فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار ژنتیک، ، تهران، خیابان ملاصدرا، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، پژوهشگاه ژنتیک

2 کارشناس ارشد آناتومی.کمیته تحقیقات دانشجویی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی قزوین، قزوین، ایران

3 استادیار علوم تشریح، مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، پژوهشکده پیشگیری از بیماری های غیر واگیر، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی قزوین، قزوین، ایران

4 دانشجوی پرستاری. کمیته تحقیقات دانشجویی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی قزوین، قزوین، ایران

10.52547/JCT/13.4.248

چکیده

هدف: بهینه سازی شرایط کشت سلول برای بهبود رشد و بلوغ تخمک در IVM (In Vitro Maturation)  در شرایط کشت داخل آزمایشگاهی IVF(In Vitro Fertilization) امروزه مورد توجه بسیاری از محققین قرار گرفته است، اما مکانیسم بهبود کیفیت کاملاً درک نشده است. آپوپتوزیس یا مرگ سلولی برنامه ریزی شده فرایندی برای حذف سلول‫های پیر و آسیب دیده از بافت‫ها است و در حیات فولیکول‫ها و تخمک‫های نارس نقش عمده‫ای دارد، اکثر سلول‫های زایشی معیوب و همچنین سلول‫های اضافی از طریق آپوپتوزیس از تخمدان‫ها حذف می‫شوند. یکی از راه‏های کاهش تنش اکسیداتیو در محیط کشت آزمایشگاهی بلوغ تخمک، استفاده از آنتی اکسیدان‏ها می‏باشد. استاتین ها داروهای درمان کلسترول بالا هستند که خواص آنتی اکسیدانتی و آنتی آپوپتوتیک برای آن گزارش شده است، آتورواستاتین در غلطت‫های بالای دارای عوارض جانبی برای قلب و کلیه‫ها است ولی در غلظت پایین دارای اثرات آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی برای سلول‫ها است و عوارض جانبی برای آن گزارش نشده است. در مطالعه ای مشابه که توسط همین گروه انجام شد در محیط حاوی دوز پائین از آتورواستاتین(2 میکرومولار)  میزان بلوغ و رشد تخمک ها به طور معنی داری افزایش داشت بنابراین در این مطالعه بر آن شدیم که به بررسی تاثیر این دوز آتورواستاتین بر میزان آپوپتوزیس در تخمک‫های موش صحرایی بپردازیم. مواد و روش ها: 200 عدد تخمک 24 ساعت بعد از تزریق 5/7 واحد PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin)، از تخمدان‫های موش‫های صحرایی ماده بالغ نژاد ویستار در محدوده وزنی 4 تا 5 هفته، خارج و در 2 گروه 100 تائی شامل گروه کنترل (محیط کشت MEM:Minimum Essential Medium + فاکتور رشدGrowth factor ) وگروه آتورواستاتین (محیط کشت MEM + mg/kg 2 آتورواستاتین+ فاکتور رشد Growth factor ) تقسیم بندی و داخل انکوباتور(با دمای 35 درجه و   5%CO2) کشت داده شدند. بعد از گذشت 24 ساعت از کشت، تخمک های بالغ شده که دارای استانداردهای یک تخمک بالغ و سالم بودند (تخمک‌هایی که میوز اول را طی کرده و دارای جسم قطبی اول و بالغ شده بودند) جدا شده و میزان آپوپتوزیس در هر گروه با استفاده از رنگ آمیزی تانل  بررسی و سپس با میکروسکوپ فلورسنت مشاهده و عکسبرداری شد، داده‫ها توسط آزمون آنالیز واریانس تجزیه و تحلیل شد. نتایج: بعد از گذشت 24 ساعت از کشت تخمک‫ها میزان آپوپتوزیس در گروه دریافت کننده آتورواستاتین در محیط کشت و گروه کنترل مورد بررسی قرار گرفتند.  میزان آپوپتوزیس در گروه کنترل و گروه آتورواستاتین به‫ترتیب برابر 22 و 24 درصد بود که نشان می‫داد آتورواستاتین با غلطت 2 میکروگرم بر کیلوگرم باعث افزایش 2 درصدی میزان آپوپتوزیس در تخمک‫های موش می‫شود که این افزایش در مقایسه با گروه کنترل از لحاظ آماری معنی‫دار نبود (11/0p=). بحث: طبق یافته‫های این مطالعه آتورواستاتین در دوزهای پائین می‫تواند به‫صورت پروآپوپتوتیک اثر کند و  باعث القای جزئی آپوپتوزیس در تخمک‫های موش در محیط آزمایشگاهی شود.  اگرچه این مطالعه بروی دوزهای دیگر آتورواستاتین انجام نشد ولی پیشنهاد می شود اثر سایر دوزهای این دارو بروی میزان القای آپوپتوزیس مورد بررسی قرار گرفته تا در خصوص نحوه تجویز و استفاده از آن تصمیم گیری مبتنی بر شواهد انجام شود. 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Investigating the Effect of Atorvastatin on the Rate of Apoptosis in Mouse Oocytes

