نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف از این پژوهش ارزیابی توان زیستی و همچنین خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی آپوپتوزیس در اسپرمهای انسان تیمار شده با سدیم آرسنیت بود.
مواد و روشها: نمونههای اسپرم انسان با غلظت‌های 0، 1/0، 20 و 100 میکرومولار سدیم آرسنیت برای زمان‌های 0، 60، 120 و 180 دقیقه تیمار شدند. ارزیابی توان زیستی اسپرم توسط سنجش MTT و تمامیت DNA توسط رنگ‌آمیزی آکریدین اورنژ صورت گرفت. تغییرات مورفولوژیکی آپوپتوزیس در هسته اسپرم با رنگ آمیزی هوخست و دیف کوئیک و جنبه بیوشیمیایی آپوپتوزیس از طریق روش تانل مورد بررسی قرار گرفت. تجزیه و تحلیل آماری دادهها به روش آنالیز واریانس یک‌طرفه و اندازه‌گیری تکراری انجام شد.
نتایج: سنجش MTT اثر متقابل معنی‌داری بین غلظت سدیم آرسنیت و زمان بر کاهش درصد توان زیستی اسپرم را نشان داد. علاوه بر آن، پس از گذشت 180 دقیقه توان زیستی اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت به‌طور معنی‌داری نسبت به گروه کنترل کاهش یافت. با این وجود این آلاینده تاثیری بر تمامیت DNA و همچنین جنبه‌های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی آپوپتوزیس در هسته اسپرم نداشت.
نتیجهگیری: سدیم آرسنیت موجب کاهش معنی‌دار توان زیستی اسپرم انسان می‌شود و این اثر احتمالا از طریق آسیب به هسته و DNA اسپرم صورت نمیگیرد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Evaluation of Viability and Apoptosis in Human Sperm Treated with Sodium Arsenite
چکیده [English]
Aim: The aim of this research was to evaluate viability as well as morphological and biochemical featears of apoptosis in human sperm treated with sodium arseinte.
Material and methods: Human sperm samples were exposed with different concentration of sodium arsenite (0, 0.1, 20 and 100 µM) for 0, 60, 120 and 180 minutes. Sperm viability was done using MTT assay and sperm DNA integrity was investigated by acridine orange staining. Morphological feature of apoptosis in sperm nucleus was studied using Hoechst and Diff-Quick staining, whereas biochemical feature of apoptosis was studied by TUNEL method. Statistical analysis was carried out by one-way ANOVA and repeated measure.
Results: MTT assay showed a significant interaction between sodium arsenite concentration and time on the decrease sperm viability. In addition, after 180 minutes, the viability of sperm treated with sodium arsenite was significantly decreased compared to control. However, this pollutant had no effect on DNA integrity as well as morphological and biochemical features of apoptosis in the sperm nucleus.
Conclusion: Sodium arsenite caused a significant decrease in human sperm viability and this effect was not due to the damage of sperm nucleus and DNA.
کلیدواژه‌ها [English]
- Human Sperm
- Apoptosis
- DNA integrity
- Sodium arsenite
- sperm viability
مقدمه
ناباروری در مردان یکی از مشکلات عمده این جنس محسوب می‌شود که آن‌ها را از نظر پزشکی و روانی مورد تاثیر قرار می‌دهد. صرف نظر از موارد معمول برای ناباروری مردان از جمله varicocele، cryptorchidism، trauma، عفونتها و تومور، در سال‌های اخیر توجه اثرات زیان آور آلایندههای زیست محیطی بر روی سیستم تناسلی انسان که می‌تواند باروری مردان را به مخاطره بیاندازد عطف شده است.
