نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد آیت آلله آملی،گروه زیست شناسی، آمل، ایران
2 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، گروه صنایع غذایی، دامغان، ایران
3 دانشگاه خوارزمی، گروه زیست شناسی، تهران، ایران
چکیده
هدف: هدف از انجام این پژوهش تجربی بررسی عوامل موثر ناباروری ترکیبات فیزالین بر روی دستگاه تناسلی موش ماده بالغ Balb/c است.
مواد و روشها:. آزمایش فوق با تهیه عصاره آبی گیاه و انتخاب سه دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم، 9 گرم بر کیلوگرم و 15 گرم بر کیلوگرم انجام گرفت، همزمان با گروههای تجربی، بهگروه سم آب مقطر تزریق و گروه کنترل نیز بهشکل دست نخورده نگهداری شد. جهت بررسی مراحل مختلف سیکل استروس اسمیر واژن تهیه میشد. یک ساعت بعد از آخرین تزریق از موشها خونگیری و سپس بهوسیله کلروفرم کشته و رحم و تخمدان آنها جهت مطالعات بافتشناسی آماده شدند.
نتایج: بررسیهای آماری نشان داد که تزریق عصاره با دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم موجب کاهش استروژن و برگشت 33 درصد باروری درموشها میشد. همچنین در دوز 9 گرم بر کیلوگرم ابتدا همه موشها نابارور ولی بعد از گذشت یک ماه از آخرین تزریق 5/16 درصد موشها برگشت باروری و افزایش معنیدار پروژسترون را نشان دادند.
نتیجهگیری: طبق نتایج بهدست آمده احتمالا بهعلت آنکه فیزالینها دارای ساختمان شبه استروئیدی هستند، گیرنده توسط فیزالین اشغال و میتواند موجب بینظمی در رشد و نمو اووسیت، سلولهای بافت رحم و تخمدان و ناباروری شود.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Physalis alkaengi extract on the ovaries and uterus of adult mice Balb/C
نویسندگان [English]
- S Mashayekh 1
- H Jalali 2
- M Azernia 3
1 Department of Biology, Ayatollah Amoli Branch, Islamic Azad University, Amol, Iran
2 Department of Food industry, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran
3 Department of Biology, Kharazmi University, Tehran, Iran.
چکیده [English]
Aim: The aim of this experimental study was to investigate the effective infertility factors of physoaline compounds on the adult reproductive system of Balb/C adult female.
Material and Methods: The above experiment was performed by preparing the aqueous extract of the plant and selecting three doses of 7.5g/kg,9g/kg and 15g/kg;Simultaneously with the experimental groups,the distilled water sham group was injected and the control group was kept intact.Vaginal stromal smear cycles were prepared to examine different stages.One hour after the last injection,the mice were given blood samples and then killed by chloroform and their uterus and ovaries were prepared for histological studies.
Results: Statistical studies have shown that injecting 7.5g/kg of extract reduces estrogen and restores 33% of fertility in mice. Also, at a dose of 9 g/kg, the mice were initially infertile, but one month after the last injection, 16.5% of the mice showed a return to fertility and a significant increase in progesterone.
Conclusion: According to the results, it is probably because physalines have a pseudo-steroidal structure. The receptor is occupied by physaline and can cause abnormalities in the growth and development of oocytes, uterine tissue cells and ovaries, and infertility.
کلیدواژهها [English]
- Physalin
- Physalis alkekengi
- Uterus
- Ovary
- Infertility
مقدمه
در عصر حاضر باتوجه به اثرات درمانی و تأثیرات قابل توجه گیاهان دارویی و سنتی نسبت به داروهای صنعتی و شیمیایی، بررسی اثرات این گیاهان در دستور کار پژوهشگران قرار گرفته است. گیاه عروسک پشت پرده (Physalis alkekengi) به عنوان یک گیاه دارویی در درمان محدوده وسیعی از بیماریها شامل: مشکلات ادراری، سنگ کلیه، مثانه، تب، التهاب، یبوست، آرتریت و روماتیسم به کار گرفته می شود. همچنین در طب سنتی به عنوان داروی سقط کنده جنین و ضد بارداری شناخته شده است (1).
گیاه عروسک پشت پرده گیاهی علفی، پایا، با ساقه ریزومی خزنده و متعلق به خانواده سولاناسه (سیب زمینی) می باشد که به نام های گوناگونی از جمله: کاکنج، عروسک پشت پرده، گرزالقدس، Winter Cherry نامیده می شود (2). با گذشت بیش از یک قرن از مطالعاتی که در سال 1965 برروی گیاه عروسک پشت پرده انجام پذیرفت تاکنون حدود 124 جزء شامل: فلاونوئیدها، فنیل پروبانوئیدها، استروئیدها، آلکالوئیدها، موادالکلی و مقدار زیادی ویتامین c از قسمتهای مختلف گیاه برداشت شده است (3). در میان این ترکیبات استروئیدها از اهمیت بیشتری برخوردارند. استروئیدهایی به نام فیزالین دارای بیشترین مقدار در این گیاه می باشد. تا الاان حدودا از 13 نوع فیزالین مختلف به نام های physalin B, physalin A physalin T, physalin S, physalin P, physalin F, physalin E, physalin D, physalin C, physalin A, Iso- physalin B, Physanol A, Physanol B, -Iso در اندام های مختلف این گیاه گزارش شده است. فیزالینA که در سال 1969 از برگهای گیاه فوق استخراج شده اولین عضو این گروه به حساب می آید. همچنین چهار استروئید شامل فیزالین Y،Z، فیزالینI و فیزالین II از کاسبرگ این گونه استخراج شده است. برگ و میوه های گیاه عروسک پشت پرده دارای طعم تلخ منحصر به فرد هستند که مربوط به یکی از مشتقات کاروتنوئیدها به نام فیزالین است (4).
