فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2 گروه زیست شناسی و مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران

چکیده

هدف: ناباروری یک بحران زندگی است که بیماران را در سراسر جهان تحت تاثیر قرار می دهد، ناباروری به عنوان عدم موفقیت در بارداری پس از 12 ماه فعالیت جنسی تعریف می شود که 15 تا 17 درصد از زوج ها را در جهان تحت تأثیر قرار می دهد و حدود 50 درصد از آنها به عوامل ناباروری زنان مربوط می شود. فعال کردن روند تقسیم میوز در اووسیت و بلوغ آن از اهداف مهم درمانی محققین علوم ناباروری بوده است. امروزه القا رشد و تکامل اووسیت در خارج از بدن یکی از روش هایی است که در فنّاوری کمکی تولیدمثل به کار گرفته می شود. مغز استخوان اندام پیچیده ای است که در آن دودمان های مختلف سلول های خونساز و استرومایی از خون سازی حمایت می کنند. وزیکول های خارج سلولی (EVs) که دارای اندازه 20-100 نانومتر می باشند توسط انواع سلول های مختلف در محیط های کشت آزاد می شوند. علاوه بر پروتئین‌ها، اگزوزوم‌ها با مجموعه‌ای از سیتوکین‌ها، قایق‌های لیپیدی خاص مانند فسفوگلیسرید، کلسترول، سرامید، زنجیره‌های چربی-آسیل و همچنین mRNAها، miRNAها، RNAهای غیر کدکننده، tRNAها، rRNAها و به ندرت DNA غنی می‌شوند هدف از انجام این پژوهش تجربی بررسی تاثیر اگزوزوم های مشتق از سلول های بنیادی مغز استخوان موش کوچک آزمایشگاهی بر بلوغ فولیکول های پره آنترال می باشد.             مواد و روشها: اگزوزوم ها از سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش کوچک آزمایشگاهی به روش فلاشینگ جداسازی و کشت داده شدند. شناسایی سلول‌های بنیادی با روش فلوسایتومتری انجام و  جداسازی و خالص سازی اگزوزوم ها به وسیله الترا سانتریفیوژ انجام شد، شناسایی اگزوزوم نیز توسط میکروسکوپ نیروی اتمی(AFM) بررسی گردید. اثرات اگزوزوم ها  بر زیستایی فولیکول ها  با روش MTT مورد سنجش قرار گرفت و همپنین  پارامترهای تکوینی از جمله قطر و تشکیل حفره آنتروم در فولیکول ها بررسی و از فولیکول‌ها در روز های صفر، دوم، سوم و چهارم کشت با بزرگنمایی 20 و با میکروسکوپ معکوس عکس برداری گردید و قطر فولیکول ها توسط نرم افزار Image J بر حسب میکرومتر اندازه گیری شد. بیان ژنهای GDF-9 و BMP-15 و BMP-7 به عنوان ژن های دخیل در رشد و بلوغ فولیکولها با استفاده از روش Real Time-PCR بررسی شد. جهت آنالیز داده های این پژوهش از نرم افزار GraphPad Prism 8 و تست آماری one way Anova استفاده شد. نتایج : ارزیابی زیستایی فولیکول‫ها نشان داد در مقایسه با گروه شاهد، فولیکول‫های تحت تیمار با اگزوزوم 25 و 50 و100 میکروگرم بر میلی لیتر افزایش زنده ماندن را نشان می‫دهند، همچنین میزان تشکیل آنتروم افزایش معنی دار در  گروه با غلظت 100 میکرو گرم بر میلی لیتر در سطح معنا داری(p<0.01**) نسبت به گروه کنترل نشان داد. قطر فولیکول ها با افزایش غلظت اگزوزوم ها نسبت به گروه کنترل افزایش نشان داد. ژن های GDF-9و BPM-15 و BMP-7 نیز در گروه های تیماری افزایش بیان داشته است.. نتیجه گیری: با توجه به یافته های این پژوهش تجربی می توان می‌توان بیان نمود که اگزوزوم های مشتق شده از سلول های بنیادی مغز استخوان موش کوچک آزمایشگاهی دارای اثر مثبت بر زیستایی و بلوغ و همچنین رشد فولیکول های تخمدانی می باشند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Effect of exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells on maturation of preantral follicles of immature NMRI mice

نویسندگان [English]

  • S Farrokhyar 1
  • J Baharara 2
  • A Eidi 1
  • N Hayati Rudbari 1

1 Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran

2 Department of Biology & Research Center for Animal Development Applied Biology, Mashhad

چکیده [English]

