نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم جانوری، تهران، ایران
2 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه زیستشناسی سلولی و مولکولی، تهران، ایران
چکیده
هدف: در این مطالعه، اثر تمایزی مایع زجاجیه بر سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیوتیک به سلولهای شبه فیبر عدسی چشم مورد بررسی قرار گرفته است .
موادو روشها: در این کار تجربی سلولهای بنیادی از مغز استخوان ران و چربی از ناحیه کشاله ران موش های بالغ NMRI و مایع آمنیوتیک از جنینهای 13 روزه موشهای NMRI جدا شده و کشت داده شد. مزانشیمی بودن سلولها با مارکرهای سطحیCD31 وCD90 به روش فلوسیتومتری بررسی شد. سپس سلولها تحت القای زجاجیه چشم گاو به مدت ۱٤ روز با درصدهای مختلف 10، 30،20،15 ، 40 و 50 قرار گرفتند. بیان مارکرهای آلفا کریستالین در نمونههای تجربی و کنترل با روش ایمونوسیتوشیمی مورد بررسی قرار گرفت .
نتایج: آنالیز فلوسایتومتری مارکرهای سطحی نشان داد که سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و مایع آمنیوتیک و بافت چربی مارکر CD90را (بهترتیب 29/29 درصد، 57/0 درصد،82 درصد) بیان میکنند. بهعلاوه سلول بنیادی مزانشیمی از هر سه منبع مارکر CD31 (بهترتیب 44/3 درصد، 53/1 درصد، 1/0 درصد) بیان میکنند. بررسیهای ایمونوسیتوشیمی نشان داد که غلظت٤۰ درصد از مایع زجاجیه بر روی سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی و مایع آمنیوتیک و غلظت ١٥ درصد از مایع زجاجیه بر روی سلولهای مغز استخوان نسبت به سایر غلظتها اثر القایی بیشتری دارد.
نتیجهگیری: بر اساس یافتههای این مطالعه، سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از هر سه منبع در اثر عمل القایی مایع زجاجیه میتوانند به سلولهای فیبر عدسی چشم تمایز یابند.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Characterization and Lens Fiber like Cells Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue and Amniotic Fluid: A Comparative Study
نویسندگان [English]
- H M 1
- M N 2
- N E 1
- Kh B 1
- P Gh 1
چکیده [English]
Aim: In this study the effect of vitreous humor on the mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow, adipose tissue and amniotic fluid to lens like cells was investigated.
Material and methods: Inthis experimental study collected stem cells from femurs bone marrow and inguinal fat pads of mature NMRI mice and amniotic fluid of 13 days embryos of NMRI mice were cultured. The mesenchymal character of these cells was proven by flow cytometry markers like CD90, CD31. This experiment took place for 14 days with different dosages 10, 15, 20, 30, 40, 50 % of bovine vitreous humor. Express of crystalline markers were detected by immunocytochemistry in experimental and control groups.
Results: The flow cytometeric analyses of surface markers were shown expression of CD90 by bone marrow and amniotic fluid stem cells and adipose tissue stem cells (29/29%, 0/57%, 82%, respectively). Moreover, mesenchymal stem cells from these 3 sources had expression of CD31 (3/44%, 1/53%, 0/1%, respectively). Immunocytochemistry results revealed that 40 % vitreous humor in culture media fluid more inducing effect on adipose and amniotic fluid mesenchymal stem cells and 15 % vitreous humor on bone marrow stem cells in order to differentiate.
Conclusion: According to the findings of this study, it can be concluded that MSCs derived from all sources can differentiate into lens fiber like cells by inducing effect of vitreous humor.