آرسنیک به عنوان یک شبه فلز سمی محسوب می‌شود که به‌طور طبیعی در پوسته زمین یافت می‌شود و می‌تواند منابع آب آشامیدنی را از طریق شستشو، فرسایش و استخراج معدن آلوده نماید (1). علاوه بر این آرسنیک در ساخت علفکشها، حشرهکشها، مواد کشنده جوندگان، مواد نگهدارنده مواد غذایی (2) و حتی داروها (3 و 4) کاربرد دارد. بنابراین آرسنیک بهعنوان یک آلاینده زیست محیطی جدی مطرح است که قادر است از طرق مختلف از جمله پوست، سیستم تنفس و گوارش جذب و سلامتی انسان و حیوانات را تهدید نماید. مسمومیت ناشی از آرسنیک به طور مزمن می‌تواند باعث ایجاد سرطان (5)، بیماری‌های پوستی (6) و عروقی (7) گردد. مطالعات همچنین نشان دهنده آثار مخرب آرسنیک بر روی سیستم تولید مثل جانور نر می‌باشد که منجر به ناباروری آن‌ها می‌گردد (8، 9 و10). مسمومیت آرسنیکی در حیوانات آزمایشگاهی موجب ناتوانی در عملکرد سلول‌های لایدیگ شده و بدین ترتیب اثرات منفی را بر روی اسپرماتوژنز اعمال می‌نماید (11َ، 12 و13). علاوه بر این گزارش‌هایی مبنی بر اثرات آرسنیک در کاهش وزن بیضه و اندام‌های جنسی مرتبط در رت (12)، کاهش تعداد اسپرم رت بالغ (10)، کاهش توان زیستی و قابلیت تحرک اسپرم رت بالغ (14)، کاهش مورفولوژی طبیعی اسپرم موش (9)، کاهش در فعالیت سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانتی بیضه (15) و تغییر در سطوح گونادوتروپین‌ها و تستوسترون (10 و 16) وجود دارد. گزارش‌های محدودی که در خصوص اثر آرسنیک بر روی اسپرمهای انسان در دسترس می‌باشد نیز حاکی از کاهش تعداد و حرکت اسپرم (17، 18 و 19) در افراد در معرض این آلاینده می‌باشد. در بیشتر مواردی که آرسنیک اثرات مخرب خود را بر روی سیستم تناسلی اعمال نموده است، القا استرس اکسیداتیو به عنوان یکی از مکانیسم‌های دخیل در این امر مطرح می‌باشد (15 و 20).
با وجود مطالعات انجام شده در خصوص اثرات سمی آرسنیک بر روی سیستم تناسلی جانوران و انسان، با این حال بر اساس دانش ما تا کنون گزارشی که با در معرض‌گذاری اسپرمهای انسان با این آلاینده در شرایط in vitro به بررسی فاکتورهای مربوط به کیفیت اسپرم بهخصوص قابلیت حیات آن پرداخته شده باشد وجود ندارد. لذا این پژوهش با هدف ارزیابی توان زیستی اسپرمهای انسان تیمار شده با سدیم آرسنیت در شرایط in vitro انجام شد. علاوه بر آن سعی شد تا بهمنظور مشخص شدن نقطه اثر سدیم آرسنیت در اسپرم، جنبه‌های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی آپوپتوزیس هسته اسپرم مورد توجه و بررسی قرار گیرد.
مواد و روشها
تهیه و آماده سازی نمونه: نمونههای اسپرم از آزمایشگاه سینا اراک و از افرادی که برای آزمایش معمول اسپرموگرام مراجعه نموده بودند تهیه و با رعایت دمای مناسب به آزمایشگاه منتقل گردید. با توجه به توصیه‌های قبلی، نمونه‌ها معمولا بین سه تا هفت روز پس از انزال قبلی جمع‌آوری شده بودند. نمونه‌گیری طبق توصیه سازمان بهداشت جهانی در ظروف مخصوص و دهانه گشاد و غیرسمی انجام گرفت. ابتدا پارامترهای اسپرمی شامل شمارش و قابلیت تحرک بر روی نمونه‌ها انجام شد تا اطلاعات اولیه‌ای در مورد کیفیت اسپرم کسب گردد. بهمنظور شستشوی اسپرم، نمونه‌ها به نسبت 1 به 4 با محیط کشت mM HEPES 25+ 10Ham’s F (21) مخلوط و سپس با دور rpm2500 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. عمل شستشو با رسوب اسپرم دو‌بار دیگر بهروش بالا تکرار گردید و سرانجام با اضافه نمودن محیط کشت فوق‌الذکر به رسوب نهایی، سوسپانسیونی از اسپرم بهدست آمد.
شمارش و قابلیت تحرکاسپرم: شمارش اسپرم بر اساس دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی (WHO) (22) انجام گرفت. به این منظور سوسپانسیون اسپرم به نسبت 9:1 با فیکساتور فرمالین 2 درصد رقیق شد. شمارش اسپرم با استفاده از هموسیتومتر نئوبار انجام و تعداد اسپرم در میلی‌لیتر محاسبه گردید. بررسی قابلیت تحرک اسپرم بر اساس دستور العمل WHO (22) انجام شد. بدین ترتیب که ابتدا 10 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپرم درونMakler chamber که از پیش در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرم شده بود منتقل و حرکات اسپرم زیر میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت. تعداد 200 اسپرم برای هر نمونه بررسی و درصد اسپرمهای دارای حرکت پیشرونده، حرکت درجا و بدون حرکت محاسبه گردید.
