فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: با توجه به اینکه مطالعات کاربردی و مولکولی در Ranunculaceae در حال افزایش است، بررسی و درک تکوین گل در این تیره ضروری است. در این پژوهش مراحل و چگونگی تکوین تخمک در گیاه Adonis flammea بررسی شد.
مواد و روش‏ها: گل‌های جوان و غنچه‌ها در مراحل مختلف برداشت، در FAA 70 تثبیت و در الکل 70 درصد نگهداری شدند. نمونه‌ها پس از آب‌گیری و قالب‌گیری در پارافین،  با میکروتوم برش‌گیری شدند .رنگ آمیزی با PAS و هماتوکسیلین  انجام گرفت. لام‌های تهیه شده از مراحل مختلف تکوینی با دقت با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی و عکسبرداری شدند.
نتایج: نتایج نشان داد تخمک ها در A. flammea  از نوع واژگون، دو پوششی و پرخورش است. مجرای سفت با پوسته درونی تشکیل می‌شود. مگاسپروسیت پس از تقسیم میوز تترادهای با هر دو نوع آرایش خطی و غیرخطی را ایجاد می کند. تکوین کیسه رویانی از تیپ پلی‌گونوم پیروی می‌کند. سلول‌های آنتی‏پُد پایا هستند که در مرحله اندوسپرم سلولی تحلیل می‏روند. ارتباطات سیتوپلاسمی سلول‏های کیسه رویانی، تحلیل برخی از تخمک‏ها و به‏دنبال آن سقط تخمک و رویان در برخی از موارد مشاهده شدند.
نتیجه گیری: الگوهای تکوین تخمک و کیسه رویانی از نهاندانگان و تیپ پلی‏گونوم تبعیت می کنند. ولی پایایی آنتی‌پُدها، تشکیل کلاهک خورشی، ارتباطات سیتوپلاسمی بین سلول‏های کیسه رویانی و عدم موفقیت در لقاح و سقط رویان در برخی از تخمک‏ها از ویژگی‌های گونه مورد مطالعه است که علت آن می‌تواند عوامل محیطی یا ژنتیکی باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Ovule and Megagametophyte Development in Adonis flammea Jacqu: Report of Ovule and Embryo Abortion

چکیده [English]

Aim: Since applied and molecular studies are increasing in Ranunculaceae, the study and understanding of the flower development in the familyis necessary. In this research ovule developmental stages in Adonis flammea were studied.
Material and Methods: The young flowers and buds were sampled in different developmental stages, fixed in FAA70 and kept in 70% ethanol. Samples were embedded in paraffin after dehydration and sliced using microtome. Staining was carried out with PAS and Hematoxylin. Prepared slides of different developmental stages were studied using light microscope and are photographed.
Results: Results showed that ova in A. flammea are anatropous, bitegumic and crassinucellate. Micropylar channel was constructed with inner integument. Megasporocyte produces both linear and nonlinear arrangement of tetrads after meiosis. Embryo sac development follows to the Polygonum type. Antipodal cells are persistent that degenerate at the cellular endosperm stage. Cytoplasmic connections of embryonic sac cells, degeneration of some ova, consciously abortion of ovules and embryo were also observed.
Conclusion: The patterns of ovule and embryo sac development are accordance with the Angiosperms and Polygonum type. But antipodal cells persistence, nucellar cap formation, cytoplasmic connections between embryo sac cells, fertilization failure and embryotocia in some ova are characters of the studied species that can due to genetical or environmental factors.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ovule
  • Embryo sac
  • Megagametophyte
  • Adonis flammea
  • Ranunculaceae

