سلول و بافت

فصلنامه

شماره جاری

بر اساس شماره‌های نشریه

بر اساس نویسندگان

بر اساس موضوعات

نمایه نویسندگان

نمایه کلیدواژه ها

درباره نشریه

اهداف و چشم انداز

اعضای هیات تحریریه

اصول اخلاقی انتشار مقاله

بانک ها و نمایه نامه ها

پیوندهای مفید

فرایند پذیرش مقالات

بیانیه حریم خصوصی

بیانیه حق مولف

پرسش‌های متداول

اخبار و اعلانات

اطلاعات آماری نشریه

خط مشی داوری

راهنمای داوران

فهرست داوران

تاثیر نسبت‌های مختلف کندروسیت و سلول‌های بنیادی مزانشیمی بر پتانسیل تمایز به غضروف در وزیکول‌های خارج سلولی استخراج شده از هم‌کشتی کندروسیت و سلول‌های بنیادی مزانشیمی

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی، مرکـز تحقیقـات علـوم سـلولی، گـروه سـلول‌هـای بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی، تهران، ایران

چکیده

هدف: عدم توانایی ترمیم خود به‫خودی بافت غضروف به‫دنبال ایجاد آسیب‌ مفصلی، نیازمند یک رویکرد درمانی موثر است. اخیرا نقش وزیکول‌های خارج سلولی (EV) در ارتباطات سلولی و ترمیم بافت از طریق تنظیم فرایندهای سلولی مورد توجه قرار گرفته است. هدف این مطالعه، مقایسه توانایی غضروف­زایی EVهای مشتق از هم‌کشتی کندروسیت/سلول بنیادی مزانشیمی با نسبت‌های 1 به 2 و 1 به 4 در شرایط برون‌تنی است. مواد و روش‌ها: در این راستا، سلول‌ها جداسازی و مشخصه­یابی شدند. محیط‌های رویی سلول‌های مورد نظر جمع­آوری و EV با استفاده از دستگاه اولتراسانتریفیوژ استخراج شد. EVها از لحاظ اندازه، مورفولوژی و بیان مارکرهای سطحی بررسی شدند. توانایی تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به کندروسیت در حضور غلظت‌های مختلف EVهای (۵۰، ۱۰۰ و۱۵۰ میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر) در ۲۱ روز بررسی شد و بیان مارکرهای غضروفی با استفاده از qRT-PCR و مطالعات بافتی ارزیابی شد. نتایج: CHO/MSC-EV 1/2 و CHO/MSC-EV 1/4 کروی‌شکل و به ترتیب با اندازه ۱۵/۸ ±۶۶/۵۱ و ۰۳/۶ ±۱۱/۱۹ نانومتر بوده و مارکرهای سطحی ویژه‌ی EVها شامل CD9 و CD81 در دو گروه بیان شد. افزایش بیان بالاتر مارکرهای ویژه­ی غضروفی به‫ویژه Col II وهمچنین ترشح آمینوگلیکان وپروتئوگلیکان در غلظت‌های 100 و150 میکروگرم بر میلی‌لیتر CHO/MSC-EV 1/2 نسبت به  CHO/MSC-EV 1/4مشاهده شد. نتیجه‌گیری: نتایج حاصل از این مطالعه پتانسیل تمایز به غضروف EVها را به‫ویژه در وزیکول‌های مشتق از CHO/MSC-EV 1/2 نشان داد. استفاده از EVها که توانایی غضروف‌زایی بالا دارند، به‫دلیل عدم ایمنی‌زایی و خطر تومورزایی می‌تواند در ترمیم بافت غضروف، موفقیت‌آمیز باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

The Impact of Different Ratios of Chondrocytes and Mesenchymal Stem Cells on Condrogenic Potential of Extracellular Vesicles Derived from Coculture of Chondrocytes and Mesenchymal Stem Cells

نویسندگان [English]

  • M Hosseinzadeh
  • S Hosseini
  • M Baghaban Eslaminejad

Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran

چکیده [English]