تیمار نمونه‌ها با سدیم آرسنیت: نمونههای اسپرم با کیفیت بالا از لحاظ تعداد و قابلیت تحرک پس از شستشو و شمارش در لوله‌های اپندورف جداگانه (20 میلیون اسپرم در میلی‌لیتر) تفکیک شدند. سپس به لوله‌ها سدیم آرسنیت (مرک، آلمان) اضافه شد بهطوری که غلظت‌های 0، 1/0، 20 و 100 میکرومولار حاصل گردد. لوله‌های مربوط به هر غلظت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای زمان‌های 0، 60، 120و180 دقیقه نگهداری شدند (6 n= برای هر غلظت و زمان). سپس این نمونه‌ها جهت اندازه‌گیری پارامترهای اسپرمی به شرح زیر مورد استفاده قرار گرفتند.
ارزیابی توان زیستی اسپرم به کمک سنجش MTT: اصول سنجش MTT، [3 – (4,5- dimethy lthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] بر اساس روش موسمن (23) صورت گرفت. جهت این سنجش، ابتدا منحنی استاندارد MTT جهت مشخص شدن ارتباط بین میزان احیا MTT و قابلیت حیات اسپرم انسان رسم گردید. بدین منظور از هشت نمونه اسپرم متفاوت با کیفیت بالا از لحاظ تعداد و قابلیت تحرک استفاده شد. پس از انجام مراحل شستشو، سوسپانسیون اسپرم به دو بخش مجزا تقسیم گردید. یکی از بخش‌ها در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد و اسپرمهای بخش دیگر بهوسیله سه دوره‌ی متناوب انجماد در نیتروژن مایع و ذوب در 37 درجه سانتی‌گراد کشته شدند. سپس از اسپرمهای دو بخش به نسبت 10:0، 8:2، 6:4، 4:6، 2:8 و 0:10 (به ترتیب مرده و زنده) در لوله‌های اپندورف طوری مخلوط شدند که در هر لوله تعداد 106×3 اسپرم وجود داشته باشد. سپس به هر لوله 10 میکرولیتر محلول غلیظ MTT (سیگما، آمریکا، 5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر mM 25+ HEPES 10Ham’s F) اضافه شد و به مدت 1 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. لوله‌ها سپس با دور rpm 10000 بهمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و رسوب در 200 میکرولیتر دیمتیل سولفوکساید (Dimethyl sulfoxide) حل شد. محلول مجددا با دور rpm 4000 بهمدت 4 دقیقه سانتریفیوژ و محلول بنفش رویی در پلیت 96 خانه وارد و جذب نوری محلول بنفش رنگ با استفاده از دستگاهElisa reader (SCO diagnostic, Germany) با طول موج 505 نانومتر قرائت گردید. با استفاده از میانگین جذب نوری هشت نمونه اسپرم منحنی استاندارد رسم شد و معادله رگرسیون حاصل از آن بهدست آمد.
از اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت، تعداد 106×3 اسپرم انتخاب و سنجش MTT بر روی آن‌ها انجام شد. سپس با استفاده از معادله رگرسیون بهدست آمده از منحنی استاندارد درصد قابلیت حیات هر نمونه تیمار محاسبه گردید.
بررسی تمامیت DNA اسپرم- رنگ آمیزی آکریدین اورنژ: جهت بررسی تمامیت DNA از لحاظ تمایز DNA دو رشته‌ای سالم از DNA تک رشته‌ای دناتوره شده از رنگ آمیزی آکریدین اورنژ استفاده شد (24). بدین ترتیب که از نمونههای اسپرم لحظه زمانی صفر، کنترل مثبت و اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت (1/0، 20 و 100 میکرومولار به مدت 180 دقیقه) گسترش تهیه (6=n) و در درجه حرارت اتاق خشک شد. سپس گسترش‌ها در محلول متانول– اسید استیک گلاسیال (به نسبت 3 به 1) بهمدت 14 ساعت در درجه حرارت 4 درجه سانتی‌گراد تثبیت و سپس با محلول آکریدین اورنژ (19/0 درصد در بافر سیترات فسفاته، 5/2pH=) بهمدت 10 دقیقه رنگ‌آمیزی شدند. لام‌ها بهمدت 5 دقیقه با آب مقطر شستشو و سپس در دمای آزمایشگاه خشک شدند. سپس لام‌ها با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس(Olympus, Japan) توسط فیلتر مناسب با بزرگنمایی ×1000 مورد بررسی قرار گرفتند. اسپرم‌ها با توجه به میزان رنگ پذیری در دو گروه شامل اسپرمهای با سر سبز (بیانگر DNA دو رشته‌ای سالم) و اسپرمهای با سر زرد یا قرمز (بیانگر DNA تک رشته‌ای دناتوره شده) مورد بررسی قرار گرفتند. در هر لام 100 اسپرم شمارش شد تا درصد اسپرمهای دو رشته‌ای و تک رشته‌ای تعیین گردد.