Aim: Infertility is a life crisis that affects patients worldwide. Infertility is defined as failure to conceive after 12 months of sexual activity, affecting 15-17% of couples worldwide. and about 50% of them are related to the factors of female infertility. Activating the process of meiosis in the oocyte and its maturation has been one of the important therapeutic goals of infertility researchers. Today, inducing oocyte growth and development outside the body is one of the methods used in assisted reproduction technology. Bone marrow is a complex organ in which different lineages of hematopoietic and stromal cells support hematopoiesis. Extracellular vesicles (EVs) with a size of 20-100 nm are released by different types of cells in culture media. In addition to proteins, exosomes are enriched with an array of cytokines, specific lipid rafts such as phosphoglyceride, cholesterol, ceramide, fatty-acyl chains, as well as mRNAs, miRNAs, non-coding RNAs, tRNAs, rRNAs, and rarely DNA.
  The purpose of this experimental research is to investigate the effect of exosomes derived from the bone marrow stem cells of small laboratory mice on the maturation of preantral follicles. Material and methods: Exosomes were isolated and cultured from the mesenchymal stem cells of the bone marrow of small laboratory mice by the flushing method. Identification of stem cells was done by flow cytometry method and separation and purification of exosomes was done by ultracentrifuge, identification of exosome was also checked by atomic force microscope (AFM). The effects of exosomes on the viability of follicles were measured by the MTT method, and developmental parameters such as the diameter and the formation of the antrum cavity in the follicles were examined and the follicles were examined on days 0, 2, 3 and 4 of culture with 20 magnification and inverted microscope. Photographs were taken and the diameter of the follicles was measured in micrometers by Image J software. The expression of GDF-9, BMP-15 and BMP-7 genes as genes involved in the growth and maturation of follicles was investigated using Real Time-PCR method. GraphPad Prism 8 software and one way Anova statistical test were used to analyze the data of this research.
Results: The evaluation of the viability of the follicles showed that compared to the control group, the follicles treated with exosome 25, 50 and 100 micrograms/ml showed an increase in viability, as well as the rate of antrum formation increased significantly in the group with the concentration 100 μg/ml showed a significant level (p<0.01**) compared to the control group. The diameter of the follicles increased with increasing the concentration of exosomes compared to the control group. GDF-9, BPM-15 and BMP-7 genes also increased in the treatment groups. Conclusion: According to the findings of this experimental research, it can be stated that exosomes derived from bone marrow stem cells Small laboratory mice have a positive effect on survival and maturity, as well as the growth of ovarian follicles.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bone marrow stem cells Exosome
  • Folliculogenesis enes
  • Preantral follicle
  • مقدمه

ناباروری اغلب یک بیماری خاموش است ناباروری یک بحران زندگی است که بیماران را در سراسر جهان تحت تاثیر قرار می دهد (1). ناباروری به‫عنوان عدم موفقیت در بارداری پس از 12 ماه فعالیت جنسی تعریف می‫شود که 15 تا 17 درصد از زوج‫ها را در جهان تحت تاثیر قرار می‫دهد و حدود 50 درصد از آن‫ها به عوامل ناباروری زنان مربوط می‫شود (2). فعال کردن روند تقسیم میوز در اووسیت و بلوغ آن از اهداف مهم درمانی محققین علوم ناباروری بوده است  بلوغ آزمایشگاهی اووسیت‫ها (In Vitro Maturation, IVM)  برای اولین بار در سال 1935 توسط Pincus and Enzman مطرح شد (3). امروزه القای رشد و تکامل اووسیت در خارج از بدن یکی از روش‫هایی است که در فناوری کمکی تولیدمثل به‫کار گرفته می شود (3). مغز استخوان اندام پیچیده‫ای است که در آن دودمان‫های مختلف سلول‫های خونساز و استرومایی از خون سازی حمایت می‫کنند (4). سلول‌های بنیادی مزانشیمی (یا استرومایی) (MSCs) زیرجمعیتی از سلول‌های تمایز نیافته را با ویژگی‌های بارز خود نوسازی و تمایز نشان می‌دهند که این جمعیت برای اولین بار در دهه 1960 به‫عنوان سلول های استخوان ساز توصیف شد (4). یکی از گسترده‌ترین موارد بررسی شده با خواص و پتانسیل کاربرد بالینی که هنوز ناشناخته است تعریف مناسب MSCها می‫باشد(5). سلول‌های بنیادی مزانشیمی در ابتدا به‫عنوان زیر گروهی از سلول‌های دارای پتانسیل استخوان‌زایی شناسایی شدند، سپس به‫عنوان بازیگران اساسی در فرآیند خون سازی معرفی شدند (6). مطالعات بر روی خواص بیولوژیکی و کاربردهای درمانی سلول‫های بنیادی مزانشیمی در 5 سال گذشته به‫طور گسترده انجام شده است، از جمله تلاش‫هایی برای تعریف این جمعیت سلولی با استفاده از نشانگرهای مناسب و استفاده گسترده از مدل‫های حیوانی. امروزه، فوریت بهینه سازی پروتکل‫ها برای کاربردهای بالینی از طریق تلاش مشترک پزشکان و دانشمندان آزمایشگاهی وجود دارد.

