فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشیار، گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، اهواز، ایران

2 گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، اهواز، ایران

چکیده

هدف: ترکیبات لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم پستانداران، به‫دلیل وجود مقادیر بالای اسیدهای چرب غیراشباع، به‫شدت نسبت به تنش اکسیداتیو حساس هستند. در سال­های اخیر، در خصوص خواص آنتی‫اکسیدانتی برخی گیاهان و نقش حفاظتی آن­ها برای اسپرم­های حیوانات تحقیقاتی صورت گرفته است. لذا پژوهش حاضر با هدف بررسی تاثیر برون­تنی عصاره میخک بر فراسنجه­های کیفی و حفظ حیات اسپرم‌­ها تحت شرایط  نگه‫داری منی به حالت مایع انجام شد.
مواد و روش­ها: اسپرم­گیری از 8 راس قوچ عربی به‫طور هفتگی به‫مدت 6 هفته انجام شد و منی مخلوط آن‫ها پس از رقیق­سازی، به 5 قسمت تقسیم شد. تیمارها شامل افزودن سطوح صفر، 25، 50، 75 و 100 میکروگرم در میلی­لیتر عصاره جوانه میخک به منی رقیق شده قوچ عربی بود. در زمان­های صفر، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از  نگه‫داری تیمارها در دمای 5 درجه­ سانتی­گراد، فراسنجه­های کیفی اسپرم­ها ارزیابی شدند.
نتایج: در زمان صفر، فراسنجه­های کیفی اسپرم­ها تحت تاثیر تیمارها قرار نگرفتند. در زمان 24 ساعت، درصد تحرک، زنده­مانی و سلامت غشای پلاسمایی اسپرم­ها در تیمار 100 میکروگرم عصاره میخک کاهش یافتند (05/0>P). با سپری شدن زمان تا 96 ساعت، غلظت­های 25 و 50 میکروگرم عصاره میخک سبب بهبود درصد تحرک، زنده­مانی و سلامت غشای پلاسمایی اسپرم­ها شدند (05/0>P). تفاوت میزان ناهنجاری‫های مورفولوژیکی اسپرم­ها در بین تیمارها معنی­دار نشد.
نتیجه­گیری: به‫طور کلی، افزودن 25 میکروگرم عصاره میخک به‫هر میلی­لیتر رقیق کننده منی قوچ عربی سبب بهبود تحرک، زنده­مانی و سلامت غشای پلاسمایی اسپرم­ها طی  نگه‫داری منی تحت دمای 5 درجه سانتی­گراد شد. 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Antioxidant effect of Syzygium aromaticum extract on sperm quality in Arabi ram during semen storage in liquid condition

نویسندگان [English]

  • S Tabatabaei Vakili 1
  • R Zeidi 2

1 Associate professor, Department of Animal Science, Faculty of Animal and Food Science, Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan, Ahvaz,

2 Ph.D. student, Department of Animal Science, Faculty of Animal and Food Science, Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan, Ahvaz

چکیده [English]

Aim: The lipid compositions of mammalian plasma membrane of spermatozoa are highly sensitive to oxidative stress due to the presence of high amounts of unsaturated fatty acids. If the production of active oxygen compounds is more than the antioxidant capacity of sperm to neutralize its effects, the sperm will undergo oxidative damage, which is characterized by the reduction of qualitative and viability parameters of spermatozoa. In recent years, research has been done on the antioxidant properties of some plants and their protective role for animal spermatozoa. So, the purpose of this research was to investigate the in vitro effect of Syzygium aromaticum extract on the spermatozoa qualitative parameters and preservation of sperm viability under the semen storage in liquid condition.
Material and Methods: Semen collection was done from 8 Arabi rams weekly for 6 weeks and their semen was immediately mixed and after dilution, divided into 5 parts. The treatments included the addition of different levels of zero (control), 25, 50, 75 and 100 µg/ml of clove bud extract to the semen diluent. At zero, 24, 48, 72 and 96 hours after storage the semen samples at 5°C, the quality parameters of the spermatozoa included the motility, viability, plasma membrane integrity and morphological defect rates were evaluated.
Results: At zero time, spermatozoa quality parameters were not affected by the treatments (P<0.05). In 24 hours, the percentage of motility, viability and plasma membrane integrity of spermatozoa in 100 µg/ml of Syzygium aromaticum extract decreased (P<0.05), and lower levels of extract were ineffective on the mentioned parameters of spermatozoa compared to the control. But, after the storage of samples up to 96 hours, 25 and 50 µg/ml of extract significantly improved the percentage of motility, viability and plasma membrane integrity of spermatozoa compared to the control (P<0.05). There was no significant difference in the percentage of spermatozoa morphological abnormalities among the treatments (P<0.05). 
Conclusion: In general, adding 25 µg/ml of Syzygium aromaticum extract to semen diluent of Arabian ram improved the motility, viability and plasma membrane integrity of spermatozoa as well as maintain their viability during the storage of semen under 5˚C. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ram
  • Semen storage
  • Sperm viability
  • Syzygium aromaticum extract