کلیدواژهها [English]
- Mesenchymal stem cells
- Vitreous Body
- Crystalline
مقدمه
سلولهای بنیادی سلولهای تمایز نیافتهای هستند که توانایی تبدیل و تمایز به انواع مختلف سلولها را دارند. سلولهای بنیادی دارای دو ویژگی مهم هستند که سلولهای بنیادی را از سایر سلولها متمایز میکنند. این سلولها، توانایی تکثیر نامحدود دارند و در حالت متمایز نشده باقی میمانند. علاوه بر این، سلولهای بنیادی چنانچه در شرایط محیطی مناسب قرار بگیرند، قادرند به سلولهای مورد نظر تبدیل شوند. سلولهای بنیادی میتوانند تحت تاثیر بعضی شرایط فیزیولوژیک یا آزمایشگاهی به سلولهایی با عملکردهای اختصاصی مانند سلولهای عضلانی قلب یا سلولهای تولیدکننده انسولین در پانکراس تبدیل شوند (1). سلولهای بنیادی از لحاظ منشا به دو دسته عمده، سلولهای بنیادی جنینی و سلولهای بنیادی بالغ تقسیم میشوند (2). سلولهای بنیادی بالغ در بسیاری از بافتها و اندامها شامل مغز، مغزاستخوان ، ماهیچهاسکلتی، شبکیه، قرنیه چشم، پالپ دندان، مغز، طناب عصبی، کبد، بافت چربی، پوست و روده وجود دارند (3). از مهمترین سلولهای بنیادی بالغ، سلولهای بنیادی مزانشیمی میباشند؛ سلولهای بنیادی مزانشیمی برای اولین بار در مغز استخوان در سال 1966 شناسایی شدند (4). در سالهای اخیر، مهمترین منبع سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بوده است، اما سلولهای بنیادی مزانشیمی را از منابع دیگر مثل بافت چربی، خون بند ناف، غشای آمنیوتیک، پولپ دندان، خون محیطی، بافت پریوست و ماهیچه اسکلتی نیز جدا کردهاند (5 و6). مغز استخوان منبع اصلی دو نوع از سلولهای بنیادی بهنام سلولهای بنیادی خونساز و سلولهای بنیادی مزانشیمی میباشد (7).
مایع زجاجیه مایعی شفاف است که از جام بینایی منشا میگیرد و فضای پشت عدسی چشم را پر کرده است و در مسیر تمایزی عدسی چشم نقش ویژه دارد. در زجاجیه کندروایتین سولفات، هپاران سولفات و اسیدهیالورونیک وجود دارند. اسید هیالورونیک تمایل بالایی برای جذب آب داشته ودر نتیجه 99 درصد وزن زجاجیه را آب تشکیل میدهد و بدین سبب اسید هیالورونیک یک حالت ژلهای به زجاجیه میدهد (8). مهمترین فاکتورهای موجود در مایع زجاجیه فاکتورهای رشد فیبروبلاستی( FGF) FGF-1 و 2 FGF-میباشد (9). مطالعات تجربی نشان داده است که این فاکتورها در محیط کشت باعث القا و تمایز سلولهای بنیادی به سلولهای عدسی میشود و همچنین باعث بیان ژنهای کریستالین، طویل شدن و تخصص یابی ساختاری در سلولهای فیبری میگردند (10). شواهد نشان میدهد که سلولهای بافت پوششی عدسی تحت القاء FGF در محیط کشت تمایز پیدا کرده و ساختار مولکولی و مورفولوژی فیبرهای عدسی را کسب کردهاند (11).
عمدهترین پروتئینهای سلولهای فیبر عدسی، کریستالینها میباشند (12) که به دوگروه عمده α وβ تقسیم میشوند (13). با افزایش سن مشکلات و بیماریهای چشمی بهویژه پیرچشمی و آب مروارید در جوامع مختلف رو به افزایش است. بنابراین امروزه استفاده از سلولهای بنیادی بعنوان یک راهکار برای ترمیم و یا جایگزینی سلولهای عدسی و شبکیه ضروری بهنظر میرسد (14). در این میان، سلولهای بنیادی مزانشیمی بهدلیل دارا بودن خاصیت خودتجدیدی و توان تمایز به سایر سلولهای دیگر بهعنوان یک منبع مناسب و یک استراتژی برای جایگزینی ضایعات سلولی و ژن درمانی محسوب میشود (15).
مواد و روشها
جداسازی و کشت سلولهای مزانشیمی مغز استخوان: در این تحقیق تجربی موشهای نژاد NMRI با سن تقریبی 4 تا 6 هفته با روش جابهجای مهرههای گردنی(cervical dislocation) بر اساس پروتوکل صادره از کمیتهی اخلاقی دانشگاه خوارزمی کشته شدند. در شرایط کاملا استریل استخوانهای ران و درشت نی جدا، داخل محیط DMEM قرار داده و به زیر هود منتقل شدند. دو سر استخوان با یک قیچی کاملا استریل بریده شده و مغز استخوان از داخل کانال استخوان با استفاده از سرنگ حاوی محیط DMEM و عمل Flushing خارج شد. مغز استخوان در فالکون ۱۵ میلیلیتری ریخته و سانتریفیوژ شد تا رسوب سلولی تشکیل شود. سپس محیط رویی تخلیه و سلولها در۲ میلیلیتر محیط کشت تازه معلق شدند. محیط مورد استفاده DMEM (Dubleco,s modified eagles medium; Gibco Germany) حاوی ۱۵ درصد FBS(Fetal Bovine Serum;Gibco,Germany) و100 واحد بینالمللی پنیسیلین (Gibco,Germany) و100 واحد بین المللی استرپتومایسین (Gibco,Germany) بود. سلولها حاصل در فلاسک ۲۵ سانتی متری کشت داده شدند. محیط سلولها هر۳ روز یکبار به مدت دو هفته تعویض شد.