نویسندگان [English]

  • M Sadeghi 1
  • R Chegini 2
  • F Sabbaghziarani 3
  • P Soleimani 4
  • MR Ashtarimajelan 2
  • F Zafari 3

1 Human Genetics Research Center, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran.

2 Cellular and Molecular Research Center, Research Institute for Prevention of Non-Communicable Diseases, Qazvin University of Medical Sciences, Qazvin, Iran

3 Cellular and Molecular Research Center, Research Institute for Prevention of Non-Communicable Diseases, Qazvin University of Medical Sciences, Qazvin, Iran

4 Student Research Committee, Faculty of Medicine, Qazvin University of Medical Sciences, Qazvin, Iran.

چکیده [English]

 
Aim: Optimizing cell culture conditions to improve oocyte growth and maturation in vitro culture conditions has been the focus of many researchers today, but the quality improvement mechanism is not fully understood. Apoptosis or programmed cell death is a process to remove old and damaged cells from tissues and plays a major role in the life of follicles and immature oocytes. Most of the defective reproductive cells as well as extra cells are removed from the ovaries through apoptosis. One of the ways to reduce oxidative stress in the laboratory culture of oocyte maturation is the use of antioxidants. Statins are drugs for the treatment of high cholesterol for which antioxidant and anti-apoptotic properties have been reported. Atorvastatin in high doses has side effects for the heart and kidneys, but in low concentrations, it has antioxidant and anti-inflammatory effects for cells, and no side effects have been reported for it.In this study, we investigated the effect of low-dose atorvastatin on the rate of apoptosis in mouse oocytes.
 
Materials and Method: 24 h after PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) inhection, 200 oocytes were obtained from adult female Wistar rats at the age of 4-5 weeks, were from were divided into 2 groups of 100 including the control group (MEM:Minimum Essential Medium culture+ Growth factor) and the atorvastatin group (MEM culture medium + 2 mg/kg atorvastatin+Growth factor) and cultured in the incubator(35 oC,CO2 %). After 24 hours of oocyte culture, Matured oocytes that met the standards of a healthy mature oocyte(oocytes that were in the first meiosis and had the first and mature polar body) were isolated the amount of apoptosis in each group was checked using tunnel staining and fluorescent microscope, the data were analyzed by variance analysis.
Results: After 24 hours of oocyte culture, the amount of apoptosis in the group receiving atorvastatin in the culture medium and the control group was investigated. The rate of apoptosis in the atorvastatin group and the control group was 24% and 22%, respectively, In the atorvastatin group, apoptosis increased by 2% compared to the control group butt the difference between the two groups was not statistically significant (p =0.11).
Conclusion: According to the findings of this study, atorvastatin in low doses can have a pro-apoptotic effect and cause partial induction of apoptosis in mouse oocytes in a laboratory environment. Although this study was not conducted on other doses of atorvastatin, it is suggested that the effect of other doses of this drug on the rate of apoptosis induction should be investigated in order to make an evidence-based decision regarding its administration and use.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Atorvastatin
  • Apoptosis
  • Oocyte
  • مقدمه

