مقدمه

کلیه یک اندام با پیچیدگی بالا می‏باشد که بیش از 30 نوع سلول مختلف را در بخش‏های متفاوت می‏سازد و دارای دو وظیفه مهم می‏باشد: یکی پاک کردن بدن از مواد زاید که یا خورده می‏شوند یا توسط متابولیسم تولید می‏شوند، عمل دوم که به‏ویژه جنبه حیاتی دارد کنترل حجم و ترکیب مایعات بدن است زیرا تعادل آب و عملا تمام الکترولیت‏ها در بدن بین مقدار ورودی و خروجی تا حدود زیادی توسط کلیه‏ها حفظ می‏شود (1و 2). بیماری‏های کلیوی در میان مهم‏ترین علل مرگ و معلولیت در بسیاری از کشورها در سراسر جهان می‏باشند. آسیب کلیوی حاد (AKI) یک بیماری سخت و معمولا با یک نسبت مرگ و میر بالا می‏باشد که توسط مسمومیت یا ایسکمی ناشی از شیمی درمانی، آنتی بیوتیک‏ها و شوک ایجاد شده توسط عفونت و جراحی‏های مهم اتفاق می‏افتد (3، 4 و 5). AKI می‏تواند منجر به ناکار آمدی و آپوپتوزیس و همچنین نکروز در سلول‏های اپی‏تلیال توبولار کلیوی، همچنین کاهش در سلول‏های اندو‏تلیال کلیوی شود (5) .در کلAKI  با یک کاهش سریع در نسبت فیلتراسیون گلومرولی شناخته می شود که توسط کاهش هم در فاکتورهای رگی و هم توبولار تعیین می‏شود و شامل افزایش انبساط رگی کلیوی، کاهش خود تنظیمی و انسداد توبولار می‏باشد (6 و 7) .آسیب کلیوی حاد بطور بالقوه یک بیماری قابل برگشت است. در اکثریت بیماران، AKI به‏طور موثری بهبود می‏یابد و هیچ‏گونه پیامد بالینی ندارد، اما در تعداد معدودی از بیماران، AKI به‏طور ناقص بهبودیافته و این بیماران یا دیالیز می‏کنند و یا به‏سوی بیماری کلیوی مزمن (CKD) پیشرفت می‏کنند که هم AKI و هم CKD دارای هزینه بالا و بار بهداشتی برای جامعه هستند. هفت درصد کل بیماران بستری شده در بخش مراقبت‏های ویژه به‏دلیل AKI بوده است (8)، به همین جهت جستجو برای ایجاد روش‏های نوین درمان AKI صورت گرفته است. مطالعات اخیر، تکنولوژی بر پایه سلول‏های بنیادی را مورد آزمایش قرار داده‏اند که جنبه‏های جالبی از درمان قدر تمند اندام‏های آسیب‏دیده شدید به‏وسیله خاصیت منحصر به فرد سلول‏های بنیادی را ایجاد کرده است (9، 10 و 11). که در این بین سلول‏های بنیادی مزانشیمی (MSCs) سلول‏های با قابلیت کاربردهای درمانی و ترمیمی بالا برای بافت‏های آسیب‏دیده می‏باشند که شامل درمان AKI نیز می‏شود (12 و 13). همچنین محققان دریافتند که MSCs یک تعداد از فاکتورهایی که به‏عنوان فاکتورهای محافظت کننده کلیه شناخته می‏شوند را ترشح می‏کنند و بدین وسیله مکانیسم‏های پاراکرین و اندوکرین را ایجاد می‏کند که احتمالا از همین طریق سلول‏های بنیادی مزانشیمی اثرات تحریک کننده ترمیمی را اعمال می‏کنند (14، 15 و 16). تعدادی از این فاکتورها شامل فاکتور رشد اپیدرمال ((EGF، فاکتور رشد هپاتوسیت ((HGF، فاکتور رشد شبه انسولین-1 ((IGF-1، فاکتور رشد اندوتلیال رگی ((VEGF و غیره می‏با‏شند (17 و 18). این فاکتورهای بیواکتیو موجب سرکوب سیستم ایمنی موضعی، مهار فیبروز و آپاپتوز، افزایش (Angogenesis) و تحریک تکثیر و تمایز می‏شوند (19). چندین مطالعه توسط فاکتورهای رشد پلی پپتید در حمایت از ترمیم کلیوی انجام شده است. در یک مطالعه محیط کشت مفید (Conditioned medium) را از سلول‏های بنیادی مشتق شده از مغز استخوان موش جداسازی و به موش‏های دارای AKI القا شده با  (Cisplatin)تزریق شد، مشاهده کردند که  (Conditioned medium)بهبود دهنده عمل‏کرد کلیوی، افزایش دهنده تکثیر سلولی توبولار و محدود کننده آپوپتوزیس سلول‏های کلیوی می‏باشند (15). Togel و همکارانش (20) نیز معتقدند سلول بنیادی مزانشیمی ممکن است در حفاظت از توبول کلیوی شر‏کت کند بدون این‏که به‏طورمستقیمی در ترمیم تو‏بول دخالت کند. آن‏ها نتیجه گرفتند تزریق سلول‏های بنیادی مزانشیمی می‏تواند فا‏کتور رشد هپاتوسیت (HGF)، فا‏کتور رشد اندوتلیال رگی (VEGF) و فاکتور رشد شبه انسولین1 (IGF-1) را تر‏شح کند که می‏تواند داخل مویر‏گ های ریز آسیب دیده جایگزین شود و آپوپتوزیس را مهار کند. این یک جنبه مهم از محا‏فظت القا شده توسط MSC در برابرischemia/reperfusion)) ARF وAKI ‏ از طریق عمل پاراکرین می‏باشد. شناسایی فاکتورهایprotective  خاص ترشح شده به‏وسیله MSCs با استفاده از روش‏های ژنومیک یا پروتئومیک ممکن است فرصت‏هایی را برای کشف راه‏های درمانی جدید و توسعه درمان‏های مولکولی و دارویی جدید فراهم آورد (21).