مقدمه

   عوامل متعددی در کاهش کیفیت و به دنبال آن باروری اسپرم به هنگام ذخیره برون تنی منی نقش دارند که یکی از مهم‫ترین مواردی که همواره مورد توجه بوده است، تغییرات غیرقابل برگشت غشای فسفولیپیدی اسپرم در اثر پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی است (1). گزارش شده است که در فرآیند سرد‌سازی اسپرم مشکل عمده‌ای که رخ می‌دهد، آسیب به غشای پلاسمایی اسپرم در نتیجه پراکسیداسیون لیپیدها می‌باشد (2). اسپرمی ‌که به لحاظ عمل‫کردی طبیعی است، سطوح پایینی از رادیکال‫های آزاد یعنی گونه‫های اکسیژن واکنش‫گر Reactive oxygen species (ROS) را تولید می‌کند، ‌اما در اثر فرآیند‌­های سرد­سازی، افزایش ROS اتفاق می­افتد که در نهایت منجر به بروز تنش اکسیداتیو در سلول می‌شود. ساز و کار­های متفاوتی برای مهار تنش اکسیداتیو و کاهش آسیب­‌های ناشی از انواع گونه­های فعال اکسیژن وجود دارد که یکی از آن‌­ها بهبود سیستم آنتی‌اکسیدانتی در منی است. غشای پلاسمایی اسپرم دارای مقادیر زیادی اسیدهای چرب غیراشباع با چند باند دوگانه است که از این لحاظ آن­ها را به آسیب­های پراکسیداتیو بسیار حساس می­کند. این آسیب­های پراکسیداتیو موجب کاهش یکپارچگی غشا، آسیب به عمل‫کرد سلول، کاهش جنبایی و نهایتا کاهش کیفیت و توانایی باروری اسپرم می‌شود. بنابراین، برای جلوگیری از آسیب­های پراکسیداسیون، به‫ویژه هنگام  نگه‫داری منی، استفاده از آنتی اکسیدانت‌ها مفید به‫نظر می­رسد (3). آنتی­اکسیدانت­ها می­توانند با کنترل گونه­های فعال اکسیژن (ROS) و کاهش پراکسیداسیون اسید­های چرب باعث بهبود کیفیت اسپرم شوند. با افزودن آنتی­اکسیدانت­ها به اسپرم رقیق شده، اکسیداسیون اسید­های چرب و به‫دنبال آن آسیب‌­های وارده به اسپرم کاهش می­یابد (4).

میخک با نام علمی Syzygium aromaticum و با نام انگلیسی clove گیاهی است که برگ­های آن همیشه سبز و دائمی بوده و درختی با اندازه متوسط 8 تا 11 متر از خانواده بومی Mirtaceae از جزیره مالاکا در شرق اندونزی است. میخک نشان دهنده یکی از منابع مهم گیاهی از ترکیبات فنلی همچون فلاوونوئیدها، اسیدهای هیدروکسی بنزوئیک، اسید هیدروکسی سینامیک و پروپن هیدروکسی فنیل است. از اسیدهای فنلی، گالیک اسید و کافئیک اسید بیشترین مقدار را دارند. از میان فلاوونوئیدها، کوئرستین، کاتچین و کامفرول بیشترین مقادیر را به‫خود اختصاص می‫دهند و از روغن­های فرار، ترکیبات اوژنول، کارواکرول، تیمول، و منتول را می­توان نام برد. امروزه، گزارش‫های بسیاری از تایید خواص آنتی­اکسیدانتی میخک به‫دلیل قدرت حفاظتی آن از تثبیت رادیکال‫های آزاد وجود دارد (5). از گیاه میخک در طب سنتی برای درمان بیماری­های مختلفی استفاده شده است. میخک به‫عنوان گیاه محرک جنسی شناخته شده و از آن برای درمان اختلالات تولید مثلی نرها استفاده می­شود. در تحقیقی، درمان با گیاه میخک سبب بهبود فعالیت­های جنسی موش­های نر آزمایشگاهی شد (6). در مطالعه دیگر، میخک علاوه بر افزایش میل جنسی موش­های نر بالغ، در فراسنجه­های اسپرم از جمله افزایش تحرک اسپرم­ها نیز تاثیر داشت (7).    

اسپرم از ساز و کارهای آنتی­اکسیدانتی آنزیمی و غیرآنزیمی برای مقابله با اثرات مخرب پراکسیداسیون لیپیدی و رادیکال‌های آزاد برخوردار هستند، اما مقدار آن کافی نبوده و افزودن آنتی­اکسیدانت‌هایی با منشا خارجی به‫عنوان یک ساز و کار دفاعی خارجی مفید به‫نظر می‌رسد (8).

با توجه به این‫که دستیابی به رقیق‌کنندهای مناسب به‫منظور  نگه‫داری منی قوچ به‫صورت مایع ضروری می‌باشد، پژوهش حاضر با هدف بررسی اثر سطوح مختلف عصاره گیاه میخک به‫صورت افزودنی به منی بر فراسنجه‌های کیفی اسپرم قوچ عربی تحت شرایط برون­تنی با توجه به خاصیت آنتی­اکسیدانتی آن انجام گرفت.

