نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد تکوینی جانوری، دانشگاه خوارزمی (تربیت معلم)، تهران، ایران
2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی (تربیت معلم)، تهران، ایران
3 گروه پاتولوژی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تهران
4 گروه پاتولوژی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج
چکیده
هدف: هدف از انجام این تحقیق بررسی اثر فاکتورهای ترشحی سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی بر آسیب حاد کلیوی ناشی از جنتامایسین در موش صحرایی میباشد.
مواد و روشها: در این تحقیق ابتدا آزمایشی جهت دستیابی به مدل حیوانی استاندارد طراحی شد. سپس حیوانات بهطور تصادفی به چهار گروه تقسیم شدند. یک گروه بهعنوان کنترل در نظر گرفته شد که هیچ تزریقی در حیوانات این گروه صورت نگرفت، سه گروه دیگر جنتامایسین را بهصورت داخل صفاقی با دوز 100 میلیگرم بر کیلوگرم درشش روز متوالی دریافت کردند. سپس به یکی از این سه گروه محیط کشت رویی سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی و به گروه دیگر محیط کشت فاقد فاکتورهای ترشحی بهصورت داخل صفاقی و بهمدت سه روز متوالی تزریق شد. در نهایت در روزهای سوم، پنجم و هشتم بعد از تزریق جنتامایسین، نمونههای کلیه و خون حیوانات جمع آوری و مورد بررسیهای بافتشناسی و بیوشیمیایی قرار گرفت.
نتایج: نتایج گرچه به جز در موردی خاص، هیچ کاهش معنیداری در میزان بیومارکرهای خونی حیوانات در گروه دریافت کننده محیط کشت رویی سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی نسبت به دو گروه دیگر نشان نداد. اما بهبودی آسیب بافتی در تعدادی از روزهای مورد بررسی مشاهده شده است.
نتیجه گیری: نتایج تحقیق حاضر پیشنهاد میکند که فاکتورهای ترشحی سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی میتوانند در برابر آسیب بافتی ناشی ازجنتامایسین اثر محافظتی داشته باشند.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Effect of Conditioned Media from Human Mesenchymal Stem Cells on Acute Kidney Injury Induced by Gentamicin in Rat
نویسندگان [English]
- A A 1
- M A 2
- M J 3
- F M 4
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to investigate the effect of secretory factors of human mesenchymal stem cells on gentamicin-induced acute kidney injury in rats.
Material and Methods: Firstly, an experiment was designed to achieve a standard animal model. Animals were randomly divided into four groups. One group was considered as control which received no injection. Three other groups were treated with intraperitoneal 100 mg/kg gentamicin for six consecutive days. Then one of the three groups was injucted with conditioned media of human mesenchymal stem cells and other group was injucted with medium without secretory factors intraperitoneally for three consecutive days. Finally, in the third, fifth and eighth days after gentamicin injection, kidney and blood samples from all animals were collected for histological and biochemical analysis.
Result: Results, except in the special case, showed no significant decrease in the amount of blood biomarkers of animals in the group receiving the condition media of human mesenchymal stem cells compared to two another groups. The improvement of tissue damage, however, has been observed in the number of days.
Conclusions: These findings suggest that secretory factors of human mesenchymal stem cells have aprotective effect against gentamicin-induced nephrotoxicity
Keywords:
کلیدواژه‌ها [English]
- Acute kidney injury
- Gentamicin
- Secretory factors
مقدمه
کلیه یک اندام با پیچیدگی بالا میباشد که بیش از 30 نوع سلول مختلف را در بخشهای متفاوت میسازد و دارای دو وظیفه مهم میباشد: یکی پاک کردن بدن از مواد زاید که یا خورده میشوند یا توسط متابولیسم تولید میشوند، عمل دوم که بهویژه جنبه حیاتی دارد کنترل حجم و ترکیب مایعات بدن است زیرا تعادل آب و عملا تمام الکترولیتها در بدن بین مقدار ورودی و خروجی تا حدود زیادی توسط کلیهها حفظ میشود (1و 2). بیماریهای کلیوی در میان مهمترین علل مرگ و معلولیت در بسیاری از کشورها در سراسر جهان میباشند. آسیب کلیوی حاد (AKI) یک بیماری سخت و معمولا با یک نسبت مرگ و میر بالا میباشد که توسط مسمومیت یا ایسکمی ناشی از شیمی درمانی، آنتی بیوتیکها و شوک ایجاد شده توسط عفونت و جراحیهای مهم اتفاق میافتد (3، 4 و 5). AKI میتواند منجر به ناکار آمدی و آپوپتوزیس و همچنین نکروز در سلولهای اپیتلیال توبولار کلیوی، همچنین کاهش در سلولهای اندوتلیال کلیوی شود (5) .