انتقال، 6، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از مواجهه جدا و در بافر فرمالین 10 درصد و محلول گلوتارآلدئید 5/2 درصد (Sigma, Germany)  قرار گرفتند (11، 12). همچنین روش معمول آماده‌سازی بافت شامل آب‌گیری با الکل اتیلیک، شفاف‌سازی با زایلول و بلوک‫گیری با پارافین انجام و برش‌هایی به ضخامت 4 تا 6 میکرون با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی و در نهایت 5 برش بافتی از هر نمونه و در هر برش حداقل 6 میدان دید میکروسکوپی به‫وسیله میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفت (13).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
میکروسکوپ الکترونی روبشی
برای آماده سازی نمونه‫ها به‫روش‌های میکروسکوپ الکترونی روبشی(Zeiss, Germany) 3 نمونه پس از تثبیت در گلوتارآلدئید 5/2 درصد با 4/7 =pH  در بافر فسفات 1/0 مولار شستشو و سپس در اتانول با درجات صعودی هر کدام از الکل‫های 90 درصد، 95 درصد، 100 درصد و استون آب‌گیری شدند. پس از آن توسط نیتروژن مایع منجمد شده و به‫صورت عمودی بر روی یک سطح غیر رسانا، پوشیده از طلا قرار داده شدند و در نهایت فتومیکروگراف‫های مناسب تهیه شد (14).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
ایمونوهیستوشیمی
برای تکنیک ایمونوهیستوشیمی مقاطع پارافینی 4 میکرونی تهیه شده توسط میکروتوم نیمه دیجیتال تنظیم شده از قبل جهت برش بر روی لام‫های پوشیده شده با L-lysin Poly  قرار گرفتند. پس از حذف پارافین توسط زایلول و آب‫گیری در الکل اتانول در محلول PBS شستشو و در محلول A که ترکیبی از PBS، کلرید سدیم و TWEEN خالص قرار داده شد. سپس اسلایدها با محلول B که ترکیبی از PBS و Regiler خالص بوده است آغشته شدند. سپس اسلایدها به‫مدت 2 دقیقه در PBS قرار گرفته و در جعبه حاوی هوای مرطوب قرار داده شدند. برای هر لام، 100 میکروگرم آنتی ژن IgGα5 رقیق به PBS اضافه شد و به‫مدت 2 ساعت در دمای اتاق نگه‫داری شدند. سپس 100 میکرولیتر آنتی ژن FITC با غلظت 100 درصد به‫هر لام اضافه و در محیط کاملا تاریک به‫مدت یک ساعت انکوبه سپس لام‫ها  در PBS شستشو و پس از قرار دادن لامل روی آن‫ها برای حفظ خواص فلورسنj در یک مکان تاریک قرار داده شدند. در نهایت توسط میکروسکوپ نوری فلورسانس در فیلترهای 450 تا490 نانومتر مشاهده و فتومیکروگراف‫های مربوطه تهیه شد (15). تمامی مواد شیمیایی استفاده شده در این بخش توسط شرکت Merck آلمان تهیه شده بود. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
3- آنالیزهای آماری
میانگین ± انحراف معیار شامل تعداد، اندازه، تراکم و مساحت دهانه راسی سلول‌های کلراید نمونه‫های شاهد و شوری مورد ارزیابی قرار گرفتند. اختلاف پارامترها در سطح معنی داری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) انجام  و تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از SPSS 18 و نسخه 13.0  در سطح 05/0

 

4-  نتایج
نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که در طول سازگاری در تیمارهای مختلف مرگ و میری مشاهده نشد. ساختار میکروسکوپی آبشش توسط ساختار غضروفی در قسمت مرکزی، رگ‌های خونی و تیغه‌هایی که توسط انواع سلول‌های کلراید پشتیبانی می‌شدند و سلول‌های نگه‫دارنده بر روی رشته‌ها در نواحی بالا و پایین قرار داشتند مشاهده شد. سلول‫های کلراید در زمان‫های مختلف تحت تاثیر شوری قرار گرفته و به‫رنگ اسیدوفیلی در لام‫ها ی میکروسکوپی شناسایی شدند. در مطالعه حاضر، دو نوع عمده سلول کلراید در نواحی فیلامنتی و قاعده‌ای – جانبی لاملاها شناسایی شدند (شکل 1). ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

 