وزیکول‫های خارج سلولی (Extracellular vesicles) (یک اصطلاح کلی برای انواع مختلف اجزای غشایی در قطر 20 تا1000 نانومتر است که توسط انواع سلول‫های مختلف در محیط‫های کشت آزاد شده شامل سلول‫های بنیادی، لنفوسیت‫های B و T، سلول‫های دندریتیک، ماست سل‫ها، سلول‫های چربی، سلول‫های عصبی، پلاکت‫ها، سلول‫های اندوتلیال و اپی‫تلیال (7). علاوه بر این، EV ها از بسیاری از مایعات بدن مانند ادرار، سرم، مایع آمنیوتیک، بزاق، مایع مغزی نخاعی، شیر مادر و ترشحات بینی جدا شده اند (8). اگزوزوم‫ها دارای چگالی شناور 10/1-21/1 گرم در میلی‫لیتر در یک گرادیان ساکارز هستند که می‫تواند با سانتریفیوژ با نیروی  g × 100.000 رسوب کند (8). علاوه بر پروتئین‌ها، اگزوزوم‌ها با مجموعه‌ای از سیتوکین‌ها، قایق‌های لیپیدی خاص مانند فسفوگلیسرید، کلسترول، سرامید، زنجیره‌های چربی-آسیل و همچنین mRNAها، miRNAها، RNAهای غیر کدکننده، tRNAها، rRNAها و به ندرت DNA غنی می‌شوند (9). سلول‫های بنیادی مزانشیمی ترمیم بافت های آسیب دیده و همچنین تعدیل پاسخ‫های ایمنی را بهبود می‫بخشد. این اثرات سلول‫های بنیادی مزانشیمی به‫طور گسترده توسط تمایز سلول‫های بنیادی مزانشیمی، سیگنال‫های پاراکرین و چندین مولکول ترشح شده مانند میکرووزیکول‫ها انجام می‫شود (10).

در مطالعه‫ی حاضر اثر اگزوزوم‫های مشتق شده از سلول‫های بنیادی بر بلوغ فولیکول‫های تخمدان موش کوچک آزمایشگاهی بررسی شده است.

  • مواد و روش‫ها

 تهیه اگزوزومها جهت تیمار فولیکولها: برای اجرای این پژوهش تجربی-آزمایشگاهی (که بخشی از طرح با کد مصوب اخلاق به شماره IR.IAU.MSHD.REC.1398.194 می‫باشد) ابتدا سلول‫های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش کوچک آزمایشگاهی به‫روش فلاشینگ جداسازی و کشت داده شدند. شناسایی سلول‌های بنیادی با روش فلوسایتومتری انجام شد (3).  جداسازی و خالص سازی اگزوزوم‫ها به‫وسیله الترا سانتریفیوژ انجام شد، شناسایی اگزوزوم نیز توسط میکروسکوپ نیروی اتمی (Atomic Force Microscope) انجام شد (3).

تعیین غلظت اگزوزومها: به جهت تعیین غلظت اگزوزم‫ها از روش بردفورد استفاده شد. به‫منظور تعیین مقدار اگزوزوم جدا شده، پروتئین آن‫را با استفاده از محلول Bradford و رسم نمودار استاندارد با استفاده ار رقت‫های متوالی شده از پروتئین BSA (Bovine Serum Albumin) با غلظت مشخص تعیین شد (3).

بررسی اثرات اگزوزومها  بر فولیکولها: حیوانات: موش‫های ماده کوچک آزمایشگاهی نژاد NMRI با سن تقریبی 14تا 21 روز از مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی – تکوین جانوری مشهد- ایران تهیه شد.

ابتدا تخمدان‫ها از بدن موش‫ها ی نابالغ نژاد NMRI خارج و پس از مجزا کردن بافت چربی و مزانتر در محیط کشتα – MEM توسط استرئومیکروسکوپ، به‫روش مکانیکی به جداسازی فولیکول‫ها پرداخته شد (11). سپس به‫صورت تصادفی در 4 گروه شامل: گروه کنترل (بدون هیچگونه تیمار در شرایط طبیعی) گروه 1 (گروه‫های تیمار با غلظت 25 میکرولیتر اگزوزوم) گروه 2 (گروه تیمار با غلظت 50 میکرولیتر اگزوزوم) گروه 3 (گروه غلظت 100 میکرولیتر اگزوزوم) تقسیم بندی شدند. فولیکول‫های جدا شده در محیط کشت کامل حاوی محیط کشت α - MEM Bioidea, Iran) )، سرم  جنین گاوی FBS) Jibco Germany, ) و محلول  FSH( Sinal F,Iran )

ITS ( Jibco, Germany) (Insulin-Transferrin-Selenium) ، و آنتی بیوتیک (Paa, Germany)  به‫مدت 12 روز در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‫گراد و 5 درصد 2Co کشت داده شدند (11) و سپس ارزیابی تعداد فولیکول‫های زنده، قطر فولیکول‫ها و حفره آنتروم، و آنالیز سطح بیان ژن‫های BMP15 و GDF9 وbmp7 انجام شد.

بررسی فولیکول ‌های کشت ‌شده: از فولیکول‌ها در روزهای صفر، دوم، سوم و چهارم کشت با بزرگ‫نمایی 20 و با میکروسکوپ معکوس عکس‫برداری شد و قطر فولیکول‫ها توسط نرم افزار Image J بر حسب میکرومتر اندازه‫گیری شد و در نهایت عواملی همچون میزان رشد فولیکول‫ها و درصد بقای فولیکول‫ها مورد بررسی قرار گرفت.