توانایی کلیه‏ها برای تغلیظ و متابولیزه مواد شیمیایی باعث می‏شود کلیه‏ها به‏طور ویژه‏ای مستعد آسیب توکسیک باشند. آنتی بیوتیک جنتامایسین از خانواده آنتی‏بیوتیک‏های آمینو‏گلیکوزید می‏باشد که به‏طور وسیعی در درمان انواعی از عفونت‏ها که توسط باکتری‏های گرم منفی و (Endocarditis) ایجاد می‏شوند به‏کار می‏رود. با این‏حال، ارزش درمانی آن به‏وسیله نفروتوکسیستی محدود می‏شود و این اتفاق در 20 تا 30 درصد بیمارانی که جنتامایسین را دریافت کرده‏اند رخ می‏دهد (22 و 23). از این جهت، برای ساخت مدل‏های نفروتوکسیستی در مطالعات کشت سلول و حیوانات آزمایشگاهی استفاده می‏شود (24، 25 و 26). نفروتوکسیستی جنتامایسین توسط آسیب توبولار پروکسیمال و زوال عمل‏کردی کلیه شناخته می‏شود و منجر به آپوپتوزیس، نکروز و اتساع توبولار می‏شود (23). در این مطالعه سعی شده است با استفاده از نفروتوکسیک شناخته شده به‏نام جنتامایسین ابتدا مدل تایید شده‏ای از بیماری حاد کلیوی ساخته شود و سپس با تیمار حیوانات بیمار با محیط کشت مفید حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیمی (conditioned medium - (MSCs  چگونگی تاثیرات این ماده بر روند بیماری حاد در کلیه مورد بررسی قرار گیرد.

مواد و روش‏ها

حیوانات: در این مطالعه تجربی، از رت بالغ نر نژاد ویستار (wistar rat) که در اتاق حیوانات دانشگاه خوارزمی نگه‏داری شده بودند استفاده شد. رت‏ها در اتاق حیوانات با دمای کنترل شده 2±25 سانتی‏گراد و دوره نوری12 ساعت روشنایی و12 ساعت تاریکی نگه‏داری شدند. آب و غذای کافی همواره در دسترس آن‏ها قرار داشت. آزمایشات روی تمام گروه‏های مورد بررسی در شرایط کاملا یکسان و مطابق اصول اخلاقی کار  با حیوانات آزمایشگاهی صورت گرفت.