در کلAKI با یک کاهش سریع در نسبت فیلتراسیون گلومرولی شناخته می شود که توسط کاهش هم در فاکتورهای رگی و هم توبولار تعیین میشود و شامل افزایش انبساط رگی کلیوی، کاهش خود تنظیمی و انسداد توبولار میباشد (6 و 7) .آسیب کلیوی حاد بطور بالقوه یک بیماری قابل برگشت است. در اکثریت بیماران، AKI بهطور موثری بهبود مییابد و هیچگونه پیامد بالینی ندارد، اما در تعداد معدودی از بیماران، AKI بهطور ناقص بهبودیافته و این بیماران یا دیالیز میکنند و یا بهسوی بیماری کلیوی مزمن (CKD) پیشرفت میکنند که هم AKI و هم CKD دارای هزینه بالا و بار بهداشتی برای جامعه هستند. هفت درصد کل بیماران بستری شده در بخش مراقبتهای ویژه بهدلیل AKI بوده است (8)، به همین جهت جستجو برای ایجاد روشهای نوین درمان AKI صورت گرفته است. مطالعات اخیر، تکنولوژی بر پایه سلولهای بنیادی را مورد آزمایش قرار دادهاند که جنبههای جالبی از درمان قدر تمند اندامهای آسیبدیده شدید بهوسیله خاصیت منحصر به فرد سلولهای بنیادی را ایجاد کرده است (9، 10 و 11). که در این بین سلولهای بنیادی مزانشیمی (MSCs) سلولهای با قابلیت کاربردهای درمانی و ترمیمی بالا برای بافتهای آسیبدیده میباشند که شامل درمان AKI نیز میشود (12 و 13). همچنین محققان دریافتند که MSCs یک تعداد از فاکتورهایی که بهعنوان فاکتورهای محافظت کننده کلیه شناخته میشوند را ترشح میکنند و بدین وسیله مکانیسمهای پاراکرین و اندوکرین را ایجاد میکند که احتمالا از همین طریق سلولهای بنیادی مزانشیمی اثرات تحریک کننده ترمیمی را اعمال میکنند (14، 15 و 16). تعدادی از این فاکتورها شامل فاکتور رشد اپیدرمال ((EGF، فاکتور رشد هپاتوسیت ((HGF، فاکتور رشد شبه انسولین-1 ((IGF-1، فاکتور رشد اندوتلیال رگی ((VEGF و غیره میباشند (17 و 18). این فاکتورهای بیواکتیو موجب سرکوب سیستم ایمنی موضعی، مهار فیبروز و آپاپتوز، افزایش (Angogenesis) و تحریک تکثیر و تمایز میشوند (19). چندین مطالعه توسط فاکتورهای رشد پلی پپتید در حمایت از ترمیم کلیوی انجام شده است. در یک مطالعه محیط کشت مفید (Conditioned medium) را از سلولهای بنیادی مشتق شده از مغز استخوان موش جداسازی و به موشهای دارای AKI القا شده با (Cisplatin)تزریق شد، مشاهده کردند که (Conditioned medium)بهبود دهنده عملکرد کلیوی، افزایش دهنده تکثیر سلولی توبولار و محدود کننده آپوپتوزیس سلولهای کلیوی میباشند (15). Togel و همکارانش (20) نیز معتقدند سلول بنیادی مزانشیمی ممکن است در حفاظت از توبول کلیوی شرکت کند بدون اینکه بهطورمستقیمی در ترمیم توبول دخالت کند. آنها نتیجه گرفتند تزریق سلولهای بنیادی مزانشیمی میتواند فاکتور رشد هپاتوسیت (HGF)، فاکتور رشد اندوتلیال رگی (VEGF) و فاکتور رشد شبه انسولین1 (IGF-1) را ترشح کند که میتواند داخل مویرگ های ریز آسیب دیده جایگزین شود و آپوپتوزیس را مهار کند. این یک جنبه مهم از محافظت القا شده توسط MSC در برابرischemia/reperfusion)) ARF وAKI از طریق عمل پاراکرین میباشد. شناسایی فاکتورهایprotective خاص ترشح شده بهوسیله MSCs با استفاده از روشهای ژنومیک یا پروتئومیک ممکن است فرصتهایی را برای کشف راههای درمانی جدید و توسعه درمانهای مولکولی و دارویی جدید فراهم آورد (21).
توانایی کلیهها برای تغلیظ و متابولیزه مواد شیمیایی باعث میشود کلیهها بهطور ویژهای مستعد آسیب توکسیک باشند. آنتی بیوتیک جنتامایسین از خانواده آنتیبیوتیکهای آمینوگلیکوزید میباشد که بهطور وسیعی در درمان انواعی از عفونتها که توسط باکتریهای گرم منفی و (Endocarditis) ایجاد میشوند بهکار میرود. با اینحال، ارزش درمانی آن بهوسیله نفروتوکسیستی محدود میشود و این اتفاق در 20 تا 30 درصد بیمارانی که جنتامایسین را دریافت کردهاند رخ میدهد (22 و 23). از این جهت، برای ساخت مدلهای نفروتوکسیستی در مطالعات کشت سلول و حیوانات آزمایشگاهی استفاده میشود (24، 25 و 26). نفروتوکسیستی جنتامایسین توسط آسیب توبولار پروکسیمال و زوال عملکردی کلیه شناخته میشود و منجر به آپوپتوزیس، نکروز و اتساع توبولار میشود (23). در این مطالعه سعی شده است با استفاده از نفروتوکسیک شناخته شده بهنام جنتامایسین ابتدا مدل تایید شدهای از بیماری حاد کلیوی ساخته شود و سپس با تیمار حیوانات بیمار با محیط کشت مفید حاصل از سلولهای بنیادی مزانشیمی (conditioned medium - (MSCs چگونگی تاثیرات این ماده بر روند بیماری حاد در کلیه مورد بررسی قرار گیرد.