جداسازی و کشت سلولهای مزانشیمی بافت چربی: در این تحقیق تجربی، موشهای نژاد NMRI با سن تقریبی 4 تا 6 هفته با روش جابهجای مهرههای گردنی کشته و سپس با استفاده از الکل 70 درصد ضدعفونی شدند. بافت چربی از ناحیه پشت کشاله ران موشها جدا شده و در محلول استریل phosphate-buffered saline (PBS) تحت شستشو قرار گرفت. سپس قطعات چربی به صورت مکانیکی با قیچی از هم جدا شدند و به قطعات دو میلیمتری درآمدند. تمامی مراحل بالا بر روی یخ انجام گرفت. سپس تمامی PBS محیط کشیده شد و تکههای چربی تحت تاثیر۰٧٥/۰کلاژناز نوع I (Merck) در PBS بهمدت چهل و پنج دقیقه در انکوباتور با دمای ٣٧ درجه سانتیگراد و 2Co، ٥ درصد قرار گرفتند، با این توصیف که هر پنج دقیقه یکبار مواد داخل فالکون پیپتاژ شد. سپس کلاژناز با PBS خنثی گردید (با اضافه کردن 5/1 میلیلیتر PBS ، رقت کلاژناز آنقدر زیاد شد که فعالیت اولیهی خود را از دست داد وخنثی گردید) و سپس فالکون در داخل سانتریفیوژ بهمدت ۱۰ دقیقه با دور g1200 قرار گرفت. پس از اتمام سانتریفیوژ مایع رویی که حاوی تکههای چربی بود دور ریخته شد و رسوب سلولی با PBS شستشو داده شد و دوباره در سانتریفیوژ با دور rpm 1500 بهمدت ٥ دقیقه قرار گرفت. پس از اینکه دوباره مایع رویی حذف شد، محیط کشت DMEM بههمراه FBS ۱٥ درصد و آنتیبیوتیکهای پنیسیلین و استرپتومایسین به نسبت ۱ به ۱۰۰ به رسوب سلولی اضافه شد و در فلاسک 25 سانتیمتر مربع بدون پوشش با درب فیلتردار کشت داده شد و هر ۲ روز یکبار تعویض محیط صورت گرفت.
جداسازی و کشت سلولهای مزانشیمی مایع آمنیوتیک: موشهای NMRI در هفته دوم بارداری بهروش جابهجای مهرههای گردنی کشته شدند و جنین آنها خارج و در ظرف حاوی HBSS قرار داده شد. سپس مایع آمنیوتیک احاطه کننده جنین بهکمک پیپت پاستور کشیده شد. کلیه این مراحل در محیط استریل انجام شد. این مایع بههمراه 5 میلیلیتر محیط کشت DMEM، FBS20 درصد و آنتیبیوتیک پنیسیلین و استرپتومایسین در فلاسک 25 سانتیمتر مکعب در شرایط عادی کشت سلولی در داخل انکوباتور در دمای 37 درجه سانتیگراد و فشار 2Co، 5 درصد کشت داده شد. اولین تعویض محیط در روز 2 و پس از آن تعویض محیط هر سه روز یکبار انجام شد.
نحـوه گرفتن مایع زجاجیه: در ایـن پـژوهش چشمهـای گـاو
گرفته شده ازکشتارگاه کرج در PBS به آزمایشگاه منتقل شد و با آنتیبیوتیک پنیسیلین و استرپتومایسین همراه با PBS استریل گردید. با فروکردن سر سرنگ 16 گرم از ناحیه پشتی چشم، مایع زجاجیه بیرون کشیده شد و در دستگاه سانتریفیوژ با دورrpm ۱٤۰۰۰ بهمدت ۲۰ دقیقه در دمای ٤ درجه سانتیگراد قرار گرفت. مایع رویی فیلتر گردید و در فریزر ٤۰- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
بررسی بیان مارکرهای سطحی به روش فلوسیتومتری: سلولهای حاصل بعد از تریپسینه و سانتریفیوژ کردن در اپندورف ریخته و با PBS شسته شدند. سپس بهمدت 10 دقیقه با دور 2000 rpm سانتریفیوژ شدند. آنتیبادیهای اولیه CD90 کونژوگه با PE (فیکواریترین) وکونژوگهCD31 با FITC (فلورسنس ایزوتیوسیانات) اضافه شد و بهمدت 30 دقیقه در یخچال قرار گرفت و برای کنترل منفی از آنتیبادیهایIgG2b PE-IgG2a, FITC- استفاده شد. در مرحله بعد سلولها پس از شستشو با PBS به مدت 10 دقیقه با دور 2000 rpm سانتریفیوژ شدند. سپس به سلولها بافر فیکس کننده فرمالین 1 درصد اضافه شد و با دستگاه فلوسیتومتری (,Germany Beckton Dickinson) آنالیز شدند.