تهیه محیط کشت مفید حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیمی انسانی :(hMSC - Conditioned Medium)بعد از این‏که سلول‏های بنیادی مزانشیمی کاملا سطح فلاسک را پرکردند،20 میلی‏لیتر محیط کشت تازه α-MEM (Cat No.22571-020,alpha MEM,Gibco) حاوی10 درصد سرم‏گاوی‏ جنینی‏ (Fetal bovine serum:FBS)(Cat No.SH30070.03,Thermo Scientific,USA) و1 درصد پنی سیلین و استرپتومایسین (Cat No.15070-063,Gibco) به‏مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و Co2 5 درصد برروی سلول‏ها انکوبه شد. با اتمام زمان انکوباسیون محیط رویی سلول‏ها جهت تیمار حیوانات مورد استفاده قرار گرفت. برای هر کیلوگرم وزن بدن، محیط کشت حاصل از10⁶ × 5‏ سلول، در نظر گرفته شد و به حیوانات تزریق گردید.

ساخت مدل حیوانی: جهت دستیابی به مدل حیوانی استاندارد از تعدادی موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن تقریبی 180 تا 250 گرم استفاده گردید. یک گروه شش‏تایی از موش‏ها به‏عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شد که در این گروه هیچ تزریقی صورت نگرفت. در گروه دوم ده عدد موش قرار گرفت که برای شش روز متوالی به آن‏ها داروی جنتامایسین با دوز 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏صورت داخل صفاقی تزریق شد. بعد از این دوره هر روز یک موش جهت خون‏گیری از قلب با تزریق محلول کتامین و زایلازین بی‏هوش شد و با تهیه سرم خون جانور میزان کراتینین (Cr) و نیتروژن اوره خون (BUN) حیوان به‏مدت ده روز مورد بررسی قرار گرفت. همچنین کلیه حیوانات برای مطالعات هیستولوژیکی خارج و در فرمالین 10 درصد نگه‏داری شدند. (به‏دلیل برداشت کلیه در گروه‏ها و مرگ و میر حیوانات نمونه‏گیری از این حیوانات لحظاتی قبل از مرگ صورت گرفت). درگروه مدل آزمایشات با شش بار تکرار صورت پذیرفت. درنهایت با بررسی میزان نیتروژن اوره خون (BUN)، کراتینین (Cr) و نسبت بین این دو، بالاترین میزان آن‏ها را طی دوره ده روزه به‏دست آورده و به‏عنوان روز اوج اثر داروی جنتامایسین در نظر گرفته شد که نشان دهنده بیشترین میزان آسیب جاندار در این روز می‏باشد و به‏عنوان دوره حاد بیماری تعریف می‏شود (با بررسی نتایج در این مطالعه روز سوم به‏عنوان روز اوج اثر جنتامایسین در نظر گرفته شد).

تیمار حیوانات دارای ‏آسیب حاد کلیوی با استفاده از محیط کشت مفید حاصل سلول‏های بنیادی مزانشیمی ((MSCs-conditioned medium: پس از ایجاد مدل حیوانی استاندارد، حیوانات به چهار گروه 6 تایی تقسیم شدند. گروه اول به‏عنوان کنترل در نظر گرفته شد که هیچ تزریقی در آن‏ها صورت نگرفت و به گروه دوم برای ایجاد مدل نارسایی حاد کلیوی تنها جنتامایسین تزریق شد که این دو گروه در بخش مدل سازی توضیح داده شدند. گروه سوم به‏عنوان گروه تجربی در نظر گرفته شد. درگروه تجربی علاوه بر تزریق جنتامایسین، MSCs-conditioned medium 24 ساعت قبل از تزریق جنتامایسین و در سه روز متوالی به‏صورت داخل صفاقی به حیوانات تزریق شد. درگروه چهارم که شم نامیده شد، حیوانات جنتامایسین و کنترل مدیا (محیط کشت فاقد فاکتورهای ترشحی) را نیز مانند گروه قبل به‏صورت داخل صفاقی 24 ساعت قبل از تزریق جنتامایسین و در سه روز متوالی دریافت کردند. شایان ذکر است در این مطالعه در تمام گروه‏هایی که جنتامایسین دریافت کرده‏اند علاوه بر بررسی در روز سوم پس از تزریق که روز اوج تاثیر جنتامایسین به‏حساب می‏آید روز پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین نیز مورد مطالعه قرار گرفت (در همه گروه‏ها آزمایشی شش بار تکرار صورت پذیرفت).