جهت کنترل روش مذکور، از نمونههای کنترل مثبت استفاده شد. بدین منظور DNA نمونههای اسپرم با استفاده از دستگاه ترموسایکلر در دمای 96 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه دناتوره شدند. از این نمونه‌ها گسترش تهیه و بهروش اشاره شده در فوق رنگ آمیزی گردید.
بررسی آپوپتوزیس در هسته اسپرم: بهمنظور بررسی تغییرات مورفولوژیکی آپوپتوزیس در هسته اسپرم، از رنگ فلورسنت هوخست 33342 (Hoechst، سیگما، آمریکا) استفاده شد (25). بدین ترتیب از نمونههای اسپرم لحظه زمانی صفر و تیمار شده با سدیم آرسنیت (1/0، 20 و 100 میکرومولار به مدت 180 دقیقه) گسترش تهیه شد (6=n). گسترش‌ها در محیط آزمایشگاه خشک و توسط هوخست (5 میکروگرم در میلی‌لیتر به مدت 30 ثانیه) رنگ آمیزی شدند. لام‌ها توسط PBS شستشو شده (3 بار و هر بار 5 دقیقه) و سپس توسط میکروسکوپ فلورسنس توسط فیلتر مناسب مورد بررسی قرار گرفتند و از آن‌ها عکس تهیه شد.
جهت بررسی کمی تغییرات هسته اسپرمهای تیمار شده، از رنگ‌آمیزی دیف‌کوئیک (Diff-Quick) استفاده شد. بدین‌ترتیب که از اسپرمهای لحظه زمانی صفر و اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت (1/0، 20 و 100 میکرومولار به مدت 180 دقیقه) گسترش تهیه (6=n) و در درجه حرارت اتاق خشک شد. گسترش‌ها به مدت 25 ثانیه با متانول خالص تثبیت و سپس با دو محلول دیف‌کوئیک (هر کدام به مدت 25 ثانیه) رنگ آمیزی شدند. سپس نمونه‌ها با میکروسکوپ نوری ارزیابی و از آن‌ها عکس تهیه شد. در این رنگ آمیزی آکروزوم اسپرم به رنگ صورتی و هسته اسپرم به رنگ بنفش دیده می‌شود. با استفاده از عکس‌های گرفته شده، قطر کوچک هسته اسپرم‌ها در گروه‌های ذکر شده توسط نرم افزار موتیک در 100 اسپرم اندازه‌گیری شد.
به منظور بررسی تغییرات بیوشیمیایی آپوپتوزیس در هسته اسپرم (شکستگی DNA)، تکنیک تانل (TUNEL TdT-mediated dUTP nick end-labeling) استفاده شد. این روش با نشاندار نمودن انتهای آزاد قطعات شکسته شده DNA دو رشته‌ای قادر است با شناسایی سطوح بالایی از شکست DNA، آپوپتوزیس را در مراحل اولیه تشخیص دهد (26). بدین منظور از نمونههای اسپرم لحظه زمانی صفر، کنترل مثبت و اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت (1/0، 20 و 100 میکرومولار به مدت 180 دقیقه) گسترش تهیه (6=n) و در درجه حرارت اتاق خشک شد. سپس گسترش‌ها توسط کیت تانل (Chemicon, USA) و بر اساس دستورالعمل ارائه شده توسط شرکت سازنده رنگ‌آمیزی و سپس توسط میکروسکوپ معمولی بررسی و با بزرگنمایی ×1000 عکس تهیه گردید.
جهت کنترل روش ذکر شده، از نمونههای کنترل مثبت استفاده شد. بدین منظور 100 میکرولیتر سوسپانسیون اسپرم سانتریفیوژ و رسوب به مدت 2 دقیقه با محلولی شامل سیترات سدیم 01/0 درصد و تریتون 100X- 1/0 درصد در آب مقطر سوسپانسیون شد. محلول با DNase (سیگما، آمریکا) با غلظت u1000 به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد مجاور شد. سپس گسترش اسپرمی تهیه شد و پس از خشک شدن در هوای اتاق توسط کیت TUNEL رنگ آمیزی و عکس تهیه شد.