مقدمه

تیره آلاله موقعیت فیلوژنتیک برجسته‌ای در راسته Ranunculales دارد و به‏نظر می‌رسد پایه و اساس گروه بزرگی از دولپه‏ای‏ها (یودایکت‌ها) باشد. این خانواده مجموعه قابل توجهی از ریخت شناسی اولیه و پیشرفته را در بر می‌گیرد. از جمله ویژگی‌های رویان شناختی این تیره بدین شرح است: گل‌های منظم یا نامنظم، دوجنس یا تک جنس، برچه­های آزاد یا متصل، برگه‌های چند تخمکی یا فندقه‌های یک تخمکی، تخمک پرخورش یا کم­خورش، تک پوسته، دو پوسته یا فاقد پوسته، تکوین کیسه رویانی از تیپ­های Allium و Polygonum پیروی می­کند، و سلول‌های آنتی‏پود زودگذر یا پایا هستند (1 و 2). پلی‏پلوئیدی مکرر در انواع سلول‌های کیسه رویانی نظیر آنتی‌پودها، سینرژید‌ها، اندوسپرم و سوسپانسور گزارش شده است (3و 4) و ارتباط آشکاری که میان ساختار این سلول‌ها و طول مدت زمان زندگی‌شان وجود دارد، نقش تغذیه‌ای آن‏ها را پیشنهاد می‌کند (5). وقوع درون پلوئیدی در سلول‌های آنتی‌پود، در اعضای این خانواده گزارش شده است (6 و 7). یکی از جنس­های این تیره جنس Adonis  است که به طایفه Ranunculeae از زیر خانواده Ranunculoideae تعلق دارد. براساس مطالعات مرجع شناختی انجام گرفته گزارشی در مورد مراحل تکوین تخمک و کیسه رویانی گیاه مورد مطالعه و به‏ویژه در خصوص سقط تخمک و رویان در این جنس در دسترس نمی باشد. هدف این مقاله توسعه مطالعه نحوه تکوین تخمک و کیسه رویانی به‏عنوان یک واحد زایای مهم در  A. flammea  است. به‏علاوه، آشکار ساختن خصوصیات ریخت­زایی تخمک علاوه بر درک کارایی مکانیسم تولید مثلی، سبب فهم بهتری از رده­بندی تیره آلاله نیز می‌شود.

 

مواد و روشها

گل­ها و جوانه­‏های گونه مورد مطالعه در اوایل تابستان از زیستگاه‏‏های طبیعی در همدان، ضلع شرقی کوه الوند، منطقه مجاور امام زاده کوه (امام­ زاده محسن) (ع) جمع آوری شد. گل­ها و غنچه­ها در مراحل مختلف تکوین برداشت و جهت تثبیت در    (Formalin Acetic acid Ethanol) FAA70 قرار داده ­شد و سپس در الکل 70 درصد نگه‏داری شدند. پس از قالب گیری، نمونه­ها در قالب­های پارافین با میکروتوم در اندازه 7 تا 10 میکرومتر برش‏گیری شدند (8). شفاف ­سازی نمونه­ها        مطابق روش  Yeung(9) و رنگ ­آمیزی مضاعف هسته و سیتوپلاسم به‏وسیله هماتوکسیلین و ائوزین صورت گرفت. نمونه‏­های مورد مطالعه با میکروسکوپ نوری             CX21FS1  Olympus   (Japan) بررسی شد و عکس­برداری به کمک دوربین دیجیتال مدل Canon G11 (Japan) انجام گرفت. با مطالعه تعداد زیادی لام تهیه شده مراحل تکوین تخمک و کیسه رویانی مشخص و مورد مطالعه قرار گرفت.

 

نتایج

تکوین تخمک

بر اساس نتایج به‏دست آمده در گیاه مورد مطالعه، استقرار تخمک‏ها در تخمدان از نوع جداری است. بنیان تخمکی پایه گرا است و به‏صورت یک برآمدگی گنبدی شکل از سلول­های قاعده سطح شکمی برچه توسعه می­یابد. پریموردیوم تخمک دارای 4 تا 7 لایه سلولی است (شکل A1). پریموردیوم تخمک، خمیدگی را از همان مراحل اولیه آغاز می­کند (شکل A1). در داخل پریموردیوم تخمک، سلول‏های آرکئوسپور به واسطه حجم زیاد، سیتوپلاسم متراکم و هسته بزرگ از بقیه سلول‏های خورش قابل تشخیص هستند (شکل­های C1 و B1). در پریموردیوم تخمک A.flammea چندین سلول آرکئوسپوری وجود دارد که یکی از این سلول‌ها به طور مستقیم به سلول مادر مگاسپور تمایز می‌یابد. سلول مادر مگاسپور در A.flammea، در لایه چهارم زیر اپیدرمی قرار دارد (شکل­های F1 وD1). پوسته­ها در قاعده پریموردیوم‏های تخمکی بنیان گذاری می­شوند. ابتدا پوسته درونی و سپس پوسته بیرونی تشکیل می­گردد. میکروپیل به‏وسیله پوسته داخلی که متشکل از 2 لایه سلولی است شکل می­گیرد. پوسته خارجی ضخیم و متشکل از 4 تا 5 لایه سلولی است. پوسته‏های تخمک در طرفین جسم تخمک، محل پیدایش نسبتا متقابل دارند و بنابراین میکروپیل حالت خطی صاف با انتهای داسی شکل دارد (شکل‏های G4 ،F4،D3). خمیدگی تخمک با واکوئل‏دار شدن و رشد بیشتر سلول‏های جهت مقابل به خمیدگی، مشخص­تر می­شود (شکل­های F2 و C2 ،B2 ،F1). با افزایش میزان خمیدگی ضمن رشد، تخمک به حالت کاملا خمیده در می­آید و سپس در ضمن تشکیل کیسه رویانی، تخمکواژگون می­شود. در نتیجه پوسته­های تخمک در کنار پایه تخمک (فونیکول) قرار می­گیرند (شکل­های F2 و C2–F1 ،D1).