مطالعات بافت‏شناسی: نمونه‏های بافتی مطابق روش‏های معمول پردازش شده و پس از قالب‏گیری با پارافین، برش‏های با ضخامت  4 تا 6 میکرون از آن‏ها تهیه شد. اسلایدهای تهیه شده با روش هماتوکسیلین _ ائوزین رنگ‏آمیزی و سپس میزان آسیب بافتی با استفاده از استانداردهای تهیه شده در مطالعات قبلی مطابق با جدول شماره1، 2 و3 کمی شد و مورد بررسی قرار گرفت.

جدول 1: نحوه امتیازدهی برای تعیین درجه تورم حاد سلولی و نکروز لوله‏های ادراری

*** در هر مقطع از کلیه‏ها 150 لوله به‏طور تصادفی شمارش شدند.

جدول 2: نحوه ارزیابی کست هیالین

*** برای ارزیابی کست هیالن، 10 شان میکروسکوپی شمارش گردید.

جدول3: نحوه ارزیابی تجمع سلول‏های آماسی

*** برای ارزیابی تجمع سلول‏های آماسی، 10 شان میکروسکوپی شمارش گردید

آزمون‏های بیوشیمیایی سرم: پس از خون‏گیری و تهیه سرم حیوانات مورد نظر، میزان Cr (کراتینین) وBUN  (نیتروژون اوره خون) که از مهم‏ترین مارکرهای سرمی آسیب کلیوی می‏باشند با استفاده از کیت‏های تولیدی شرکت زیست‏شیمی و دستگاه آنالیزر اندازه‏گیری شدند.

آنالیزهای آماری: نتایج به‏دست اماده توسط نرم افزار               16. SPSSو آزمون واریانس یک‏طرفه با تست Post  Hoc Tukey  و با سطح معنی‏داری (05/0 P≤) آنالیز و به‏صورت SE)  (Mean ± بیان شدند.

نتایج

صحت القای مدل

مطالعات داروشناختی روی بیماری‏های کلیه نیازمند دستیابی به مدل‏های حیوانی مناسب می‏باشد که مقلد شرایط پاتوفیزیولوژیک بیماری باشند. از این‏رو در این مطالعه جهت اطمینان از صحت القای مدل، آزمایشی مطابق آنچه در روش کار ارایه نمودیم طراحی شد. نتایج پس از القای مدل نشان داد که تزریق جنتامایسین با دوز 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم در یک دوره شش روزه باعث افزایش معنی‏دار (001/0P≤) کراتینین‏ (نمودار1) و نیتروژن اوره خون (نمودار2) در روزهای سوم و پنجم پس از تزریق جنتامایسین نسبت به گروه کنترل شده است. همچنین کراتینین درروز هشتم پس از تزریق جنتامایسین دارای سطح معنی دار (0.05 P≤) نسبت به گروه کنترل می‏باشد (نمودار1). لازم به ذکر است با درنظر گرفتن بالاترین مقادیر BUN (نیتروژن اوره خون)‏، کراتینین و نسبت بین این دو طی دوره ده روزه بررسی پس ازتزریق جنتامایسین، روز سوم، روز اوج اثر جنتامایسین برحیوان می‏باشد که به‏عنوان دوره حاد بیماری در نظر گرفته شد.

نتایج حاصل از مارکرهای بیوشیمیایی خون نشان دهنده القای آسیب بودند. مطالعات بافت‏شناسی نیز حاکی از تورم حاد سلولی، نکروز لوله‏های ادراری، تجمع سلول‏های آماسی و کست هیالین در گروه مدل (گروه دریافت کننده جنتامایسین) نسبت به گروه کنترل می‏باشد (شکل1: C، D). درحالی ‏که بافت کلیه در گروه کنترل کاملا طبیعی به‏نظر می‏رسید و هیچ آسیبی دیده نمی‏شد (شکل1:B، A). با توجه به مطالعات گذشته در القای مدل حاد کلیوی‏، نتایج ما نشان دادند این میزان از              داروی جنتامایسین می‏تواند مدل مناسبی از بیماری حاد    کلیوی را القا کند. به‏عبارتی یافته‏های ما موید صحت روند مدل‏سازی انجام شده بودند از این‏رو با القای بیماری         به‏روش آزموده شده در مدل‏سازی و تیمار حیوانات با       hMSC – conditioned medium تاثیرآن بر بیماری حاد کلیوی بررسی شد.