آنالیز آماری: داده‌های حاصل با استفاده از نرم افزار SPSS از طریق آنالیز واریانس یک‌طرفه و اندازه‌گیری تکراری(repeated measure) مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. جهت مقایسه میانگین‌ها از تست توکی استفاده شد. مقادیر به‌صورت میانگین ± انحراف معیار و تفاوت میانگین‌ها در سطح 05/0P< معنی‌دار در نظر گرفته شد.
نتایج
توان زیستی اسپرم انسان تیمار شده با سدیم آرسنیت
با استفاده از سنجش MTT، نتایج حاصل از آنالیز واریانس اندازه‌گیری تکراری نشان داد که اثر متقابل معنی‌داری (01/0P<) بین غلظت سدیم آرسنیت و زمان بر کاهش درصد توان زیستی اسپرم وجود دارد (جدول 1).
جدول 1: اثر متقابل بین غلظت سدیم آرسنیت و زمان بر کاهش معنی‌دار درصد توان زیستی اسپرم انسان. مقادیر به صورت میانگین±انحراف معیار بیان شده است. آنالیز واریانس اندازه‌گیری تکراری، 6n=.
|
Sodium arsenite (µM) |
Time (minute) |
P-value |
|||
|
0 |
60 |
120 |
180 |
|
|
|
0 |
92.5±5.6 |
86.5±8.4 |
81.7±7.9 |
77.1±3.3 |
P<0.01 |
|
0.1 |
92.5±5.6 |
75.5±13.7 |
66.9±16.4 |
51.9±9.2 |
|
|
20 |
92.5±5.6 |
57.6±8.9 |
48.8±10.2 |
39.7±12.8 |
|
|
100 |
92.5±5.6 |
47.9±9.4 |
38.2±9.1 |
23.5±5.4 |
|
|
P-value |
P<0.01 |
|
|||
سنجش MTT همچنین نشان داد که پس از گذشت 180 دقیقه توان زیستی اسپرمهای تیمار شده با غلظت‌های مختلف سدیم آرسنیت (1/0، 20 و 100 میکرومولار) به‌صورت وابسته به غلظت به‌طور معنی‌داری (001/0P<) نسبت به گروه غلظت صفر، لحظه زمانی 180 دقیقه کاهش یافته است (شکل 1). این شکل همچنین نشان می‌دهد که انکوباسیون اسپرم‌ها پس از 180 دقیقه (غلظت صفر) موجب کاهش معنی‌دار (001/0P<) توان زیستی آن‌ها نسبت به لحظه زمانی صفر شده است.
شکل 1: تاثیر سدیم آرسنیت بر توان زیستی اسپرم انسان سنجش شده با روش MTT. تیمار اسپرم‌ها پس از 180 دقیقه با غلظت‌های مختلف سدیم آرسنیت (1/0، 20 و 100 میکرومولار) به‌صورت وابسته به غلظت موجب کاهش معنی‌دار توان زیستی اسپرم‌ها نسبت به گروه غلظت صفر، لحظه زمانی 180 دقیقه شده است. حروف غیر مشابه بیانگر معنی‌دار بودن میانگین‌ها می‌باشد. مقادیر به صورت میانگین±انحراف معیار بیان شده است. آنالیز واریانس یک طرفه، تست توکی، 6n=.
تمامیت DNA اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت
نتایج بررسی تمامیت DNA (دو رشته‌ای سالم در مقابل تک رشته‌ای دناتوره) در اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت با غلظت های 1/0 و 20 میکرومولار (دادهها نشان داده نشده است) و 100 میکرومولار به مدت 180 دقیقه نشان داد که تیمار اسپرم‌ها با سدیم آرسنیت در مقایسه با گروه لحظه زمانی صفر، تاثیر قابل توجه‌ای روی دناتوره شدن ساختمان دو رشته‌ای DNA اسپرم نداشت (شکل 2).
شکل2: بررسی تمامیت DNA دو رشته‌ای در مقابل تک رشته‌ای در نمونههای اسپرم انسان: (a) اسپرمهای لحظه زمانی صفر: اسپرم با DNA دو رشته‌ای سالم (سبز رنگ)، (b) اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت (100 میکرومولار به مدت 180 دقیقه) در مقایسه با اسپرمهای لحظه زمانی صفر تاثیر قابل توجهی بر تمامیت DNA اسپرم نداشت. (c) کنترل مثبت: اسپرم انسان با DNA تک رشته‌ای (به مواد و روشها مراجعه شود) (قرمز رنگ). رنگ‌آمیزی آکریدین اورنژ، بزرگنمایی ×1000.