2- مواد و روش­ها

   پژوهش حاضر در ایستگاه دامپروری دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان واقع در شهر ملاثانی، 36 کیلومتری شمال شرقی اهواز طی فصل تولیدمثل گوسفند یعنی پاییز انجام شد. برای این منظور، تعداد 8 رأس قوچ عربی سالم با متوسط سن حدود 5/2 سال استفاده شدند. این قوچ­ها در یک جایگاه مسقف نیمه باز مجزا در نزدیکی جایگاه میش­ها  نگه‫داری می‫شدند. جیره  نگه‫داری قوچ­ها­ شامل یونجه خشک (40 درصد)، کاه گندم (20 درصد)، ذرت (26 درصد)، سبوس گندم (13 درصد)، نمک (5/0 درصد) و افزودنی معدنی (5/0 درصد) با انرژی قابل متابولیسم 40/2 مگاکالری در کیلوگرم، 3/15 درصد پروتئین، 8/0 درصد کلسیم و 7/0 درصد فسفر بود که به‫صورت آزاد در اختیار دام­ها قرار داشت. اسپرم­گیری از قوچ­ها با دستگاه الکترواجاکولیتور (Ogawa Seiki Co Ltd, Japan) به‫طور هفتگی و به‫مدت 6 هفته انجام گرفت. منی جمع­آوری شده از دام­ها، به‫منظور از بین بردن اثرات فردی بلافاصله با هم مخلوط شده و پس از رقیق­سازی بر پایه تریس به نسبت 1 به 10 (یک قسمت منی در 10 قسمت رقیق کننده) (جدول 1)، به 5 قسمت تقسیم و غلظت­های مختلف عصاره جوانه میخک شامل صفر (شاهد)، 25، 50، 75 و 100 میکروگرم در هر میلی­لیتر منی رقیق شده را دریافت کردند. نمونه­های منی مربوط به هر تیمار، در زمان­های صفر، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از  نگه‫داری به‫حالت مایع در دمای 5 درجه­ سانتی­گراد، تحت ارزیابی فراسنجه‌های کیفی اسپرم­ها شامل درصد تحرک، زنده­مانی، سلامت غشای پلاسمایی و ناهنجاری­های مورفولوژیکی قرار گرفتند.

 

جدول 1: اجزا و مقدار رقیق­کننده­ تریس برای منی قوچ

تریس (هیدروکسی متیل آمینومتان) (گرم)                                             

63/3

فروکتوز (گرم)                                                                                  

5/0

اسیدسیتریک (منوهیدرات) (گرم)                                                         

99/1

زرده­ تخم­مرغ (میلی­لیتر)                                                                  

14

آب مقطر (میلی­لیتر)                                                                        

100

 

جهت بررسی درصد تحرک اسپرم، از سیستم کاسا (CASA, Video Test Sperm 2.1, Ltd, Russia) و برای ارزیابی درصد اسپرم­های زنده و ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم­ از رنگ­آمیزی توسط محلول ائوزین و نیگروزین با حل کردن 67/1 گرم ائوزین Y (مرک آلمان، کد محصول 115935)، 10 گرم نیگروزین (مرک آلمان، کد محصول 115924) و 9/2 سیترات سدیم در 100 میلی­لیتر آب مقطر استفاده شد. بدین صورت که بر روی یک لام گرم، قطره­ای از نمونه منی به‫همراه ترکیب رنگ مذکور قرار داده و پس از تهیه گسترش و خشک شدن در مجاورت هوا، درصد اسپرم­های زنده تحت بزرگ‫نمایی ×1000 میکروسکوپ نوری و با استفاده از روغن ایمرسیون تعیین شد. رنگ ائوزین از غشای پلاسمایی اسپرم­های زنده عبور نکرده و سر آن­ها بدون رنگ می­مانند. در حالی‫که ائوزین از غشای اسپرم­های مرده عبور کرده و سر آن­ها صورتی رنگ می­شود (9).

بررسی سلامت غشای پلاسمایی اسپرم­ها توسط آزمون  (Hypo osmotic swelling test) HOSTو با استفاده از محلول هیپواسموتیک انجام شد. واکنش اسپرم­ها به محیط هیپواسمول (شامل 9 گرم در لیتر فروکتوز و 9/4 گرم در لیتر سیترات سدیم) به‫صورت تورم دم یا دم پیچ خورده است. در این‫حالت اسپرم­هایی که غشای پلاسمایی سالمی دارند، به محلول واکنش نشان می­دهند ولی اسپرم­های ناسالم بدون واکنش باقی می­مانند. برای این منظور، 10 میکرولیتر نمونه منی با 100 میکرولیتر محیط هیپواسموتیک مخلوط و به‫مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. پس از تهیه گسترش بر روی لام، با استفاده از میکروسکوپ نوری تحت بزرگنمایی ×400 مورد بررسی قرار گرفت (10).

داده­های حاصل از این تحقیق، در قالب طرح کامل تصادفی با استفاده از برنامه­ نرم افزاری SPSS (ویرایش 20) مورد آنالیز قرار گرفت. برای بررسی کیفیت اسپرم در هر کدام از زمان­های مورد مطالعه، از تحلیل واریانس یک‫طرفه                      (One wayANOVA) و برای مقایسه میانگین­ها، از آزمون مقایسه­ای چند دامنه­ای دانکن استفاده شد.