القای تخمک‌گذاری: در روز دوازدهم کشت به‌منظور القای تخمک‌گذاری، محیط کشت پایه با محیط کشت حاوی1/5 IU/ml HCG  تعویض شد و تا 48 ساعت بعد، میزان بلوغ تخمک‌های اووله شده بررسی شد. در پایان این مرحله تعداد و درصد تکوین تخمک بررسی و ثبت شد

بررسی تغییرات بیان ژنهایBMP-15 ،  GDF-9 و BMP-7 توسط Real Time-PCR در فولیکولها: پس از گذشت چهل و هشت ساعت از تیمار فولیکول‫ها با  غلظت‫های 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر اگزوزوم، بیان GDF-9، BMP-15 و BMP-7 به‫عنوان ژن‫های موثر در فرآیند فولیکولوژنز با تکنیک Real Time-PCR مورد بررسی قرار گرفت. توالی پرایمرهای مورد استفاده در مطالعه حاضر در جدول 1 قابل مشاهده است.

جدول1: توالی پرایمرهای مورد استفاده در این پژوهش

5ʹ CCAGCAACCAGGTGACAGGAC3ʹ

GDF-9 Forward

5ʹ AGTGGAGGAGGAAGAGGCAGAG3ʹ

GDF-9 Reverse

 

5ʹ TGCTGACGACCCTACATTGC3ʹ

BMP15 Forward

 

5ʹ CAGCCTCACCATTTTCGCTC3ʹ

BMP15 Reverse

 

5ʹTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC3ʹ

Actin Forward

 

5ʹ CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3ʹ

Actin Reverse

 

5ʹ TTACTTTAGAGCCCTAGTCTG 3ʹ

BMP7 Forward

 

5ʹ TATGGGTACATCGGTCCAAC 3ʹ

BMP7 Reverse

 

 

RNA کل از گروه‫های تیمار شده و تیمار نشده طبق دستورالعمل سازنده (Scientific Thermo Fisher) استخراج شد. cDNA با کیت سنتز cDNA  ( پارس توس، ایران) ساخته شد. تکنیک  Real Time PCR با استفاده دستگاه ریل تایم پی سی آر (BIORAD CFX 96 U.S.A.) انجام شد (12). در این تکنیک از رنگ فلورسنت سایبرگرین (پارس توس، ایران) استفاده شد.

  • آنالیز آماری

جهت آنالیز داده‫های این پژوهش از نرم افزار GraphPad Prism 8 و تست آماری one way Anova استفاده شد. کلیه نمودارها هم با استفاده از نرم افزار Excel  رسم شده است.

  • نتایج

اثر اگزوزوم بر زیستایی فولیکولها

ارزیابی زیستایی فولیکول‫ها نشان داد در مقایسه با گروه شاهد، فولیکول‫های تحت تیمار با اگزوزوم 25 و 50 و100 میکروگرم بر میلی لیتر افزایش زنده ماندن را نشان می‫دهند و سلول‫هایی که تحت تیمار با اگزوزوم 100 میکروگرم در میلی‫لیتر بوده‫اند، بیشترین افزایش زیستایی را برخوردار شده بودند (نمودار 1)

 

نمودار 1 : اثر اگزوزوم‫های مشتق از سلول‫های بنیادی مغز استخوان در تنظیم زیستایی فولیکول‫ها با استفاده از روش MTT . فولیکول‫ها  با غلظت‫های 25 و 50 و 100 میکروگرم در میلی‫لیتر اگزوزوم به‫مدت 24 و 48 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند. (***001/0 P<).

 

نتایج بررسی قطر فولیکول ها

قطر فولیکول‌ها به‫مدت 4 روز در گروه‌های کنترل و گروه با غلطت  25 میکروگرم بر میلی‫لیتر اگزوزوم و گروه با غلطت 50 میکرو‫گرم بر میلی‫لیتر اگزوزوم و گروه با غلطت 100 میکرو‫گرم بر میلی لیتر اگزوزوم بررسی و اندازه گیری شد.

در روز یک کشت افزایش معنی‫داری (001/0 p<***)در قطر فولیکول‫ها در گروه تیمار با غلظت ۱۰۰ میکرو‫گرم بر میلی‫لیتر نسبت به کنترل همان روز مشاهده شد.

در روز دوم کشت افزایش معنی‫داری (001/0 p<***)در قطر فولیکول‫ها در گروه تیمار با غلظت 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر نسبت به کنترل همان روز و در گروه تیمار با غلظت 100 میکرو‫گرم بر میلی‫لیتر نسبت به کنترل همان روز  مشاهده شد.

همچنین نتایج مربوط به روز سوم کشت افزایش معنی‫داری (001/0 p<***) در قطر فولیکول ها در گروه تیمار با غلظت 50  میکروگرم بر میلی‫لیتر نسبت به کنترل همان روز و در گروه تیمار با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر نسبت به کنترل همان روز را نشان دادند.

