شناسنامه علمی شماره
نویسندگان
پردیس علوم دانشگاه تهران، دانشکده زیست شناسی، گروه علوم سلولی و مولکولی، صندوق پستی 6455-14155 تهران، ایران
چکیده
هدف: روشهای متعددی برای وارد کردن مواد ژنتیکی خصوصا DNA بهداخل سلولهای حیوان بهکار گرفته شدهاند. روش وابسته به فسفات کلسیم روشی آسان و ارزان قیمت است با اینحال این روش برای ترانسفکشن عدهای از سلولهای حیوانی کارایی مناسبی ندارد. در این مطالعه تلاش بر این بود که بتوان کارایی ترانسفکشن با واسطه فسفات کلسیم را افزایش داد. مواد و روشها: دویست هزار سلول HEK293T در هر یک از خانههای ظروف 6 خانهای که حاوی یک لامل پوشیده از پلیاللیزین بود کاشته شده و تا رسیدن به تراکم 60 درصد در محیط مناسب رشد داده شدند. سلولها سپس توسط یک روش استاندارد فسفات کلسیم در حضور یا عدم حضور فسفات کلروکین با پلاسمید رمز کننده پروتئین GFP (Green Fluorescence Protein) ترانسفکت شدند. سلولها با میکروسکوپ فلورسانس مورد مشاهده قرار گرفته و میزان بیان GFP توسط نرم افزار Image J مورد اندازهگیری قرار گرفت. نتایج: ما نشان میدهیم که فسفات کلروکین میتواند بهمیزان قابل ملاحظهای ترانسفکشن سلولهای HEK293T را با واسطه فسفات کلسیم افزایش دهد بهطوریکه در حضور این ماده تعداد سلولهای ترانسفکت شده تا 8 برابر افزایش مییابد. فسفات کلروکین هیچ سمیتی برای سلولها نداشت ولی افزایش کارایی ترانسفکشن این ماده در حضور گلیسرول و یا DMSO (Dimethyl sulphoxide) مشاهده نگردید. نتیجه گیری: ما فسفات کلروکین را بهمنظور افزایش کارایی ترانسفکشن توسط روش فسفات کلسیم توصیه میکنیم. بهعلاوه پیشنهاد میشود فسفات کلروکین بهصورت تنها و در عدم حضور سایر محرکهای ترانسفکشن مورد استفاده قرار گیرد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
In the absence of Glycerol or DMSO, chloroquine phosphate is a potent inducer of calcium phosphate-mediated transfection of HEK293T cells
نویسندگان [English]
- S A
- M S
- S S
- SM A
چکیده [English]
Aim: Different methods have been used for introducing DNA into mammalian cells. Calcium phosphate-based transfection protocols are inexpensive and easy to perform, however, the transfection efficiency in some cases is not satisfactory. In this study we try to increase the efficiency of calcium phosphate-mediated cell transfection. Material and Methods: 2.0×105 HEK293T cells were plated in each well of a 6-well plate containing a 10% poly L lysine-coated coverslip and grown to 60% confluency. The cells were then transfected with a plasmid encoding GFP (Green Fluorescence Protein), using a standard calcium phosphate protocol in the presence or absence of chloroquine phosphate. GFP protein expression was observed by immunofluorescence microscopy and quantified with the help of Image J software. Results: We have shown that chloroquine phosphate can highly improve the efficiency of calcium phosphate-dependent transfection in the HEK293T cells, leading to an approximate 8-fold increase in the number of transfected cells. Chloroquine phosphate was not toxic to the cells, however, its positive effect on transfection efficiency was abolished in the presence of glycerol or DMSO (Dimethyl sulphoxide). Conclusion: we recommend chloroquine phosphate for increasing the efficiency of transfection by the inexpensive method of calcium phosphate. In addition, we recommend that chloroquine phosphate to be used alone and not along with other inducers of cell transfection.