تیمار سلولهای جداشده با مایع زجاجیه: پس از پاساژ سوم سلولها بعد از شمارش سلولی، به تعداد 104×4 سلول در 7 خانهی پلیت ۲٤ خانهای کشت داده شدند و پس از چسبیدن سلولها به کف ظرف، گروههای تجربی با درصدهای مختلف 10، 30،20،15 ، 40 و 50 از مایع زجاجیه در محیط کشت تیمار شدند و گروه کنترل بدون تیمار با مایع زجاجیه و صرفا با DMEM و FBS ۱٥ درصد و آنتیبیوتیکها کشت داده شدند. این خانهها بهمدت ۱٤ روز تحت تیمار و کشت قرار گرفتند.
رنگآمیزی سلولها با مارکر کریستالین:در انتهای روز١٤، نمونههای تجربی و نمونههای کنترل، با آنتیبادی اولیه کریستالینalpha A+ alpha B crystalline antibody (ab28163) و آنتیبادی ثانویه AF8035) (anti-rabbit- IgG-fitc رنگآمیزی شدند. بهمنظور انجام ارزیابی ایمونوسیتوشیمی، سلولهای مزانشیمی تیمار شده بهمدت ۱۵ دقیقه با پارافرمالدئید ۴ درصد در دمای اتاق تثبیت شدند. سپس با PBS شستشو و از بافر بلاک کننده حاوی Triton X-100 جهت نفوذ پذیری سلولها برای ورود آنتیبادی استفاده شد. سپس Goat serum اضافه شد و پس از خارج کردن Goat serum، آنتیبادی اولیه alpha A+ alpha B crystalline antibody رقیق شده در BSA/PBST (Phosphate Buffered Saline Tween-20 /Bovine serum albumin) 2/0 درصد اضافه شد و سلولها در این محلول به مدت ۴۵ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند. نمونهها ۲ بار با PBS/Tween 1/0 درصد شستشو داده شدند. آنتیبادی ثانویهرقیق شده در BSA/PBST 2/0 درصد، بهمدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق اضافه شد. از میکروسکوپ معکوس فلورسانس جهت ارزیابی سلولها استفاده شد.
نتایج
مورفولوژی سلولهای کشت شده
در کشت اولیه، سلولهای گرفته شده از مغز استخوان موشهای NMRI به شکل گروههای سلولی ناهمگن و هتروژن دیده شدند (شکل A1). در روز هفتم، سلولها با مورفولوژی متفاوت نظیر پهن، دوکی و چند وجهی مشاهده شدند (شکل B1). در پاساژهای بعدی تعداد سلولهای دوکی شکل بیشتر شدند، بهطوریکه در پاساژ سوم اکثریت سلولها دوکی شکل بودند. در ادامه پاساژهای بعدی سلولهای بنیادی مزانشیمی بهصورت خالص در آمده بودند و سلولهای مزانشیمی از لحاظ مورفولوژیکی بیشتر شبیه به سلولهای فیبروبلاست (دوکی شکل) بودند. سلولهای بنیادی بافت چربی بعد از کشت اولیه در زیر میکروسکوپ معکوس بهصورت سلولهای شبه فیبروبلاستی همراه با زوائد کوچکی در اطراف روئیت شدند که به ظرف کشت چسبیده بودند و سلولهای مرده بهصورت اجسام شفاف در سطح کشت نمایان بودند (شکل A2). بعد از یک هفته، تعداد سلولهای مزانشیمی بافت چربی که دوکی شده بودند افزایش یافت (شکل B2). سلولهای مایع آمنیوتیک در روز اول کشت شامل جمعیت هتروژنی از سلولها بودند. در روز دوم، محیط کشت شامل جمعیتی از سلولهای بنیادی مزانشیمی چسبیده به کف ظرف با مورفولوژی فیبروبلاستی بههمراه گروهی از سلولهای غیر مزانشیمی شناور بودند (شکل A3). سلولهای بنیادی مزانشیمی چسبیده به کف ظرف بهسرعت تکثیر شدند و ظرف یک هفته به صورت یک تک لایه کف ظرف را پر کردند (شکل B3).
|
|
||||
شکل ۱:کشتسلولهایمغزاستخوان گرفته شده ازموش. (A)در روز اول کشت، سلولهای مزانشیمی و غیر مزانشیمی به شکل ناهمگن دیده شدند. (B)درروزهفتم، سلولهای مزانشیمی بیشتر بهصورت دوکیشکلمشاهده شدند. (میکروسکوپفازکنتراستمعکوسبا بزرگنمایی ×۴٠۰).
