مقدمه

سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی(Spermatogonial Stem Cells, SSCs)  از طریق گامت‏زایی اطلاعات ژنتیکی را از نسلی به نسل دیگر منتقل می‏کنند (1). علی‏رغم انتقال اطلاعات ژنتیکی که مهم‏ترین عمل سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی است. مطالعات جدید الگوی تکاملی دیگری را نیز برای این سلول‏ها در نظر می‏گیرند (2). سلول‏های اسپرماتوگونی پس از کشت در محیط In vitro کلونی‏های سلولی ES-like cells) (Embryonic Stem like cells, را شکل می‏دهند که این سلول‏ها به سلول‏های بنیادی جنینی ESCs)  (Embryonic stem cell, شبیه هستند و دارای قابلیت خودترمیمی (Self-renewal) و تولید هر سه نوع لایه زایای اکتودرمی، مزودرمی و آندودرمی می‏باشند (3).

طی تبدیل شدن سلول‏های اسپرماتوگونی به سلول‏های ES-like cells بیان ژن‏ها دستخوش تغییرات گسترده‏ای می‏گردند به‏طوری‏که برخی از ژن‏های پر توانی نظیر ,SOX2,SSEA1 Nanog ،C-myc و Oct4 افزایش می‏یابد که برای برنامه ریزی مجدد  (Reprogramming) فیبروبلاست به‏مرحله پر توانی ضروری است )4). در حالی‏که بیان مارکرهای اختصاصی سلول‏های اسپرماتوگونی شامل Stra8، ,DAZLPlzf کاهش می‏یابد (5).

نظریه‏ی خاصیت پرتوانی سلول‏های اسپرماتوگونی برای نخستین‏بار در سال 2004 پس از کشت سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی موش تازه متولد شده عنوان شد (6).  محققان دیگر پس از کشت سلول‏های اسپرماتوگونی موش بالغ ES-like cells حاصله را به انواع مختلف سلولی تمایز دادند (7). همچنین نتایج مشابهی پس از کشت سلول‏های اسپرماتوگونی انسانی به‏دست آمد (8).

امروزه استراتژی‏های سلول درمانی فعالیت تکثیری گسترده و پرتوانی سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی را پیشنهاد می‏دهد (9). در واقع این سلول‏ها می‏توانند به حد کافی تکثیر و گسترش یابند که منبع کافی جهت تولید سلولی برای درمان بسیاری از بیماری‏ها و ضایعات ژنتیکی فراهم آورند (10).

منشا سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی سلول‏های اپی‏بلاست جنینی هستند که این سلول‏ها تحت القای BMP4) (Bone Morphogenetic Protein 4, وارد مرحله اختصاصی شدن می‏شوند (11). سپس این سلول‏ها به مزودرم خارج رویانی مهاجرت کرده و در گناد در حال تکامل به سلول‏های رده اسپرماتوگونی تمایز می‏یابند (12و13). سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی مارکرهای ویژه را نظیر Stra8 ,Plzf ,Dazl را بیان می‏کنند که از این مارکرها به‏عنوان مارکرهای اختصاصی اسپرماتوگونی جهت جداسازی این سلول‏ها استفاده می‏شود (14). علاوه بر این تحقیقات جدید نشان می‏دهد که سلول‏های اسپرماتوگونی دارای پتانسیل تشکیل کلونی‏های سلولی ES-like cells تحت شرایط محیط کشت in vitro و حتی بدون دستکاری‏های ژنتیکی می‏باشند (15). این کلونی‏ها از نظر مورفولوژی بسیار شبیه کلونی‏های سلولی بنیادی جنینی هستند. این کلونی‏ها مشابه کلونی‏های مشتق شده از سلول‏های بنیادی جنینی دارای قابلیت خودترمیمی و تولید هرسه نوع لایه زایای جنینی می‏باشند )16-19).

در همین راستا نتایج تحقیقات Huang  و Glasser (20و21) نیز موید ظهور کلونی سلول‏های ES-like cells پس از کشت سلول‏های اسپرماتوگونی بودند که این کلونی‏ها از نظر مورفولوژی مشابه سلول‏های ES-like cells  بوده و مارکرهای پرتوانی و میزان بالای از فعالیت آلکالین فسفاتاز را خود بیان کردند. با توجه به گزارشات مذکور و اهمیت استفاده از سلول‏های اسپرماتوگونی به‏عنوان یک منبع سلولی جدید برای تولید و دستیابی به سلول‏های پرتوان، لذا تحقیقات بیشتری در زمینه کشت سلول‏های اسپرماتوگونی و تولید سلول‏هایES-like cells  ضروری به‏نظر می‏رسد. بنابراین هدف از تحقیق حاضر تولید سلول‏ها ES-like cells پس از کشت سلول‏های اسپرماتوگونی و بررسی تغییرات مورفولوژی و ژنتیکی حاصله در این سلول‏ها و مقایسه با سلول‏های اسپرماتوگونی و سلول‏های بنیادی جنینی است.