کلیدواژه‌ها [English]
- Chloroquine phosphate
- Transfection
- HEK293T cells
مقدمه
ترانسفکشن سلولها به فرآیندی اطلاق میگردد که در طی آن یک ماده ژنتیکی بهصورت DNA یا RNA بهدرون سلولها فرستاده میشود (1). حاملین مولکولی مختلفی برای ترانسفکشن سلولهای پستانداران مورد استفاده قرار گرفته اند. این حاملین معمولا دارای بار الکتریکی مثبت هستند و بهدنبال اتصال با DNA توسط پدیده آندوسیتوز وارد سلول میشوند. لیپوزومها حاملین بسیار خوبی برای انتقال مواد ژنتیکی مانند DNA هستند زیرا انواع مختلف سلولها را میتوان توسط آنها ترانسفکت کرد و این ترانسفکشن معمولا با کارایی مناسب صورت میگیرد و اثرات سمی نسبتا کمی بر سلولها دارد (4-2). با اینحال عواملی مانند سلامت سلولها- کیفیت و کمیت ماده ژنتیکی- سرم موجود در محیط کشت- روش تهیه لیپوزوم و در نهایت مدت زمان ترانسفکشن از عواملی هستند که ممکن است کارایی ترانسفکشن توسط لیپوزومها را کاهش دهند (5 و 6). بهعلاوه لیپوزومها حاملین بسیار گران قیمتی هستند.
اولین روش ترانسفکشن وابسته به فسفات کلسیم توسط دانشمندانی بهنامهای Graham و van der Eb معرفی شد (7). این روش وابسته به مخلوط کردن DNA با محلولی از کلرید کلسیم است. سپس این مخلوط به یک محلول بافری سالین/ فسفات (saline/phosphate) اضافه میگردد و در دمای اتقاق نگهداری میشود تا رسوبات DNA با کلسیم تشکیل گردد. سپس محلول حاوی این رسوبات به کشت سلولها اضافه میگردد که در نتیجه آن سلولها توسط پدیده آندوسیتوز رسوبات ریز DNA/کلسیم را به خود جذب نموده و از طریق آندوزومها (endosomes) DNA به هسته سلول منتقل میگردد (2 و 8).
علیرغم کارایی پایین روش فسفات کلسیم در ترانسفکشن سلولها و نیز حساسیت این روش به ,pH حرارت و تغییر غلظت سالین، این روش برای ترانسفکشن انواع مختلفی از سلولهای حیوانی مورد استفاده قرار گرفته است (6 و 9). بهعلاوه این روش ساده و ارزان قیمت است و در میان سایر روشهای ترانسفکشن تنها روشی است که از یونهای کوچکی که بهطور طبیعی در محیط کشت سلول وجود دارند استفاده میکند (9 و 10).
در این مقاله ما نتایج دیگر دانشمندان را مورد تایید قرار داده و نشان دادیم که کیفیت پائین ترانسفکشن توسط روش کلسیم فسفات میتواند بهمیزان قابل ملاحظهای توسط مادهای بهنام فسفات کلروکین (chloroquine phosphate) که یک داروی ضد مالاریا است (11) بهبود یابد. افزودن فسفات کلروکین با غلظت 25 میکروگرم در هر میلیلیتر (mg/ml) کارایی ترانسفکشن سلولهای HEK293T را به میزان قابل ملاحظهای (تا 8 برابر) افزایش داد و جالب آنکه در این شرایط سلولها سلامت خود را حفظ کردند و کاهشی در حیات سلولها مشاهده نگردید. بهعلاوه، نتایج ما نشان داد که گلیسرول و یا دی متیل سولفوکسید (DMSO, Dimethyl sulphoxide) که از محرکهای ترانسفکشن سلولها محسوب میشوند، اثرات افزایشی فسفات کلروکین در ترانسفکشن سلولها را از بین میبرند.