مدل آماری طرح به‫صورت زیر می­باشد:

 

Yij: مشاهدات مربوط به صفات

:  میانگین کل مشاهدات

Ti: اثر تیمار

Eij : اثر خطا

3- نتایج

   نتایج تاثیر افزودن سطوح مختلف عصاره گیاه میخک به منی قوچ عربی بر درصد تحرک اسپرم­ها در جدول 2 ارائه شده است. در زمان صفر (بلافاصله پس از اسپرم­گیری و افزودن عصاره)، تحرک اسپرم­ها تحت تاثیر تیمارهای آزمایشی قرار نگرفتند. در حالی‫که با افزایش مدت  نگه‫داری منی، تیمارهای 25 و 50 میکروگرم در میلی­لیتر عصاره سبب بهبود معنی­دار تحرک اسپرم­ها شدند (05/0 >P). تیمارهای آزمایشی تاثیر معنی­داری بر درصد زنده­مانی اسپرم در زمان صفر نداشتند. این در حالی است که 24 ساعت پس از  نگه‫داری منی، سطح 100 میکروگرم در میلی­لیتر عصاره میخک کمترین زنده­مانی اسپرم را داشت. (05/0 >P). با گذشت مدت ذخیره اسپرم تا رسیدن به زمان 96 ساعت، بیشترین درصد زنده­مانی اسپرم­ها در سطوح 25 و 50 میکروگرم در میلی­لیتر عصاره میخک و کمترین آن مربوط به شاهد و غلظت 100 میکروگرم در میلی­لیتر عصاره بود (05/0>P)  (جدول 3).

 

جدول 2: تاثیر غلظت­های مختلف عصاره میخک بر درصد تحرک اسپرم قوچ عربی طی  نگه‫داری منی به حالت مایع

غلظت­های عصاره

(میکروگرم در میلی­لیتر)

زمان ذخیره­سازی (ساعت)

0

24

48

72

96

0

88/86

a73/69

ab65/50

b18/19

b70/11

25

80/86

a25/81

a50/72

a75/58

a00/30

50

33/80

a 50/72

a 75/68

a 25/62

a 25/36

75

50/72

b75/38

b25/31

b25/27

b00/15

100

67/69

b88/37

b00/25

b00/13

b50/6

SEM

34/3

71/5

55/5

14/5

09/3

P-value

154/0

027/0

017/0

001/0

004/0

SEM: خطای استاندارد میانگین­­ها؛ a-b تفاوت میانگین­ها با حروف متفاوت در هر ستون معنی­دار است (05/0>P)

 

جدول 3: تاثیر غلظت­های مختلف عصاره میخک بر درصد زنده­مانی اسپرم قوچ عربی طی  نگه‫داری منی به حالت مایع

غلظت­های عصاره

(میکروگرم در میلی­لیتر)

زمان ذخیره­سازی (ساعت)

0

24

48

72

96

0

75/89

a50/80

bc75/58

bc75/33

c75/16

25

33/88

a50/87

a25/81

a25/66

a25/51

50

00/82

a 25/83

ab 25/76

a 00/67

a 50/50

75

00/75

ab25/71

c75/48

b50/45

b00/40

100

33/74

b75/58

c25/41

c00/30

c25/23

SEM

31/3

18/3

34/4

05/4

48/3

P-value

187/0

016/0

003/0

003/0

001/0

SEM: خطای استاندارد میانگین­­ها؛ a-c تفاوت میانگین­ها با حروف متفاوت در هر ستون معنی­دار است (05/0>P)

در جدول 4، نتایج افزودن عصاره میخک به منی بر درصد اسپرم­های با غشای پلاسمایی سالم مشاهده می­شود. در زمان صفر ارزیابی، اختلاف معنی­داری بین تیمارهای آزمایشی یافت نشد. در زمان 24 ساعت، کمترین درصد سلامت غشای پلاسمایی اسپرم متعلق به بالاترین سطح عصاره میخک (100 میکروگرم در میلی­­لیتر) بود. 48 ساعت پس از نگه‫داری منی، تیمارهای 25 و 50 میکروگرم در میلی­لیتر عصاره موجب بهبود سلامت غشای پلاسمایی اسپرم­ها در مقایسه با شاهد و دیگر سطوح عصاره شدند (05/0 >p). در زمان­های 72 و 96 ساعت از  نگه‫داری منی، بیشترین و کمترین درصد اسپرم­های با سلامت غشای پلاسمایی سالم به ترتیب مربوط به غلظت 50 میکروگرم در میلی­لیتر عصاره میخک و شاهد بودند (05/0 >P).  در هیچ‫کدام از زمان­های مورد مطالعه، سطوح بکار رفته عصاره میخک تاثیر معنی­داری بر درصد ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم­ها نداشتند (جدول 5).