مواد و روش‏ها

تهیه و جداسازی سلول‏های اسپرماتو گونی:در این تحقیق از سلول‏ها‏ی اسپرماتوگونیموش نوزاد 2 تا 4 روز استفاده شد. بدین ترتیب سلول‏های اسپرماتوگونی از بیضه موش نوزاد توسط دو مرحله هضم مکانیکی و آنزیمی جداسازی می‏شوند (22).

مرحله اول هضم مکانیکی: در این مرحله پس از جداسازی کپسول، بیضه‏های موش های نوزاد 2 تا 4 روزه نژاد NMRIدر محیط کشت حاوی آنزیم‏های لازم جهت هضم آنزیمی به‏طور مکانیکی قطعه قطعه و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. در طی این مدت محیط حاوی بیضه‏ها، هر 10 دقیقه یک بار به آرامی و توسط سمپلر به‏مدت 1 دقیقه به‏هم زده می‏شد. پس از 1 ساعت، محیط حاوی سلول‏ها و قطعات لوله‏های منی‏ساز به‏مدت 5 دقیقه با سرعت RPM1200 سانتریفیوژ شده و محیط بالای رسوب ته لوله با محیط DMEM تازه جایگزین شد. این‏کار باعث حذف بافت بینابینی، از قطعات بیضه شد. حاصل اولین مرحله هضم آنزیمی در انتهای این مرحله قطعات لوله‏های منی‏ساز بودند که برای هضم بیشتر وارد مرحله دوم هضم آنزیمی شدند.

مرحله دوم هضم آنزیمی: به‏منظورجدا شدن سلول‏ها از قطعات لوله‏های منی‏ساز حاصل از اولین مرحله هضم آنزیمی، لوله‏ها در محیطی مشابه مرحله اول به‏مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. در طی این مدت هر 10 دقیقه یک بار، محلول حاوی لوله ها توسط سمپلر و به‏مدت یک دقیقه به‏منظور خرد شدن تجمعات سلولی موجود در تعلیق تا حد امکان به‏طور کامل هم زده شد. در انتهای زمان انکوباسیون تعلیق فوق جهت جداسازی قطعات هضم نشده با سرعت معادل  rpm400 و به‏مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. قطعات هضم نشده لوله‏های منی‏ساز در ته لوله رسوب کرده و سلول‏های منفرد و برخی از تجمعات سلولی در بالای تعلیق قرار گرفتند. مایع سلولی بالای رسوب از فیلترهای نایلونی 70 میکرومتر عبور داده شد. تعلیق حاصل عمدتا حاوی سلول‏های سرتولی، اسپرماتوگونی بود که در مراحل بعدی از یکدیگر جدا شدند (22).

جداسازی سلول‏های سرتولی: جداسازی سلول‏های سرتولی از تعلیق سلولی حاصل از مرحله دوم هضم آنزیمی با استفاده از روش اسکارپینو و همکاران (22) انجام شد. برای این منظور از 5  میکرو گرم بر میلی‏لیتر لکتین داچورا استرامونیوم اگلوتینین (DSA, Sigma, USA) در بافر فسفات استفاده شد پتری دیش حاوی این محلول به‏مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. پس از شستشوی پتری دیش با بافر فسفات سالین (Phosphate Buffered Saline, PBS) حاوی 5/0 درصد سرم آلبومین گاوی (Bovine Serum Albumin,BSA) محصولات شرکت Sigma تعلیق سلولی به پتری دیش پوشیده با لکتین DSA منتقل شده و به‏مدت یک ساعت در دمای 32 درجه سانتی‏گراد و فشار 5 درصد CO₂، انکوبه شد. پس از یک ساعت انکوباسیون سلول‏های شناور به‏عنوان سلول‏های اسپرماتوگونی در نظر گرفته شدند درحالی‏که سلول‏های چسبیده به کف پتری به‏عنوان سلول‏های سرتولی شناخته شدند. (22).