مواد و روشها
کشت سلول و ترانسفکشن: رده سلولی HEK293T از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری شد. دویست هزار سلول (2 X 105) HEK293T در هر یک از خانههای یک ظرف 6 خانهای (مخصوص کشت سلولهای جانوری) که حاوی یک لامل پوشیده از پلیاللیزین بود کاشته شدند و سلولها در انکوباتور کشت سلول با شرایط استاندارد، در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد دی اکسید کربن و رطوبت مناسب کشت داده شدند. برای کشت سلولها از محیطDMEM حاوی 10 درصد سرم گوساله (FBS, fetal bovine serum) و آنتی بیوتیک (100 میکروگرم در میلیلیتر پنی سیلین و 100 واحد در میلیلیتر استرپتومایسین) استفاده شد. هنگامیکه سلولها تقریبا به تراکم رشدی 60 درصد (confluency) رسیدند، محیط کشت سلولها با محیط تازه حاوی 25 میکروگرم در میلی لیتر فسفات کلروکین (Ipca laboratories, India) تعویض گردید. در آزمایشهایی که اثرات گلیسرول و یا DMSO مورد ارزیابی قرار گرفت، هر یک از آنها بهمیزان درصد حجمی 10 درصد به محیط کشت سلولها اضافه شدند. بعد از 2 ساعت سلولها با 2 میکروگرم از یک حامل پلاسمیدی رمز کننده پروتئین GFP (Green Fluorescence Protein) ترانسفکت شدند. یک روش استاندارد وابسته به فسفات کلسیم برای ترانسفکشن سلولها مورد استفاده قرار گرفت (12). 6 ساعت بعد از ترانسفکشن، محیط سلولها با محیط فاقد فسفات کلروکین تعویض شد و 36 ساعت بعد سلولها برداشت شدند و برای بیان پروتئین GFP با استفاده از میکروسکوپ فلوئورسنس (Zeiss, Germany) مورد بررسی قرار گرفتند.
آنالیز بیان پروتئین GFP با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (immunofluorescence microscopy): سلولهای ترانسفکت شده با پلاسمید GFP بعد از برداشت، با محلول (PBS, phosphate-buffered saline) شستشو داده شدند و سپس در محلول 4 درصد پارافرمالدئید (در PBS) بهمدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق ثابت (fix) شدند. سلولها مجددا شستشو داده شدند و توسط محلول 2/0 درصد تریتون X-100 در PBS بهمدت 3 دقیقه نفوذ پذیر شدند. لاملهای حاوی سلول سپس دو بار (هر بار 5 دقیقه) توسط محلول PBS شستشو داده شده و سپس هر کدام از آنها بر روی یک اسلاید میکروسکوپی تمیز حاوی یک قطره کوچک از محیط چسبنده شامل 90 درصد گلیسرول و 10 درصد PBS (mounting medium) قرار گرفتند. کنارههای لاملها توسط لاک ناخن مسدود شده و سپس توسط میکروسکوپ فلورسانس (Zeiss, Germany) مورد مشاهده قرار گرفتند. میزان تجلی پروتئین GFP توسط نرم افزاز image J مورد اندازه گیری کمی قرار گرفت و اندیکس تجلی پروتئین همانند روش توضیح داده شده در منبع شماره 13 محاسبه گردید (13).
نتایج
بسیاری از ردههای سلولی میتوانند توسط رسوبات DNA/فسفات کلسیم ترانسفکت شوند که این رسوبات به سطح سلول میچسبند و توسط پدیده آندوسیتوز وارد سلول میشوند (14). برای مطالعه نقش فسفات کلروکین در کارایی ترانسفکشن، سلولهای HEK293T با پلاسمید تجلی دهنده پروتئین GFP (حامل cDNA ژن GFP) و با یک روش استاندارد وابسته به فسفات کلسیم ترانسفکت شدند (12). ژن GFP که پروتئین Green Flouroscent Protein را تجلی میدهد بهطور گسترده بهعنوان یک ژن گزارشگر (reporter gene) در مطالعات بیان ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفته است (15). تیمار با فسفات کلروکین تا 8 برابر میزان ترانسفکشن سلولها را افزایش داد در حالیکه تیمار سلولها با گلیسرول و یا DMSO تاثیری بر ترانسفکشن سلولها نداشت (شکل 1).