Aim: Cartilage tissue has limited capacity for spontaneous repair and self-renew due to the absence of vascularization and progenitor cells, thus requiring a therapeutic approach to repair tissue damage. Recently, extracellular vesicles (EVs) have attracted attentions because of their major roles in cell communication and tissue repair by regulating cellular processes such as cell growth, differentiation, and proliferation. Therefore, it is necessary to isolate extracellular vesicles with chondrogenic potential from an appropriate cellular source for cartilage regeneration. This study aims to compare the chondrogenic ability of extracellular vesicles derived from cocultured -chondrocytes / mesenchymal stem cells (CHO / MSC) at ratios of 1/2 and 1/4.
Material and Methods: Towards this goal, chondrocytes and mesenchymal stem cells were isolated from rabbit articular cartilage and bone marrow, respectively. Mesenchymal phenotype of isolated MSCs were characterized based on their surface markers and by differentiation into mesenchymal lineages. Chondrocytes and mesenchymal stem cells were co-cultured with defined ratios, their conditioned media were collected and extracellular vesicles were extracted with an ultracentrifuge. Concentrations of extracellular vesicles were determined using BCA Protein Assay Kit, then EVs were characterized in terms of size, morphology, and expression of surface markers by dynamic light scattering (DLS), scanning electron microscope (SEM) and western blotting, respectively. Mesenchymal stem cells were treated with different concentrations of extracellular vesicles (50, 100, and 150 ug/ml) for 21 days. Quantitative real time-PCR (qRT-PCR) and histological analysis were subsequently performed to assess the quality of chondrogenic differentiation among experimental groups. The differentiation of MSCs to osteogenic and adipogenic lineages  was demonstrated by Oil Red and Alizarin Red staining after 21 days.
Results: The results of flow cytometry showed that CD90 was expressed by 88.6% of the cell population as a positive marker and CD34 as a negative marker was only expressed in 5.48% of the cell population. SEM micrographs confirmed the spherical shape of CHO/ MSC-EV 1/2 and CHO/MSC-EV 1/4 and the mean particle size of isolated EVs were 51.66 ± 8.15 and 19.11 ± 6.03 nm, respectively. Special surface markers for extracellular vesicles containing CD9 and CD81 were expressed in both groups. At concentrations of 100 and 150 ug/ml of CHO/MSC-EV 1/2, higher cartilage - specific markers, including Col II were observed compared to CHO/MSC-EV 1/4. Similarly, safranin O and toluidine blue staining revealed the more deposition of aminoglycan and proteoglycan at concentrations of 100 and 150 ug/ml of CHO/ MSC-EV 1/2, compared to CHO/ MSC-EV 1/4. This study demonstrated the chondrogenesis potential of extracellular vesicles, especially in CHO /MSC-EV 1/2 and extracellular vesicles derived from co-culturing chondrocytes/MSCs improve matrix production and chondrogenesis.
Conclusion: Our research shows that chondrocyte-MSCs proximity is essential for the response as improved viability, chondrogenesis, and matrix formation in recipient MSCs. It is also proposed that co-cultured derived EVs with the ability to promote chondrogenesis have the potential to be utilized in cartilage regeneration.  Due to their immunogenicity and their low tumorigenic potential, extracellular vesicles can be used to help repair cartilage tissue.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Extracellular vesicles
  • Mesenchymal stem cells
  • Chondrocyte
  • Chondrogenesis
اصل مقاله
  • مقدمه