 

 

شکل 1:  مراحل اولیه تکوین تخمک و مگاسپوروژنز در A.flammea.A) بنیان تخمکی که به‏صورت برآمدگی کوچکی در سطح شکمی تخمدان  تشکیل شده و خمیدگی را از همان مراحل اولیه آغاز می­کند در بعضی برچه­ها بیش از یک پریموردیوم شکل می­گیرد ولی تنها یکی از آن‏ها رشد می­کند؛ B) بیش از یک سلول آرکئوسپور‏ی در راس خورش شکل می­گیرد (▲)؛ C) پیشرفت تقسیمات آرکئوسپور (Ar) به‏همراه سیتوپلاسم متراکم آن و رشد پوسته؛ D) متافاز  I() در سلول مادر مگاسپور؛ E) آنافاز I () در سلول مادر مگاسپور؛ F) حضور سلول مادر مگاسپور (mmc) در لایه چهارم. شاخص ۳۰ میکرومتر. مخففها:  ii، پوسته درونی؛  oi، پوسته بیرونی؛ car، برچه؛ Po، پریموردیوم تخمکی، f، پایه تخمک (فونیکول).

 

 

در این گونه، مادگی با برچه‌های متعدد و آزاد به‏طور مارپیچ و به‏دنبال استقرار مارپیچی پرچم­ها روی نهنج برجسته قرار دارد. برچه‌ها از آغاز کوزه ‌مانند هستند (شکل H4). مادگی در نمونه مورد مطالعه، دارای پایک و همچنین کرک از نوع غده­ای است (شکل­های F4 و C4). پریموردیوم تخمکی به‏صورت برجستگی کوچک انگشت ­مانند دیده می­شود (شکل B 1). تعداد این برجستگی­ها معمولا دو یا سه عدد می­باشد که تنها یکی از آن‏ها رشد می­کند و بالغ می­شود. در نمونه مورد مطالعه تخمک از نوع دو پوسته ای،  متوسط خورش و واژگون است (شکل­های G4 و F4).

مگاسپورزایی و نمو گامتوفیت ماده

سلول مگاسپوروسیت با حجم زیاد، هسته درشت، سیتوپلاسم متراکم و شکل چند وجهی خود از سایر سلول­های خورش قابل تشخیص می­باشد (شکل­های F1–D1). مگاسپوروسیت با انجام میوز مگاسپورها را تشکیل می­دهد. با اولین تقسیم میوزی مگاسپوروسیت، دو سلول دیاد هاپلوئید تشکیل می‏گردد. دیاد در حالتی که هنوز سیتوکینز انجام نشده (شکل A2) قابل مشاهده است که پس از سیتوکینز  هم دیاد طولی (شکل B2) و هم دیاد عرضی (شکل C2) مشاهده شد. دومین تقسیم میوزی موجب تشکیل چهار سلول تتراد می­شود. تتراد‏های مشاهده شده از نوع خطی طولی و T شکل (شکل­های E2 و D2)  است. از چهار سلول حاصل از میوز (تتراد)، سه سلول تحلیل می‏روند و در این نمونه موقعیت سلول مگاسپور عمل‏کردی سفتی (میکروپیلی) است (شکل F2) که در نهایت به کیسه رویانی تحول می‏یابد.وقتی میوز با تشکیل تترادها به پایان می رسد، پوسته تخمک حدود 4/3 جسم تخمک را می­پوشاند. هسته سلول بنیادی کیسه رویانی سه تقسیم میتوزی متوالی را انجام می­دهد و به‏ترتیب کیسه رویانی دو هسته­ای و چهار هسته­ای را ایجاد می­کند.  در نهایت، تقسیم سوم، کیسه رویانی هشت هسته‏­ای را به وجود می­آورد.در این مرحله پوسته خارجی به حداکثر اندازه خود رسیده است. سه سلول در قطب مجاور مجرای سفت (میکروپیل) دستگاه تخم ­زا را  ایجاد می­کنند. دستگاه تخم ­زا شامل یک سلول میانی تخم ­زا و دو سلول کناری قرینه (سینرژید) است (شکل B3).