|
|||||
|
|
شکل 2: کشت اولیه سلولهای بنیادی جدا شده از بافت چربی(A) و کشت سلولها بعد از یک هفته (B). (بزرگنمایی ×٤۰۰).
|
|
||
شکل 3: جمعیت هتروژن سلولهای کشت داده شده مایع آمنیوتیک در روز دوم (A) و سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک در روز هفتم(B). (بزرگنمایی ×٤۰۰). |
نتایج بهدست آمده از بررسی بیان مارکرهای سطحی بهروش فلوسیتومتری
جهت اثبات ماهیت مزانشیمی بودن این سلولها علاوه بر خاصیت چسبندگی آنها به ظرف کشت، یکی دیگر از راههای شناسایی آنها استفاده از مارکر سطحی میباشد که بعد از پاساژ اول و جداشدن سلولهای بنیادی مزانشیمی از سایر سلولها بهروش فلوسیتومتری بررسی شد. در این بررسی سلولهای بنیادی مزانشیمی هر سه منبع با دو مارکر CD90 و CD31 بررسی شدند. نتایج در مورد مارکر CD90بر روی سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و مایع آمنیوتیک بهترتیب 29/29 درصد و 57/0 درصد بوده است (شکل 4)، در حالیکه سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی این مارکر را بهمیزان 82 درصد بیان کردند (شکل 4). در مورد مارکر CD31 هر سه منبع سلولهای بنیادی آن را بهمیزان کم بیان کردند. همانطور که در شکل4 دیده میشود بافتهای چربی، مغز استخوان و مایع آمنیوتیک مارکر CD31 را بهترتیب ۱/۰ درصد، ۴۴/۳ درصد، ۵۳/۱ درصد بیان میکنند.
نتایج حاصل از بررسی مورفولوژی سلولها در طی تمایز
پس از پاساژ سوم سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیوتیک تحت القا درصدهای مختلف 10، 15 ،20،30، 40 و 50 از مایع زجاجیه نسبت به محیط کشت، بهمدت ١٤ روز قرار گرفتند. گروههای تجربی سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در غلظت 10 درصد شباهت بسیاری به گروه کنترل (بدون مایع زجاجیه) داشتند در حالیکه در غلظت 15 درصد سلولها کشیده تر و به صورت موضعی بهموازات هم آرایش یافته بودند و پس از آن در غلظتهای 20 ، 30، 40و 50 درصد میزان مرگ و میر سلولها بسیار زیاد گردید و آرایش سلولی از بین رفت. گروههای تجربی سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک در غلظت 10، 15 ، 20 و 30 درصد شباهت بسیاری به گروه کنترل داشتند در حالیکه در غلظت 40 درصد سلولها کشیدهتر و بهموازات هم آرایش یافته و دارای هستکهای بیشتری در داخل هسته بودند و پس از آن در غلظت 50 درصد میزان مرگ و میر سلولها بسیار زیاد گردید و آرایش سلولی از بین رفت. روند اخیر در مورد سلولهای مزانشیمی چربی نیز دقیقا بههمین صورت بوده و افزایش تعداد هستکهای داخل هسته و موازی بودن سلولها بهصورت موضعی در غلظت 40 درصد حاکی از تاثیر زجاجیه بر سلولهای بنیادی و القا هدفمند آن داشته است (شکل5).
|
|
||
|
|
||
|
|
شکل 4: نتایج فلوسیتومتری برای A: سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان که مارکر سطحی CD31 را 44/3 درصد بیان کردند. B: سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان که مارکر سطحی CD90را 29/29 درصد بیان کردند. C: سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک که مارکر سطحی CD31 را 53/1 درصد بیان کردند. D: سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک که مارکر سطحی CD90 را 57/0 درصد بیان کردند. E:سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی که مارکر سطحی CD31 را 1/0 درصد بیان کردند. F: سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی که مارکر سطحی CD90 را 82 درصد بیان کردند.