نتایج مربوط به روز چهارم کشت افزایش معنی‫داری (001/0 p<***)در قطر فولیکول ها در گروه تیمار با غلظت 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر نسبت به کنترل همان روز و در گروه تیمار با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر نسبت به کنترل همان روز را نشان دادند (نمودار 2).

 

نمودار 2: اثر غلظت‫های 25، 50 و 100میکروگرم بر میلی‫لیتر اگزوزوم‫های مشتق از سلول‫های بنیادی مغز استخوان بر قطر فولیکول‫ها در روزهای 0 تا 4 نسبت به گروه کنترل (میلی متر)001/0 p-value= ***

نتایج ایجاد آنتروم در فولیکولها

میزان تشکیل آنتروم در گروه با غلظت 25 میکرو‫گرم بر میلی‫لیتر (37/82±19/9)، گروه با غلظت 50 میکرو‫گرم بر میلی‫لیتر (85/0±02/6) و گروه  با غلظت 100 میکرو‫گرم بر میلی‫لیتر (50/94±3/5)، در مقایسه با گروه کنترل (9/10±77/0) افزایش یافت. افزایش معنی‫دار در  گروه با غلظت 100 میکرو‫گرم بر میلی‫لیتر در سطح معنی‫داری           (01/0 p<**) نسبت به گروه کنترل مشاهده شد (نمودار 3).

 

نمودار3 : اثر اگزوزوم‫های مشتق از سلول‫های بنیادی مغز استخوان در ایجاد آنتروم   01/0 p-value=**

 

بررسی بیان ژنهای GDF-9، BMP7 و BMP15 در فولیکو‫‫لها با استفاده از تکنیک Real Time PCR

مقدار بیان ژن GDF-9 در فولیکول‫ها بررسی شد. نتایج نشان دهنده افزایش بیان ژن مذکور در گروه‫های تیماری نسبت به گروه کنترل بود به‫طوری‫که در گروه با غلظت 50 و 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر این افزایش در سطح معنی‫داری            001/ P<0*** ( نمودار 4)

 

نمودار4:  نتایج بیان ژن GDF-9 در فولیکول‫ها 001/0p-value=***

 

بررسی میزان بیان ژن BMP-7   در فولیکولها

مقدار بیان ژن BMP-7  در فولیکول‫ها بررسی شد. نتایج نشان دهنده ی افزایش بیان ژن BMP-7 در گروه‫های تیماری با غلظت 50 و 100 میکروگرم برمیلی‫لیتر در سطح معنی‫داری001/0 P<***   بود (نمودار 5)

 

نمودار 5: نتایج بیان ژن BMP-7 در فولیکول ها 001/0p-value=***

 

 

بررسی میزان بیان ژن BMP-15   در فولیکولها

مقدار بیان ژن BMP-15 در فولیکول‫ها بررسی شد. نتایج نشان دادند در گروه اگزوزوم µg/ml 100 مقدار بیان این ژن در مقایسه با گروه کنترل در سطح معنی‫داری 001/0P<***  افزایش یافته است( نمودار 6).

 

نمودار 6: نتایج بیان ژن BMP-15 در فولیکول‫ها 001/0p-value=***

 

  • بحث

امروزه  مشکل ناباروری در دنیای به‌صورت یک نگرانی اجتماعی درآمده است و می‌تواند ضربه روانی شدیدی به زوجین وارد سازد (13). نتایج برخی مطالعات نشان می‌دهد میزان ناباروری در جوامع بشری رو به افزایش است (13). ﻓﻌﺎﻝ ﮐـﺮﺩﻥ ﺭﻭﻧـﺪ ﺗﻘـﺴﻴﻢ ﻣﻴـﻮﺯ ﺩﺭ ﺍﻭﻭﺳـﻴﺖ ﻭ ﺑﻠـﻮﻍ ﺁﻥ از اهداف ﻣﻬﻢ ﺩﺭﻣﺎﻧﻲ ﻣﺤﻘﻘﻴﻦ ﻋﻠﻮﻡ ﻧﺎﺑـﺎﺭﻭﺭﻱ بوده است ﺑﻠـﻮﻍ ﺁﺯﻣﺎﻳﺸﮕﺎﻫﻲ ﺍﻭﻭﺳﻴﺖ‫ﻫـﺎ In Vitro Maturation IVM)) ﺑﺮﺍﻱ ﺍﻭﻟﻴﻦ ﺑـﺎﺭ توسط Leibfried و همکاران ﻣﻄﺮﺡ (14) شد. آن‌ها ﺗﻮﺍﻧﺴﺘﻨﺪ ﺑﺪﻭﻥ ﺍﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﺍﺯ ﻫﻮﺭﻣﻮﻥ، ﺗﻘﺴﻴﻢ ﻣﻴــﻮﺯ را ﺩﺭ ﺍﻭﻭﺳــﻴﺖ‫های ﻓﻮﻟﻴﮑــﻮﻝ ﺧﺮﮔــﻮﺵ ﻓﻌــﺎﻝ ﮐﻨﻨــﺪ ﻭ ﺍﻭﻭﺳــﻴﺖ‫های ﻧﺎﺑــﺎﻟﻎ (Germinal Vesicle GV) را به مرحله (GVBD(Germinal Vesicle Breakdown  ﺑﺮﺳﺎﻧﻨﺪ. در طول زندگی باروری، بیش از 99 درصد  از فولیکول‫های تخمدان طی فرآیندی به‫نام آترزی فولیکولی پس از تولد که تا حد زیادی در روند مناسب فولیکولوژنز و به‫دنبال آن باروری بسیار موثر است، تخریب می‫شوند  همچنین طی چندین دهه اخیر، به‌کارگیری تکنولوژی‌های تولیدمثلی همچون بلوغ و لقاح آزمایشگاهی تخمک بسیار مورد توجه قرارگرفته است (15). در زمینه بلوغ آزمایشگاهی تخمک تحقیقات زیادی بر روی بلوغ سیتوپلاسم آن نیز صورت گرفته است زیرا بلوغ سیتوپلاسم تخمک نقش مهمی در لقاح آزمایشگاهی می‌تواند داشته باشد (16).