این سلول‏ها آرایش مثلثی شکلی را ایجاد می­کنند. در قطب بنی، سلول‏های آنتی‏­پود به‏وجود می­آیند که آن‏ها نیز آرایشی مثلثی شکل دارند. در نمونه مورد بررسی آنتی­ پود­ها کوچک‏ترین سلول‏های کیسه رویانی هستند (شکل­های B4 و E3). هم‏زمان با تمایز سلول‏های سفتی به دو سلول قرینه و سلول تخم­زا، دو هسته قطبی جدا شده از قطب‏های سفتی و بنی در قسمت مرکزی کیسه رویانی (شکل A3) به هم ملحق می‌شوند تا هسته ثانویه یا سلول مرکزی را تشکیل ‌دهند؛ ارتباطات سیتوپلاسمی بین کلیه سلول‏های کیسه رویانی بر قرار است (3E, F, 4DD). سپس سلول مرکزی مهاجرت کرده و در زیر دستگاه تخم ­زا قرار می‌گیرد (شکل­های E3–B3). در نمونه مورد مطالعه ترکیب هسته‏­های قطبی و تشکیل هسته ثانویه قبل از لقاح  تشکیل می‌شود. با تشکیل کیسه­ رویانی و سلولهایی که قابلیت لقاح را دارند، یعنی تخم­زا (هاپلوئید) و هسته­ دوتایی (دیپلوئید) تکوین تخمک به پایان می­رسد.

در زمان لقاح تعداد زیادی لوله گرده به تخمک راه پیدا می­کنند (شکل C3) و در این بین تنها یکی از لوله­های گرده  از طریق مجرای سفت وارد شده، و از طریق یکی از سینرژید­ها به کیسه رویانی راه پیدا می­کند و محتویات خود را به داخل کیسه تخلیه می­نماید. یکی از اسپرم­ها با سلول تخم‏زا و دیگری با سلول مرکزی لقاح می­یابد (شکل E3) و بدین ترتیب سلول تخم (شکل­ F3) و سلول مادر آندوسپرم (شکل A4) تشکیل می­شود.

 

 

 

شکل 2: مگاسپوروژنز و تکوین گامتوفیت ماده در A.flammea.. A) دیاد () بدون سیتوکینز؛ B) دیاد خطی طولی، دیواره بین سلول­ها () قابل رویت است؛ C) در این برچه سه تخمک دیده می­شود که دو عدد از آ‏ن‏ها در مرحله پریموردیوم تخمکی به سر می­برد و دیگری در مرحله دیاد می­باشد. دیاد از نوع خطی عرضی () است؛ D) تتراد خطی () ؛ E) تتراد T شکل (). ii: پوسته داخلی، oi: پوسته خارجی؛F) موقعیت مگاسپور عمل‏کردی (FMe) در قطب بنی است، پایه تخمک (f) در این شکل دیده می­شود. شاخص ۴۰ میکرومتر.  مخففها:  ii، پوسته درونی؛  oi، پوسته بیرونی؛ car، برچه؛ Po، پریموردیوم تخمکی؛ f، پایه تخمک (فونیکول). 

 

نمو سلول مادر آندوسپرم به‏سرعت انجام می‏شود و بافت آندوسپرم را به‏وجود می‏آورد. اندوسپرم ابتدا از نوع هسته­ای است (شکل­های D4–B4) و سپس جداربندی نموده و سلولی می­شود (شکل E4). پس از نمو سلول تخم و در مرحله رویان کروی شکل، اندوسپرم کاملا سلولی می­شود ( شکل E4). سلولهای اندوسپرم تک هسته‏ای هستند.