 
شکل 1: ساختار میکروسکوپ نوری بافت آبشش در گروه‫های کنترل (a) و شوری های ppt 4 (b)، ppt 8 (c) و ppt  12                                         (d). ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬فیلامنت(F) ؛ لاملا(L) ؛ غضروف  (C)؛ رگ خونی (A)؛ سلول پوشش (P)؛  سلول‫های کلرید (فلش مورب). (H & E)  ‬‬‬‬‬‬‬.‬‬‬‬‬

بیشترین تعداد سلول‫های کلراید فیلامنتی (33/1±28/26) در شوری ppt 12 و کمترین آن (22/1±6/24) مربوط به گروه کنترل بود. به‫طور کلی، تعداد سلول‫های کلراید فیلامنتی در سطح میدان دید میکروسکوپی معین در شوری بالا به‫مقدار زیادی افزایش یافته بود. بیشترین تعداد سلول‫های کلراید در لاملاهای مورد مطالعه (27/1±11/19) مربوط به شوری ppt  12و کمترین تعداد مربوط به گروه شاهد (18/0±42/1) بود. بر تعداد سلول‫های کلراید با افزایش شوری افزوده شده بود (شکل 2)‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

 

شکل 2: تعداد سلول‫های کلراید (μm2) در موقعیت‫های فیلامنتی (a) و لاملایی (b) در طول دوره سازگاری در زمان و شوری مختلف (حروف متفاوت در هر ستون نشان دهنده تفاوت معنی داری در سطح (05/0<p) است.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬


بیش‫ترین اندازه سلول‫های کلراید فیلامنتی مربوط به شوری ppt 12 (46/51±1/22) و کمترین آن مربوط به گروه شاهد (28/45±0/8) بود. به‫طور کلی، بر اساس نتایج این مطالعه در شوری و زمان‌های مختلف اندازه سلول‌های کلراید رشته‌ای با افزایش شوری افزایش یافت. نتایج آنالیز واریانس یک‫طرفه نشان داد که در برخی از گروه‫ها تفاوت معنی‫داری در اندازه سلول‫های کلراید رشته ای وجود داشت (05/0<p). بیش‫ترین اندازه سلول‫های کلراید لاملایی مربوط به شوری ppt 12 (23/72±1/12) و کم‫ترین آن مربوط به گروه شاهد (22/43±0/7) بود. به‫طورکلی، با افزایش شوری و زمان اندازه سلول‌های کلراید تیغه‫ای افزایش یافت. نتایج آنالیز واریانس یک‫طرفه تفاوت معنی‌داری را در اندازه سلول‌های کلراید تیغه‫ای نشان داد. همچنین تفاوت معنی‫داری در اندازه این سلول‫ها در برخی تیمارهای مختلف شوری مشاهده شد (05/0<p)  (شکل 3)‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

 

 

 

شکل 3: اندازه سلول‌های کلراید (μm2) در موقعیت‌های رشته‌ای (a) و تیغه‫ای (b) در طول دوره سازگاری در زمان و شوری مختلف (حروف متفاوت در هر ستون نشان‌دهنده تفاوت معنی‌دار در سطح  (05/0 p<) است.‬‬‬‬‬‬‬‬‬

سه شکل از سلول‫های کلراید در فتومیکروگراف‫های تهیه شده از میکروسکوپ الکترونی روبشی شناسایی شدند. در مقایسه با گروه شاهد تعداد سلول‌های کلراید با حفره عمیق به‫ویژه در شوری ppt 12 افزایش یافت. اما در ساعات اولیه و تمام شوری اکثر سلول‫های کلراید ساختار Shallow basin داشتند. به‫طور کلی، با گذشت زمان، تراکم دهانه سلول‫های کلراید با افزایش شوری افزایش یافت. کم‫ترین تراکم و سطح باز شدن سلول‫های کلرید در گروه کنترل و بیش‫ترین در شوری ppt 12مشاهده شد (شکل‫های 4 و 5).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 
شکل 4: ساختار میکروگراف الکترونی سلول‫های کلراید در گروه‫های کنترل (a) و شوری های ppt4 (b)، ppt8 (c) و ppt12 (d) پس از 96 ساعت. Shallow basin (S); Deep hole (D); Wavy convex (W)‬‬‬‬