 

جدول 4: تاثیر غلظت­های مختلف عصاره میخک بر درصد سلامت غشای پلاسمایی اسپرم قوچ عربی طی  نگه‫داری منی به حالت مایع

غلظت­های عصاره

(میکروگرم در میلی­لیتر)

زمان ذخیره­سازی (ساعت)

0

24

48

72

96

0

00/77

               a25/64

              b50/52

c75/28

c25/14

25

50/77

a00/70

a75/63

ab75/48

ab25/41

50

25/76

a 25/71

a 25/66

a 50/57

a 50/47

75

75/73

a50/69

bc75/43

bc25/41

b75/33

100

50/72

b75/53

c50/40

c00/29

c00/20

SEM

97/0

83/1

75/2

01/3

19/3

P-value

39/0

003/0

001/0

001/0

0001/0

SEM: خطای استاندارد میانگین­­ها؛ a-c تفاوت میانگین­ها با حروف متفاوت در هر ستون معنی­دار است (05/0>P)

جدول 5: تاثیر غلظت­های مختلف عصاره میخک بر درصد ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم قوچ عربی طی  نگه‫داری منی به حالت مایع

غلظت­های عصاره

(میکروگرم در میلی­لیتر)

زمان ذخیره­سازی (ساعت)

0

24

48

72

96

0

00/8

75/11

00/18

75/20

00/25

25

50/6

00/11

25/14

50/20

75/24

50

75/7

75/11

75/16

50/21

25/25

75

25/6

00/9

75/13

00/20

50/23

100

25/7

50/10

25/14

75/18

50/22

SEM

44/0

58/0

73/0

24/1

47/1

P-value

52/0

59/0

24/0

071/0

106/0

SEM: خطای استاندارد میانگین­­ها 05/0 >p.

4- بحث

   جوانه میخک به‫عنوان یک آنتی­اکسیدانت گیاهی موثر حاوی ترکیبات فنلی (عمدتا اوژنول) شناخته شده است. در یک سنجش آزمایشگاهی، نشان داده شد که اوژنول باعث کاهش پراکسیداسیون و افزایش گلوتاتیون و ال-آسکوربات در سلول­های موش می­شود (11).

پژوهش حاضر نشان داد که افزودن سطوح کمتر عصاره میخک یعنی 25 و 50 میکروگرم در هر میلی­لیتر منی رقیق شده قوچ عربی، سبب بهبود تحرک و زنده­مانی اسپرم­ها پس از  نگه‫داری منی تحت دمای 5 درجه سانتی­گراد شد. اثـرات آنتی‫اکسیدانتی ترکیبات پلی­فنولیـک گیاهـان که نقش مهمی در محافظت از ساختار لیپیدی اسپرم­ها و در نتیجه حفظ تحرک و حیات اسپرم­ها دارد، بـه‫طـور عمده به خاصیت دهندگی الکترون آن­ها مربوط بـوده و می­توانند با انتقال گـروه هیدروکسـیل از سـاختمان خــود بــه ترکیــب لیپیــدها، آنهــا را از فرآینــد پراکسیداســیون حفــظ نماینــد. همچنــین ایــن ترکیبات با داشتن خصوصیت شلاته کنندگی یون­های فلــزی و مهــار فعالیــت آنــزیم­هــای اکســیداتیو و هیــدرولیتیک مــی­تواننــد فعالیــت جــذب یــا مهــار رادیکال­های آزاد را از خود نشان دهد (12).

تحقیقات نشان داده­اند که گیاه میخک نه تنها برای درمان اختلالات جنسی در نرها موثر است، بلکه بر فیزیولوژی عمل‫کردی سیستم تولیدمثلی از جمله تحرک اسپرم نیز تاثیرگذار می­باشد (14 و 13). با تزریق عصاره میخک به بیضه موش رت، تحرک اسپرم افزایش یافت (15). در مطالعه دیگر، اثرات تولیدمثلی جوانه میخک به‫صورت مصرف خوراکی با مقادیر 15، 30 و 60 میلی­گرم در کیلوگرم وزن بدن در موش­های رت بررسی شد. نتایج وابسته به دوز بود، به طوری که سطح پایین آن (15 میلی‫گرم در کیلوگرم) سبب افزایش تحرک اسپرم شده و فعالیت ترشحی اپی‫دیدیم و غدد وزیکولی را افزایش داد. این در حالی است که سطوح دیگر آن اثر برعکس داشته و با کاهش عمل‫کرد تولیدمثلی همراه بودند (13). در تحقیقی، با افزودن عصاره گیاه میخک در سطوح 35، 75 و 115 میکروگرم در میلی­لیتر منی قوچ­های لری بختیاری و انجماد منی، تحرک پیشرونده و سایر فراسنجه­های حرکتی اسپرم متعاقب یخ­گشایی، در سطوح 35 و 75 میکروگرم این عصاره بهبود یافتند (11). با این‫حال، با استفاده از عصاره میخک در موش نر، اثرات نامطلوب تولیدمثلی نیز گزارش شده است. در این مطالعه، موش­های نر تحت تغذیه با سطوح 250، 500 و 1000 میلی­گرم عصاره میخک به‫ازای هر کیلوگرم وزن بدن در هر روز به‫مدت 34 قرار گرفتند. نتایج نشان داد که در حیوانات تحت درمان با دوز بالای عصاره، کاهش چشمگیر در غلظت و تحرک اسپرم و نیز کاهش غلظت تستوسترون خون مشاهده شد و در گروه­های درمانی در مقایسه با گروه شاهد، لوله­های منی­ساز حاوی جمعیت کمتری از اسپرم، احتمالا به‫دلیل کاهش فعالیت اسپرم­زایی بودند (16). در پژوهش گل اندام و همکاران (17). با موضوع بررسی تاثیر برون­تنی سطوح مختلف عصاره نعنای فلفلی (خاصیت آنتی­اکسیدانتی مشابه با میخک به لحاظ دارا بودن فلاوونوئیدها) بر فراسنجه­های کیفی منی قوچ عربی مشخص شد که نه تنها سطوح به‫کار رفته این عصاره سبب بهبود فراسنجه­های کیفی اسپرم نشدند، بلکه اثر مخربی هم داشتند. لذا، علی­رغم این‫که امروزه استفاده از آنتی­اکسیدنت‌ها در محیط رقیق‌کننده‌ اسپرم جهت کاهش اثرات فرآیند خنک­سازی منی مورد استفاده قرار می‌گیرد (18)، اما کیفیت منی بسته به نوع و غلظت به‫کار رفته این ترکیبات آنتی­اکسیدانتی می­تواند در جهت مثبت یا حتی منفی سوق پیدا کند. با افزودن غلظت­های مختلف عصاره گیاه اسطوخودوس به منی خروس که مشابه با میخک حاوی ترکیبات فنلی است، غلظت 10 میکروگرم در میلی­لیتر آن، بهترین خاصیت حفاظتی و زنده­مانی برای اسپرم­ها داشت (19). در جمع­بندی این بخش از نتایج تحقیق حاضر می­توان بیان نمود که سطوح کمتر عصاره میخک احتمالا از طریق اثر آنتی­اکسیدانتی توانست سبب حفظ قدرت تحرک و زنده­مانی اسپرم­های قوچ عربی طی مدت سردسازی منی شود.     