 کشت سلول‏های اسپرماتوگونی: سلول‏های اسپرماتوگونی در محیط  ES medium که حاوی DMEM، FBS 15 درصد، (1000 IU/ml; Chemicon) LIF، 1 درصد اسید‏های آمینه غیر ضروری، بتا مرکاپتواتانول mM1 و 1 درصد پنی سیلین/ استرپتومایسین بوده  کشت داده شدند. پاساژ سلول‏های اسپرماتوگونی هر سه روز یک‏بار و با استفاده از تریپسین-EDTA و پیپتاز انجام شد. در هر گروه به تعداد پنج بار مراحل کشت سلولی تکرار شد.

ایجاد ES-like cell: سلول‏های اسپرماتوگونی در محیط   ES mediumبه‏مدت دو تا سه هفته کشت داده شدند. سلول‏ها هر هفته دو بار پاساژ داده شده و در پاساژ پنجم معادل هفته 3  کشت کلونی‏های ES-like cells حاصل شد.

کشت سلول بنیادی جنینی موش(ESC) : در پژوهش فوق از رده سلولی بنیادی جنینی موشی (CGR8) مشتق از گونه موش SV/129،  اهدائی از طرف دکتر سلیمانی (دانشگاه تربیت مدرس) استفاده شد. کشت اولیه سلول‏های بنیادی جنینی در محیط کشتES mediumبوده که پس ازبررسی سلول‏ها در زیر میکروسکوپ، به‏صورتروزانهتعویض محیط کشت انجام شد

 ارزیابی سلول‏هایES-like Cells : در مطالعه حاضر سعی شد با به‏کارگیری روش‏های متفاوتی حضور سلول‏های ES-like cells حاصله مشخص گردید که شامل ارزیابی‏های مورفولوژیک، ایمونوسیتوشیمی و مولکولی بود. ماهیت پر توانی سلول‏های ES-like cells از طریق مقایسه با سلول‏های بنیادی جنینی ذکر شده به‏عنوان کنترل مثبت انجام شد. 

ارزیابی‏های مورفولوژیک: پس از گذشت 3 تا 4 روز از کشت سلول‏های اسپرماتوگونی به‏تدریج کلونی‏های اسپرماتوگونی ظاهر شدند. این کلونی‏ها از نظر ویژگی‏های مورفولوژیک و شکل ظاهری توسط میکروسکوپ معکوس مورد ارزیابی قرار گرفتند. همچنین کلونی‏های ES-like cells حاصله از کشت سلول‏های اسپرماتوگونی در هفته چهارم نیز از نظر ویژگی مذکور مجددا مورد ارزیابی و مقایسه با کلونی های سلولی اسپرماتوگونی و ESC قرار گرفتند.

  هیستوشیمی آلکالین فسفاتاز: برای ارزیابی آلکالین فسفاتاز (Sigma) ابتدا سلول‏های حاصل از کلونی‏های اسپرماتوگونی، ES-like cells و سلول بنیادی جنینی به‏وسیله PBS سه مرتبه شستشو شدند. ابتدا سلول‏ها در محلول تثبیت کننده که حاوی استن، فرمالدئید و سیترات به‏مدت 10 دقیقه فیکس شدند. در مرحله بعد سلول‏ها توسط محلول Tris 0.1 M دو مرتبه شستشو داده شدند. سپس سلول‏های فیکس شده در محلولی که حاوی Violet (Sigma) 0.5 mg/ml Fast Red و 40 μl/ml Naphtol Phosphate به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق، نسبتا مرطوب و تاریک انکوبه شدند. در نهایت سلول‏ها با آب مقطر شستشو شدند و محل‏های فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز توسط میکروسکوپ نوری Olympus  مشاهده و عکس‏برداری شدند (23).

 ارزیابی ایمونوسیتوشیمی: در ابتدا سلول‏های حاصل از کلونی‏های اسپرماتوگونی، ES-like cells و سلول بنیادی جنینی توسط  PBSسه مرتبه شستشو شدند. سلول‏های مذکور در محلول پارافرمالدئید 4 درصد در دمای اتاق به‏مدت یک شب تثبیت شدند. سپس سلول‏ها با محلول Tween 20  0.05% + PBS شستشو داده شده و با محلول Triton X-100 0.2% نفوذپذیر شده و مجددا توسط محلول Tween 20  0.05% +  PBS به‏مدت 5 دقیقه شسته شدند و سلول‏ها به‏مدت 60 دقیقه در دمای اتاق با سرم بز پوشانده شدند. آنتی بادی اولیه Oct4 (Goat polyclonal IgG, ab764, abcam system) به رقت 200/1 در محلول Tween 20  0.05% +  PBS+ BSA 1% به‏مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی‏گراد به سلول‏های مذکور اضافه شد. پس از سه مرتبه شستشو با PBS، سلول‏های مذکور توسط آنتی‏بادی ثانویه (Phycoerythrin (PE) -conjugated Donkey polyclonal to Goat IgG, ab976,abcam system) به رقت 100/1 در محلول Tween 20 0.05% +  PBS+ BSA 1% به‏مدت یک ساعت در دمای اتاق و در شرایط تاریکی انکوبه شدند. رنگ آمیزی هسته سلول‏ها با استفاده از DAPI محصول شرکت سیگما صورت پذیرفت و در انتها بررسی نمونه‏ها با استفاده از میکروسکوپ فلورسانسOlympus phase contrast microscope (BX51, Olympus, Tokyo, Japan) صورت گرفت (24و25).