 
شکل 5: تراکم (a) و مساحت (b) (μm2) دهانه راسی سلول‫های کلراید در طول سازگاری با شوری‫های مختلف (حروف مختلف در هر ستون تفاوت معنی‫داری را در (05/0< p) نشان می‫دهد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

در مطالعات ایمونوهیستوشیمی سلول‫های کلراید با چگالی بالا و واکنش‫های مثبت آنزیم  Na + / K+ -ATPase شناسایی شدند. رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس، روشی برای تشخیص سلول‌های کلراید، آنها را در نواحی قاعده‫ای جانبی و فیلامنت آبشش مشخص کرد. بیش‫ترین واکنش  Na + / K+ -ATPase در شوری ppt 12 و در پایان دوره مشاهده شد (شکل 6 ).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 
شکل 6: ایمونوفلورسانس آنزیم  K + - ATPase  Na + در گروه‫های کنترل (a) و شوری های ppt 4(b)،  8ppt (c) و ppt 12(d) پس از 96 ساعت.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

 


5- بحث
استفاده از آنتی بادی‫های IgGα5 برای مکان‫یابی آنزیم Na+/K+-ATPase و در واقع سلول‫های کلراید در حشرات آبزی، سخت پوستان و ماهی‫ها به‫عنوان یکی از موفق‫ترین روش‫ها ذکر شده است (16، 17). تنظیم اسمزی در واقع باعث کنترل غلظت الکترولیت‫ها، مواد آلی محلول در مایعات بدن، حفظ تعادل آب و نمک در آبزیان می‫شود. در یک تحقیق گزارش شده است که در آبشش Sparidentex hasta  سلول‫های کلراید واکنش سریعی به تغییرات ناگهانی شوری داشته بنابراین پس از 24 ساعت، تغییرات قابل توجهی در فراساختار ناحیه دهانه راسی سلول‫های کلراید و تراکم ایجاد شده است (18). همچنین نتایج مشابهی در Acanthopagrus latus و Sparus sarba گزارش شده است به‫طوری‫که یک روز پس از قرار گرفتن در معرض شوری ppt60 تعداد دهانه‫های راسی سلول‫های کلراید نسبت به سایر تیمارها افزایش معنی‫داری نشان داد و مساحت این دهانه‫ها در این تیمار افزایش معنی‫داری را نشان داد. این افزایش در تراکم و مساحت در پایان دوره کاهش یافت. همچنین در گونه‫های دریایی مانند Liza aurata، اکثر ماهی‫ها به فعالیت Na+/K+-ATPase واکنش‫های متفاوتی نشان دادند به‫طوری که در شوری ppt20 واکنش پذیری سلول‫های کلراید کمتر از سایر شوری‫ها بود. این کاهش در واکنش پذیری در این شوری تنها در اپی‫تلیوم فیلامنتی گزارش شده بود (19 و 20). سایر محققین در مطالعه بر روی این سلول‫ها در قسمت فیلامنتی Pagrus auratus نشان دادند که واکنش پذیری سلول‫های کلراید در معرض شوری ppt20 کاهش می‫یابد. محققان معتقدند به‫دلیل کاهش اختلاف غلظت یون‫ها در محیط خارجی و داخلی بدن ماهی نیاز به دفع فعال یون‫های اضافی در محیط مذکور کاهش می‫یابد. بنابراین در یک پاسخ تطبیقی با کاهش تعداد و اندازه سلول‫های کلراید تعداد آنزیم‫ها و ناقل‫های یونی که در غشای سلولی وجود دارند و در نتیجه فعالیت این سلول‫ها کاهش می‫یابد. محققان خاطرنشان کردند که تغییر در تعداد و مساحت سلول‫های کلراید به‫دلیل قرار گرفتن در محیط با شوری بالا و افزایش فعالیت آن‫ها برای دفع یون‫های اضافی Na و Cl می‫باشد (21). پاپی و همکاران (22) نتایج مشابهی را با تحقیق روی سلول‫های کلراید فیلامنتی A. latus گونه آب شور بر خلاف گونه آب شیرین مورد مطالعه گزارش کردند. همچنین در این گونه عدم وجود حفره‫های عمیق سلول‫های کلراید پس از سازگاری با شوری ppt60 گزارش شده است. در تحقیق حاضر بر روی آبشش‌ ماهی کپور معمولی که در معرض شوری‫های مختلف  و در مدت کوتاه قرار گرفته بود در پایان سازگاری با شوری ppt12 حفره‌های عمیق سلول‌های کلرایدی بیشتر نمایان شدند. در این مطالعه، در شوری ppt8 و ppt12 تراکم دهانه آپیکال سلول‌های کلراید کمتر از شاهد بود. همچنین شوری در ppt4 تعداد سلول‫های کلراید با سطح باز بیشتر از سایر تیمارها گزارش شد در حالی‫که سطح دهانه سلول‫های کلریدی در