مواد و روشها
حیوانات: در این مطالعه تجربی، از رت بالغ نر نژاد ویستار (wistar rat) که در اتاق حیوانات دانشگاه خوارزمی نگهداری شده بودند استفاده شد. رتها در اتاق حیوانات با دمای کنترل شده 2±25 سانتیگراد و دوره نوری12 ساعت روشنایی و12 ساعت تاریکی نگهداری شدند. آب و غذای کافی همواره در دسترس آنها قرار داشت. آزمایشات روی تمام گروههای مورد بررسی در شرایط کاملا یکسان و مطابق اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی صورت گرفت.
تهیه محیط کشت مفید حاصل از سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی :(hMSC - Conditioned Medium)بعد از اینکه سلولهای بنیادی مزانشیمی کاملا سطح فلاسک را پرکردند،20 میلیلیتر محیط کشت تازه α-MEM (Cat No.22571-020,alpha MEM,Gibco) حاوی10 درصد سرمگاوی جنینی (Fetal bovine serum:FBS)(Cat No.SH30070.03,Thermo Scientific,USA) و1 درصد پنی سیلین و استرپتومایسین (Cat No.15070-063,Gibco) بهمدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و Co2 5 درصد برروی سلولها انکوبه شد. با اتمام زمان انکوباسیون محیط رویی سلولها جهت تیمار حیوانات مورد استفاده قرار گرفت. برای هر کیلوگرم وزن بدن، محیط کشت حاصل از106 × 5 سلول، در نظر گرفته شد و به حیوانات تزریق گردید.
ساخت مدل حیوانی: جهت دستیابی به مدل حیوانی استاندارد از تعدادی موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن تقریبی 180 تا 250 گرم استفاده گردید. یک گروه ششتایی از موشها بهعنوان گروه کنترل در نظر گرفته شد که در این گروه هیچ تزریقی صورت نگرفت. در گروه دوم ده عدد موش قرار گرفت که برای شش روز متوالی به آنها داروی جنتامایسین با دوز 100 میلیگرم بر کیلوگرم بهصورت داخل صفاقی تزریق شد. بعد از این دوره هر روز یک موش جهت خونگیری از قلب با تزریق محلول کتامین و زایلازین بیهوش شد و با تهیه سرم خون جانور میزان کراتینین (Cr) و نیتروژن اوره خون (BUN) حیوان بهمدت ده روز مورد بررسی قرار گرفت. همچنین کلیه حیوانات برای مطالعات هیستولوژیکی خارج و در فرمالین 10 درصد نگهداری شدند. (بهدلیل برداشت کلیه در گروهها و مرگ و میر حیوانات نمونهگیری از این حیوانات لحظاتی قبل از مرگ صورت گرفت). درگروه مدل آزمایشات با شش بار تکرار صورت پذیرفت. درنهایت با بررسی میزان نیتروژن اوره خون (BUN)، کراتینین (Cr) و نسبت بین این دو، بالاترین میزان آنها را طی دوره ده روزه بهدست آورده و بهعنوان روز اوج اثر داروی جنتامایسین در نظر گرفته شد که نشان دهنده بیشترین میزان آسیب جاندار در این روز میباشد و بهعنوان دوره حاد بیماری تعریف میشود (با بررسی نتایج در این مطالعه روز سوم بهعنوان روز اوج اثر جنتامایسین در نظر گرفته شد).
تیمار حیوانات دارای آسیب حاد کلیوی با استفاده از محیط کشت مفید حاصل سلولهای بنیادی مزانشیمی ((MSCs-conditioned medium: پس از ایجاد مدل حیوانی استاندارد، حیوانات به چهار گروه 6 تایی تقسیم شدند. گروه اول بهعنوان کنترل در نظر گرفته شد که هیچ تزریقی در آنها صورت نگرفت و به گروه دوم برای ایجاد مدل نارسایی حاد کلیوی تنها جنتامایسین تزریق شد که این دو گروه در بخش مدل سازی توضیح داده شدند. گروه سوم بهعنوان گروه تجربی در نظر گرفته شد. درگروه تجربی علاوه بر تزریق جنتامایسین، MSCs-conditioned medium 24 ساعت قبل از تزریق جنتامایسین و در سه روز متوالی بهصورت داخل صفاقی به حیوانات تزریق شد. درگروه چهارم که شم نامیده شد، حیوانات جنتامایسین و کنترل مدیا (محیط کشت فاقد فاکتورهای ترشحی) را نیز مانند گروه قبل بهصورت داخل صفاقی 24 ساعت قبل از تزریق جنتامایسین و در سه روز متوالی دریافت کردند. شایان ذکر است در این مطالعه در تمام گروههایی که جنتامایسین دریافت کردهاند علاوه بر بررسی در روز سوم پس از تزریق که روز اوج تاثیر جنتامایسین بهحساب میآید روز پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین نیز مورد مطالعه قرار گرفت (در همه گروهها آزمایشی شش بار تکرار صورت پذیرفت).