   ناباروری یکی از مهم‫ترین مشکلات بهداشت جهانی است که حدود بیست درصد از زوج‫های جوان را در سراسر جهان تحت تاثیر قرار داده است و علاوه بر پیشرفت چشمگیر روش‫های درمانی و بهبود در بخش سلامت تولید مثل میزان ناباروری در طی دو دهه گذشته همچنان رو به افزایش است (1). از مهم‫ترین عوامل موثر بر ناباروری می‫تواند به  محیط زیست، استرس، سبک زندگی، عوامل هورمونی و فاکتورهای پاتوفیزیولوژیک اشاره کرد (2). افزایش استرس باعث تولید گونه‫های اکسیژن فعال (ROS) در سطح تخمدان‫ها می‫شود که خود یکی از عوامل حذف سلول‫های زایا از طریق القای آپوپتوزیس است (3و 4). تعداد زیادی از سلول‫های زایشی قبل از بلوغ از تخمدان حذف می‫شوند و در دوران بلوغ کمتر از 1 درصد از سلول‫های زایشی در تخمدان‫هایی که برای کل طول عمر تولید مثلی فرد لازم هستند باقی می‫ماند (5). آپوپتوزیس یا مرگ سلولی برنامه ریزی شده فرایندی برای حذف سلول‫های پیر و آسیب دیده از بافت‫ها است و در حیات فولیکول‫ها و تخمک‫های نارس نقش عمده‫ای دارد، اکثر سلول‫های زایشی معیوب و همچنین سلول‫های اضافی از طریق آپوپتوزیس از تخمدان‫ها حذف می‫شوند (6). افزایش سطح هورمون استرس و ROS ها نه تنها در سلول‫های گرانولوزا  بلکه در تخمک‫های فولیکولی نیز باعث بروز آپوپتوزیس می‫شود. آپوپتوزیس نقش عمده ای در تعیین کیفیت تخمک‫های فولیکولی بازی می‫کند و به‫طور مستقیم بر تولید مثل تاثیر می‫گذارد و تحریک آپوپتوزیس می‫تواند یکی از عوامل داخل سلولی حذف تخمک‫ها و  ایجاد ناباروری باشد (7).

   آتورواستاتین یکی از داروهای گروه استاتین‫ها است که به‫طور رایج برای کاهش کلسترول خون استفاده می‫شود، استاتین‫ها از طریق فعال کردن مسیر پروتئین NADPH  و  مهار هیدروکسی متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMG-CoA) سطح سرمی کلسترول را کاهش می‫دهند (8). بر اساس گزارش‫های منتشر شده مصرف دوزهای پایین آتورواستاتین برای طولانی مدت بدون عوارض بوده و خطرات و آسیب‫های قلبی عروقی ناشی از هیپرکلسترمی را در بیمار کاهش می‫دهد و اثرات محافظتی بر روی سلول‫های جنسی دارد (9و10) به‫نظر می‫رسد بیشتر این اثرات به‫خاطر خاصیت مهارکنندگی ROS ها باشد، ولی مصرف دوزهای بالاتر می‫تواند با عوارضی از جمله عوارض قلبی برای فرد همراه باشد (11). علاوه بر کاهش میزان کلسترول اثرات متنوع دیگری از جمله اثرات ضد التهابی، آنتی اکسیدانتی و اثرات آنتی آپوپتوزی نیز برای آتورواستاتین گزارش شده است (12). با توجه به عملکرد آنتی اکسیدانتی آتورواستاتین و پتانسیل‫های مختلف آن و از طرفی روشن نبودن تاثیرات دقیق دوزهای مختلف آن بر عملکرد سلول‫های جنسی در این مطالعه ما تصمیم به بررسی تاثیر دوز mg/kg 2  آتورواستاتین بر میزان آپوپتوزیس تخمک‫های موش در محیط آزمایشگاهی گرفته شد.