 

 

 

 

شکل3: تکوین و لقاح گامتوفیت ماده در A.flammea. A) هسته­های قطبی (PN) در مرکز کیسه رویانی در حال تلفیق هستند؛ B) کیسه رویانی بالغ شامل دو عدد سلول سینرژید (syn) و یک سلول میانی تخم­زا (ec) ، سلول مرکزی (cc) در بالای این مجموعه استقرار می­یابد؛ C) ورود لوله­ گرده (Pt) () به داخل کیسه رویانی؛ D) شکل کلی تخمک و کیسه رویانی، شکل خطی هلالی میکروپیل که پوسته داخلی در تشکیل آن دخالت دارد در این تصویر نمایان است؛ E) بخش فوقانی کیسه رویانی با جزئیات دقیق تر، در این شکل تلقیح اسپرم () به داخل سلول مرکزی و سلول تخم­زا دیده می­شود. سلول­های سینرژید و سلول­های آنتی پود نیز حضور دارند؛ F)در این شکل سلول تخم (z) تشکیل شده و تلفیق هسته­ای بین اسپرم () و سلول مرکزی (cc) برقرار شده است. پیکانهای توپر محل اتصالات سلولی در بین برخی از سلول‏های کیسه رویانی را نشان می دهد. شاخص در  شکل D ۴۰ و در بقیه شکل‏ها ۱۵ میکرومتر است.

 

 

تعداد آنتی‏­پود­ها در ابتدا سه عدد است اما به موازات رشد کیسه رویانی تعداد آن‏ها در نتیجه تقسیمات میتوزی افزایش می‏یابد. تعداد آن‏ها گرچه بیش از سه عدد ولی نامشخص است. تعدادی از آن‏ها بعد از لقاح نیز تا مدتی پایا مانده (شکل B4) و احتمالا در جریان سلولی شدن اندوسپرم، فشرده و تخریب می­شوند. سلول تخم تقسیم شده، پیش‏رویان و سپس رویان را ایجاد می­کند (شکل C4). در طی بلوغ کیسه رویانی کلاهک خورشی تحلیل می­رود. تکوین کیسه­ رویانی از تیپ پلی­گونوم پیروی می‏کند و در طی بلوغ کشیده و طویل می­گردد.در تخمک A.flammea دستجات آوندی در خورش و پوسته­ها به خوبی قابل مشاهده است (شکل­های G4 و F4). در غنچه­های مورد بررسی، مادگی متشکل از  6 تا 8 برچه است و تنها یک تخمک زایا در هر برچه دیده می‏شود. بعضی از تخمک­ها در مراحل پایانی تکوین گامتوفیت ماده تخریب می­شوند و آثار تخمک‏های تحلیل رونده با کیسه رویانی غیر عادی قابل رویت و تشخیص است (شکل­های D5–A5).  شمارش اولیه در بیش از ۳۰ نمونه گل مورد مطالعه و ارزیابی تعداد تخمک‏های در حال تحلیل و لقاح نیافته نشان داد که تعداد آن‏ها قابل توجه و حدود 40 درصد از تخمک‏های گیاه مورد بررسی را  شامل می­شود و حدود یک سوم از موارد فوق (تخمک‏های در حال تحلیل) مربوط به تخمک‏هایی است که لقاح یافته و محتوی رویان اولیه ولی در حال سقط می‏باشد.

 

 

 

 

شکل 4: گامتوفیت ماده بعد از لقاح در A.flammea. A) سلول مادر اندوسپرم (Emc) تشکیل و شروع به تقسیم می­کند؛ B) در حالی‏که تقسیمات اولیه اندوسپرم (en) آغاز شده هنوز سلول­های آنتی‏پودی (Ant) حضور دارند؛ C) در این شکل اندوسپرم هسته­ای (en) در مجاورت جنین (EM) دیده می­شود؛ در دیواره تخمدان کرک غده­ای (gh) حضور دارد؛ D) وسعت اندوسپرم هسته­ای در این تصویر کاملا نمایان است؛ E) اندوسپرم سلولی، F) تخمک پرخورش، دو پوسته­ای آویخته در برچه، دستجات آوندی در حال ورود به پوسته می­باشد؛ G) درپوش سفتی () بر روی پوسته خارجی حضور دارد. دسته آوندی (VB) قابل مشاهده است؛ H) برش طولی از یک غنچه جوان شامل: 1،نهنج؛2، برچه؛ 3، خامه وکلاله. شاخص در شکل A ۱۵ و در سایر شکل‏ها ۴۰ میکرون است. مخففها همانند تصاویر قبلی است.

 

شکل 5: تخمک‏های در حال تحلیل در  A.flammea که به علت کافی نبودن تعداد دانه‏های گردهو یا شرایط اکولوژیک، تعدادی از تخمک‏ها موفق به لقاح نمی‏شوند (A) و سقط می‏شوند و برخی نیز پس از لقاح و در مرحله تشکیل پیش رویان غالبا کروی شکل(B)  سقط می شوند. در شکلهای C و D کیسه رویانی با تکوین ناقص و فاقد مجموعه ساختارهای سلولی کامل دیده می شود که نشان دهنده سقط آنها است.  شاخص ۴۰ میکرومتر.