در این مطالعه، سطوح 25 و 50 میکروگرم عصاره میخک سبب بهبود سلامت غشای پلاسمایی اسپرم­ها پس از سپری شدن 48 ساعت از  نگه‫داری منی به‫حالت مایع شد. در حالی­که ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم­ها تحت تاثیر تیمارهای آزمایشی قرار نگرفتند. ترکیبات فنولی به‫خصوص فلاوونوئیدها، با پوشش دادن لیپیدها، روند پراکسیداسیون لیپیدی را تغییر داده و متوقف می­کند و نیز سبب کاهش سیالیت غشای سلول می­شود. لذا با محدود کردن پراکسیداسیون فسفولیپیدها، از غشاهای سلولی محافظت می­کند (20). غشای پلاسمایی اسپرم در طی  نگه‫داری منی و تحت شرایط دمایی سرد دچار تنش می­شود که ممکن است سبب تغییر در عدم تقارن دو لایه فسفولیپیدی غشاء شده و وضعیت عملکردی غشای اسپرم را مختل کند (21).   در تحقیقی با استفاده از سطوح مختلف عصاره دانه خرنوب حاوی فلاوونوئیدها بر فراسنجه­های کیفی اسپرم قوچ فراهانی بعد از فرایند انجماد و یخ­گشایی، نتایج نشان داد که افزودن 05/0 میلی­لیتر عصاره به رقیق کننده منی سبب بهبود سلامت غشای پلاسمایی و مورفولوژی اسپرم­ها نسبت به شاهد شد (22). در ارزیابی اثرات برون­تنی روغن‌های اساسی میخک در غلظت­های 10، 15 و 20 میکروگرم در میلی­لیتر بر شاخص­های کیفی اسپرم اپی‫دیدیم گاو طی 1 و 6 ساعت از انکوباسیون نمونه­های منی، سلامت غشای پلاسمایی، ناهنجاری­های مورفولوژیکی و نیز تحرک اسپرم­ها تحت تاثیر تیمارهای آزمایشی قرار نگرفتند. با این‫حال، اسپرم­های انکوبه شده همراه با 15 میکروگرم در میلی­لیتر روغن‌های اسانسی میخک در مدت یک ساعت، به‫طور معنی­داری گونه­های فعال اکسیژن را با داشتن خاصیت آنتی­اکسیدانتی در مقایسه با دیگر تیمارهای آزمایشی کاهش داد (23). در تحقیقی، استفاده از عصاره رزماری با خاصیت آنتی­اکسیدانتی شبیه به میخک (حاوی ترکیبات فنلی) در بز سبب بهبود درصد سلامت غشای پلاسمایی و کاهش میزان ناهنجاری­­های مورفولوژیکی اسپرم شد (24). پژوهش دیگر با هدف بررسی اثر تغذیه­ای پودر برگ گیاه مورد که مشابه با میخک دارای ماده موثره کوئرستین با خاصیت آنتی­اکسیدانتی است بر عملکرد تولیدمثلی قوچ عربی نشان داد که فراسنجه­های کیفی اسپرم از جمله سلامت غشای پلاسمایی اسپرم­ها به‫صورت وابسته به دوز این گیاه بهبود یافتند (25). در بررسی برون­تنی اثر آنتی­اکسیدانتی عصاره مرزه (دارای کارواکرول و تیمول مشابه با میخک) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم پس از فرایند انجماد- یخ­گشایی در سطوح 2 تا 20 میلی­لیتر بر دسی­لیتر منی، مشخص شد که غلظت کمتر این عصاره (4 میلی­لیتر در دسی­لیتر) بهترین اثر حفاظتی بر سلامت اسپرم یخ­گشایی شده داشت (26). همچنین، با افزودن سطوح 2 تا 12 میلی­لیتر بر دسی­لیتر عصاره درمنه (حاوی تیمول مشابه با میخک) به منی قوچ مغانی، غلظت 4 میلی­لیتر بر دسی­لیتر عصاره سبب بهبود ساختار غشای پلاسمایی اسپرم و زنده­مانی آن شد (27). این یافته­ها در خصوص اثر آنتی­اکسیدانتی گیاهان دارویی بر بهبود عملکرد اسپرم حیوانات با تاکید بر غلظت­های کم‫تر و موثر آن موافق با نتایج مطالعه حاضر با استفاده از عصاره میخک به‫صورت برون­تنی و تحت شرایط  نگه‫داری منی به‫صورت مایع در قوچ عربی می­باشند. در پژوهشی با تجویز درون صفاقی سطوح مختلف عصاره هیدروالکلی گیاه چویر حاوی ترکیبات فنلی با غلظت­های 100، 200 و 400 میلی­گرم در کیلوگرم وزن بدن در موش­های صحرایی نر، بیشترین دوز عصاره سبب بهبود مورفولوژی، ساختار غشای پلاسمایی و زنده­مانی و نیز تحرک اسپرم­ها در مقایسه با شاهد شد (28). همچنین، با افزودن سطوح 100 و 200 میکرولیتر در میلی­لیتر عصاره اتانولی پونه حاوی منتول و فلاوونوئیدهای مشابه با میخک به منی رقیق شده قوچ بلوچی و انجماد منی، سلامت غشای پلاسمایی و مورفولوژی اسپرم­ها در بین تیمارهای آزمایشی تفاوت معنی­داری با شاهد نداشتند (29). در مطالعه حاضر، بیشترین غلظت عصاره میخک به‫طور معنی­داری سبب کاهش میزان فراسنجه­های کیفی اسپرم در مقایسه با سطوح پایین­تر آن شد. شاید به این دلیل باشد که غلظت بالای آنتی­اکسیدانت‫ها ممکن است بر سیالیت غشا  اثر گذاشته و سبب به‫هم خوردن تعادل غشایی رادیکال­های آزاد شود (1). همچنین ممکن است به علت تغییر فشار اسمزی، pH و بهم خوردن تعادل ترکیبات رقیق کننده باشد که در طی فرایند ذخیره­سازی اسپرم بسیار حائز اهمیت بوده و در نتیجه حیات اسپرم را به مخاطره می­اندازد (30). در مجموع، سطوح کمتر عصاره میخک در پژوهش حاضر توانست درمقابل تنش­های حاصل از  نگه‫داری و سردسازی منی بر غشای پلاسمایی اسپرم قوچ عربی اثر محافظتی داشته باشد.