وقوع آپوپتوزیس در اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت
بررسی مورفولوژیکی هسته اسپرمهای انسان که با هوخست 33342 رنگ آمیزی شده بودند، در گروه تیمار شده با سدیم آرسنیت با غلظت 1/0 و 20 میکرومولار (دادهها نشان داده نشده است) و 100 میکرومولار در زمان 180 دقیقه، در مقایسه با اسپرمهای لحظه زمانی صفر نشانههای مورفولوژیکی آپوپتوزیس را نشان نداد (شکل 3). علاوه بر آن، نتایج حاصل از رنگ آمیزی دیف‌کوئیک نشان داد که قطر هسته اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت (1/0، 20 و 100 میکرومولار به مدت 3 ساعت) تغییر معنی‌داری در مقایسه با اسپرمهای، لحظه زمانی صفر نداشت (جدول2).
شکل3: بررسی مورفولوژیکی آپوپتوزیس در هسته اسپرمهای انسان. a) اسپرمهای لحظه زمانی صفر: b) اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت (100 میکرومولار به مدت 180 دقیقه) در مقایسه با اسپرمهای لحظه زمانی صفر تاثیر قابل توجهی بر مورفولوژی هسته اسپرم را نشان نداد. رنگ آمیزی هوخست 33342، بزرگنمایی ×1000.
جدول2: میانگین قطر هسته اسپرم انسان در گروه‌های تیمار شده با سدیم آرسنیت با غلظت 1/0، 20 و 100 میکرومولار به مدت 180 دقیقه در مقایسه با اسپرمهای لحظه زمانی صفر تفاوت معنی‌داری نداشت. مقادیر به صورت میانگین ± انحراف معیار است. آنالیز واریانس یک طرفه، 6n=.
|
Sodium arsenite (µM ) |
Diameter of sperm nucleus (µm ) |
||
|
Time (minute) |
|
||
|
|
0 |
180 |
|
|
0 |
3.37±.0.24 |
3.37±.0.24 |
|
|
0.1 |
3.37±.0.24 |
3.41±0.19 |
|
|
20 |
3.37±.0.24 |
3.33±0.21 |
|
|
100 |
3.37±.0.24 |
3.39±0.24 |
|
بهمنظور بررسی جنبه بیوشیمیایی آپوپتوزیس (شکسته شدن DNA) در اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت روش تانل انجام شد. نتایج نشان داد که تیمار اسپرمهای انسان با غلظت‌های 1/0 و 20 میکرومولار (دادهها نشان داده نشده است) و 100 میکرومولار سدیم آرسنیت برای180 دقیقه در مقایسه با اسپرمهای لحظه زمانی صفر، تاثیر قابل ملاحظه‌ای روی شکسته شدن DNA اسپرم نداشت و اسپرمهای گروه تیمار همچون اسپرمهای لحظه زمانی صفر به‌صورت تانل منفی ظاهر شدند (شکل 4).
شکل4: بررسی جنبه بیوشیمیایی آپوپتوزیس (شکسته شدن DNA) در اسپرمهای انسان با استفاده از روش تانل: (a) اسپرمهای لحظه زمانی صفر: اسپرمهای با DNA سالم (تانل منفی). (b) اسپرمهای تیمار شده با سدیم آرسنیت (100 میکرومولار به مدت 180 دقیقه) به‌صورت تانل منفی ظاهر شدند. (c)کنترل مثبت: اسپرمهای آپوپتوتیک با DNA شکسته شده (به مواد و روشها مراجعه شود) که به‌صورت تانل مثبت ظاهر شدند. بزرگنمایی ×1000.
بحث
نتایج پژوهش حاضر نشان داد که در معرض‌گذاری اسپرم انسان با سدیم آرسنیت طی سه ساعت توان زیستی اسپرم‌ها را کاهش می‌دهد و این کاهش احتمالا ناشی از تغییر در هسته و DNA اسپرم نیست.