  • مواد و روش‌ها

جمع آوری و کشت تخمک: در این مطالعه مورد شاهدی از 200 تخمک استفاده شد که از 40  سر موش ماده نژاد ویستار، با سن 4 تا 5 هفته‫ای تهیه شدند، برای تهیه تخمک‫ها 24 ساعت بعد از تزریق PMSG موش‫ها با کشش گردنی معدوم شدند، تخمدان‫ها برداشته شدند در مرحله بعد تخمک‫های GV به‫دست آمده از تخمدان موش در دیش محیط کشت حاوی 10 میکرومول آتورواستاتین قرار داده شدند و نهایتا به انکوباتور 37 درجه سانتی‫گراد و CO2، 5 درصد منتقل شدند.200 تخمک پس از استخراج و قرار گرفتن در محیط کشت 50 میکرو لیتری به‫دو گروه مساوی زیر تقسیم شدند، گروه کنترل: محیط کشت+ فاکتور رشد. گروه آتورواستاتین: محیط کشت + فاکتور رشد + 2 میکرو مولار آتورواستاتین.  تخمک‌ها در هر گروه 24 ساعت داخل انکوباتور قرار گرفتند.

بررسی میزان آپوپتوزیس: برای بررسی آپوپتوزیس با استفاده از میکروسکوپ اینورت (XDS-2ITALY) تخمک‌هایی که میوز اول را طی کرده و دارای جسم قطبی اول و بالغ شده بودند شمارش و عکس‌برداری شدند، در مرحله بعد میزان آپوپتوزیس تخمک‫ها با استفاده از رنگ آمیزی تانل در دو گروه کنترل و گروه آتورواستاتین بررسی شدند (شکل 1و 2)، جهت انجام آزمایش تانل از کیت تشخیص تانلIn situ cell death detection kit(Germany, Roche)  استفاده شد، برای این منظور پس از شستشو نمونه‫ها با PBS نمونه‫ها با سوبسترای DAB انکوبه شدند و جهت رنگ آمیزی نهائی از تولوئیدن بلو استفاده شد. در نهایت لام‫ها با میکروسکوپ نوری جهت تشخیص سلول‫های آپوپتوتیک تغییر رنگ یافته مورد بررسی قرار گرفتند. 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: رنگ آمیزی تانل در تخمک‫های کشت داده شده با آتورواستاتین (بزرگنمائی برابر با  x300).A : رنگ آمیزی تانل برای نشان دادن شکست DNA ، B: رنگ آمیزی PI برای رنگ زمینه اووسیت، C: تصویر تلفیقی A و B، که DNA شکسته شده به رنگ سبز مایل به زرد مشاهده می‫شود.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: رنگ آمیزی تانل تخمک های گروه کنترل. A: رنگ آمیزی تانل برای نشان دادن شکست DNA ، B: رنگ آمیزی PI برای رنگ زمینه اووسیت، C: تصویر تلفیقی A و B، که DNA شکسته شده به رنگ سبز مایل به زرد مشاهده می‫شود (بزرگنمائی برابر با  x300).

3-آنالیز آماری

   به‫منظور آنالیز آماری تصاویر دو گروه با استفاده از نرم‌افزار image j  آنالیز شد و داده‌های دو گروه توسط تست کای دو و نرم افزار spss12  آنالیز آماری شد، داده‫ها حاصل از گروه‫ها توسط آزمون Way- One ANOVA بین گروه‫ها مورد مقایسه قرارگرفت، در تمامی محاسبات 05/0p≤  معنی‫دار در نظر گرفته شد.

  • نتایج

میزان آپوپتوزیس تخمکها

  برای بررسی میزان آپوپتوز تخمک‫ها رنگ‫آمیزی تانل بر روی 100 تخمک بالغ از هر گروه انجام شد، تصاویر 1و2 توسط میکروسکوپ فلئورسانس تانل مثبت و منفی را نشان می‫دهد. از بین 100 تخمک گروه کنترل در 22 تخمک آپوپتوزیس مشاهده شد (22 درصد)  از 100 تخمک گروه آتورواستاتین آپوپتوزیس در 24 تخمک مشاهده شد (24 درصد). میزان آپوپتوزیس در گروه کنترل و گروه آتورواستاتین به‫ترتیب برابر 22 و 24 درصد بود که نشان می‫داد آتورواستاتین با غلطت 2 میکروگرم بر کیلوگرم باعث افزایش 2 درصدی میزان آپوپتوزیس در تخمک‫های موش می‫شود که این افزایش در مقایسه با گروه کنترل از لحاظ آماری معنی‫دار نبود (11/0 p =) (شکل 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل1: نمودار میزان آپوپتوزیس و بلوغ تخمک‫ها در دو گروه کنترل و  آتورواستاتین  24 ساعت پس از کشت آزمایشگاهی