نتایج این مطالعه نشان می دهد که اگزوزوم استخراج شده از سلول های مغز استخوان  باعث ازدیاد زیستایی فولیکول های تخمدانی می شود، Wycherleyو همکاران (17) سیستم کشت ساده و جدیدی را برای کشت فولیکول های پره آنترال موش ارائه کردند. آن‫ها فولیکول‫ها را در قطرات معلق و در ظروف 96 خانه، بدون پوشش روغن کشت دادند و با روش معمول همراه یا بدون روغن مقایسه کردند. محیط کشت مورد استفاده آنها حاوی FSH انسانی و اسید اسکوربیک بود. آن‫ها دریافتند، در این روش فولیکول ها رشد بیشتری را نسبت به دو روش دیگر پیدا کرده‫اند. تکثیر سلول های فولیکولی نیز به طور قابل توجهی افزایش نشان داد. بنابراین آن‫ها روش فوق را روشی مناسب تر برای کشت فولیکول دانستند. نتایج این پژوهش تجربی نیز نشان داد تیمار فولیکول ها با اگزوزوم های مشتق از سلول های بنیادی مزانشیمی باعث افزایش زیستایی فولیکول‫ها می شود.

نتایج پژوهش حاضر نشان داد که تیمار فولیکول‫های تخمدانی با اگزوزوم‫های مشتق از مغز استخوان موش، موجب افزایش قطر فولیکول‫ها وابسته به غلظت می‫شوند. همچنین نتایج این تحقیق موید این موضوع بود که اگزوزوم های مشتق از مغز استخوان دارای تاثیر بر روی پارامترهای تکوینی فولیکول‫ها نظیر بلوغ فولیکول و تشکیل حفره‫ی آنتروم هستند به‫طوری‫که با افزایش غلظت اگزوزوم‫ها این پارامترها دچار تغییرات مثبت به‫صورت معنی‫دار در مقایسه با گروه کنترل می شوند.

شوریی و همکاران اثر عصاره بافت تخمدان را بر روی موش بررسی کردند که نشان داد که عصاره بافت تخمدان یک عامل تکثیری و بلوغی است که باعث رشد و تکوین فولیکول پره آنترال تا مرحله بلوغ می‫شود و باعث افزایش قطر فولیکول و بقا می‫شود که در آزمایش حاضر نیز اگزوزوم‫های مشتق از سلول‫های بنیادی مغز استخوان با غلظت‫های 50 و 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر باعث افزایش در قطر فولیکول و بقا شده است که نتایج پژوهش حاضر هم‫راستا با نتایج گزارش شده توسط شوریی وهمکاران است (18).

همچنین در مطالعه ای که  توسط khazaei  و همکاران (19) بر روی موش انجام شد، نشان داد که استفاده از مقادیر 100، 200 میلی‫گرم برکیلو گرم از عصاره ی الکلی رازیانه در 6 روز باعث افزایش بقا فولیکول وتعداد فولیکول می‫شود که با نتایج این تحقیق در خصوص تیمار با اگزوزوم ها هم‫راستا است

در مطالعه ای دیگر Mazangi  و همکاران (20) اثر ژل رویال که دارای ترکیبات فنلی می‫باشد، به محیط کشت اضافه کردند که نتایج نشان می‫دهد که ژل رویال باعث بلوغ برون تنی اووسیت و منجر به افزایش نرخ بلوغ اووسیت شده است که هم راستا با پژوهش حاضر است.

در تحقیقی مشابه محمد نبیونی و همکاران (21) نشان داد که زهر زنبور عسل سبب افزایش معنی‫داری در سیر بلوغ آزمایشگاهی فولیکول‫های پره آنترال شده در نتیجه موجب آمادگی بهتر برای لقاح می‫شود که این می‫تواند مربوط به اثرات ضد التهابی آن باشد. نتایج این تحقیق نیز نشان داد که تیمار فولیکول‫ها با غلظت 25 و 50 میکروگرم بر میلی‫لیتر اگزوزوم‫ها موجب بلوغ و ازاد سازی تخمک از فولیکول به‫صورت معنی‫داری (01/0>p) تیمار فولیکول‫ها با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر اگزوزوم‫ها موجب بلوغ و آزاد سازی تخمک از فولیکول به‫صورت معنی‫داری (001/0>p) می شود که این نتایج هم‫راستا با تحقیق فوق بود.