 

بحث

توالی بنیانگذاری مارپیچی اندام‏های تشکیل دهنده گل در خانواده Rnunculaceae  یک الگوی کلی است (10) و یک سطح سیستماتیکی پائین را نشان می­دهد (11). وضعیت دو پوسته‏ای و مجرای سفت (میکروپیل) اندوستومیک، ویژگی­های ابتدایی هستند که در اغلب گیاهان این تیره دیده می­شود، در حالی‏که میکروپیل bistomic و تخمک تک پوسته­ای که در برخی از گیاهان این تیره دیده می­شود ویژگی­های اشتقاق یافته از گروه اول هستند (12). در نمونه مورد مطالعه، تخمک از نوع ابتدایی و دو پوسته­ای است که ابتدا پوسته درونی و سپس پوسته بیرونی تخمک بنیانگذاری می­شود. پوسته بیرونی از رشد زیادی برخوردار بوده و تعداد لایه­‏های آن بیش از دو عدد می­باشد در حالی‏که پوسته درونی محدود به دو لایه سلولی است. در تخمک‏های با پوسته‏­های چند لایه­ای، اپی‏درم و پارانشیم تمایز یافته دیده می­شود (13). در تخمک دو پوسته­ای مورد بررسی، تنها پوسته داخلی در تشکیل میکروپیل دخالت دارد، به عبارتی میکروپیل اندوستومیک است که یک ویژگی ابتدایی محسوب می­شود (11) .در اغلب اسپرماتوفیت­ها، پوسته به خورش متصل است و در بیشتر موارد فقط در انتهای میکروپیلی به صورت آزاد باقی می­ماند (14). در اعضای برخی تاکسون­ها، فرایند کامل اتصال می­تواند وجود داشته باشد. بنابراین در برخی اعضای تیره آلاله پوسته‌های آزاد، بدون اتصال به‏طور محکم فشرده می‌شود و در برخی دیگر فرایند کامل اتصال دیده می‌شود به‏طوری که حاشیه بین پوسته‏ها قابل تشخیص نیست (12). حالت اخیر درA. flammea،مشاهده گردید. در نهاندانگان پایه (بازال آنژیوسپرم­ها) تخمک­های پرخورش غالب هستند (10) و تیره آلاله در بین تاکسون‏­های ابتدایی دو لپه­ای­ها حجیم‏­ترین خورش را دارد (10)، اما در نمونه مورد مطالعه تخمک از نوع متوسط خورش مشاهده گردید.

 در تیره آلاله تقسیمات مماسی سلول‏های اپی‏درمی منجر به تشکیل کلاهک خورشی می­شود. درجه نمو کلاهک، یک ویژگی مخصوص گونه است. کلاهک خورشی در A. flammea 4-2 لایه­ای است. در خانواده آلاله کلاهک خورشی می­تواند موجب تشکیل اپیستاز شود (15 و 16) که بافتی با دیواره سلولی ضخیم است که بر اساس گزارش‏های فوق در دانه­های بالغ پایدار می‏ماند اما در نمونه‏های مورد مطالعه ما در مراحل پیشرفته قابل تشخیص نیست. سد­های پوستکی در نتیجه توسعه لبه راسی پوسته و به طور معمول از پوسته درونی به‏وجود می­آیند و به‏صورت کمتر معمول، از پوسته­های بیرونی تشکیل می­شوند. به‏طور کلی سد­ها در طی تشکیل کیسه رویانی به‏وجود می­آیند و در زمان ورود لوله گرده به حفره تخمدان به‏طور کامل نمو یافته می­شوند (17، 18، 19 و 20). اغلب انواع سد پس از لقاح از بین می­روند و برخی در دانه بالغ باقی می­مانند. در گونه A. flammea سد از پوسته بیرونی منشا می­گیرد و تشکیل آن در طی نمو کیسه رویانی و در حالی است که پوسته بیرونی به حداکثر رشد خود رسیده است. وجود چندین سلول آرکئوسپور در هر تخمک، از ویژگی­های تیره آلاله و به طور کلی از خصوصیات تخمک‏های با خورش حجیم و چند لایه­ای است. اما فقط یکی از آن‏ها به سلول مادر مگاسپور تمایز می­یابد. الگوی مگاسپوروژنز منظم است. مطالعه بر روی مگاسپورانژ نشان می­دهد که شکل تترادها در این تیره دارای تنوع بسیار زیادی است. دستجات آوندی در خورش و پوسته­ها مشاهده شد. حضور دستجات آوندی در پوسته­ها یک ویژگی ابتدایی است (21). این دستجات عناصر تراکئید­ی هستند.

