نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناس ارشد فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه اراک، اراک، ایران
2 دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کد پستی7349-8-38156
3 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد آشتیان، گروه زیست شناسی، آشتیان، ایران
چکیده
هدف: در این پژوهش اثر سمیت کلرید آلومینیوم (AlCl3) بر القا آپوپتوزیس درسوسپانسیون سلولی دو رقم برنج (Oryza sativa) خزر و طارم مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه سلولهای سوسپانسیون سلولی از دو رقم خزر و طارم به مدت 3 هفته در محیطMS Skoog) Murashig and) مایع کشت داده شدند. سپس سلولهای دو رقم با غلظت‌های مختلف (0، 40، 80 و 120 میکرومولار) کلرید آلومینیوم به مدت 56 ساعت تیمار شدند. تغییرات بیوشیمیایی آپوپتوزیس DNA سلول‌ها توسط الکتروفورز ژل و تست تانل و تغییرات ریخت شناسی آپوپتوزیس سلول‌ها با رنگ آمیزی هوخست و پروپیدیوم یدید مورد مطالعه قرار گرفت.
نتایج: نتایج حاصل از الکتروفورز ژل و تست تانل، آسیب DNA و ایجاد قطعات 180 تا 200 جفت بازی را در دو رقم نشان دادند. همچنین نتایج حاصل از رنگ آمیزی هوخست و پروپیدیوم یدید تغییرات ریختشناسی سلول‌هاشامل متراکم شدن هسته‌ها، تخریب غشا و چروکیدگی سیتوپلاسم را با افزایش غلظت بهویژه تحت غلظت 120 میکرومولار و در رقم طارم نشان دادند.
نتیجه گیری: سمیت AlCl3 باعث تخریب DNA و تغییرات ریختشناسی سلول‌ها در دو رقم برنج بهویژه رقم طارم پس از 56 ساعت تیمار و با افزایش غلظت شد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Effect of Aluminum Toxicity on Inducing of Apoptosis in Cell Suspension of Rice (Oryza sativa) Khazar and Tarom Cultivars
نویسندگان [English]
- A N 1
- M M 2
- M Y 3
- MR A 2
چکیده [English]
Aim: In this study the effect of AlCl3 toxicity on apoptosis in cells suspension of two rice cultivars Khazar, Tarom were investigated.
Material and Methods: In present research cells suspension of two rice cultivars (Khazar and Tarom) grew up in liquid Murashig and Skoog medium within a period of 3 weeks. Then cells were treated with different concentrations (0, 40, 80 and 120 µmolL-1) of AlCl3 for 56 hours. Biochemical changes of DNA by gel electrophoresis and TUNEL test and morphological changes by Hoechst and propidium iodide (PI) staining were investigated.
Results: Results of gel electrophoresis and TUNEL test showed DNA damage in these cultivars. Results of Hoechst and PI dying also showed morphological changes such as: condensation of nucleus, membrane damage and shrinkage of cytoplasm.
Conclusion: AlCl3 induced nuclear DNA damage and also morphological change in two cultivars of rice especially Tarom by increasing concentration after 56 hours of treats.
کلیدواژه‌ها [English]
- Apoptosis
- Aluminium
- Cell culture
- Rice (Oryza sativa)
- Toxicity
مقدمه
آلومینیوم سومین عنصر فراوان بعد از اکسیژن و سیلیس که بیش از 8 درصد سطح زمین را اشغال می‌کند (1). آلومینیوم در خاک، آب‌ها و زنجیره غذایی وجود داشته که باعث ایجاد بیماری در انسان و همچنین کاهش محصولات کشاورزی می‌شود. منابع آلومینیوم شامل معادن، کارخانه‌های ذوب فلزات حاوی هیدروکسید آلومینیوم ، ظروف آشپزخانه، وسایل آرایشی و پزشکی (2 و 3) و باران‌های اسیدی میباشد (4). در خاک‌های اسیدی آلومینیوم، باعث مهار تقسیم و طویل شدن سلولهای راس ریشه شده که در نهایت باعث کاهش جذب آب و مواد غذایی می‌شود (5 و 6). این عنصر می‌تواند به مکان‌هایی در سلول از جمله دیواره سلولی، غشا پلاسمایی، اسکلت سلولی و هسته‌ها متصل شده و در نتیجه باعث ایجاد اثراتی گردد که نشان دهنده سمیت آلومینیوم میباشد (8-6). آلومینیوم همچنین بر روی مکانیسم‌های کنترلی سازماندهی میکروتوبول اسکلت سلولی، پلی‌مریزاسیون توبولین تثیر و همچنین باعث بی‌نظمی در حرکات کروموزوم بهواسطه رشته‌های میتوزی و تاخیر در سر هم‌بندی میکروتوبول‌ها در طی میتوز می‌شود (9).