در پژوهش حاضر فولیکول‌های پره آنترال موش با استفاده از سوزن سرنگ انسولین جداسازی شدند و به‫مدت 14 روز در محیط کشت α-MEM بهینه‌سازی شده و با غلظت‫های متفاوت اگزوزوم‫های مشتق از سلول‫های بنیادی  کشت داده شدند و قطر فولیکول‌ها و میزان رشد و بلوغ آن مورد بررسی قرار گرفتند که هم‫راستا با مطالعه آذرنیا و همکاران (22) است آن‌ها اثر توام متفورمین و زهر زنبور بر بلوغ آزمایشگاهی فولیکول‌های پره آنترال موش را مورد بررسی قراردادند و فولیکول‌ها را از تخمدان موش‌های 14 روزه به‌صورت مکانیکی جداسازی شده و در محیط کشت قطره‌ای α-MEM دارای روغن مینرال به‫مدت 14 روز کشت داده شد،  متفورمین و زهر زنبور نیز به‌طور جداگانه و نیز هم‌افزایی به محیط کشت افزوده شدند و قطر فولیکول‌ها تا روز چهارم کشت و بقای آن‌ها به‌صورت هر دو روز یک‫بار مورد بررسی میکروسکوپی قرار گرفت همچنین در روز 12 کشت به جهت القای اوولاسیون hCG افزوده شد. نتایج این پژوهش تجربی  نیز هم راستا با تحقیق فوق بود.

همچنین بیان ژن‫های BMP-7  و  BMP-15و GDF-9 در فولیکول‫های تخمدانی مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاصل از آزمون Real Time PCR نشان داد که هنگامی که فولیکول‫های تخمدانی مستخرج از موش، در معرض اگزوزوم‫های مشتق شده از سلول‫های مغز استخوان  قرار گرفتند بیان ژن‫های مذکور افزایش یافته است .

مارکرهای مولکولی مختلفی برای تعیین توان تکوینی اووسیت و فولیکول‫ها مورد استفاده قرار گرفته است. مهم‫ترین مارکرهای اعضای سوپر خانواده TGF-β شامل GDF9 و BMP15 می باشد که از تخمک ترشح می‫شوند و از اعضای کلیدی این سوپر خانواده محسوب می‫شوند و نقش بسیار مهمی در تمایز اووسیت درطی اووژنز و فولیکوژنز دارند (23). Demeestere و همکاران (24) به بررسی نقش سینرژیک ژن 15-BMP در تکوین و عملکرد کمپلکس اووسیت – کومولوس در موش پرداخت که باعث پیشروی تکوین و عملکرد فولیکول می‫شود. در این پژوهش نیز نتایج نشان داد با افزایش غلظت اگزوزوم‫ها بیان ژن  15-BMP نیز افزایش می‫یابد.

  در مطالعه‫ی حاضر بیان ژن 4-BMP و 15-BMP نیز با بلوغ اووسیت افزایش یافت و نتایج به‌دست‌آمده مشابه با مطالعات Kathirvel (25) است. وی بیان ژن‌های 4-BMP و 15-BMP در طی بلوغ آزمایشگاهی اووسیت را مورد بررسی قرارداد و مشخص کرد که این دو ژن در طی فرآیند بلوغ به‌طور افتراقی بیان می‌شوند  و الگو بیان  15-BMP به‌طور خاص با زمان گسترش سلول‌های کومولوس هم‫زمان است.

  • نتیجه‌گیری

با توجه به نتایج مطالعه حاضر می‌توان بیان نمود که اگزوزوم‫ها دارای اثر مثبت بر بلوغ و رشد فولیکول‫های تخمدانی می‫باشند.

  • تشکر و قدردانی

نویسندگان از همکاران محترم مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری دانشگاه آزاد اسلامی که در انجام این پژوهش تجربی همکاری داشتند تشکر می‫کنند.