نتایج ما نشان داد که مکان تلفیق هسته‏­های قطبی در مرکز کیسه رویانی است ولی به‏علت مهاجرت به‏سمت میکروپیل در نهایت موقعیت استقرار هسته ثانویه در A. flammea در مجاورت سلول تخم ­زا است. در این خانواده دو تیپ پلی­پلوئیدی در سلول‏های آنتی­پود گزارش شده است (۱۰). اما در گونه A. flammea تعداد آنتی‏­پود­ها در ابتدا سه عدد بود ولی تعداد آن‏ها به‏سرعت افزایش یافته به‏طوری که تعداد نامشخصی داشتند و از نظر اندازه نیز بسیار کوچک می­مانند و در واقع کوچکترین سلول‏های کیسه رویانی هستند و به‏نظر نمی­رسد دارای پلی‏پلوئیدی باشند. به‏علاوه، تعدادی از آنتی­‏پود­ها تا مدتی پس از لقاح پایا می­مانند. اگرچه سلول‏های آنتی‏پود به‏عنوان سلول‏های با پایداری کم در نظر گرفته می‏شوند که اغلب قبل از لقاح و یا بلافاصله پس از لقاح از بین می‏روند (۱۳)، ولی در برخی از گیاهان سلول‏های مزبور پایداری بالایی دارند و حتی تعداد آن‏ها نیز افزایش می‏یابد  (22 و۲۳)، پس از لقاح باقی‏مانده و حتی موجب تشکیل رویان می شوند (24 و 25).  پایین بودن نسبت جنسی (نسبت دانه‏های گرده به تخمک) و عوامل ژنتیکی نظیر پلی‏پلوئیدی می‏تواند موجب کاهش شانس لقاح و باروری شود و تخمک‏های لقاح نیافته در حال تحلیل را برجای بگذارد (13). در گیاه مورد بررسی نیز تعداد قابل توجهی از تخمک‏های مورد مطالعه در حال تحلیل مشاهده شدند که حاکی از عدم لقاح موفق در آن‏ها است.  یافتن علت این پدیده نیاز به بررسی عوامل ژنتیکی و محیطی دارد.

نتیجه گیری

بررسی­ دقیق روند تکوین مادگی و کیسه رویانی نشان داد که اگرچه الگوی تکوین از الگوی گیاهان نهاندانه پیروی می‏کند، اما ویژگی‏های منحصر به‏فردی نیز در گونه مورد مطالعه وجود دارد. تخمک دو پوسته‏ای است اما مجرای سفت فقط با پوسته درونی ساخته می‏شود در کلاهک خورشی 2 تا 4 لایه وجود دارد که موجب تشکیل اپیستاز می‏گردد. چندین سلول ارکئوسپوری وجود دارد، اما فقط یکی از آن‏ها به مگاگامتوسیت تبدیل می‏شود. روند مگاسپروژنز روند عادی و متداول است. در کیسه رویانی سلول‏های آنتی‏پود برخلاف حالت معمول نسبتا کوچک هستند که نشان دهنده این است که در تغذیه کیسه رویانی نقش مهمی ندارند. آن‏ها همچنین بر خلاف حالت متداول دوام بیشتری دارند و تا مدت‏های طولانی پس از لقاح دوام می یابند. یکی از ویژگی‏های جالب توجه در گونه مورد مطالعه تخریب و تحلیل تعداد قابل توجهی از تخمک‏ها است که نشان‏دهنده عدم موفقیت آن‏ها در فرایند لقاح است. علت این پدیده می‏تواند عوامل ژنتیکی و پایین بودن نسبت جنسی (نسبت دانه‏های گرده به تخمک) و یا عوامل محیطی باشد که نیاز به بررسی بیشتر دارد. بر اساس مطالعات مرجع شناختی ما، مطالعه حاضر اولین مطالعه در ارتباط با روند تکوین تخمک، مگاسپوروژنز  و کیسه رویانی در A. flammea است.