شکل 1: الف) نتیجه یکی از آزمایشات ایمونوفلورسانس که در آن، سلولهای HEK293T با پلاسمید کد کننده پروتئین GFP (Green Flouroscent Protein) همانند روش توضیح داده شده در قسمت "مواد و روشها" ترانسفکت و با موادی که در شکل معرفی شده اند تیمار شدهاند. ب) نمودار معرف نوع تیمار سلولهای ترانسفکت شده و همینطور معرف میزان بیان ژن GFP در سلولها می باشد که توسط نرم افزار Image J اندازهگیری شده است. متوسط اندازهگیری نتایج سه آزمایش مختلف (همانند آزمایش نشان داده شده درالف، در این شکل نشان داده شده است.
جالب آنکه تیمار سلولها با گلیسرول و یا DMSO بهطور کامل باعث از بین رفتن اثر افزایشی فسفات کلروکین بر ترانسفکشن سلولها شد که بیانگر آنست که هر یک از این دو ماده به نوعی باعث از بین رفتن اثر فسفات کلروکین بر ترانسفکشن سلولها میگردد (شکل 1).
اندازهگیری میزان ترانسفکشن بر اساس تعداد سلولهای ترانسفکت شده و شدت بیان ژن GFP مورد ارزیابی قرار گرفت که هر دو این عوامل در حضور فسفات کلروکین افزایش پیدا کردند. شدت بیان ژن GFPتوسط نرم افزار Image J مورد اندازهگیری قرار گرفت.
ما همچنین در این مطالعه دریافتیم که تیمار سلولهای HEK293T با غلظت 25 میکروگرم در میلیلیتر (mg/ml) فسفات کلروکین بهمدت 6 ساعت (بعد از ترانسفکشن) باعث هیچگونه کاهشی در بقای سلولها نمیشود (شکل 2).
شکل 2: الف) نمونهای از رنگ آمیزی هسته سلولها با رنگ DAPI (diamidino-2-phenylindole). این شکل جمعیت سلولها را در حالت تیمار شده و تیمار نشده با فسفات کلروکین مورد مقایسه قرار میدهد. ب) نمودار بیانگر اندازهگیری کمی نتایج است.
بحث
ترانسفکشن سلولها با روش وابسته به فسفات کلسیم روشی آسان و از نظر اقتصادی به صرفه است. با اینحال کارایی این روش برای بعضی از سنجشهای آزمایشگاهی کافی نیست (16). در این مطالعه ما نشان میدهیم که فسفات کلروکین بهمیزان قابل ملاحظهای کارایی ترانسفکشن سلولهای HEK293T را با روش فسفات کلسیم افزایش میدهد.
فسفات کلروکین مادهای است که مدتهاست در درمان مالاریا مورد استفاده قرار گرفته است (17). گزارشاتی است مبنی بر اینکه غلظتهای بالای این ماده و یا در معرض قرار گرفتن طولانی مدت سلولها با این ماده برای سلولها سمی است و باعث مرگ آنها میگردد (18). با اینحال در غلظت مورد استفاده در این مطالعه (25 میکروگرم در میلیلیتر) و زمان ترانسفکشن (6 ساعت)، فسفات کلروکین هیچگونه اثر سمی بر سلولهای HEK293T نداشت.