  • بحث

در این مطالعه به بررسی تاثیر غلظت mg/kg 2 داروی آتورواستاتین در آپوپتوزیس تخمک‫های موش در محیط آزمایشگاهی پرداخته شد. نتایج این مطالعه نشان داد که آتورواستاتین در غلظت پائین باعث افزایش جزئی آپوپتوزیس در تخمک‫های موش می‫شود. میزان تکوین تخمک‫های نارس در محیط‫های خارج رحم یکی از فاکتورهای کلیدی در میزان موفقیت تکنیک های باروری خارج رحمی (IVF) است، عدم وجود فاکتورهای رشد کافی در طی مراحل رشد و تقسیمات اولیه تخمک و به‫خصوص در مرحله پروفاز1 سبب فعال شدن اولین موج آپوپتوزیس در اووسیت‫ها می‫شود، دومین موج آپوپتوزی وقتی که تخمک‫ها به بلوک دیپلوتن می‫رسند و در هنگام تشکیل اولین جسم قطبی رخ می‫دهد (13-15). آتورواستاتین در غلطت‫های بالای دارای عوارض جانبی برای قلب و کلیه‫ها است ولی در غلظت پایین دارای اثرات آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی برای سلول‫ها است و عوارض جانبی برای آن گزارش نشده است (16-18). Sathyapalan و همکاران (19) گزارش کردند که مصرف آتورواستاتین در بیماران مبتلا به تخمدان پلی کیستیک و هیپراندروژنمی بعد از 12 هفته باعث کاهش التهاب و پارامترهای متابولیک در تخمدان‫ها می‫شود. التهاب یک فرآیند فیزیولوژیکی بسیار مهم در تخمک‫گذاری، قاعدگی و لانه گزینی است و التهاب کنترل نشده اثرات نا‫مطلوبی  بر تولید هورمون های جنسی و تخمک‫گذاری دارد (20). از طرف دیگر، در تخمدان‫ها  افزایش ROS در طی تخمک گذاری و بلوغ تخمک و رشد جنین بسیار مهم است، ROS با پراکسیداسیون لیپیدها و القای آپوپتوزیس باعث عملکرد نامطلوب تخمدان‫ها می‫شود (21-23). Hamzeh و همکاران (24) گزارش کردند که آتورواستاتین در غلظت mg/kg 10 در برابر آسیب تخمدانی ناشی از سیس پلاتین خاصیت آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی قوی ایفا می‫کند و باعث کاهش آپوپتوزیس در تخمک‫های موش می‫شود و همچنین گزارش کردند که این اثر می‫تواند از طریق افزایش میزان استروژن و پروژسترون سرمی القا شده توسط آتورواستاتین باشد. ما در مطالعه حاضر در غلظت mg/kg 2  آتورواستاتین شاهد افزایش جزئی در آپوپتوزیس تخمک‫ها بودیم که این یافته‫ها با یافته‫های حمزه  و همکاران (24) هم راستا نبود که به‫نظر می‫رسد دلیل آن استفاده از غلظت پائین‫تر آتورواستاتین در مطالعه ما باشد. در مطالعه‫ای دیگر Doustar و همکاران (25) گزارش کردند که دوز پائین (mg/kg 10) آتورواستاتین باعث کاهش میزان آپوپتوزیس در سلول‫های عضلانی قلب موش می‫شود  که این نتایج با نتایج ما بر روی تخمک‫های نارس هم راستا نبود.  Aprigliano و همکاران (26) بـه اثـرات آتورواسـتاتین در القـای آپوپتوزیس  بر روی سـلول‫هـای میوفیبروبلاست (HSCs) از طریق فعال کردن مسـیر کاسـپاز3 و 9 اشاره کردند. آن‫ها در مطالعه خود برای اولین بار اثرات وابسته به دوز آتورواستاتین را گزارش کردند و با اندازه‫گیری میزان آتورواسـتاتین در سـرم خـون بـه ایـن نتیجـه رسیدند که دوز lit/mol 10-3 بیشترین اثرآپوپتوتیک را دارد که این یافته‫ها با یافته‫های مطالعه ما هم راستا بود، طبق یافته‫های ما و یافته‫های Aprigliano داروی آتورواستاین همواره اثرات آنتی اپوپتوتیک ندارد و در موراردی باعث القای آپوپتوزیس می‫شود که این نشانگر اثرات وابسته به دوز این دارو است. بنابراین در مصرف آتورواستاتین باید به‫میزان دوز دقیق مصرف دقت شود به‫طوری‫که به‫نظر می‫رسد آتورواستاتین در دوزهای پائین تر از  mg/kg 5 به‫صورت یک داروی القا کننده آپوپتوزیس اثر می‫کند و در دوزهای بالاتر از این مقدار به‫صورت یک داروی آنتی آپوپتوتیک اثر می‫کند که دلیل این امر نیاز به بررسی‫های سلولی و مولکولی بیشتری دارد.