مطالعات بافتشناسی: نمونههای بافتی مطابق روشهای معمول پردازش شده و پس از قالبگیری با پارافین، برشهای با ضخامت 4 تا 6 میکرون از آنها تهیه شد. اسلایدهای تهیه شده با روش هماتوکسیلین _ ائوزین رنگآمیزی و سپس میزان آسیب بافتی با استفاده از استانداردهای تهیه شده در مطالعات قبلی مطابق با جدول شماره1، 2 و3 کمی شد و مورد بررسی قرار گرفت.
جدول 1: نحوه امتیازدهی برای تعیین درجه تورم حاد سلولی و نکروز لولههای ادراری
|
درجه آسیب توبولی |
|
|
0 |
سلولهای جدار لولههای ادرای سالم بوده و هیچگونه تورم حادسلولی و نکروز دیده نمیشود |
|
1 |
در کمتر از یک سوم لولههای شمارش شده تورم حاد سلولی و نکروز لولههای ادراری دیده میشود. |
|
2 |
بین یک سوم تا دو سوم لولههای شمارش شده تورم حاد سلولی و نکروز لولههای ادراری دیده میشود. |
|
3 |
در بیشتر از دو سوم لولههای شمارش شده تورم حادسلولی ونکروز لوله های ادراری دیده میشود |
*** در هر مقطع از کلیهها 150 لوله بهطور تصادفی شمارش شدند.
جدول 2: نحوه ارزیابی کست هیالین
|
کست هیالین |
|
|
0 |
هیچ کستی داخل لولهها دیده نمیشود. |
|
1 |
در کمتر از یک سوم لولهها کست وجود دارد. |
|
2 |
در یک سوم تا دو سوم لولهها کست وجود دارد. |
|
3 |
در بیشتر از دو سوم لولهها کست وجود دارد. |
*** برای ارزیابی کست هیالن، 10 شان میکروسکوپی شمارش گردید.
جدول3: نحوه ارزیابی تجمع سلولهای آماسی
|
تجمع سلولهای آماسی |
|
|
0 |
هیچ تجمعی از سلولهای آماسی در فضای بین توبولی دیده نمیشود. |
|
1 |
در کمتر از یک سوم فضای بین توبولی تجمع سلولهای آماسی تک هسته دیده میشود |
|
2 |
بین یک سوم تا دو سوم فضای بین توبولی تجمع سلولهای تک هسته دیده میشود |
|
3 |
در بیشتر از دو سوم فضای بین توبولی تجمع سلول های تک هستهای وجود دارد. |
*** برای ارزیابی تجمع سلولهای آماسی، 10 شان میکروسکوپی شمارش گردید
آزمونهای بیوشیمیایی سرم: پس از خونگیری و تهیه سرم حیوانات مورد نظر، میزان Cr (کراتینین) وBUN (نیتروژون اوره خون) که از مهمترین مارکرهای سرمی آسیب کلیوی میباشند با استفاده از کیتهای تولیدی شرکت زیستشیمی و دستگاه آنالیزر اندازهگیری شدند.
آنالیزهای آماری: نتایج بهدست اماده توسط نرم افزار 16. SPSSو آزمون واریانس یکطرفه با تست Post Hoc Tukey و با سطح معنیداری (05/0 P≤) آنالیز و بهصورت SE) (Mean ± بیان شدند.
نتایج
صحت القای مدل
مطالعات داروشناختی روی بیماریهای کلیه نیازمند دستیابی به مدلهای حیوانی مناسب میباشد که مقلد شرایط پاتوفیزیولوژیک بیماری باشند. از اینرو در این مطالعه جهت اطمینان از صحت القای مدل، آزمایشی مطابق آنچه در روش کار ارایه نمودیم طراحی شد. نتایج پس از القای مدل نشان داد که تزریق جنتامایسین با دوز 100 میلیگرم بر کیلوگرم در یک دوره شش روزه باعث افزایش معنیدار (001/0P≤) کراتینین (نمودار1) و نیتروژن اوره خون (نمودار2) در روزهای سوم و پنجم پس از تزریق جنتامایسین نسبت به گروه کنترل شده است. همچنین کراتینین درروز هشتم پس از تزریق جنتامایسین دارای سطح معنی دار (0.05 P≤) نسبت به گروه کنترل میباشد (نمودار1). لازم به ذکر است با درنظر گرفتن بالاترین مقادیر BUN (نیتروژن اوره خون)، کراتینین و نسبت بین این دو طی دوره ده روزه بررسی پس ازتزریق جنتامایسین، روز سوم، روز اوج اثر جنتامایسین برحیوان میباشد که بهعنوان دوره حاد بیماری در نظر گرفته شد.
نتایج حاصل از مارکرهای بیوشیمیایی خون نشان دهنده القای آسیب بودند. مطالعات بافتشناسی نیز حاکی از تورم حاد سلولی، نکروز لولههای ادراری، تجمع سلولهای آماسی و کست هیالین در گروه مدل (گروه دریافت کننده جنتامایسین) نسبت به گروه کنترل میباشد (شکل1: C، D). درحالی که بافت کلیه در گروه کنترل کاملا طبیعی بهنظر میرسید و هیچ آسیبی دیده نمیشد (شکل1:B، A). با توجه به مطالعات گذشته در القای مدل حاد کلیوی، نتایج ما نشان دادند این میزان از داروی جنتامایسین میتواند مدل مناسبی از بیماری حاد کلیوی را القا کند. بهعبارتی یافتههای ما موید صحت روند مدلسازی انجام شده بودند از اینرو با القای بیماری بهروش آزموده شده در مدلسازی و تیمار حیوانات با hMSC – conditioned medium تاثیرآن بر بیماری حاد کلیوی بررسی شد.