5- نتیجه­گیری

به‫طور کلی در مطالعه حاضر، تاثیر برون­تنی عصاره جوانه میخک با دارا بودن خاصیت آنتی­اکسیدانتی بر حفظ کیفیت منی قوچ عربی به‫صورت وابسته به دوز مشاهده شد. به‫طوری‫که افزودن غلظت 25 میکروگرم در میلی­لیتر عصاره میخک به رقیق کننده منی قوچ عربی سبب بهبود فراسنجه­های کیفی اسپرم­ و توان زنده­مانی حیات آن­ها طی مدت نگه‫داری نمونه­های منی به‫صورت مایع در دمای یخچال شد.

6- تشکر و قدردانی

پژوهش حاضر مربوط به طرح مصوب پژوهشی در دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان می­باشد که بدین‫وسیله تشکر و قدردانی می­شود.

-

  1. Shafigh H, Shakeri M, Zeinoaldini S, Kohram H, et al. Improving sperm cryopreservation of rooster by using rosemary alcoholic essential oil. J Anim Prod (J Agri). 2016; 18(3): 615-624.
  2. Uysal O, Bucak MN. Effects of oxidized glutathione, bovine serum albumin, cysteine and lycopene on the quality of frozen-thawed ram semen. Acta Vet Brno. 2007; 76(3): 383-390.
  3. Leboeuf B, Guillouet Ph, Batellier F, Bernelas D, et al. Effect of native phosphocaseinate on the in vitro preservation of fresh semen. Theriogenol. 2003; 60(5): 867-877.
  4. Long JA, Kramer M. Effect of vitamin E on lipid peroxidation and fertility after artificial insemination with liquid-stored turkey semen. Poult Sci. 2003; 82(11): 1802-1807.
  5. Khoshdouni F, Khoshdouni Z. Chemical identification of clove (Syzygium aromaticum) extract and essential oil. Sci Res Applied Biol. 2017; 7(3): 1-7.
  6. Mishra RK, Singh SK. Reproductive effects of lipid soluble components of Syzygium aromaticum flower bud in male mice. J Ayurveda Integr Med. 2013; 4: 94-98.
  7. Moghimian M, Abtahi-Evari SH, Shokoohi M, Amiri M, et al. Effect of Syzygium aromaticum (clove) extract on seminiferous tubules and oxidative stress after testicular torsion in adult rats. Physiol Pharmacol. 2017; 21: 343-350.
  8. Bansal AK, Bilaspuri GS. Impacts of oxidative stress and antioxidants on semen functions. Vet Med Int. 2011; 1-7. doi:10.4061/2011/686137.
  9. Uysal O, Bucak MN. The role of different trehalose concentrations and cooling rates in freezing of ram semen. Ankara Univ Vet Fak Derg. 2009; 56: 99-103.
  10. Evans G, Maxwell WMC. Handling and examination semen. In: Maxwell WMC, editor. Salamon’s artificial insemination of sheep and goat. Sydney: Butterworths. 1987; 93-106.
  11. Baghshahi H, Riasi A, Mahdavi AH, Shirazi A. Antioxidant effects of clove bud (Syzygium aromaticum) extract used with different extenders on ram spermatozoa during cryopreservation. Cryobiol. 2014; 69: 482-487.
  12. Alizadeh K, Moslemipour F, Bahri Binabaj F, Mojtahedin A. Study of effect of adding horsmint ethanol extract and cysteine into extender on fertility features of frozen Baluchi ram semen after thawing. J Rumin Res. 2020; 8(1): 49-62.
  13. Mishra RK, Singh SK. Reproductive effects of lipid soluble components of syzygium aromaticum flower bud in male mice. J Ayurveda Integrat Med. 2013; 4: 94-98.
  14. Choi D, Roh HS, Kang DW, Lee JS. The potential regressive role of syzygium aromaticum on the reproduction of male golden hamsters. Develop Reprod. 2014; 18: 57-64.
  15. Memudu AE, Odetola AA, Adeleye OO, Ehebha SE. Histological, hormonal and semen quality assessment following ingestion of clove buds (Syzgium aromaticum) on the testes of adult male sprague dawley rats. J Anat Sci. 2021; 12(1):1-11.