|
|
||
|
|
شکل5:(A): سلولهای بنیادی مزانشیمی در گروه کنترل است که پس از ۱۴ روز کشت بدون مجاورت با مایع زجاجیه علائمی از کشیدگی سلولی در آنها دیده نمیشود. (B): سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی پس از ۱۴ روز کشت با غلظت ۴۰ درصد مایع زجاجیه که سلولها نسبت به گروه کنترل کشیدهتر شدهاند. (C) سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیکپس از ۱۴ روز کشت با غلظت ۴۰ درصد مایع زجاجیه نسبت به محیط کشت که سلولها نسبت به گروه کنترل کشیدهتر شدهاند. (D) سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان پس از ۱۴ روز کشت با غلظت ۱۵ درصد مایع زجاجیه نسبت به محیط کشت که سلولها نسبت به گروه کنترل کشیدهتر شدهاند. در هر سه نمونه B,C و Dسلولهای تیمار شده کشیدهتر و فیبری شکل شده اند و بهسمت آرایش موازی پیش میروند. (بزرگنمایی x٤٠٠)
نتایج بررسی بیان مارکرهای آلفا کریستالین بهروش ایمونوسیتوشیمی
نتایج بررسیهای ایمونوسیتوشیمی سلولهای گروه تجربی و گروه کنترل با آنتیبادی پلیکلونال alpha A+ alpha B crystalline antibody پس از 14 روز نشان داد که در سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان میزان بیان کریستالین در سلولهای تیمار شده با غلظت 15 درصد مایع زجاجیه نسبت به سایر غلظتهای مایع زجاجیه بیشتر بود، چنانچه در غلظت 10 درصد فقط تعداد کمی از سلولها رنگ پذیرفته بودند و در غلظتهای دیگر مرگ و میر سلولی مانع رنگ گیری شده و اثری بر صفحه مشاهده نشد. در سلولهای تیمار شده، بافت چربی و مایع آمنیوتیک با غلظت 40 درصد نسبت به سایر غلظتهای مایع زجاجیه میزان بیان کریستالین بیشتر بوده و در غلظت 50 درصد صفحه سیاه بود و اثری از رنگپذیری سلولها دیده نشد. در حالیکه در غلظتهای زیر 40 درصد اندک رنگی در نواحی روئیت شده بود ( شکل6).
|
|
||
|
|
||
شکل 6: بررسی ایمنوسیتوشیمی بیان آلفا کریستالینها در سلولهای گروه کنترل (A) پس از ۱۴ روز کشت بدون مجاورت با مایع زجاجیه که هیچگونه سیگنالی مبنی بر بیان کریستالینها را نشان نمیدهد. در سلولهای بنیادی گروه تجربی مایع آمنیوتیک (B) و بافت چربی (C) که تحت القای ۴۰ درصد مایع زجاجیه نسبت به محیط کشت پس از 14 روز بوده اند و بیان آلفا کریستالینها با رنگ سبز مشاهده میشود و همچنین سلولهای بنیادی مغز استخوان (D) که تحت القا 15 درصد مایع زجاجیه نسبت به محیط کشت به مدت 14 روز قرار گرفتند و بیان آلفا کریستالینها با رنگ سبز قابل روئیت است. (بزرگنمایی×200)
|
بحث
جداسازی و خلوص سلولهای بنیادی مزانشیمی موش بهعلت تعداد کم سلولهای مزانشیمی در مغز استخوان و رشد ناخواسته سلولهای غیرمزانشیمی بهمراتب مشکل تر از دیگر گونههای جانوری است (16). سلولهای مغز استخوان شامل فیبروبلاستها، سلولهای اجدادی خونی (17)، ماکروفاژها، سلولهای اندوتلیالی و چربی میباشند (18). مطالعات قبلی نشان دادند این سلولها در کشت باقی مانده و باعث آلودهسازی سلولهای فیبروبلاستی میشوند (19 و20). اما تعویض محیط کشت مانع از چسبیدن سلولهای غیر مزانشیمی و خونی به پلیت پلاستیکی کشت میشود. در این مطالعه بدون کمترین استرس برسلولها و با بهبود روش چسبیدن به ظرف کشت پلاستیک از طریق تعویض سریع محیط کشت در ساعات اولیه از کشت سلولهای مغز استخوان موش، از چسبیدن سلولهای غیر مزانشیمی به ظرف کشت جلوگیری گردید. سلولهای بنیادی مشتق شده از بافت چربی، سلولهایی هستند که چند توان بوده و از نوع بنیادین بالغ میباشند (21). این سلولها همانند سلولهای بنیادی مغز استخوان به کف ظرف پلاستیکی کشت میچسبند و از لحاظ بررسی مارکرها حدودا مشابه عمل میکنند. این سلولها نسبت به مارکرهای سطحی سلولهای خونساز منفی عمل کرده و نسبت به مارکرهای سلولهای بنیادی مزانشیمی مثبت هستند (22). در تحقیقات گذشته نشان داده شد که سلولهای بنیادی مایع آمنیوتیک در مقایسه با سلولهای بنیادی مغز استخوان، قدرت تکثیر و خودنوزایی بالاتری دارند (23 و24). در این مطالعه نیز تکثیر بالای سلولهای بنیادی مایع آمنیوتیک در مقایسه با سایر سلولها موید مطالعات محققین قبلی بود.