نمودار1: میزان تغییرات کراتینین (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) سرم خون، طی دوره ده روز پس از  تزریق جنتامایسین نسبت به گروه کنترل: (05/0*p<) (01/0**p<) (001/0***p<)

نمودار2: میزان تغییرات نیتروژن اوره (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) سرم خون،طی دوره ده روز پس از  تزریق جنتامایسین نسبت به گروه کنترل: (05/0*p<) (01/0**p<) (001/0***p<)

(٭لازم به ذکراست با درنظر گرفتن بالاترین مقادیر BUN‏، کراتینین و نسبت بین این دو طی دوره ده روزه بررسی پس از تزریق جنتا‏مایسین‏، روزسوم روز اوج اثرجنتامایسین برحیوان می‏باشد که به‏عنوان دوره حاد بیماری در نظر گرفته شد.)

شکل1: بررسی صحت القای آسیب حاد کلیوی به‏وسیله آنالیز بافت شناسی کلیه حیوانات مورد آزمایش. A و:Bمیکروگراف نوری ازکلیه حیوانات گروه کنترل، بافت کلیه در قمست قشر (A) و مدولا (B) کاملا طبیعی به‏نظر می‏رسد و هیچگونه آسیبی مشاهده نمی‏شود. C وD‏: میکروگراف نوری از بافت کلیه حیوانات گروه دریافت کننده جنتامایسین (مدل)، نکروز لوله‏‏های ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی) و تجمع سلول‏‏های آماسی (پیکان نارنجی) در بخش قشری کلیه (شکل C) و همچنین کست هیالین (پیکان زرد) در بخش مدولا کلیه (شکل D) به‏وضوح قابل مشاهده می‏باشد.رنگ‏آمیزیهماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.

بررسی اثر محیط کشت مفید حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیمی انسانی(conditioned medium- (hMSC برمیزان نیتروژون اوره خون (BUN) وکراتینین (Cr) سرمی بعد از تیمار با جنتا‏مایسین

بررسی در گروه‏های آزمایشی در روز سوم پس از تزریق جنتامایسین نشان داد گرچه در گروه تجربی (جنتامایسین + محیط کشت مفید‏) کاهش اندکی در میزان Cr سرم خون نسبت به گروه مدل (جنتامایسین) و شم صورت پذیرفته است. اما فاقد سطح معنی‏دار می‏باشد (نمودار3). تغییرات BUN نیز در روز سوم مطالعه گویای این مطلب می‏باشد (نمودار4). درروز پنجم بعد ازتزریق جنتامایسین نیز هیچ کاهش معنی‏داری در میزان BUN و Crسرم خون نسبت به گروه مدل وشم دیده نشد (نمودار 3 و 4). همچنین مطالعه در روز هشتم پس از تزریق جنتامایسین در چهار گروه آزمایشی نشان داد میزان BUN  در گروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم بدون هیچ‏گونه تغییر معنی‏دار می باشد (نمودار4). اما میزان کراتینین سرم خون درگروه تجربی دارای کاهش با سطح معنی‏داری (001/0p<) نسبت به گروه جنتا‏مایسین و شم می‏باشد (نمودار3).

بررسی اثر محیط کشت مفید حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیم انسانی بر تغییرات بافتی کلیه بعد از تیمار با جنتامایسین

نمونه‏های بافتی مطابق روش‏های معمول پردازش شده و پس از قالب‏گیری با پارافین، برش‏هایی با ضخامت 4 تا 6 میکرون از آن‏ها تهیه شد. اسلایدهای تهیه شده با روش هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‏آمیزی شده و مورد بررسی قرار گرفتند. میزان تورم حاد سلولی، نکروز لوله های ادراری، تجمع سلول‏های آماسی و کست هیالین مطابق جداول 1، 2 و 3 کمی شد.