ppt12 در روزهای اول کمتر از سایر تیمارها بود که با گزارش سایر محققین بر روی گونه‫های مشابه مطابقت داشت (23). همچنین در مطالعه‌ای بر روی Mylio macrocephalus گزارش شد که سطح راسی سلول‌های کلرید در شوری تا ppt50 بیشتر از نوع عمیق بوده است (24). از سوی دیگر در مطالعه‌ای بر رویOreochromis mossambicus تطابق داده شده با در شوری ppt40 گزارش شد که سطح راسی سلول‌های کلرایدی با یک افزایش در تعداد این نوع از سلول‫ها همراه بوده است (25) محققان اخیر گزارش داده‫اند که در روزهای اولیه به‫ویژه در شوری کم نیاز به مواد معدنی برای تنظیم اسمز ضروری است. در مطالعه‫ای بر روی  O. mossambicus در معرض انواع شوک‫های هیپراسموتیک، از جمله آب شور، چگالی دهانه راسی سلول‫های کلرید 3 ساعت پس از انتقال به‫طور قابل توجهی کاهش یافت که دلیل این امر کاهش تراکم این سلول‫ها در آبشش ماهی در معرض شوری بوده است (26). همان‫طور که در یک مطالعه اخیر مشاهده شد تغییرات در تعداد و ناحیه دهانه سلول‫های کلراید اغلب می‫تواند با تغییرات در میزان یون‫های Na و  Cl مرتبط باشد. تغییرات در دهانه سلول‫های کلراید می‫تواند به‫‫دلیل افزایش یا تغییر تبادل یونی در محیط‫های هیپراسموتیک و هیپواسموتیک باشد (27). زیرا بر اساس مطالعات متعدد مشخص شد که دهانه‫های راسی سلول‫های کلرید پتانسیل بالایی برای عبور یون‫ها دارند و چنین تغییراتی بیشتر در قسمت‫های راسی این سلول‫ها رخ می‫دهد. این عامل همچنین ممکن است به‫دلیل تغییر در سرعت جذب یا دفع یون بسته به شرایط محیطی ماهی باشد (28). در تحقیق بر روی Dicentrachus labrax دریافتند که تعداد سلول‫های کلرید در آب دریا در مقایسه با آب شیرین افزایش قابل توجهی را نشان می‫دهد. از سوی دیگر، مساحت سلول‫های کلرید در آب دریا نسبت به آب شیرین افزایش معنی‫داری نشان داد. محققان بر این باورند که در بیشتر گونه‌های یوری هالین تعداد سلول‌های کلراید در انتقال از آب شیرین به آب دریا افزایش یافته است، در حالی‫که برعکس آن کمتر دیده می‌شود. این جانوران آبزی می‫توانند با طیف وسیعی از شوری‫ها سازگار شوند. افزایش تعداد سلول‫های کلراید به‫دنبال انتقال به شوری‫های بالاتر ممکن است با افزایش نیاز به ظرفیت انتقال یون در آب دریا یا شوری‫های بالاتر همراه باشد. این نتیجه با مطالعه یون‫های مختلف درگیر در تنظیم اسمزی در آبشش ماهی نشان داده شده است (29). مطالعه اخیر نشان داد که سازگاری این گونه با تغییرات شوری محیط به دلیل تغییرات سریع سلول‫های کلرید برای تنظیم ورود و خروج آب و الکترولیت‫ها است. به‫طوری‫که در شرایط جدید برای سازگاری سلولی، تغییراتی در دهانه‫های راس ایجاد می‫شود که میزان آنزیم‫های حامل الکترولیت را تنظیم می‫کند.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
6-  نتیجه گیری
یافته‫های پژوهش حاضر نشان داد که کپور معمولی می‫تواند با شوری‫های مختلف سازگار شود. تغییرات در ساختار و چگالی روزنه‫های سلول‫های کلراید را می‫توان در لحظات اولیه پس از انتقال تشخیص داد. واکنش‌پذیری ایمنیایی آنزیم Na+/K+-ATPase در شوری‌های بالاتر افزایش می‌یابد و محلی‌سازی این آنزیم نشان داد که سلول‌های غنی از میتوکندری آبشش‌های کپور در فیلامنت و به‫ندرت در اپی‫تلیوم لایه‌ای وجود دارند. همچنین در زیر میکروسکوپ الکترونی روبشی برای تشخیص تغییرات سریع در تعداد و مساحت راسی سلول‫های کلراید برای ارزیابی تحمل به شوری در این ماهی می‫توان تاکید کرد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
7-  تشکر و قدردانی
از زحمات و حمایت همه جانبه معاونت محترم پژوهش و فناوری دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر به‫ویژه در تقبل هزینه صمیمانه تشکر و قدردانی می‫شود.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