مرگ برنامهریزی شده سلول (Programmed Cell Death or PCD) و یا آپوپتوزیس روندی است که باعث حذف و یا آسیب به سلولهای مضر در چرخه زندگی موجودات پر سلولی می‌گردد. مرگ برنامه ریزی شده سلول، نقش مهمی در طی چرخه تکاملی و ریختزایی موجودات از طریق حذف سلولهای ناخواسته و یا اضافی ایفا می‌کند. در سلولهای جانوری مرگ برنامهریزی شده سلول با یکسری ویژگی‌های ریختشناسی همراه میباشد (9) از جمله این ویژگی‌ها تراکم هسته و سیتوپلاسم، قطعه قطعه شدن DNA هسته‌ای ( طرح نردبانی DNA)، ایجاد برآمدگی‌هایی در سطح سلول و ظهور اجسام آپوپتیک میباشد. در سلولهای گیاهی مشابه جانوران مرگ برنامهریزی شده سلول نقش ویژه‌ای در رشد و تکامل موجودات، پاسخ گیاه علیه عوامل بیماری‌زا (10)، استرس‌های زیستی و غیرزیستی مانند ازن، اشعه ماورا بنفش و یکسری از مواد شیمیایی سمی از جمله فلزات سنگین ایفا می‌کند (13-11). خانواده‌ای از آنزیم‌های پروتئاز به نام کاسپازها نقش مهمی در ایجاد ویژگی‌های مرگ برنامهریزی شده سلول ایفا می‌کنند (14). محققان بیان کردند که بخشی از سمیت آلومینیوم به دلیل استرس اکسیداتیو ایجاد شده توسط این یون میباشد بنابراین تحمل گیاهان به آلومینیوم ممکن است وابسته به فعالیت سیستم آنتی اکسیدانی گیاه باشد (19-15). ROS های (گونه‌های فعال اکسیژن) تولید شده در اثر سمیت آلومینیوم به مولکول‌های بیولوژیکی از جمله RNA، DNA، پروتئین و لیپید بهواسطه پراکسیداسیون لیپید آسیب می‌رساند (20). ROS تولیدی در نهایت می‌تواند باعث القا مرگ برنامه ریزی شده سلول و یا آپوپتوزیس در گیاهان شود (21).
برنج در تمام قاره‌ها رشد می‌کند. اینگونه گیاهی علاوه بر اینکه یک گیاه مدل برای مطالعات مولکولی میباشد دارای اهمیت اقتصادی و اجتماعی فراوان نیز میباشد (22 و 23). بنابراین بررسی آپوپتوزیس ناشی از تنش‌های محیطی با هدف بهدست آوردن دانش بیشتر در مورد مکانیسم‌های تحمل به اهمیت اقتصادی و اجتماعی اینگونه گیاهی کمک می‌کند. با توجه به اینکه تاکنون اثر سمی آلومینیوم بر ویژگی‌های بیوشیمیایی و ریخت شناسی سوسپانسیون سلولی برنج بررسی نشده در این تحقیق ویژگی‌های بیوشیمیایی از جمله طرح نردبانی DNA، آشکار سازی انتهای OH/3 DNA آسیب دیده در طی آپوپتوزیس و ویژگی‌های ریخت شناسی مانند تراکم هسته و تخریب غشا روی سلولهای رشد یافته در محیط حاوی آلومینیوم بررسی شد.