نمودار1: میزان تغییرات کراتینین (میلیگرم بر دسیلیتر) سرم خون، طی دوره ده روز پس از تزریق جنتامایسین نسبت به گروه کنترل: (05/0*p<) (01/0**p<) (001/0***p<)
نمودار2: میزان تغییرات نیتروژن اوره (میلیگرم بر دسیلیتر) سرم خون،طی دوره ده روز پس از تزریق جنتامایسین نسبت به گروه کنترل: (05/0*p<) (01/0**p<) (001/0***p<)
(٭لازم به ذکراست با درنظر گرفتن بالاترین مقادیر BUN، کراتینین و نسبت بین این دو طی دوره ده روزه بررسی پس از تزریق جنتامایسین، روزسوم روز اوج اثرجنتامایسین برحیوان میباشد که بهعنوان دوره حاد بیماری در نظر گرفته شد.)
شکل1: بررسی صحت القای آسیب حاد کلیوی بهوسیله آنالیز بافت شناسی کلیه حیوانات مورد آزمایش. A و:Bمیکروگراف نوری ازکلیه حیوانات گروه کنترل، بافت کلیه در قمست قشر (A) و مدولا (B) کاملا طبیعی بهنظر میرسد و هیچگونه آسیبی مشاهده نمیشود. C وD: میکروگراف نوری از بافت کلیه حیوانات گروه دریافت کننده جنتامایسین (مدل)، نکروز لولههای ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی) و تجمع سلولهای آماسی (پیکان نارنجی) در بخش قشری کلیه (شکل C) و همچنین کست هیالین (پیکان زرد) در بخش مدولا کلیه (شکل D) بهوضوح قابل مشاهده میباشد.رنگآمیزیهماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.
بررسی اثر محیط کشت مفید حاصل از سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی(conditioned medium- (hMSC برمیزان نیتروژون اوره خون (BUN) وکراتینین (Cr) سرمی بعد از تیمار با جنتامایسین
بررسی در گروههای آزمایشی در روز سوم پس از تزریق جنتامایسین نشان داد گرچه در گروه تجربی (جنتامایسین + محیط کشت مفید) کاهش اندکی در میزان Cr سرم خون نسبت به گروه مدل (جنتامایسین) و شم صورت پذیرفته است. اما فاقد سطح معنیدار میباشد (نمودار3). تغییرات BUN نیز در روز سوم مطالعه گویای این مطلب میباشد (نمودار4). درروز پنجم بعد ازتزریق جنتامایسین نیز هیچ کاهش معنیداری در میزان BUN و Crسرم خون نسبت به گروه مدل وشم دیده نشد (نمودار 3 و 4). همچنین مطالعه در روز هشتم پس از تزریق جنتامایسین در چهار گروه آزمایشی نشان داد میزان BUN در گروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم بدون هیچگونه تغییر معنیدار می باشد (نمودار4). اما میزان کراتینین سرم خون درگروه تجربی دارای کاهش با سطح معنیداری (001/0p<) نسبت به گروه جنتامایسین و شم میباشد (نمودار3).
بررسی اثر محیط کشت مفید حاصل از سلولهای بنیادی مزانشیم انسانی بر تغییرات بافتی کلیه بعد از تیمار با جنتامایسین
نمونههای بافتی مطابق روشهای معمول پردازش شده و پس از قالبگیری با پارافین، برشهایی با ضخامت 4 تا 6 میکرون از آنها تهیه شد. اسلایدهای تهیه شده با روش هماتوکسیلین و ائوزین رنگآمیزی شده و مورد بررسی قرار گرفتند. میزان تورم حاد سلولی، نکروز لوله های ادراری، تجمع سلولهای آماسی و کست هیالین مطابق جداول 1، 2 و 3 کمی شد.
برطبق مطالعات، کلیه سالم درگروه کنترل بدون هیچگونه آسیب بافتی در تمام قسمت های نفرون شامل گلومرول، لولههای پروکسیمال و دیستال در ناحیه قشری _ مرکزی میباشد (شکل1:B ، A). بررسیهای بافتشناسی در روز سوم پس از تزریق جنتامایسین درگروههای آزمایشی نشان میدهد که در گروه تجربی برخلاف انتظار، تورم حاد سلولی و نکروز لولههای ادراری دارای افزایش معنیدار (001/0p<) نسبت به گروه مدل و شم میباشد. در حالیکه تجمع سلولهای آماسی در گروههای آزمایشی در این روز تغییر چندانی را نشان نمیدهد. اما کست هیالین در گروه تجربی دارای کاهش معنی دار (001/0p<) نسبت به گروه جنتامایسین و شم میباشد (نمودار5 و شکل2).