برطبق مطالعات، کلیه سالم درگروه کنترل بدون هیچ‏گونه آسیب بافتی در تمام قسمت های نفرون شامل گلومرول، لوله‏های پروکسیمال و دیستال در ناحیه قشری _ مرکزی می‏باشد (شکل1:B ، A). بررسی‏های بافت‏شناسی در روز سوم پس از تزریق جنتامایسین درگروه‏های آزمایشی نشان می‏دهد که در گروه تجربی برخلاف انتظار، تورم حاد سلولی و نکروز لوله‏های ادراری دارای افزایش معنی‏دار (001/0p<) نسبت به گروه مدل و شم می‏باشد. در حالی‏که تجمع سلول‏های آماسی در گروه‏ها‏ی آزمایشی در این روز تغییر چندانی را نشان نمی‏دهد. اما کست هیالین در گروه تجربی دارای کاهش معنی دار (001/0p<) نسبت به گروه جنتامایسین و شم می‏باشد (نمودار5 و شکل2).

نمودار3‏: بررسی اثر hMSC-CM برمیزان تغییرات کراتینین (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) در روزهای سوم ،پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین: hMSC – CM فقط در روز هشتم پس از تزریق جنتامایسین سبب کاهش کراتینین باسطح معنی‏داری (001/0▪▪▪p<) درگروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم شده است. درروزهای سوم وپنجم هیچ کاهش معنی‏داری درگروه تجربی نسبت به گروه شم وکنترل مشاهده نمی‏شود.                  { (001/0***p<)و(01/0**p<) سطح معنی‏داری گروه‏های آزمایشی را نسبت به گروه کنترل نشان می‏دهد.{

نمودار4‏: بررسی اثر hMSC-CM برمیزان تغییرات نیتروژن اوره (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) ‏در روزهای سوم‏، پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین: hMSC – CM درهیچ‏کدام از روزهای سوم، پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین منجر به کاهش معنی‏داری درسطح BUN (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر)سرم خون در گروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم نشده است.{ (05/0*p<)، (001/0***p<) سطح معنی‏داری گروه‏های آزمایشی را نسبت به گروه کنترل نشان می‏دهد.{

نمودار5:بررسی اثر hMSC-CM بر تغییرات بافتی کلیه در روز سوم پس از تزریق جنتا‏مایسین‏: در گروه تجربی برخلاف انتظار تورم حاد سلولی و نکروز لوله‏های ادراری دارای افزایش معنی‏دار (001/0p<***) نسبت به گروه مدل وشم می‏باشد. درحالی‏که تجمع سلول‏های آماسی در گروه‏ها‏ی آزمایشی در این روز تغییر چندانی را نشان نمی‏دهد. اما کست هیالین در گروه تجربی دارای کاهش معنی‏دار (001/0p<***) نسبت به گروه جنتامایسین و شم می‏باشد.

شکل 2: تاثیرhMSC- CM برتغییرات بافتی کلیه در حیوانات مدل آسیب حاد کلیوی القا شده با جنتامایسین در روز سوم مطالعه.A  وB: فتومیکروگراف از بافت کلیه درگروه جنتامایسین تیمار نشده باhMSC- CM ، نکروز لوله‏‏های ادراری، تورم حاد سلولی و تجمع سلول‏‏های آماسی در بخش قشر کلیه (A) و همچنین کست هیالین در قسمت مدولا (B)  در این روز مشهود می‏باشد.C  وD : فتومیکروگراف از بخش قشر و مدولا بافت کلیه در گروه تجربی که تنها نشان‏دهنده کاهش معنی‏داری در میزان کست هیالین در بخش مدولا در روز سوم مطالعه می باشد. {نکروز لوله‏‏های ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی)، تجمع سلول‏‏های آماسی(پیکان نارنجی) و کست هیالین (پیکان زرد) }. رنگ‏آمیزیهماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.