  بیماری‌های غضروف مفصلی یکی از اختلالات شایع به‫ویژه در میان قشر میانسال و مسن جامعه است. غضروف مفصلی به‫علت عدم وجود رگ خونی و تراکم پایین سلولی ظرفیت محدودی برای ترمیم خودبه‌خودی دارد، در نتیجه آسیب‌های جزئی می‌توانند به آسیب‌های پیشرونده مانند استئوآرتریت (OA) منجر شوند (1). روش‌های سنتی شامل دارو درمانی و جراحی برای درمان آسیب غضروف مفصلی به‫کار گرفته شده است اما هیچکدام در درمان کامل آسیب غضروفی موفق نبوده‌اند (2, 3). سلول‌درمانی یکی از روش‌های نوین در درمان آسیب‌های غضروفی است و سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs) براساس دارا بودن توانایی تمایز به غضروف و استخوان به‫عنوان یک منبع سلولی مناسب مورد توجه قرار گرفته‌اند (4-6). علی‌رغم امکان تکثیر MSCها در شرایط برون‌تنی استفاده از این سلول‌ها همچنان با چالش‌هایی از جمله از دست رفتن ظرفیت تمایز به غضروف در شرایط کشت و تکثیر، خطرتومورزایی و ایمنی‌زایی همراه است (7). در سال‌های اخیر استفاده از وزیکول‌های خارج سلولی که یکی از انواع ترشحات سلولی است به‫عنوان یک رویکرد درمانی عاری از سلول و بدون عوارض ناشی از سلول درمانی از جمله تومورزایی و ایمنی‌زایی مورد توجه قرار گرفته است. وزیکول‌های خارج سلولی، وزیکول‌هایی با غشای دو لایه‌ی لیپیدی هستند و از انواع سلول‌ها و همچنین از مایعات مختلف بدن مانند سرم، بزاق، مایع مغزی-نخاعی و مایع سینوویال استخراج می­شوند (12-8). وزیکول‌های خارج سلولی با تنظیم فرایندهای سلولی از جمله رشد، تمایز و فراخوانی سلول‌‌ها، در فرایند ترمیم بافت‌های مختلف، نقش مهمی ایفا می‌نماید و نقش درمانی آن‌ها برای ترمیم بافت‌های مختلف شامل قلب، کلیه، کبد، ریه و پوست نیز مورد مطالعه قرار گرفته است (13-18).Wang و همکاران با استفاده از EV‌های مشتق از CPC‌ها (Chondrogenic Progenitor Cells) در مدل موشی دچار استئوآرتریت (OA) نشان دادند که این EV‌ها قادر به جلوگیری از پیشرفت و شدت OA در داخل بدن و همچنین افزایش تحریک در روند تکثیر کندروسیت‌ها در شرایط آزمایشگاهی هستند. همچنین نتایج qRT-PCR نشان داد که ژن‌های دخیل در فرایند ترمیم غضروف در موش‌های دریافت کننده‌ی EVهای مشتق از CPC‌ها افزایش بیان و ژن‌های دخیل در التهاب کاهش بیان داشتند (19). نتایج حاصل از مطالعه‌ای که توسط Zhang و همکاران در بررسی نقش وزیکول‌های خارج سلولی جدا شده از سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از جنین انسانی در ترمیم آسیب استئوکندرال انجام شد، نشان داد که وزیکول‌های خارج سلولی منجر به بهبود آسیب استئوکندرال از طریق تشکیل بافت شبه استخوان ساب­کندرال و بافت شبه غضروف هیالین شد (20). همچنین گروه Tao در سال ۲۰۱۷ اثر وزیکول‌های خارج سلولی مشتق از سلول­های MSC مایع سینوویال با افزایش بیان miRNA- 140 را در آسیب استئوکندرال بررسی کردند. نتایج این مطالعه نشان داد که استفاده از این وزیکول‌های خارج سلولی سبب افزایش تکثیر کندروسیت‌ها در شرایط برون­تنی و جلوگیری از پیشرفت استئوآرتریت در شرایط درون­تنی گردید (21). در مطالعه‌ای دیگر که سال ۲۰۱۸ توسط گروه Vonk