مواد و روش‌ها
این مطالعه تجربی بر روی سوسپانسیون سلولی دو رقم برنج (Oryza sativa) خزر و طارم رشد یافته در محیط کشت
Murashig and Skoog (MS) مایع حاوی 5/2 میلی گرم بر لیتر 2,4,D(phenoxyacetic acid 2,4Dichloro) انجام گردید (24). محیط کشت MS هر 5 روز با محیط کشت جدید تعویض شد. پس از 15 روز، سوسپانسیون سلولی در شرایط استریل به لوله فالکون‌های 50 میلی‌لیتری منتقل و سانتریفوژ گردید. محلول غذایی قبلی خارج و محلول جدید حاوی غلظت‌های مختلف (0، 40، 80 و 120 میکرومولار) کلرید آلومینیوم (2/4=pH) اضافه گردید.
استخراج DNA و الکتروفورز ژل: لوله فالکون‌های محتوی سوسپانسیون سلولی در دور g1200 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شدند و سپس رسوب سلولی حاصل برای استخراج DNA بر طبق روش Doyl and Doyl (25) مورد استفاده قرار گرفت. بافر استخراجیDNA شامل Tris-HCl 100 میلیمولار، Na2EDTA 20 میلیمولار Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) Na2( (8=pH)، NaCl 4/1 میلیمولار و CTAB 2 درصد (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) بود. پس از اضافه کردن حجم مساوی از کلروفرم/ایزوآمیل الکل (24:1) به رسوب موجود، اتانول 70 درصد اضافه و سپس محلول رویی دور ریخته شده و پس از آن DNA در دمای اتاق خشک و در نهایت 50 میکرولیتر بافر TE به رسوب اضافه گردید. در نهایت 2 میکروگرم DNA برای انجام الکتروفورز ژل 8/1 درصد مورد استفاده قرار گرفت. ژل توسط اتیدیم بروماید رنگ آمیزی و سپس با ولتاژ 85 ولت و مدت زمان 45 دقیقه الکتروفورز و سپس توسط دستگاه Gel documentation عکسبرداری گردید.
تست تانل: بهمنظور آشکار سازی انتهای OH/3 DNA آسیب دیده از تست تانل استفاده گردید. برای انجام این تست ابتدا سلول‌ها با پارافرمالدهید 4 درصد فیکس گردیدند. سپس یک قطره از سوسپانسیون سلولی روی لام ریخته و بهمدت چند دقیقه در معرض دمای محیط قرار گرفت. از کیت تانل(TdT-mediated deoxy-uracil nick end labeling) (In situ Apoptosis Detection. Takara, Japan Kit) بهمنظور آشکارسازی DNA قطعه قطعه شده بهواسطه برچسب دار کردن انتهای OH/3 رشته DNA شکسته شده استفاده شد. اساس این روش اتصالTdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) به انتهای OH/3 رشته DNA شکسته شده میباشد. برچسب دار شدن انتهای شکسته DNA در تاریکی و دمای 37 درجه سانتیگراد و طبق دستورالعمل کیت تانل انجام گردید. در آخر بهمنظور افتراق سلولهای مرده از زنده، سلول‌ها با DAB (3,3'-diaminobenzidine) و سبز متیل رنگ آمیزی و پس از شستشو با آب مقطر، سلول‌ها توسط میکروسکوپ نوری مشاهده و عکسبرداری شدند.