  1. Abdi R, Pourkhadje MR, Zolgharnein H, Hoseinzade Sahafi H, et al. Effect of salinity on mitochondria of chloride cells in gill of juvenile's grouper (Epinephelus coioides). Journal of Animal Environment. 2011; 2 (48): 37-42.
  2. Chang IC, Lee TH, Yang CH, Wei YY, et al. Morphology and Function of Gill Mitochondria-Rich Cells in Fish Acclimated to Different Environments. Physiology Biochemistry Zoology. 2001; 74(1): 111-119.
  3. Varsamos S, Diaz JP, Charmantier G, Blasco C, et al. Branchial chloride cells in sea bass (Dicentraachus labrax) adapted to fresh water, seawater, and doubly concentrated seawater. Journal of Exprimental Zool. 2002; 293: 12- 26.
  4. Dastan V, Abdi R, Movahedinia AA, Salari-Aliabadi MA. Study of gill and kidney tissue changes in Tenualosa ilisha during migration from sea to the Karun and Bahmanshir rivers. Iranian Fisheries Science Journal. 2017; 25(4): 53-62.
  5. Morovvati H, Abdi R, Shamsi MM. Effect of different salinity concentration on gill of benni Barbus sharpeyi. Journal of Veterinary Reserch. 2017; 72(2): 243-24.
  6. Carmona R, Garcia-Gallego M, Sanz A, Domezain A, et al. Chloride cells and pavement cells in gill epithelia of Acipencer naccarii: ultrastructural modifications in seawater-acclimated specimens. Journal of Fish Biology. 2014; 64: 553-566.
  7. Rumiani E, Abdi R, Zolgharnein H, Morovati H, et al. Histology of kidney tubules and Na+- K+ Atpase immonolocalization of ionocyte cells in the tubules of grouper juveniles (Epinephelus coioides). Journal of Marine Science Technology.2010; 9(1): 4 - 12.
  8. Sabery M, Abdi R, Morovvati H, Ronagh M, et al.  Study of histopathology in gill of Liza klunzingeri Caused by industrial and municipal wastewater pollution. Journal of Animal Environment. 2014; 6(3): 225-231.
  9. Blank T, Burggren W. Hypoxia-induced developmental plasticity of the gills and air-breathing organ of Trichopodus trichopterus. Journal of Fish Biology. 2014; 291: 808-826.
  10. Salati AP, Baghbanzadeh A, Soltani M, Peyghan R, Riazi G. Effect of different levels of salinity on gill and kidney function in common carp Cyprinus carpio (Pisces: Cyprinidae). Italian Journal of Zoology. 2011; 78(3): 298-303.
  11. Basir Z, Peyghan R. The process of kidney gradual changes in, Tenualosa ilisha during migration from sea to the river. Journal of Persian Gulf. 2016; 7(26): 47-56.
  12. Lin C, Huang C, Yang C, Lee T, et al. Time-Course Changes in the Expression of Na, K-ATPase and the Morphometry of Mitochondrion-Rich Cells in Gills of Euryhaline Tilapia (Oreochromis mossambicus) During Freshwater Acclimation. Journal of Exprimental Zoology. 2004; 301:85–96.
  13. Moradkhani A, Abdi R, Salari Ali-Abadi MA, Nabavi S, et al. Quantification and description of gut-associated lymphoid tissue in, shabbout, Arabibarbus grypus (actinopterygii: cypriniformes: cyprinidae), in warm and cold season. Acta Ichthyologica et Piscataria. 2020; 50(4): 423-432.
  14. Platell ME, Ang HP, Hesp SA, Potter IC. Comparisons between the influences of habitat, body size and season on the dietary composition of the sparid Acanthopagrus latus in a large marine embayment. Estuar  Coastal Shelf Science. 2007; 72:  626-634.