خصوصیات سطحی به‫وسیله کوت کردن با پلاسما استفاده شد و سلول‫های بنیادی چربی انسانی روی آن کاشته شد.

  • نتیجه­گیری

   در یک نتیجه گیری کلی بر اساس یافته‫های ما بر خلاف شناخته شدن آتورواستاتین به‫عنوان یک داروی آنتی آپوپتوتیک آتورواستاتین در دوز پایین می‫تواند باعث القای آپوپتوزیس تخمک‫های موش شود و آتورواستاتین به‫صورت یک داروی وابسته به دوز اثرات متفاوتی دارد.

  • تشکر و قدردانی

   در این قسمت از مرکز تحقیقات سلولی مولکولی دانشگاه علوم پزشکی قزوین به‫خاطر فراهم کردن امکانات این مطالعه صمیمانه تشکر می‫شود.

-

  1.  
    1. Mascarenhas MN, Flaxman SR, Boerma T, Vanderpoel S, et al. National, regional, and global trends in infertility prevalence since 1990: a systematic analysis of 277 health surveys. PLoS Med. 2012;9 (12): e1001356.
    2. Prasad S, Tiwari M, Pandey AN, Shrivastav TG, et al. Impact of stress on oocyte quality and reproductive outcome. J Biomed Sci. 2016; 23: 36.
    3. Mrazek M, Fulka J. Failure of oocyte maturation: Possible mechanisms for oocyte maturation arrest. Hum Reprod. 2003; 18(11): 2249- 2252.
    4. Chaube SK, Prasad PV, Thakur SC, Shrivastav TG. Hydrogen peroxidemodulates meiotic cell cycle and induces morphological features characteristic of apoptosis in rat oocytes cultured in vitro. Apoptosis. 2005; 10(4): 863-874.
    5. Tiwari M, Prasad S, Tripathi A, Pandey AN, et al. Apoptosis in mammalian oocytes: A review. Apoptosis; 2015; 20(8): 1019-1025.
    6. Myers M, Morgan FH, Liew SH, Zerafa N, et al. PUMA regulates germ cell loss and primordial follicle endowment in mice. Reproduction. 2014; 148(2): 211-219.
    7. Barrett SL, Albertini DF. Cumulus cell contact during oocyte maturation in mice regulates meiotic spindle positioning and enhances developmental competence. J Assist Reprod Genet. 2010; 27(1): 29-39.
    8. Sacks FM, Pfeffer MA, Moye LA, et al.The effect of pravastatin on coronary events after myocardial infarction in patients with average cholesterol levels. N Engl J Med. 1996; 335: 1001-1009.
    9. Hamzeh M, Talebpour Amiri F, Karimpour Malekshah A, Yaghubi Beklar S, et al. Protective Effect of Atorvastatin against Cardiotoxicity and Hematotoxicity Induced by Cyclophosphamide in Rat.] J Mazandaran Univ Med Sci 2017; 27: 1-11. (in Persian).
    10. Naeimi RA, Talebpour Amiri F, Khalatbary AR, Ghasemi A, et al. Atorvastatin mitigates testicular injuries induced by ionizing radiation in mice. Reprod Toxicol. 2017; 72: 115-121.
    11. Parlakgumus HA, Aka Bolat F, Bulgan Kilicdag E, Simsek E, et al. Atorvastatin for ovarian torsion: effects on follicle counts, AMH, and VEGF expression. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2014; 175: 186-190.