  16. Dehghani F, Heshmatpour A, Panjehshahin MR, Talaei-Khozani T. Oxic effects of water/alcoholic extract of Syzygium aromaticum on sperm quality, sex hormones and reproductive tissues in male mouse. IUFS J Biol. 2012; 71(2): 95-102.
  17. Golandam Sh, Tabatabaei Vakili S, Mirzadeh Kh. In Vitro effect of different levels ‎of peppermint (Mentha piperital) ‎extract on semen quality ‎parameters in Arabi ram. Exper Anim Biol. 2021; 10(1): 71-79.
  18. Shariatzadeh SMA, Mohammadi M. Protective role of green tea (Camellia sinensis) hydroalcholic extract on sperm parameters and testicular tissue in NMRI mice exposed to sodium arsenite. J Birjand Uni Med Sci. 2015; 21(4): 432-443.
  19. Tabatabaei Vakili S, Aghaei A, Kazemizadeh A. Effect of different concentrations of Lavandula angustifolia extract on semen quality of rooster during storage in liquid condition. Res Anim Prod. 2020; 11 (27): 74-81.
  20. Daghighkia H, Sadeghi Sadegh Abad F, Ebrahimi M, Samadian F. Comparative effect of different concentrations of hydro-ethanolic extract of chamomile on freeze-thawn semen quality of rams. J Vet Clin Pathol. 2017; 11(1): 13-23.
  21. Bustani GS, Baiee FH. Semen extenders: An evaluative overview of preservative mechanisms of semen and semen extenders. Vet World. 2021; 14(5): 1220-1233.
  22. Asgari M, Khodaei Motlagh M, Kazemi Bonchenari M, Vahedi V. Antioxidant effect of carob seed extract (Ceratonia siliqua L) on quality parameters Farahani ram sperm after freeze-thawing. J Cell Tissue. 2020; 11(1): 1-12.
  23. Santos MVDO, da Silva AM, Praxedes ÉA, Borges AA, et al. Antioxidant effects of the essential oil of Syzygium aromaticum on bovine epididymal spermatozoa. Andrologia. 2019; 51(11): 1-8.
  24. Zanganeh Z, Zhandi M, Zare Shahneh A, Najafi A, et al. Does rosemary aqueous extract improve buck semen cryopreservation? Small Rumin Res. 2013; 114(1): 120-125.
  25. Tabatabaei Vakili S, Mohaysenzade E, Mohammadabadi T, Zarei M. Effect of dietary Myrtus communis leaf powder on quantitative and qualitative characteristics of sperm and antioxidant function of semen and blood in Arabi ram. Vet Res Biol Prod. 2021; 33(4): 102-111.
  26. Daghighkia H,  Shahbaz Zadeh R, Ashrafi I. Antioxidant effect of Macrantha satureja extraction on microscopic and biochemical parameters of bull sperm after freeze -thawing process. Anim Sci J. 2015; 28: 101-112.
  27. Ahadi H, Karimi A,  Besharati M, Vahedi V, et al. Antioxidant effect of Artemisia (Artemisia incana) extract on the quality of frozen-thawed semen of Moghani ram. J Anim Environ. 2021; 13(2): 87-94.
  28. Bohlouli S, Rostaminasab G. Effect of hydroalcoholic extract of Ferollago angulata on sperm and testosterone indices in male rats. J Ilam Uni Med Sci. 2019; 27(3): 47-55.
  29. Alizadeh K, Moslemipour F, Bahri Binabaj F, Mojtahedin A. Study of effect of adding horsmint ethanol extract and cysteine into extender on fertility features of frozen Baluchi ram semen after thawing. J Rumin Res. 2020; 8(1): 49-62.
  30. Gharagozloo M, Amirghofran Z. Effects of silymarin on the spontaneous proliferation and cell cycle of human peripheral blood leukemia T cells. J Cancer Res Clin Oncol. 2007; 133(8): 525-532.