بازدارندگی تجزیه DNA توسط فسفات کلروکین یکی از مکانیسمهای محتمل در افزایش میزان ترانسفکشن توسط این ماده میباشد. در طی ترانسفکشن، اکثر مولکولهای پلاسمید از طریق پدیده آندوسیتوز وارد سلول می شوند و در این مرحله DNA ممکن است قبل از آنکه به هسته سلول برسد بهعلت ادغام اندوزوم (endosome) و لیزوزوم (lysosome) توسط آنزیمهای نوکلئاز لیزوزومال مورد تجزیه واقع گردد (19). ادغام اندوزوم و لیزوزوم میتواند توسط عوامل لیزوزوموتروپیک مانند فسفات کلروکین، که از ادغام اندوزوم و لیزوزوم ممانعت میکنند، جلوگیری شود (لازم به ذکر است که مواد لیزوزوموتروپیک موادی هستند که بهطور ترجیحی در لیزوزومها تجمع پیدا میکنند) (8). در حقیقت فسفات کلروکین میتواند pH اندوزوم را تنظیم کند و فرآیند اسیدی شدن را بر هم بزند و بنابراین باعث افزایش اسمولاریته و در نهایت پارگی وزیکولها گردد که در نتیجه آن DNA پلاسمیدی بهداخل سیتوپلاسم آزاد میگردد (9 و 10).
این نکته قابل ذکر است که فسفات کلروکین کارایی ترانسفکشن سلولهای سرطانی کولون (SW480) و سلولهای سرطانی پروستات (PC-3) را افزایش نداد. دلیل این امر میتواند تفاوت در خصوصیات بیولوژیک (مانند تراوایی غشایی) میان سلولهای HEK293T و سلولهای ذکر شده باشد. بنابراین بهنظر میرسد که ماده فسفات کلروکین بهطور ترجیهی تنها باعث افزایش ترانسفکشن عدهای از سلولها میشود.
فسفات کلروکین اول بار برای ترانسفکشن سلولها با DNA ویروس پولیوما مورد استفاده قرار گرفت (20) و از آن زمان تاکنون بهعنوان یک ماده موثر در ترانسفکشن برای عده ای از سلولهای پستانداران مورد استفاده قرار گرفته است (21و 22). میزان افزایش کارایی ترانسفکشن توسط فسفات کلروکین به نوع سلول- محیط کشت و روش ترانسفکشن بستگی دارد و بنابراین محققین دیگری که از فسفات کلروکین برای تحریک ترانسفکشن سلولی استفاده کردهاند میزان افزایش متفاوتی را تجربه کردهاند. برای مثال در مورد رده سلولی استئوسارکوما افزایش 3 برابری ترانسفکشن توسط فسفات کلروکین گزارش شده است (22) و یا گروه دیگری توانستهاند ترانسفکشن سلولهای رت را با DNA ویروس پولیوما تا 6 برابر توسط فسفات کلروکین افزایش دهند (20). گروه دیگری ترانسفکشن سلولهای CHO (Chinese hamster ovary) را با پلاسمید pSV2neo توسط فسفات کلروکین تا 20 برابر افزایش دادهاند (21). با روش توضیح داده شده در این مقاله ما نشان میدهیم که کارایی ترانسفکشن سلولهای HEK293T بهطور قابل ملاحظهای تا 8 برابر میتواند توسط فسفات کلروکین افزایش یابد. بهعلاوه ما نشان میدهیم که دو ماده گلیسرول و یا DMSO (که هر دو بهعنوان محرکهای ترانسفکشن سلولها شناخته شدهاند) اثر افزایشی ترانسفکشن توسط فسفات کلروکین را از بین میبرند. بنابراین با توجه به نتایج فوق توصیه نمیکنیم که این محرکها توام با فسفات کلروکین مورد استفاده
قرار گیرند.
نتیجه گیری
بهطور خلاصه با توجه به استفاده گسترده از سلولهای HEK293T در مطالعات بیان ژنتیکی, ما فسفات کلروکین را بهعنوان یک ماده با ارزش برای افزایش کارایی ترانسفکشن توسط روش ارزان قیمت فسفات کلسیم توصیه میکنیم. با اینحال با توجه به نتایج این مقاله پیشنهاد میگردد که فسفات کلروکین بهعنوان تنها محرک در واکنش ترانسفکشن مورد استفاده قرار گیرد و از استفاده توام آن با سایر محرکها مانند گلیسرول و DMSO خودداری گردد.