ارزیابی مولکولی: به‏منظور ارزیابی بیان ژن‏هایStra8 ، Plzf،Dazl ،Nanog ، Klf4، SOX2 از روش نسخه برداری معکوس واکنش زنجیره‏ای پلی مراز (RT-PCR) استفاده شد. بدین ترتیب که  RNA کل با استفاده از کیت RNA Plus (محصول شرکت فرمنتاز) از کلونی‏های حاصل از اسپرماتوگونی، ES-like cells و سلول بنیادی جنینی استخراج شده و پس از اطمینان یافتن از کیفیت RNA استخراج شده، جهت تبدیل mRNA مورد نظر به  cDNAاز پرایمر الیگو dT (MWG-Biotech AG) و آنزیم نسخه بردار معکوس (Gibco BRL, M-MLV)  استفاده شد. لازم به‏ذکر است که پرایمرهای مورد استفاده تحقیق مذکور در جدول 1 آورده شدند (28-26).

جدول 1: ویژگی‏ها و توالی پرایمر‏های ذکر شده در تحقیق حاضر.

نتایج

تاییدهویت سلول‏هایES-like cells  

مورفولوژی

کلونی‏های ES-like cellsبه لحاظ مورفولوژیک بسیار شبیه کلونی‏هایسلول‏های بنیادی جنینیو دارای شکلکروی تا بیضی با محدود سلولی نامشخص بودند.

توانایی تولید اجسام شبه جنینی

سلول‏هایES-like cells در صورت کشت معلق قادر به تشکیل دستجات و تولید اجسام شبه جنینی (Embryoid Bodies, EBs) هستند.

سنجش آنزیم آلکالین فسفاتاز

بررسی هیستوشیمی آنزیم آلکالین فسفاتاز نشان داد که سلول‏هایES-like cells مشابه ESC دارای فعالیت آلکالین فسفاتازی نسبتا بالای هستند. به‏طوری‏که محل‏های فعالیت آنزیم به‏صورت نقاط صورتی تا قرمز قابل مشاهده است. علاوه بر این سلول‏های مشتق شده از اسپرماتوگونی نیز دارای فعالیت آلکالین فسفاتاز می‏باشند (شکل 1،A  و (B.

ردیابی نشانگر سلولی Oct4

به‏کارگیری آنتی‏بادی ضد  Oct4به‏روش ایمونویستوشیمی بیان این نشانگر را در سلول‏های ES-like cells مذکور به اثبات رسانید (شکل 2‌، (B، علاوه بر این بیان این پروتئین در ES-like cells مشابه سلول‏های بنیادی جنینی بوده (شکل 2، (D که این امر دال بر فعالیت پرتوانی سلول‏های ES-like cells است. هر چند که در کلونی‏های حاصل از اسپرماتوگونی این نشانگر ظهور پیدا نکرد (شکل 2، (F.

شکل 1: ارزیابی هیستوشیمی آنزیم آلکالین فسفاتاز. (A). کلونی‏های حاصل از ESC و(B)  کلونی‏هایES-like cells  مشتق از سلول‏های بنیادی اسپرماتوگونی، بزرگنمایی ×400.

شکل2:روش ایمونوسیتوشیمی برای تعیین محل Oct4 در کلونی‏های ES-like. (A)، کلونی‏های حاصل از سلول‏های بنیادی جنینی، (B)، کلونی‏های حاصل از سلول‏های بنیادی جنینی، (C)  در کلونی‏های حاصل از اسپرماتوگونی ،(D) در کلونی‏های حاصل از اسپرماتوگونی، (E) توسط DAPI به رنگ آبی در آمده اند، (F) همچنین هسته سلول‏ها به‏ترتیب برای کلونی‏های ES-like ، بزرگنمایی ×400.