  15. Al-Balawi HF, Al-Akel A, Al-Misned AS, Suliman F, et al. Effects of sub-lethal exposure of lead acetate on histopathology of gills, liver, kidney and muscle and its accumulation in these organs of Clarias gariepinus. Brazilian Archive of Biology Technology. 2013; 56: 293–302.
  16. Basir Z, Peyghan R. Immunohistochemical and ultrastructural study of the effect of different salinities on gill chloride cells of Cyprinus Carpio. Iranian Fisheries Science Journal. 2016; 28(5): 131-141.
  17. Camps L, Serret J, Ramos-López D, Gonzalez-Linares J, et al. Oxidative stress, genotoxicity and histopathology biomarker responses in Mugil cephalus and Dicentrarchus labrax gill exposed to persistent pollut-ants, a field study in the Bizerte Lagoon. Tunisia Chemospher. 2015; 135: 67–74.
  18. Evans DH, Piermarini PM, Cho KP. The multifumctional fish gill: Dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous wast. Journal of Exprimental Biology. 2005; 85: 97-177.
  19. Manoharan S, Mathan R, Rakpong P, Rama Krishnan P. Influence of environmental salinity and cortisol pretreatment on gill Na+/K+ −ATPase activity and survival and growth rates in Cyprinus carpio. Aquaculture Report. 2018; 11: 1-7.
  20. Pisam M, Boeuf G, Prunet P, Rambourg A. Ultrastructural features of mitochondria-rich cells in stenohaline freshwater and seawater fishes. Journal of Exprimental Biology. 1998; 187: 21-31.
  21. Pereira S, Pinto AL, Cortes R, Fontaínhas-Fernandes A, et al. Gill histopathological and oxidative stress evaluation in native fish captured in Portuguese northwestern rivers. Ecotoxicology Environmental  Safety. 2013; 90: 157–166.
  22. Papi H, Abdi R, Movahedinia AA. Morphological changes of mitochondria-rich cells in gill of Sparidentex hasta during adaptation to different environmental salinities by scanning electron microscopy. Journal of Marine Science Technology. 2016; 15(1): 121-131.
  23. Pourkhadje MR,  Abdi R,  Zolgharnein H, Hoseinzade Sahafi H, et al. Histology and immunolocalization of ionocyte cells in gill of juvenile's Grouper (Epinephelus coioides). Journal Oceanography. 2011; 2(6): 1-6.
  24. Khodabandeh S, Shahriarimoghaddam M, Abtahi B. Changes in Chloride Cell Abundance, Na+, K+-ATPase Immunolocalization and Activity in the Gills of Golden Grey Mullet, Liza aurata, Fry During Adaptation to Different Salinities. Yakhteh Medical Journal. (2009a); 11(1): 49 -54.
  25. Papi H, Movahedinia A,  Abdi R. Immunohistochemical study on gill chloride cells in Sobaity, Sparidentex hasta under different environmental salinities. Journal of Veterinary Reserch. 2016; 71(2): 127-133.
  26. Fonseca AR, Sanches Fernandes LF, Fontainhas-Fernandes A, Monteiro SM, et al. From catchment to fish: Impact of anthropogenic pressures on gill histopathology. Science Total Environment. 2016; 550 (3): 972–986.
  27. Fridman S. Ontogeny of the osmoregulatory capacity of teleosts and the role of ionocytes. Fronter Marine Science. 2020; 7: 709-716.
  28. Moron S, Oba E, Andrade C, Fernandes M. Chloride Cell Responses to Ion Challenge in Two Tropical Freshwater Fish, the Erythrinids Hoplias malabaricus and Hoplerythrinus unitaeniatus. Journal of Exprimental Zoology. 2003; 298: 93–104.
  29. Wang PJ, Lin CH, Hwang LY, Huang CL, et al. Differential responses in gills of euryhaline tilapia, Oreochromis mossambicus, to various hyperosmotic shocks. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular  Integrative Physiology. 2003;152(4): 544-551.