نمودار3: بررسی اثر hMSC-CM برمیزان تغییرات کراتینین (میلیگرم بر دسیلیتر) در روزهای سوم ،پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین: hMSC – CM فقط در روز هشتم پس از تزریق جنتامایسین سبب کاهش کراتینین باسطح معنیداری (001/0▪▪▪p<) درگروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم شده است. درروزهای سوم وپنجم هیچ کاهش معنیداری درگروه تجربی نسبت به گروه شم وکنترل مشاهده نمیشود. { (001/0***p<)و(01/0**p<) سطح معنیداری گروههای آزمایشی را نسبت به گروه کنترل نشان میدهد.{
نمودار4: بررسی اثر hMSC-CM برمیزان تغییرات نیتروژن اوره (میلیگرم بر دسیلیتر) در روزهای سوم، پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین: hMSC – CM درهیچکدام از روزهای سوم، پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین منجر به کاهش معنیداری درسطح BUN (میلیگرم بر دسیلیتر)سرم خون در گروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم نشده است.{ (05/0*p<)، (001/0***p<) سطح معنیداری گروههای آزمایشی را نسبت به گروه کنترل نشان میدهد.{
نمودار5:بررسی اثر hMSC-CM بر تغییرات بافتی کلیه در روز سوم پس از تزریق جنتامایسین: در گروه تجربی برخلاف انتظار تورم حاد سلولی و نکروز لولههای ادراری دارای افزایش معنیدار (001/0p<***) نسبت به گروه مدل وشم میباشد. درحالیکه تجمع سلولهای آماسی در گروههای آزمایشی در این روز تغییر چندانی را نشان نمیدهد. اما کست هیالین در گروه تجربی دارای کاهش معنیدار (001/0p<***) نسبت به گروه جنتامایسین و شم میباشد.
شکل 2: تاثیرhMSC- CM برتغییرات بافتی کلیه در حیوانات مدل آسیب حاد کلیوی القا شده با جنتامایسین در روز سوم مطالعه.A وB: فتومیکروگراف از بافت کلیه درگروه جنتامایسین تیمار نشده باhMSC- CM ، نکروز لولههای ادراری، تورم حاد سلولی و تجمع سلولهای آماسی در بخش قشر کلیه (A) و همچنین کست هیالین در قسمت مدولا (B) در این روز مشهود میباشد.C وD : فتومیکروگراف از بخش قشر و مدولا بافت کلیه در گروه تجربی که تنها نشاندهنده کاهش معنیداری در میزان کست هیالین در بخش مدولا در روز سوم مطالعه می باشد. {نکروز لولههای ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی)، تجمع سلولهای آماسی(پیکان نارنجی) و کست هیالین (پیکان زرد) }. رنگآمیزیهماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.
بررسیهای بافتشناسی در روز پنجم پس از تزریق جنتامایسین در گروههای آزمایشی نشان میدهد که تورم حاد سلولی، نکروز لولههای ادراری وکست هیالین در گروه تجربی نسبت به گروههای مدل و شم با سطح معنیداری (0001/0p<) کاهش یافته است. درحالیکه تجمع سلولهای آماسی در گروههای آزمایشی در این روز هیچ گونه تغییر معنیدار را نشان نمیدهد (نمودار6 و شکل 3).
نمودار6:بررسی اثر hMSC-CM بر تغییرات بافتی کلیه در روز پنجم پس از تزریق جنتامایسین: تورم حاد سلولی، نکروز لولههای ادراری و کست هیالین در گروه تجربی نسبت به گروههای مدل و شم با سطح معنیداری (001/0p<***) کاهش یافته است. اما درتجمع سلولهای آماسی در گروههای آزمایشی در این روز هیچگونه تغییر معنیداری مشاهده نشده است.
شکل3: تاثیرhMSC- CM برتغییرات بافتی کلیه در حیوانات مدل آسیب حاد کلیوی القاء شده با جنتامایسین در روز پنجم مطالعه.A وB: فتومیکروگراف از بافت کلیه درگروه جنتامایسین تیمار نشده باhMSC- CM ، نکروز لولههای ادراری، تورم حاد سلولی و تجمع سلولهای آماسی در بخش قشر کلیه (A) و همچنین کست هیالین در قسمت مدولا (B) مشهود میباشد.C و:D فتومیکروگراف از بخش قشر و مدولا بافت کلیه گروه تجربی را نشان میدهد که میتوان کاهش قابل ملاحظهای در میزان تورم حاد سلولی و نکروز لولههای ادراری در بخش قشر کلیه وکست هیالین در لولههای جمع کننده ادراری نسبت به گروه مدل در روز پنجم مطالعه مشاهده کرد. { نکروز لولههای ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی)، تجمع سلولهای آماسی (پیکان نارنجی) و کست هیالین (پیکان زرد) }. رنگآمیزیهماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.
در روز هشتم پس از تزریق جنتامایسین نیز تورم حاد سلولی، نکروز لولههای ادراری، تجمع سلولهای آماسی و کست هیالین با سطح معنیداری (001/0p<) در گروه تجربی نسبت به گروه مدل و شم کاهش یافته است (نمودار7 و شکل 4). با توجه به این نتایج در روز سوم پس از تزریق جنتامایسین در گروه تجربی بهبودی قابل توجه در بافت کلیه مشاهده نشده است. اما بافت کلیه در روزهای پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین در گروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم ترمیم یافته است.