    12. Steinberg D. Hypercholesterolemia and inflammation in atherogenesis: two sides of the same coin. Mol Nutr Food Res. 2005;49(11):995-8.
    13. Kang M, Wook J Ch, Ku JH, Kwak Ch, et al. Inhibition of Autophagy Potentiates Atorvastatin-Induced Apoptotic Cell Death in Human Bladder Cancer Cells in Vitro. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 8106-8121.
    14. Klinger FGRossi VDe Felici M. Francesca G. Multifaceted programmed cell death in the mammalian fetal ovary. Int J Dev Biol.2015;59(1-3):51-4.
    15. Kuida K, Haydar TF, Kuan Ch Y, Gu Y, et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell, 1998; 94 (3), 325–337.
    16. Ene ACPark SEdelmann WTaketo T. Caspase 9 is constitutively activated in mouse oocytes and plays a key role in oocyte elimination during meiotic prophase progression. Dev Biol.2013; 377(1):213-23.
    17. Zhou Q, Liao JK. Pleiotropic effects of statins: basic research and clinical perspectives. Cir J 2010; 74: 818-826.
    18. Crevar-Sakac M, Vujić Z, Kotur-Stevuljević J, Ivanisević J, et al. Effects of atorvastatin and artichoke leaf tincture on oxidative stress in hypercholesterolemic rats. Vojnosanit Pregl. 2016; 73: 178-187.
    19. Sathyapalan T, Kilpatrick ES, Coady A-M, Atkin SL. The effect of atorvastatin in patients with polycystic ovary syndrome: a randomized double-blind placebo-controlled study. J Clin Endocrinol Metab. 2009; 94: 103-108.
    20. Jabbour HN, Sales KJ, Catalano RD, Norman JE. Inflammatory pathways in female reproductive health and disease. Reproduction. 2009; 138: 903-919.
    21. Herath S, Williams EJ, Lilly ST, Gilbert RO, et al. Ovarian follicular cells have innate immune capabilities that modulate their endocrine function. Reproduction 2007; 134: 683-693.
    22. Shkolnik K, Tadmor A, Ben-Dor S, Nevo N, et al. Reactive oxygen species are indispensable in ovulation. Proc Nati Acad Sci U.S.A. 2011; 108: 1462-1467.
    23. Fujii J, Iuchi Y, Okada F. Fundamental roles of reactive oxygen species and protective mechanisms in the female reproductive system. Reprod Biol Endocrinol 2005; 3: 43.
    24. Hamzeh M, Hosseinimehr SJ, Mohammadi HR, Yaghubi Beklar S, et al. Atorvastatin attenuates the ovarian damage induced by cyclophosphamide in rat: An experimental study. Int J Reprod Biomed. 2018;16(5):323-334. 
    25. Doustar Y, Mohajeri D. The anti-apoptotic effects of atorvastatin in isoproterenol induced experimental heart failure. Zahedan J Res Med Sci (ZJRMS)2011; 13(2): 13- 19.
    26. Aprigliano I, Dudas J, Ramadori G and Saile B. Atorvastatin induces apoptosis by caspase-9- dependent pathway: an in-vitro study on activated rat hepatic stellate cells. Liver Int. 2008; 28(4): 546- 557.