تشکر و قدردانی
حامل پلاسمیدی رمز کننده پروتئین GFP بهصورت اهدایی از دکتر Peter Klein (از دانشگاه پنسیلوانیا در کشور آمریکا) دریافت گردید. اینکار توسط طرح پژوهشی شماره 31/86103 صندوق حمایت از پژوهشگران ریاست جمهوری و معاونت پژوهشی دانشگاه تهران مورد حمایت مالی قرار گرفته است.
- Bassani-Molinas MM. Transient transfection of HEK293 cells in suspension: process characterization and optimization by applying invasive nucleotide and non-invasive electronic nose technology. Doctoral thesis. Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig, Germany. 2003.
- Jordan M, Schallhorn A, Wurm FM. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucl Acid Res. 1996; 24(4): 596-601.
- Wordragen MV, Shakya R, Verkerk R, Peytavis R, et al. Liposome-mediated transfer of YAC DNA to tobacco cells. Plant Mol Biol Rep. 1997; 15: 170-178.
- Lonez C,VandenbrandenM, RuysschaertMJ. Cationic liposomal lipids: From gene carriers to cell signalingProgress. Lipid Res. 2008; 47(5): 340-347.
- Felgner JH, Kumar R, Sridhar CN, Wheeler CJ, et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J Biol Chem. 1994; 269: 2550-2561.
- Gavrilescu LC, Van Etten RA. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. 2007; 10: 550.
- Graham FL, van der Eb AJ. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 1973; 52: 456-467.
- Moore NM, Sheppard CL, Sakiyama-Elbert SE. Characterization of a multifunctional PEG-based gene delivery system containing nuclear localization signals and endosomal escape peptides. Acta Biomaterialia. 2009; 5: 854-564.
- Erbacher P, Roche AC, Monsigny M, Midoux P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Exp Cell Res. 1996; 225: 186-194.
10. Wolfert MA, Seymour LW. Chloroquine and amphipathic peptide helices show synergistic transfection in vitro. Gene Ther. 1998;5(3): 409-414.
11. Bruce Chwatt, L.J. Essential malariology; 2th Ed. John Wiley &.
Sons Inc. New York, NY. 1985.
12. Pear WS, Nolan GP, Scott ML, Baltimore D. Production of high-titer helper free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90(18): 8392-8396.
13. Kang Y, Saile E, Schell MA, Deny TP. Quantitative immunofluorescence of regulated eps gene expression in single cells of Ralstonia solanacearum. Appl Environ Microbiol 1999; 65: 2356-2362.
14. Welzel T, Radtke T, Meyer-Zaika W, Heumannb R, et al. Transfection of cells with custom-made calcium phosphate nanoparticles coated with DNA. J Mat Chem. 2004; 14: 2213-2217.
15. TsienRY. The green fluorescent protein, Ann Rev Biochem. 1998;67: 509-544.
16. Kingston RE, Chen CA, Rose JK. Calcium phosphate transfection. Curr Prot Mol Biol. 2003; Chapter 9: Unit 9.1.
17. Cooper RG, Magwere T. Chloroquine: Novel uses and manifestations. Indian J Med Res. 2007;127: 305-316.
18. Boya P, Gonzalez-Polo RA, Poncet D, Andreau K, et al. Mitochondrial membrane permeabilization is a critical step of lysosome-initiated apoptosis induced by hydroxychloroquine. Oncogene 2003; 22: 3927-3936.
19. Ciftci K, Levy RJ. Enhanced plasmid DNA transfection with lysosomotropic agents in cultured fibroblasts. Int. J. Pharmaceutics. 2001; 218(1-2): 81-92.
20. Luthman H, Magnusson G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucl Acid Res. 1983; 11(5): 1295-1308.
21. Mazahir T, Hasan RS, Chang TY. High-efficiency stable gene transfection using chloroquine-treated Chinese hamster ovary cells. Soma Cell Mol Genet. 1991; 17: 513-517.
22. Karikó K, Kuo A, Barnathan ES, Langer DJ. Phosphate-enhanced transfection of cationic lipid-complexed mRNA and plasmid DNA. Biochim Biophys Acta. 1998; 1369(2): 320-334.
)