رنگ آمیزی هوخست و پروپیدیوم یدید (PI): بهمنظور بررسی تغییرات مورفولوژیکی هسته در طی تنش آلومینیوم، سلولهای حاصله از سوسپانسیون پس از سانتریفوژ و شستشو با بافرPBS (Phosphat buffer salin) با هوخست (Hochest) وPI (Propidium Iodide) رنگ آمیزی شدند. 100میکرولیتر از سلولهای محیط کشت با 50 میکرولیتر رنگ هوخست ml µg -1 5/ به مدت 2 دقیقه در تاریکی انکوبه و پس از آن سلولهای سوسپانسیون در زیر میکروسکوپ فلورسنس ( OLYMPUS, DP71, Japan) مشاهده شدند. همچنین برای تمایز سلولهای مرده از زنده (26) به 50 میکرولیتر از نمونه‌ها 8 میکرولیتر رنگ فلورسنت PI µg/ml01/ در شرایط تاریکی اضافه و پس 20 ثانیه این سلول‌ها نیز جداگانه توسط میکروسکوپ ( OLYMPUS, DP71, Japan) عکسبرداری شدند.
نتایج
بررسی تغییرات بیوشیمیایی آپوپتوزیس
در این بررسی بهدنبال القای آپوتوزیس و فعال شدن نوکلئازها،DNA به قطعات 180 تا 200 جفت بازی شکسته شده بهطوریکه DNA سلولهای تیمار یافته با غلظت‌های 80،40 و 120 میکرومولار بر روی ژل الکتروفورز ایجاد طرح نردبانی کردند (شکل1).
|
200bp |
|
100bp |
شکل 1:DNA ladder در سوسپانسیون سلولی برنج پس از 56 ساعت تیمار با غلظت‌های مختلف کلرید آلومنیوم.
M:مارکر،1Lane: شاهد، Laneهای 2، 3 و 4 مربوط به رقم طارم بهترتیب تحت تیمار با غلظت‌های 40، 80 و 120 میکرومولار و Laneهای 5، 6 و 7 مربوط به رقم خزر به ترتیب تحت تیمار با غلظت‌های 40، 80و 120 میکرومولار. (ایجاد طرح نردبانی در دو رقم و بویژه طارم تحت غلظت 120 میکرومولارLane4 ). رنگ آمیزی ژل 8/1 درصد آگارز توسط اتیدیم بروماید.
از تست تانل نیز برای مشخص نمودن آپوپتوزیس استفاده گردید. در این روش DNA سلولهای تیمار یافته با غلظت‌های 40، 80 و 120 میکرومولار کلرید آلومینیوم نشاندار شده و در نتیجه هسته سلولهای آسیب دیده به رنگ قهوه‌ای مشاهده شدند که موید تانل مثبت و در نتیجه آپوپتوزیس میباشد. نشاندار نشدن سلول‌ها ناشی از آسیب ندیدن DNA و در نتیجه عدم وقوع آپوپتوزیس در آنها میباشد و در نتیجه هسته سلولهای شاهد به رنگ سبز مشاهده گردیدند (شکل 2). نتایج حاصل از الکتروفورز ژل و تست تانل در سوسپانسیون سلولی نشان داد که غلظت‌های 40، 80 و بهویژه غلظت 120 میکرومولار AlCl3 در هر دو رقم خزر و بویژه رقم طارم باعث القا آپوپتوزیس پس از 56 ساعت تیمار گردیدند که این نتایج نشان دهنده حساس‌تر بودن رقم طارم با افزایش غلظت میباشد.
(شاهد)
(غلظت 40 میکرومولار)
(غلظت 80 میکرومولار)
(غلظت 120 میکرومولار)
شکل 2: نتایج تست تانل در سوسپانسیون سلولی ارقام طارم و خزر. a) سلول شاهد- b، d و f) مربوط به رقم خزر تحت تیمار 56 ساعته با کلرید آلومینیوم بهترتیب با غلظت‌های 40، 80 و 120 میکرومولار–c،e وg ) مربوط به رقم طارم تحت تیمار 56 ساعته با کلرید آلومینیوم بهترتیب با غلظت‌های 40، 80 و 120 میکرومولار (بزرگنمایی ×100). هسته سلولهای شاهد به رنگ سبز (تانل منفی) و هسته سلولهای آپوپتوتیک به رنگ قهوه‌ای (تانل مثبت) قابل مشاهده است.