نمودار7: بررسی اثر hMSC-CM بر تغییرات بافتی کلیه در روز هشتم پس از تزریق جنتا مایسین: تورم حاد سلولی، نکروز لولههای ادراری، تجمع سلولهای آماسی، کست هیالین با سطح معنیداری (001/0p<***) در گروه تجربی نسبت به گروه مدل و شم کاهش یافته است.
شکل4: تاثیرhMSC- CM برتغییرات بافتی کلیه در حیوانات مدل آسیب حاد کلیوی القا شده با جنتامایسین در روز هشتم مطالعه.A و B: فتومیکروگراف از بافت کلیه درگروه جنتامایسین تیمار نشده باhMSC- CM ، نکروز لولههای ادراری، تورم حاد سلولی و تجمع سلولهای آماسی در بخش قشر کلیه (A) و همچنین کست هیالین در قسمت مدولا (B)در روز هشتم مطالعه مشهود میباشد.C وD: فتومیکروگراف از بخش قشر و مدولا بافت کلیه گروه تجربی را نشان میدهد که میتوان کاهش معنیدار در تمام معیارهای آسیب بافتی را در این گروه نسبت به گروه مدل در روز مورد بررسی مشاهده کرد. { نکروز لولههای ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی)، تجمع سلولهای آماسی (پیکان نارنجی) و کست هیالین (پیکان زرد) }. رنگآمیزیهماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.
بحث
سمیت حاد کلیوی ناشی از مصرف جنتامایسین دربیماران مبتلا به انواعی از عفونتها بهعنوان مثال عفونت های چشمی، ریوی و رودهای ازجمله عوارض جانبی مهم این دارو میباشد که باعث محدودیت مصرف آن می شود (23). علیرغم اثرات سمی ناخوشایند جنتامایسین، بهدلیل ثبات شیمیایی آنتی بیوتیکهای آمینوگلیکوزید، اثرات ضد باکتریایی شدید، کاربرد توام با آنتیبیوتیکهای دیگر، مقاومت کم و هزینه درمانی اندک برای بیماران هنوز هم بهطور وسیعی بهکار میروند (27).
در این مطالعه برطبق تعدادی تحقیقات و مطالعات گذشته انتظار میرفت که محیط کشت حاصل از سلولهای بنیادی مزانشیمی اثرات محافظتی در برابر سمیت حاد کلیوی ناشی از جنتامایسین درمدل حیوانی موش صحرایی داشته باشد. با اینکه محیط کشت حاصل از سلولهای بنیادی مزانشیمی موجب ترمیم بافتی در روزهای پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین درگروه تجربی شدند. اما تقریبا هیچ تاثیر معنیداری در کاهش بیومارکرهای شیمیای سرم خون در روزهای مورد بررسی نداشتند. اما ترمیم بافت کلیوی در روزهای مورد نظر در گروه تجربی را میتوان نشانه اثرات مثبت و ترمیمکنندگی محیط کشت حاصل از سلولهای بنیادی مزانشیمی بر بافت کلیه دارای نارسایی حاد کلیوی ناشی از جنتامایسین دانست. بهعلاوه نشان داده شد که محیط کشت فاقد فاکتورهای ترشحی این سلولها از سلولهای کلیه در برابر جنتامایسین محافظت نمیکنند.
آمینوگلیکوزیدها متابولیزه نمیشوند و اساسا توسط فیلتراسیون گلومرولی دفع میشوند. بهطور نسبی مقادیر بالا از دوز تزریق داخل رگی (حدود 10 درصد) درکورتکس کلیه تجمع مییابد. درحالیکه توزیع کمی از آمینو گلیکوزیدها داخل بافتهای دیگر گزارش شده است (28). در کل مسمومیت توبولار جنتامایسین بهدوصورت ظاهر میشود یا جنتامایسین موجب مرگ در سلولهای اپیتلیال توبولار می شود که همراه با تولید ترکیبات التهابی می باشد یا باعث اختلال در عملکرد ترکیبات کلیدی سلولی که درگیر در نقل وانتقال آب و مواد محلول هستند میشود (29 و 30). در واقع جنتامایسین با القا نکروز و آپوپتوزیس در سلولهای اپیتلیال توبولار منجر به کاهش عملکرد توبولار و نقص در بازجذب مایع و الکترولیتها میگردد. این رخداد گرچه منجر به هیچ کاهش مستقیمی در GFR(نسبت فیلتراسیون گلومرولی) نمیشود. اما بهطور مستقیم از طریق فعالسازی مکانیسم TGF(ضریب تصفیه گلومرولی) موجب کاهش در سطوح GFR میشود. از آنجا که فرآوردهای زاید متابولیک برای دفع به فیلتراسیون گلومرولی وابسته هستند. هر گاه GFR به میزان 50 درصد کاهش یابد. کلیهها به صورت گذرا فقط نیمی از کراتینین را تصفیه و دفع میکنند. بنابراین کراتینین در مایعات بدن تجمع یافته و غلظت پلاسمایی آن بالا میرود. در بیماران مبتلا به بیماریهای کلیوی که دچار کاهش زیادی در GFR هستند غلظت اوره پلاسما بهطور بارزی افزایش مییابد. به این ترتیب جنتامایسین با کاهش GFR موجب افزایش کراتینین و BUN درخون میشود (31).