ارزیابی توان زیستی اسپرم یکی از روش‌هایی است که می‌تواند اطلاعاتی را در خصوص ظرفیت لقاح اسپرم ارائه دهد. این سنجش به روش‌های مختلف از جمله ائوزین- نگروزین، MTT، تریپان بلو و پروپیدیوم آیوداید قابل انجام است. روش ائوزین- نگروزین بهعنوان یک روش تشخیصی کیفی جهت تفکیک اسپرمهای زنده از مرده مورد استفاده قرار می‌گیرد (8, 27). اگرچه این روش ساده و ارزان است ولی تحت تاثیر مشاهده کننده قرار داشته و با خطا همراه می‌باشد. اخیرا سنجش MTT توسط نصر اصفهانی و همکاران (21) بهمنظور بررسی توان زیستی اسپرم انسان مورد استفاده قرار گرفته است. با این حال این ارزیابی به‌صورت کیفی انجام شده که نمی‌تواند اطلاعات دقیقی را در خصوص توان زیستی اسپرم انسان ارائه نماید. در مطالعه حاضر روش کمی سنجش MTT برای اولین بار برای ارزیابی توان زیستی اسپرم انسان به کار گرفته شد. این روش کمی برای ارزیابی توان زیستی اسپرم گاو (28)، اسب (29)، بوفالو (30) و گراز (31) نیز مورد استفاده قرار گرفته است. در روش MTTفعالیت متابولیکی و ظرفیت میتوکندری‌های فعال سلول‌ها مورد سنجش قرار می‌گیرد (32). برعکس سایر روش‌های بررسی توان زیستی سلولی که در آن‌جا از تریپان بلو و پروپیدیوم آیوداید استفاده می‌شود، تنها تمامیت غشای سلول‌ها سنجش می‌شود (33 و 34) و اطلاعاتی در خصوص میتوکندری‌ها و یا عمل متابولیکی سلول ارائه نمیگردد. در روش MTT که به طور گسترده جهت ارزیابی توان زیستی و تزاید سلولی مورد استفاده قرار می‌گیرد (23) نمک زرد تترازولیوم بهوسیله دهیدروژنازهای میتوکندری‌های فعال در سلول‌های زنده به بنفش فورمازان احیا می‌شود و بنابراین میزان رنگ بنفش تولید شده متناسب با تعداد سلول‌های زنده و لذا توان زیستی سلولی است (35). اگر چه این روش تمامیت میتوکندریایی را مورد سنجش قرار می‌دهد، اما بایستی توجه داشت که احیای MTT می‌تواند بوسیله دهیدروژنازهای متعلق به دیگر ارگانل‌های سلولی مثل لیزوزوم‌ها نیز صورت گیرد. صرف نظر از اینکه احیای MTT توسط میتوکندری‌ها و یا سایر ساختارهای دیگر سلولی صورت می‌گیرد، سلول‌هایی که از نظر متابولیکی فعال می‌باشند این احیا را انجام می‌دهند و می‌تواند بهعنوان یک روش رنگ سنجی سریع و معتبر برای سنجش توان زیستی اسپرم به‌کار رود.
نتایج پژوهش حاضر نشان داد که انکوباسیون اسپرم‌ها پس از 180 دقیقه موجب کاهش معنی‌داری در توان زیستی اسپرم در مقایسه با اسپرمهای لحظه زمانی صفر شد. مطالعات نشان می‌دهد که انکوباسیون اسپرم انسان در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت می‌تواند موجب کاهش شدید قابلیت تحرک آن‌ها به‌واسطه افزایش گونه اکسیژن واکنش پذیر (Reactive Oxygen Species, ROS)گردد (36). بنابراین این احتمال وجود دارد که کاهش توان زیستی ایجاد شده در اسپرم‌ها در این پژوهش نیز ناشی از انکوباسیون اسپرم‌ها و احتمالا در اثر افزایش تولید ROS در آن‌ها بوده باشد. نتایج همچنین نشان داد که تیمار اسپرم‌ها با سدیم آرسنیت موجب کاهش وابسته به زمان و غلظت در توان زیستی اسپرم‌ها می‌شود. گزارش‌های متعددی وجود دارد که در آن‌ها اثرات مخرب آرسنیک بر روی دستگاه تناسلی را به القا استرس اکسیداتیو نسبت می‌دهند (8، 15، 20 و 37). بنابراین این احتمال وجود دارد که کاهش قابلیت حیات ایجاد شده در اسپرم‌ها در این پژوهش نیز ناشی از استرس اکسیداتیو حاصل از تاثیر سدیم آرسنیت بوده باشد. با این فرض، این سوال مطرح است که این آلاینده اثرات خود را مشخصا بر روی کدام بخش اسپرم اعمال نموده است. آیا سر با دارا بودن هسته و کروماتین و یا تنه با اجتماعی از میتوکندی‌ها؟