1. Vijayaraghavan MR, Bhandari NN. Studies in the family Ranunculaceae: Embryology of Thalictrum javanicum Blume. Flora.1970; 159: 450-458.
2. Johri BM, Ambegaokar K, Srivastava PS. Comparative embryology of Angiosperms, 2th Ed. Berlin: Springer-Verlag; 1992.
3. Kozieradzka-Kiszkurno M, Bohdanwicz J. Sedum acre embryogenesis: Polyploidization in the suspensor. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica. 2003; 45:153–157.
4. Greilhuber J, Dolezel J, Lysak MA, Bennett MD. The origin, evolution and proposed stabilization of the terms 'genome size' and 'C-value' to describe nuclear DNA contents. Annals of Botany. 2005; 95(1): 255–260.
5. Raghavan, V. Molecular embryology of flowering plants, 4th Ed. Cambridge: Cambridge University Press; 1997.
6. Turala-Szybowskak K, Wedzony M. Endopolyploidy in the antipodals of Ranunculus subgenus Batrachium. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 1981; 50: 161–164.
7. Turala-Szybowskak K, Wolanska J. Two mechanisms of polyploidization of the antipodals in Aquilegia vulgaris L. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica. 1989; 31: 63-74.
8. Chehregani A, Tanaomi N. Ovule ontogenesis and megagametophyte development in Onobrychis schahuensis Bornm. (Fabaceae). Turkish Journal of Botany.2010; 34: 241-248.
9. Yeung EC, Cavey MG. Developmental changes in the inner epidermis of the bean seed coat. Protoplasma. 1990; 154: 45-52.
10. Ren Y, Li ZJ, Chang HL, Lei YJ, Lu AM. Floral development of Kingdonia (Ranunculaceae s. l., Ranunculales). Plant Systematic and Evolution. 2004; 247: 145-153.
11. Endress PK. Floral structure and evolution in Ranunculanae. Plant Systematic and Evolution. 1995; 9: 47-61.
12. Wang Z, Ren Y. Ovule Morphogenesis in Ranunculaceae and its Systematic Significance. Oxford Journal. 2007; 101:447-462.
13. Rezanejad  F, Chehregani A. Embryology of Flowering Plants (Translated from Batygina, T.B.). 1th. Kerman: Shahid Bahonar University; 2004.
14. Eames, A. Morphologyof Angiosperms. 1th Ed. New York: McGraw-Hill; 1961.
15. Van Tieghem Ph. Epideepharide genre nouveau Luxembourgiacées. J Botany France.1901; 12: 376-389.
16. Van Tieghem, Ph. 1901b. Ĺhypostase, sa structure et son role constans, sa position et sa forme variables. Bull Mus Natn Hist.Nat 1901; 7 (8): 412-418.
17. Bhargava HR. Contribution to the morphology of Boerhaavia repanda, Indian J Botanical Society. 1932; 11 (4): 303-326.
18. Savchenko MI, Komar GA. Morphology of the ovule in some Monocotyledons, pp. 74-113. In M.S. Yakovlev (eds). Flower Morphology and Reproductive Process in Angiosperms, Moscow-Leningrad, Russia; 1965.
19. Savchenko MI. Morphology of the flowering plant ovule. 1th Ed. Russia: Nouka, Leningrad; 1973.
20. Shamrov II, Nikiticheva ZI. The ovule and seed morphogenesis in Gymnadenia conopsea (Orchidaceae): structural and histochemical investigation. Bot Zhurnal. 1992; 77: 45-60.
21. Öztürk R, Ünal M. Cytoembryological studies on Paeonia peregrina L. Journal of Cell and Molecular Biology 2003; 2: 85-89.
 
22. Chehregani A, Mohsenzadeh F, Hajisaddeghian S. Study on the developmental stages of ovule and pollen grains in Tanacetum parthenium. Journal of Developmental Biology. 2010; 1:17-19.
23. Chehregani A, Hajisaddeghian S, Mohsenzadeh F. Study on the developmental stages of ovule and pollen grains of Inula aucheriana DC. Iranian Journal of Plant Biology. 2010; 2(6): 1-10.
24. Chehregani A, Zarre Sh, Hajisadeghian S. Embryology of Tripleurospermum disciforme: New and rare type of embryogenesis. Iranian Journal of Biology. 2010; 23(1): 26-34.
25. Mohsenzadeh F, Chehregani Rad A, Ekhtari S. Study on Developmental Stage of Gynoecium and Megagametophyte in Rannunculus arvenisis L. Journal of Cell and Tissue. 2012;3(3): 201-210.