مراجع
  1. Hosseinzadeh M, Kamali A, Hosseini S, Baghaban Eslaminejad M. Higher Chondrogenic Potential of Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells Compared to Chondrocytes-EVs In Vitro. BioMed Research International. 2021;2021:9011548.
  2. Krishnan Y, Grodzinsky AJ. Cartilage diseases. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 2018;71-72:51-69.
  3. Musumeci G, Loreto C, Carnazza ML, Martinez G. Characterization of apoptosis in articular cartilage derived from the knee joints of patients with osteoarthritis. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 2011;19(2):307-13.
  4. Wei X, Yang X, Han ZP, Qu FF. et al. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta pharmacologica Sinica. 2013;34(6):747-54.
  5. Caplan AI. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. Journal of cellular physiology. 2007;213(2):341-7.
  6. Nasiri N, Hosseini S, Reihani-Sabet F, Eslaminejad M. Targeted mesenchymal stem cell therapy equipped with a cell-tissue nanomatchmaker attenuates osteoarthritis progression. Scientific Reports. 2022;12.
  7. Heldring N, Mäger I, Wood MJ, Le Blanc K. et al. Therapeutic potential of multipotent mesenchymal stromal cells and their extracellular vesicles. Human gene therapy. 2015;26(8):506-17.
  8. Kim JY, Song S-H, Kim KL, Ko J-J. et al. Human Cord Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells and Their Conditioned Media Exhibit Therapeutic Equivalence for Diabetic Wound Healing. Cell Transplantation. 2010;19(12):1635-44.
  9. Street JM, Barran PE, Mackay CL, Weidt S. et al. Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. Journal of Translational Medicine. 2012;10(1):5.
  10. Lässer C, Seyed Alikhani V, Ekström K, Eldh M. et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 2011;9(1):9.
  11. Dear JW, Street JM, Bailey MA. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. PROTEOMICS. 2013;13(10-11):1572-80.
  12. Madison MN, Roller RJ, Okeoma CM. Human semen contains exosomes with potent anti-HIV-1 activity. Retrovirology. 2014;11(1):102.
  13. Malda J, Boere J, van de Lest CHA, van Weeren PR. et al. Extracellular vesicles — new tool for joint repair and regeneration. Nature Reviews Rheumatology. 2016;12(4):243-49.
  14. Timmers L, Lim SK, Arslan F, Armstrong JS. et al. Reduction of myocardial infarct size by human mesenchymal stem cell conditioned medium. Stem cell research.2007; 21(2):129-37.
  15. Gatti S, Bruno S, Deregibus MC, Sordi A. et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association. 2011;26(5):1474-83.
  16. Tan CY, Lai RC, Wong W, Dan YY. et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes promote hepatic regeneration in drug-induced liver injury models. Stem cell research & therapy. 2014;5(3):76.
  17. Zhu YG, Feng XM, Abbott J, Fang XH. et al. Human mesenchymal stem cell microvesicles for treatment of Escherichia coli endotoxin-induced acute lung injury in mice. Stem cells (Dayton, Ohio). 2014;32(1):116-25.
  18. Zhang B, Shi Y, Gong A, Pan Z. et al. HucMSC Exosome-Delivered 14-3-3ζ Orchestrates Self-Control of the Wnt Response via Modulation of YAP During Cutaneous Regeneration. Stem cells (Dayton, Ohio). 2016;34(10):2485-500.
  19. Wang R, Jiang W, Zhang L, Xie S. et al. Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model. Stem cell research & therapy. 2020;11(1):93.
  20. Zhang S, Chu WC, Lai RC, Lim SK. et al. Exosomes derived from human embryonic mesenchymal stem cells promote osteochondral regeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 2016;24.
  21. Tao S-C, Yuan T, Zhang Y-L, Yin W-J. et al. Exosomes derived from miR-15-40 p-overexpressing human synovial mesenchymal stem cells enhance cartilage tissue regeneration and prevent osteoarthritis of the knee in a rat model. Theranostics. 2017;7(1):180.
  22. Vonk LA, van Dooremalen SFJ, Liv N, Klumperman J. et al. Mesenchymal Stromal/stem Cell-derived Extracellular Vesicles Promote Human Cartilage Regeneration In Vitro. Theranostics. 2018;8(4):906-20.
  23. Kim M, Steinberg DR, Burdick JA, Mauck RL. Extracellular vesicles mediate improved functional outcomes in engineered cartilage produced from MSC/chondrocyte cocultures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2019;116(5):1569-78.