یکی دیگر از روشهای شناسایی این سلولها استفاده از مارکر سطحی است. Baddoo و همکارانش (25) مارکرهای سطحی،CD106 ،CD81 ،CD11b ،CD34 ،CD105 ، CD48 و CD31 را در سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش بررسی کردند که نتایج این بررسی نشان داد که این سلولها مارکرهای CD105،CD106 و CD81 را به میزان بالایی بیان کردند، در حالیکه مارکرهایCD11b،CD34 ، CD45 CD48 و CD31 به میزان کمی بیان شدند. مطالعات انجام شده نشان میدهد که سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از بافت چربی مارکرهای سطحی متفاوتی مانند,CD29, CD44,CD54, CD73 (SH3), CD90, CD105 (SH2), CD106, CD146, CD166 را بیان میکنند، ولی فاقد مارکرهای دیگری مانند CD14, CD31, CD34, CD45, CD133, CD144, HLA-DR, STRO-1 میباشند. آنالیز فلوسایتومتری از مارکرهای سطحی سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان و بافت چربی نشان داده است که این سلولها مارکرهایی مانند CD13, CD29, CD44, CD90, CD105 (SH2), CD73 (SH3), را بیان می کنند در حالیکه این سلولها بیان متفاوتی از CD49d, CD54, CD34 دارند (26). You و همکارانش (27) بر روی سلولهای بنیادی مایع آمنیوتیک انسانی مارکرهای سطحی CD29 و CD31 و CD45 را بررسی کردند که نتایج این بررسی نشان داد که این سلولها مارکرهای CD29 را بیان میکنند اما CD31 و CD45 بهمیزان خیلی کم بیان میکنند. Liu و همکارانش (28) مطالعهای بر روی سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک موشی انجام دادند که مشخص شد که این سلولها فیبروبلاستی شکل مارکر CD44 را بیان میکنند اما مارکرهای CD90، CD31 و CD45 را بیان نمیکنند.
در این مطالعه بیان برخی مارکرهای سطحی نظیر CD31 و CD90 در سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیوتیک به روش فلوسیتومتری مورد بررسی قرار گرفت که نتایج این تحقیق نشان داد که سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و مایع آمنیوتیک مارکر CD90را بهمیزان کم بهترتیب 29/29 درصد و 57/0 درصد بیان کردند، اما سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی این مارکر را بهمیزان بالا بهمقدار دقیق 82 درصد بیان کردند. بیان مارکر CD31 در بافتهای چربی، مغزاستخوان و مایع آمنیوتیک به ترتیب ۱/۰ درصد، ۴۴/۳ درصد، ۵۳/۱ درصد میباشد که نشانگر بیان اندک این مارکر در سلولهای بنیادی هر سه منبع است.
بیان CD90 و CD31 در سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک آنقدر اندک است که عملا موید عدم بیان این مارکرهاست. این نتایج در راستای مطالعات محققین قبلی است که سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک را فاقد مارکرهای CD90 و CD31 میدانند.
در این تحقیق، توانایی تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیوتیک به سلولهای فیبر عدسی چشم بررسی گردید. به این منظور سلولهای مزانشیمی از مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیوتیک موش جدا شد و بهمدت 14 روز با مایع زجاجیه چشم گاو تیمار شد. Eleanor و همکارانش (29) بر روی رشد و تمایز سلولهای اپیتلیومی عدسی انسان مطالعه کردند. آنها این سلولهای اپیتلیومی را جدا کرده و بهمدت ۱٥ روز در محیط دارای FGF-2 کشت دادند. در نهایت مشاهده کردند که مورفولوژی آنها تغییر یافته و اجسام لنتوئیدی (lentoid) (مجموعه دستجات چند سلولی گرد و دارای خاصیت انکسار بالا) ظاهر شدند. آنها برای اثبات ادعای خود در مورد تمایز این سلولها به عدسی چشم از مارکر آلفا کریستالینها با روش RT-PCR استفاده کردند. در تحقیق حاضر سلولهای بنیادی مزانشیمی که بهمدت ۱٤ روز تحت القای مایع زجاجیه چشم قرار داشتند از نظر بیان آلفا کریستالین توسط روش ایمونوسیتوشیمی مورد بررسی قرار گرفتند که پاسخ مثبت این سلولها بیانگر تمایز آنها بهسمت ایجاد سلولهای فیبر عدسی و بیان ژنهای خاص عدسی میباشد.