تمامیت DNA اسپرم یکی از پارامترهای مهم کیفیت اسپرم در پیش بینی ناباروری محسوب می‌شود (37). گزارش‌هایی نیز وجود دارد که آسیب DNA بهوسیله آرسنیک را نشان می‌دهد (38). بنابراین یکی از احتمالات ممکن برای کاهش قابلیت حیات اسپرمهای مورد تاثیر بهوسیله سدیم آرسنیت می‌توانست تاثیر بر روی تمامیت هسته و DNA باشد. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که سدیم آرسنیت تاثیری بر روی تبدیل DNA دو رشته‌ای به تک رشته‌ای نداشت. علاوه بر آن، مشخصه‌های مورفولوژیکی (تغییرات هسته و کروماتین) و بیوشیمیایی (شکستگی DNA) آپوپتوزیس در اسپرمهای مورد تاثیر با سدیم آرسنیت حاکی از عدم بروز نشانههای آپوپتوزیس در هسته و DNA این اسپرم‌ها بود. عدم تاثیر سدیم آرسنیت بر تمامیت هسته و DNA در مطالعه قبلی (37) که در آن جا تیمار رتها با سدیم آرسنیت (8 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به مدت 56 روز انجام شده بود نیز تاییدی بر مطالعه حاضر بود. بنابراین این طور می‌توان نتیجه گرفت که کاهش قابلیت حیات اسپرم‌ها ناشی از سدیم آرسنیت احتمالا بهعلت تاثیر آن بر روی هسته و DNA اسپرم نبوده و دلیل آن نیز ممکن است به علت فشرده بودن DNA اسپرم و مقاومت آن در مقابل آسیب ناشی از این آلاینده باشد. احتمال دیگر کاهش قابلیت حیات اسپرم می‌توانست از طریق تاثیر سدیم آرسنیت بر روی میتوکندری‌های اسپرم باشد. این احتمال وجود دارد که سدیم آرسنیت با ایجاد استرس اکسیداتیو و در پی آن پراکسیداسیون لیپید منجر به تغییر در تراوایی غشا (39) و یا تغییر پتانسیل غشای میتوکندری‌ها (40) که به نوبه خود منجر به آزاد شدن فاکتورهای آپوپتوژنیک مثل سیتوکروم c و فاکتور القا کننده آپوپتوزیس (Apoptosis inducing factor) از میتوکندری‌ها می‌شود شده باشد. همچنین این آلاینده ممکن است با ایجاد اختلال در عملکرد میتوکندری‌ها موجب اختلال در فرایند فسفوریلاسیون اکسیداتیو در این اندامک شده و منجر به تخلیه ATP (41) در اسپرم شود که در نهایت منجر به کاهش قابلیت حیات اسپرم شده باشد. سدیم آرسنیت همچنین قادر است با اتصال به لیگاندهای حاوی سولفور باعث ایجاد اختلال و کاهش در فعالیت آنزیم‌های سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانت شود (15 و42) و این امر می‌تواند در تشدید اثرات اکسیداتیو سدیم آرسنیت روی کاهش توان زیستی اسپرم عمل نموده باشد. اینکه آیا در این پژوهش سدیم آرسنیت اثرات مخرب خود را به‌طور مستقیم بر روی اسپرم یا به‌طور غیر‌مستقیم از طریق تضعیف سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانتی اعمال نموده است مشخص نیست و نیاز به تحقیق بیشتر در این زمینه دارد. اندازه‌گیری شاخص‌های القا استرس اکسیداتیو و یا اندازه‌گیری آنزیم‌های سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانتی در اسپرم می‌تواند این موضوع را روشن نماید.
نتیجه گیری
نتایج حاصل از سنجش کمی MTT نشان دهنده اثرات مخرب سدیم آرسنیت در کاهش توان زیستی اسپرم انسان بود. از آن‌جا که این آلاینده تاثیری بر تمامیت DNA و همچنین القا آپوپتوزیس در اسپرمهای انسان نداشته است، لذا این طور می‌توان احتمال داد که کاهش توان زیستی القا شده در اسپـرم‌های تیمـار شـده با سـدیم آرسنیت (در بـازه زمـانی سـه
ساعت) از طریق آسیب به هسته و DNA نبوده است.
تشکر و قدردانی
این پژوهش با حمایت مالی حوزه معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه اراک انجام شده است (قرارداد طرح پژوهشی به شماره 10633/90 مورخ 10/10/90) که بدین‌وسیله از مسئولین مربوطه تشکر بهعمل میآید. نویسندگان همچنین از مسئولین محترم آزمایشگاه سینا اراک که نسبت به در اختیار گذاشتن اسپرم انسان، در این پژوهش همکاری شایسته‌ای معمول نمودند صمیمانه تشکر و سپاسگزاری می‌نمایند.
)