  24. Aung A, Gupta G, Majid G, Varghese S. Osteoarthritic chondrocyte-secreted morphogens induce chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Arthritis Rheum. 2011;63(1):148-58.
  25. Shi J, Liang J, Guo B, Zhang Y. et al. Adipose-Derived Stem Cells Cocultured with Chondrocytes Promote the Proliferation of Chondrocytes. Stem Cells Int. 2017;2017:1709582.
  26. Bian L, Zhai DY, Mauck RL, Burdick JA. Coculture of human mesenchymal stem cells and articular chondrocytes reduces hypertrophy and enhances functional properties of engineered cartilage. Tissue engineering Part A. 2011;17(7-8):1137-45.
  27. Xu L, Wu Y, Xiong Z, Zhou Y. et al. Mesenchymal Stem Cells Reshape and Provoke Proliferation of Articular Chondrocytes by Paracrine Secretion. Scientific Reports. 2016;6(1):32705.
  28. Li Q, Yu H, Sun M, Yang P. et al. The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration. Acta Biomater. 2021;125:253-66.
  29. Khalilifar MA, Baghaban Eslaminejad MR, Ghasemzadeh M, Hosseini S. et al. In Vitro and In Vivo Comparison of Different Types of Rabbit Mesenchymal Stem Cells for Cartilage Repair. Cell journal. 2019;21(2):150-60.
  30. Théry C, Witwer KW, Aikawa E, Alcaraz MJ. et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 2018;7(1):1535750.
  31. Eslaminejad MB, Poor EM. Mesenchymal stem cells as a potent cell source for articular cartilage regeneration. World journal of stem cells. 2014;6(3):344.
  32. Bakhtina A, Tohfafarosh M, Lichtler A, Arinzeh TL. Characterization and differentiation potential of rabbit mesenchymal stem cells for translational regenerative medicine. In vitro cellular & developmental biology Animal. 2014;50(3):251-60.
  33. Wen Z, Mai Z, Zhu X, Wu T. et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes ameliorate cardiomyocyte apoptosis in hypoxic conditions through microRNA144 by targeting the PTEN/AKT pathway. Stem cell research & therapy. 2020;11(1):36.
  34. Chen Y, Xue K, Zhang X, Zheng Z. et al. Exosomes derived from mature chondrocytes facilitate subcutaneous stable ectopic chondrogenesis of cartilage progenitor cells. Stem cell research & therapy. 2018;9(1):318.
  35. Lian C, Wang X, Qiu X, Wu Z. et al. Collagen type II suppresses articular chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis progression by promoting integrin β1−SMAD1 interaction. Bone Research. 2019;7:8.
  36. Ghosh S, Laha M, Mondal S, Sengupta S. et al. In vitro model of mesenchymal condensation during chondrogenic development. Biomaterials. 2009;30(33):6530-40.
  37. Akiyama H, Chaboissier MC, Martin JF, Schedl A. et al. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes & development. 2002;16(21):2813-28.
  38. Hodax JK, Quintos JB, Gruppuso PA, Chen Q. et al. Aggrecan is required for chondrocyte differentiation in ATDC5 chondroprogenitor cells. PLoS One. 2019;14(6):e0218399.
  39. Esmaeili A, Hosseini S, Kamali A, Hosseinzadeh M. et al. Co-aggregation of MSC/chondrocyte in a dynamic 3D culture elevates the therapeutic effect of secreted extracellular vesicles on osteoarthritis in a rat model. Scientific Reports. 2022;12(1):19827.
  40. Shen G. The role of type X collagen in facilitating and regulating endochondral ossification of articular cartilage. Orthodontics & craniofacial research. 2005;8(1):11-17.
  41. Mueller MB, Tuan RS. Functional characterization of hypertrophy in chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Arthritis Rheum. 2008;58(5):1377-88.
  42. Knuth CA, Andres Sastre E, Fahy NB, Witte-Bouma J. et al. Collagen type X is essential for successful mesenchymal stem cell-mediated cartilage formation and subsequent endochondral ossification. European cells & materials. 2019;38:106-22.
  43. Fabre H, Ducret M, Degoul O, Rodriguez J. et al. Characterization of Different Sources of Human MSCs Expanded in Serum-Free Conditions with Quantification of Chondrogenic Induction in 3D. Stem Cells International. 2019;2019:2186728.
سلول و بافت
دوره 13، شماره 4
بهمن 1401
صفحه 268-284
فایل ها
سابقه مقاله
  • تاریخ دریافت: 10 بهمن 1401
  • تاریخ پذیرش: 10 بهمن 1401
هم رسانی
ارجاع به این مقاله
آمار