بررسی تغییرات ریخت شناسی آپوپتوزیس
تغییرات ریخت شناسی سلول‌ها پس از 56 ساعت تیمار با غلظت‌های 40، 80 و 120 میکرومولار AlCl3 با رنگ فلورسنت هوخست شامل: متراکم شدن و تغییر شکل هسته در مقایسه با شاهد بود. بهطوریکه سلول شاهد دارای هسته کروی و واضح میباشد (شکلa3). در حالیکه هسته سلولهای تیمار یافته با غلظت‌های 40، 80 و 120 میکرومولار دچار تراکم و تغییر شکل شدند (شکلb-g 3). سلولهای تیمار یافته با غلظت120 میکرومولار حداکثر فشردگی و تغییر شکل را نسبت به شاهد بهویژه در رقم طارم نشان دادند (شکلg 3(.
(شاهد)
(غلظت 40 میکرومولار)
(غلظت 80 میکرومولار)
(غلظت 120 میکرومولار)
شکل3: رنگ آمیزی هوخست در سوسپانسیون سلولی a) سلول شاهدb، d و f) مربوط به رقم خزر c،e وg ) مربوط به رقم طارم پس از 56 ساعت تیمار با کلرید آلومنیوم. (بزرگنمایی ×40). هسته نمونه شاهد سالم و گرد و کروی میباشد (a). سلولهای تیمار یافته دچار آسیب شده‌اند که هسته‌ها متراکم و تغییر شکل داده‌اند. حداکثر متراکم شدن و تغییر شکل تحت غلظت 120 میکرومولار رقم طارم مشاهده گردید (g).
رنگ آمیزی سلولهای تیمار یافته با غلظت‌های 40، 80 و 120 میکرومولار توسط رنگ پروپیدیم یدید افزایش تخریب غشا و مرگ سلول‌ها در مقایسه با شاهد را نشان داد. سلولهای شاهد دارای غشا پلاسمایی سالم بوده و به رنگ فلورسنت PI غیر قابل نفوذ بوده و در نتیجه رنگ فلورسنت PI نمی‌تواند وارد سلول‌ها شود (شکلa4) ولی سلولهای آسیب دیده (تیمار یافته با غلظت‌های 40، 80 و 120 میکرومولار) اجازه ورود PI را بهدرون سلولهای خود داده و در نتیجه هسته سلولهای آسیب دیده بهرنگ قرمز مشاهده شدند ( شکلb-g4). همانطور که شکل نشان میدهد سلولهای تیمار یافته با غلظت 120 میکرومولاررقم طارم بیشتر دچار آسیب شده‌اند (شکلg 4).
(شاهد)
(غلظت 40 میکرومولار)
(غلظت 80 میکرومولار)
(غلظت 120 میکرومولار)
شکل 4: رنگ آمیزی همزمان هوخست و پروپیدیم یدید در سوسپانسیون سلولی a) سلول شاهد - b، d و f) مربوط به رقم خزر - c،e وg ) مربوط به رقم طارم پس از 56 ساعت تیمار با کلرید آلومنیوم. (بزرگنمایی ×40). سلولهای شاهد دارای غشا پلاسمایی سالم بوده و به رنگ فلورسنت PI غیرقابل نفوذ بوده و در نتیجه رنگ فلورسنت PI نمی‌تواند وارد سلول‌ها شود (a). ولی سلولهای آسیب دیده اجازه ورود PI را به درون سلولهای خود داده و در نتیجه سلولهای آسیب دیده به رنگ قرمز مشاهده شدند (b-g).