تعدادی از مطالعات پیشین مشخص نموده است که تجویز فاکتورهای رشد قبل و بعد از آسیب کلیوی در مدلهای جانوری، موجب بهبود آسیب و افزایش ترمیم کلیوی میشود. علت آن میتواند اثرات آنتی آپوپتوتیک،Prolifrative و پروآنژیوژنیک آنها باشد (32 و33). اثبات شده است که محیط کشت حاصل از سلول های بنیادی مزانشیم انسانی فعال کننده مسیر سیگنالین PI3K-AKT میباشد که کاهش دهنده آپوپتوزیس و افزایش دهنده بقا سلولهای اپیتلیال توبولار پرکسیمال میباشد (34). بهعنوان مثال فاکتور رشد هپاتوسیت، فاکتور رشد اندوتلیال رگی، IGF-1،EGF پروتئین phoshatidylinositol-3-kinase را فسفریله و فعال میکنند که آن نیزAKT را فسفریله و فعال میکند AKTسیگنالهای بقا را توسط چند مکانیسم مستقل فراهم میکند (35، 36 و 37). دراین مطالعه ما فرض کردیم اگر فاکتورهای لازم برای ترمیم در هنگام بروز آسیب در محل حضور داشته باشند بیشتر میتوانند مفید واقع شوند. از طرف دیگر تزریق محیط کشت مفید پیش از تزریق جنتامایسین احتمالا میتواند موجب افزایش پروتئینهای آنتیآپوپتوتیک و پروآنژیوژنیک نسبت به پروآپوپتوتیک و آنتیآنژیوژنیک شود که ممکن است این افزایش که از قبل ایجاد شده در هنگام تزریق جنتامایسین مفید واقع شود و از اثرات سمی آن بکاهد.
در زمان حاضر مشخص نمیباشد که چطور فاکتورهای ترشح شده بهوسیله سلولهای بنیادی مزانشیمی میتوانند محافظت کلیوی را ارائه دهند. شناسایی و پالایش این فا کتورها مسیر جدیدی را برای درمان دارویی AKI فراهم می آورد و بدینوسیله از تزریق یک حجم زیادی از MSC-conditioned medium جلوگیری میکند (38). با اینحال با وجود همه اطلاعاتی که در جریان مطالعات بهدست آمده هنوز نمیتوانیم یک نتیجه نهایی بهدست آوریم. که آیا اثرات سلولهای بنیادی مزانشیمی درگیر در تر میم کلیه بهطور مستقیم بهوسیله تمایز سلولی می باشند یا ناشی از امتزاج بین این سلولها و سلولهای آسیب دیده است. یا اینکه بهطور غیر مستقیم توسط اثرات پاراکرینی- اندوکرینی متنوع ایجاد شده بهوسیله سلولهای بنیادی مزانشیمی روی سلولهای توبولار میباشد (39، 40 و 41). اگر اثرات محافظتی بهواسطه عملکرد اندوکرینی سلولها باشد، تزریق خود سلولها ضروری بهنظر نمیرسد، بلکه فاکتورهای ترشحی آنها هستند که باید هنگام آسیب در محل حاضر باشند. نتایج حاصل از این مطالعه منعکس کننده اثرات محافظتی سلولهای بنیادی مزانشیمی به واسطه عملکرد اندوکرینی آنها میباشد (15) که با تعدادی از مطالعات پیشین مطابقت دارد. به گونه ای که Hui Zhang و همکارانش (42) تحت یک مطالعه بیان کردند فاکتورهای سلولهای بنیادی و فاکتورهای تحریک کننده کلنی ماکروفاژ- گرانولوسیت بهطور جزئی موجب تحریک سلولهای مغز استخوان و ایجاد اثرات درمانی در نکروز توبولار حاد ناشی از جنتامایسین میشوند. در پژوهشی دیگر Parekkadan و همکارانش (43) حضور فاکتورهای رشد VEGF،HGF ،IGF-1 و مولکولهای آنتیآپوپتوتیک دیگر را در MSC-Conditioned medium آشکار کردند و نشان دادند این مولکولهای بیواکتیو منجر به افزایش درصد بقا حیوانات دریافت کننده میگردد. گرچه Gheisari و همکارانش (44) اثرات درمانی Conditioned media حاصل از سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش (MSC)و سلولهای بنیادی سوماتیک طناب خونی نافی انسانی (USSC) را بر نارسایی حاد کلیوی مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه هیچ اثر سودمندی برای Conditioned media مشتق شده از این دو نوع سلول بر بهبودی نفروپاتی القا شده با سیس پلاتین مشاهده نشد (44).
نتیجه گیری
نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تیمار با محیط کشت حاصل از سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی گرچه موجب کاهش در بیومارکرهای شیمیایی سرم خون در کلیه دارای نارسایی حاد کلیوی با جنتامایسین (به جز در کراتینین سرم خون روزهشتم) نمیشود، اما تقریبا باعث بهبودی بافت کلیه در تعدادی از روزهای مورد بررسی در کلیه واجد آسیب بافتی ناشی از القا جنتامایسین میشود.
تشکر و قدردانی
مولفین مراتب سپاس خود را از زحمات فراوان خانم سارا طالب گلستانی و خانم مرضیه قاسمی در انجام این پروژه ابراز میدارند.
)