-

  1. Rooney KL, Domar AD. The relationship between stress and infertility. Dialogues Clin Neurosci. 2018;20(1):41–7.
  2. Akbaribazm M, Goodarzi N, Rahimi M. Female infertility and herbal medicine: An overview of the new findings. Food Sci Nutr. 2021 Aug 15;9(10):5869-5882
  3. Farrokhyar S, Baharara J, Eidi A, Hayati Rodbari N. The effect of exosomes derived from bone marrow stem cells on the levels of estradiol and testosterone secreted from the ovarian granulosa cells of immature NMRI mice. iranjournals.nlai.ir‏. 2020;12(4):1–8.
  4. Fierabracci A, Del Fattore A, Luciano R, Muraca M, Teti A, Muraca M. Recent advances in mesenchymal stem cell immunomodulation: The role of microvesicles. Cell Transplant. 2015;24(2):133–49.
  5. Keating A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 2012 Jun 14;10(6):709-716.
  6. Figueroa FE, Carrión F, Villanueva S, Khoury M. Mesenchymal stem cell treatment for autoimmune diseases: a critical review. Biol Res. 2012;45(3):269-77.
  7. Sarvar DP, Shamsasenjan K, Akbarzadehlaleh P. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: New opportunity in cell-free therapy. Vol. 6, Advanced Pharmaceutical Bulletin. 2016. p. 293–9.
  8. Bruschi M, Ravera S, Santucci L, Candiano G, Bartolucci M, Calzia D, et al. The human urinary exosome as a potential metabolic effector cargo. Expert Rev Proteomics. 2015 Aug 1;12(4):425–32.
  9. Hannafon BN, Ding WQ. Intercellular communication by exosome-derived microRNAs in cancer. Int J Mol Sci. 2013 Jul 9;14(7):14240-69.
  10. Fierabracci A, Del Fattore A, Luciano R, Muraca M, Teti A, Muraca M. Recent advances in mesenchymal stem cell immunomodulation: the role of microvesicles. Cell Transplant. 2015;24(2):133-49.
  11. Shoorei H, Salehnia M, Abdi S. The effects of different concentrations of ovarian tissue extract on preantral mouse follicle development after three-dimensional culture. Modares J Med Sci Pathobiol. 2016;19(4):41–53
  12. De Los Reyes M, Palomino J, Araujo A, Flores J, Ramirez G, Parraguez VH, et al. Cyclooxygenase 2 messenger RNA levels in canine follicular cells: interrelationship with GDF-9, BMP-15, and progesterone. Domest Anim Endocrinol. 2021;74:106529.
  13. Jonaidy E, Noorani Sadodin SH, Mokhber N. Comparing the marital satisfaction in infertile and fertile women referred to the public clinics in Mashhad. Iran J Obs Gynecol Infertil. 2009;12(1):7-16.
  14. Leibfried ML, Bavister BD. Fertilizability of in vitro matured oocytes from golden hamsters. J Exp Zool. 1983 Jun;226(3):481–5.
  15. Foix-L’Hélias L, Grynberg M, Ducot B, Frydman N, Kerbrat V, Bouyer J, et al. Growth development of French children born after in vitro maturation. PLoS One. 2014 Jan;9(2):e89713.
  16. Chang EM, Song HS, Lee DR, Lee WS, Yoon TK. In vitro maturation of human oocytes : Its role in infertility treatment and new possibilities. Clin Exp Reprod Med. 2014;41(2):41–6.
  17. Wycherley, G., Downey, D., Kane, M. T., & Hynes, A. C. A novel follicle culture system markedly increases follicle volume, cell number and oestradiol secretion. Reproduction, 2004; 127(6): 669-677
  18. Shoorei H, Salehnia M, Abdi S. The Effects of Different Concentrations of Ovarian Tissue Extract on Preantral Mouse Follicle Development after Three-dimensional Culture. mjms. 2017;19(4):41-53.
  19. Khazaei M, Montaseri A, Khazaei MR, Khanahmadi M. Study of foeniculum vulgare effect on folliculogenesis in female mice. Int J Fertil Steril. 2011;5(3):122–7.
  20. Mazangi HR, Deldar H, Kashan NE, Mohammadi-Sangcheshmeh A. 305 ROYAL JELLY TREATMENT DURING OOCYTE MATURATION IMPROVES IN VITRO MEIOTIC COMPETENCE OF GOAT OOCYTES BY INFLUENCING INTRACELLULAR GLUTATHIONE SYNTHESIS AND APOPTOSIS GENE EXPRESSION. Reproduction, Fertility and Development. 2014;27(1):241 5
  21. Nabiuni M, KAKAEI M, Nazari Z, Karimzadeh L. Effect of honey bee venom on in vitro maturation of preantral follicles in NMRI mice. J Sci Tarbiat MoallemUniversity. 2013;13(1):749–60.
  22. Azarnia M, Nabuni M, Kouchesfahani mohseni H, Tousu A. The effects of metformin and bee venom on in vitro maturation of isolated preantral follicles in mice. J Anim Res (IRANIAN J Biol. 2013;26(3):228–36.
  23. Piotrowska H, Kempisty B, Sosinska P, Ciesiolka S, Bukowska D, Antosik P, et al. The role of TGF superfamily gene expression in the regulation of folliculogenesis and oogenesis in mammals: a review. Veterinární medicína. 2013;v.58 no.10(no. 10):pp. 505-15.
  24. Demeestere I, Centner J, Gervy C, Englert Y, Delbaere A. Impact of various endocrine and paracrine factors on in vitro culture of preantral follicles in rodents. Reproduction. 2005 Aug;130(2):147–56.
  25. Kathirvel M, Soundian E, Kumanan V. Differential expression dynamics of Growth differentiation factor9 ( GDF9 ) and Bone transcripts during in vitro maturation of buffalo ( Bubalus bubalis ) cumulus – oocyte complexes. Springerplus. 2013;2(1)(206):2–6.