بررسی‏های بافت‏شناسی در روز پنجم پس از تزریق جنتامایسین در گروه‏های آزمایشی نشان می‏دهد که تورم حاد سلولی‏، نکروز لوله‏های ادراری وکست هیالین در گروه تجربی نسبت به گروه‏های مدل و شم با سطح معنی‏داری (0001/0p<) کاهش یافته است. درحالی‏که تجمع سلول‏های آماسی در گروه‏های آزمایشی در این روز هیچ گونه تغییر معنی‏دار را نشان نمی‏دهد (نمودار6 و شکل 3).

نمودار6:بررسی اثر hMSC-CM بر تغییرات بافتی کلیه در روز پنجم پس از تزریق جنتا‏مایسین: تورم حاد سلولی، نکروز لوله‏های ادراری و کست هیالین در گروه تجربی نسبت به گروه‏های مدل و شم با سطح معنی‏داری (001/0p<***) کاهش یافته است. اما درتجمع سلول‏های آماسی در گروه‏های آزمایشی در این روز هیچ‏گونه تغییر معنی‏داری مشاهده نشده است.

شکل3: تاثیرhMSC- CM برتغییرات بافتی کلیه در حیوانات مدل آسیب حاد کلیوی القاء شده با جنتامایسین در روز پنجم مطالعه.A  وB: فتومیکروگراف از بافت کلیه درگروه جنتامایسین تیمار نشده باhMSC- CM ، نکروز لوله‏‏های ادراری، تورم حاد سلولی و تجمع سلول‏‏های آماسی در بخش قشر کلیه (A) و همچنین کست هیالین در قسمت مدولا (B) مشهود می‏باشد.C  و:D فتومیکروگراف از بخش قشر و مدولا بافت کلیه گروه تجربی را نشان می‏‏دهد که می‏توان کاهش قابل ملا‏حظه‏ای در میزان تورم حاد سلولی و نکروز لوله‏‏های ادراری در بخش قشر کلیه وکست هیالین در لوله‏‏های جمع کننده ادراری نسبت به گروه مدل در روز پنجم مطالعه مشاهده کرد. { نکروز لوله‏‏های ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی)، تجمع سلول‏‏های آماسی (پیکان نارنجی) و کست هیالین (پیکان زرد) }. رنگ‏آمیزیهماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.

در روز هشتم پس از تزریق جنتامایسین نیز تورم حاد سلولی، نکروز لوله‏های ادراری، تجمع سلول‏های آماسی و کست هیالین با سطح معنی‏داری (001/0p<) در گروه تجربی نسبت به گروه مدل و شم کاهش یافته است (نمودار7 و شکل 4). با توجه به این‏ نتایج در روز سوم پس از تزریق جنتامایسین در گروه تجربی بهبودی قابل توجه در بافت کلیه مشاهده نشده است. اما بافت کلیه در روزهای پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین در گروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم ترمیم یافته است.

نمودار7: بررسی اثر hMSC-CM بر تغییرات بافتی کلیه در روز هشتم پس از تزریق جنتا مایسین: تورم حاد سلولی، نکروز لوله‏های ادراری، تجمع سلول‏های آماسی‏، کست هیالین با سطح معنی‏داری (001/0p<***) در گروه تجربی نسبت به گروه مدل و شم کاهش یافته است.

شکل4: تاثیرhMSC- CM برتغییرات بافتی کلیه در حیوانات مدل آسیب حاد کلیوی القا شده با جنتامایسین در روز هشتم مطالعه.A  و B: فتومیکروگراف از بافت کلیه درگروه جنتامایسین تیمار نشده باhMSC- CM ، نکروز لوله‏‏های ادراری، تورم حاد سلولی و تجمع سلول‏‏های آماسی در بخش قشر کلیه (A) و همچنین کست هیالین در قسمت مدولا (B)در روز هشتم مطالعه مشهود می‏باشد.C  وD: فتومیکروگراف از بخش قشر و مدولا بافت کلیه گروه تجربی را نشان می‏دهد که می‏توان کاهش معنی‏دار در تمام معیارهای آسیب بافتی را در این گروه نسبت به گروه مدل در روز مورد بررسی مشاهده کرد. { نکروز لوله‏‏های ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی)، تجمع سلول‏‏های آماسی (پیکان نارنجی) و کست هیالین (پیکان زرد) }. رنگ‏آمیزیهماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.