بحث
مسمومیت ناشی از آلومینیوم عامل اصلی محدود کننده تولید محصول در خاک‌های اسیدی از جمله شالیزارهاست (15). از آنجا که مقاومت ارقام مختلف گیاهان نسبت به مسمومیت آلومینیوم متفاوت است (2) لذا در این تحقیق از دو رقم طارم و خزر برای مقایسه پاسخ آنها در کشت سلولی استفاده شد. سیستم‌های ساده کشت سلولی تحت تنش‌های زیستی و غیرزیستی بهطور گسترده برای فهم مکانیسم‌های بیولوژیکی در گیاهان مورد استفاده قرار می‌گیرند (27 و 28). در گیاهان آپوپتوزیس فرآیندی فیزیولوژیکی و طبیعی است که با یکسری ویژگی‌های بیوشیمیایی و ریخت شناسی همراه میباشد. مشخص‌ترین ویژگی‌های مرگ برنامه ریزی شده سلول: کاهش حجم سیتوپلاسم، تراکم هسته و قطعه قطعه شدن DNA به قطعات 180 تا 200 جفت بازی میباشد (31-29). در این بررسی پس از تیمار سلول‌ها با غلظت‌های 40، 80 و 120 میکرومولار کلرید آلومینیوم تغییرات بیوشیمایی شامل تخریب DNA و تغییرات ریختشناسی از قبیل تغییر شکل و تراکم هسته، چروکیدگی سیتوپلاسم و همچنین افزایش تعداد سلو‌های مرده پس از 56 ساعت تیمار مشاهده شد. در واقع نتایج نشان دادند که تغییرات بیوشیمیایی و ریخت شناسی آپوپتوزیس در سلولهای رقم طارم و تحت غلظت 120 میکرومولار حداکثر بود. نتایج مشابه از مرگ برنامه ریزی شده سلول در سوسپانسیون سلولی گوجه فرنگی در اثر تیمار با غلظت 100 میکرومولار آلومینیوم (32) و همچنین در سوسپانسیون سلولی Thellungiella halophile تحت تیمار 300 میلی مولار شوری (33) مشاهده شد. مطالعات نشان داده که آلومینیوم باعث تغییر سطح کلسیم سیتوپلاسمی و در نتیجه فعالسازی نوکلئازهای وابسته به کلسیم می‌شود و در نهایت این آنزیم‌ها، DNA را در منطقه بین نوکلئوزومی برش و منجر به قطعه قطعه شدن DNA و ایجاد طرح نردبانی بر روی ژل می‌شوند (32). از آنجاییکه آلومینیوم به DNA و هسته متصل می‌شود این عامل می‌تواند دلیل تغییر شکل و متراکم شدن هسته سلولهای تحت تیمار باشد (34). پس از تیمار سلول‌ها با آلومینیوم بسیاری از سلولهای سوسپانسیون دو رقم خزر و طارم دچار مرگ شدند که این بهدلیل افزایش نفوذپذیری اکثر سلول‌ها بهدنبال تیمار با آلومینیوم میباشد. در واقع یکی از مناطق اتصال آلومینیوم به سلول، غشا پلاسمایی بوده (35) که آلومینیوم می‌تواند به گروه‌های فسفات و کربوکسیل غشا متصل و بدین ترتیب یکپارچگی غشا را از بین برده و منجر به افزایش نفوذپذیری غشا پلاسمایی می‌شود (36) و در نتیجه سلول‌هایی که غشا پلاسمایی خود را از دست داده‌اند اجازه ورود رنگ PI را داده و در نتیجه هسته سلولهای مرده به رنگ قرمز در حالی که سلولهای سالم به رنگ آبی میباشد.
نتیجه گیری
بر طبق نتایج بهدست آمده از این تحقیق می‌توان بیان نمود که غلظت‌های مختلف آلومینیوم و بهویژه غلظت 120میکرومولار باعث القای آپوپتوزیس و در نتیجه ایجاد تغییرات بیوشیمیایی و ریخت شناسی در سوسپانسیون سلولی دو رقم برنج و بهویژه رقم طارم گردیدکه این نتایج نشان دهنده حساس‌تر بودن رقم طارم میباشد. با توجه به اهمیت این موضوع پیشنهاد می‌گردد مطالعات بیشتری برای بررسی اثرات مختلف این یون صورت پذیرد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله از حوزه معاونت محترم پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک که حمایت مالی و اجرایی این تحقیق را به عهده داشتند صمیمانه تشکر و قدردانی می‌نمایند.
)