Michael و همکارانش (30) دو بافت اپیتلیومی از دو عدسی مجزا را بر روی هم در محیط کشت مخلوط با زجاجیه گاوی (1:1) کشت دادند و علاوه بر بررسیهای میکروسکوپی و تعیین میزان توانایی این ساختار عدسی مانند، نشان دادند که در این شرایط این سلولها بعد از ٣۰ روز کشت شکلی مشابه سلولهای فیبر عدسی پیدا کرده و شفاف شده اند و قادر به متمرکز کردن نور گردیدهاند. در نتیجه مایع زجاجیه گاوی فاکتورهای مناسب برای تمایز به سمت سلولهای عدسی را داراست.
در تحقیق حاضر از مایع زجاجیه چشم گاو با دوزهای متفاوت استفاده شد. بررسیهای مورفولوژیکی نشان داد که در سلولهای گروه تجربی، میتوان تغییرات قابل مقایسهای را نسبت به گروههای کنترل مشاهده کرد. تغییرات مورفولوژیکی مشاهده شده در این تحقیق عبارتند از کشیدگی زیاد سلولها، بهموازات هم قرارگیری آنها، افزایش تعداد هستکها و از دست دادن هسته سلولی که همه این نتایج مورفولوژیکی بیانگر شروع تمایز این سلولها بهسمت ساختارهای شبه فیبر عدسی بوده و با نتایج Michael و همکارانش مطابقت دارد.
ملکی و همکارانش (31) سلولهای بنیادی بند ناف موش سوری را جدا کرده و در مجاورت مایع زجاجیه چشم گاو کشت دادند و بیان پروتئینهای کریستالین A α و B α را بعد از ۱٤ روز کشت در دوز 25 درصد با استفاده از روش Western blot analysis مشاهده نمودند.
در مطالعهی حاضر، دوزهای مختلفی از مایع زجاجیه با محیط کشت آماده گردید تا روند تاثیرگذاری میزان زجاجیه بر القا سلولی مشخص گردد. این دوزها در ابتدا از 50 درصد شروع شد اما چون نتیجهی مطلوب حاصل نشد و مرگ و میر سلولی بسیار بالا بود در نتیجه میزان دوز از 10 درصد آغاز گردید که در این روند با بررسی کامل سلولهای تحت القا سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک و بافت چربی مارکر کریستالینها را در دوز 40 درصد و سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در دوز 15 درصد بیان کردند. در این بررسی دیده شد که در دوز 50 درصد ، مرگ میر سلولی بسیار بالا بود. این مطلب نشان دهندهی کشنده بودن مایع زجاجیه در غلظتهای بالا برای سلولها میباشد. این نتایج همانند کار ملکی و همکارانش (31) نشان دادند که تحت القا فاکتورهای رشد موجود در مایع زجاجیه چشم، سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیون میتوانند به ساختاری مشابه به فیبر عدسی تمایز یابند که در هر دو تحقیق مارکر تمایزی آلفا کریستالین بیان شدند. بیان آلفا کریستالینها در انواع مختلف سلولهای بنیادی تحت القا دوزهـای متفـاوت مایع
زجاجیه حاکی از توان تمایزی متفاوت سلولهای بنیادی گرفته شده از منابع متفاوت میباشد.
نتیجه گیری
در کل از یافتههای این تحقیق می توان نتیجه گرفت که بر اساس تغییرات مورفولوژیکی و بیان مارکرهای خاص عدسی، سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان، بافت چربی و مایع آمنیوتیک در اثر تیمار با زجاجیه توان تمایز در جهت تشکیل سلولهای فیبری عدسی را دارند. تخلیص سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان بهعلت هتروژن بودن نسبت به بافت چربی و مایع آمنیوتیک از مزیت کمتری برای کشت برخوردار است و از طرف دیگر تکثیر سلولهای مایع آمنیوتیک بسیار بالاتر از دو بافت دیگر است، اما با توجه به اینکه سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان در دوز پایینتری نسبت به دو بافت دیگر القا شدند بافت مناسبتری میباشند. با توجه به ویژگیهای مشابه سلولهای موش و انسانی میتوان امیدوار بود که سلولهای بنیادی انسانی نیز این قابلیت را داشته باشند که در اینصورت میتوان از این سلولها در درمان بیماریهای چشمی استفاده کرد. تخلیص سلولهایی با منشاهای متفاوت موجب میشود تا دست محققان و پزشکان در امر درمان بازتر باشد تا اگر تهیه سلول از یک بافت با مشکل مواجه شد امکان جایگزینی با روش مناسب تر را داسته باشند.
تشکر و قدردانی
از همکاری آقای دکتر امیر آتشی مدیر گروه سلولی شرکت بن یاخته و همچنین مساعدت نمودن دانشگاه علوم پزشکی ایران و انستیتو پاستور ایران جهت انجام آنالیز فلوسایتومتری صمیمانه سپاسگزاری مینماییم