در حقیقت فیزالین یکی از ترکیات شیمیایی خاص در گیاه عروسک پشت پرده است که نوعی استروئید با اسکلت سیکلو-13 و 14- سکو ارگوستان (Ergostane) می باشند (5).
متسورا و همکاران (6)، فیزالینهای A B, وC را از گیاه P.alkekengi و چیانگ و همکاران (7)، فیزالینهای F ، D را از گیاه P.angulataکشف نمودهاند.
برای فیزالینها و ترکیبات شیمیایی وابسته به آنها نظیر ویتانولیدها، هیدروفیزالینها و فیزالولاکتونها خواص زیستی متعددی گزارش شده است. اما به طور عمده در طب گیاهی ایران از میوههای گیاه P.alkekengi به عنوان داروی ضدبارداری، ضداسکوربوت، مدر، زخم معده، سوزاک، اختلالات قلبی عروقی و در درمان بیماریهای دستگاه ادراری استفاده میشود (8).
در پژوهشی که توسط منتظری و همکاران در بررسی اثرات عصاره الکلی این گیاه برروی ناباروری قرار گرفت مشخص شده که عصاره بر بارداری و تخمک گذاری تاثیر منفی می گذارد (9).
عصاره آبی میوه گیاه عروسک پشت پرده بر روی سیکل استروس، تولیدمثل و آنزیم کراتین کیناز رحم در موش Rat توسط دکتر وصال و همکارانش نیز بررسی شده است که باعث تولید 100 درصد دیاستروس و کاهش تعداد نوزادان شده بود (10). همچنین توسط این گروه نیز گزارش شده است که عصاره آبی میوه گیاه عروسک پشت پرده باعث کاهش c6PD رحم (یک پروتئین القا کننده استروژن ) تا 52 درصد میشود (11). در این مقاله بطور روشن حضور یک آنتاگونیست استروژن در عصاره آبی میوه گیاه گزارش شده است.
بنابراین با توجه به خواص ذکر شده و عدم انجام بررسی های آزمایشگاهی همه جانبه برروی این گیاه و تعیین نکات مثبت و عوارض جانبی آن از لحاظ فیزیولوژیکی و فارماکولوژیکی مقرر گردید که در تحقیق حاضر اثرات ترکیبات فیزالین موجود در گیاه فوق را به عنوان یک داروی گیاهی بر روی تخمدان، رحم و ناباروری بررسی شود.
مواد و روشها
روش تهیه عصاره آبی: در این مطالعه تجربی ابتدا میوه گیاه عروسک پشت پرده از جنگلهای شمال ایران جمعآوری شد و پس از خشک نمودن، نمونهها بهوسیله آسیاب برقی بهدقت خرد شده و برای یکنواخت کردند ذرات الک شدند و سپس بهمقدار 30 گرم پودر میوه این گیاه 200 میلیلیتر آب مقطر افزوده و سوسپاسیون حاصل بهآهستگی بهمدت یک ساعت جوشانده شد، سپس عصاره را با کاغذ صافی معمولی صاف شده و با کاغذ صافی وات من شماره 4 مجدد فیلتر شده و در مرحله بعدی محلول زیر صافی در دمای حداکثر 60 درجه سانتیگراد تغلیظ شد تا حجم نهایی آن به 20 میلیلیتر برسد. پس از تهیه عصاره آبی دوز کشنده (LD50) در شرایط In vivo، 6/20 گرم بر کیلوگرم براساس وزن بدن موشها تعیین و با در نظر گرفتن دوز آستانهای سه دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم، 9 گرم بر کیلوگرم و 15گرم بر کیلوگرم جهت آزمایش مورد انتخاب قرار گرفت.
روش جداسازی و شناسای مواد موثره موجود در عصاره گیاه: مقدار 1250 گرم پودر قسمتهای هوایی گیاه در حلال متانول قرار داده شد و بعد از 24 ساعت محلول مذکور بهکمک قیف بوخنر صاف شد. محلول زیر صافی بهوسیله دستگاه روتاری تحت شرایط خلا و دمای حداکثر 5 درجه سانتیگراد تغلیظ شد. در ادامه کار برای جداسازی چربیها و هیدروکربنهای اشباع، مقداری متانول بهعصاره گیاه اضافه شد و بهمدت 24 ساعت در 15 درجه سانتیگراد نگهداری شد. بهاین ترتیب چربیها و هیدروکربنهای سنگین رسوب داده شد و با صاف نمودن از عصاره گیاه جدا شدند. محلول زیر صافی بهکمک متانول سرد، شستوشو سپس بهوسیله دستگاه روتاری غلیظ شد. برای آمادهسازی عصاره برای کروماتوگرافی ستونی، مقداری پودر سیلیکاژل مخصوص ستون و کلروفرم به بالن اضافه نموده و عمل تبخیر شدن حلال از عصاره تا حد خشک شدن کامل ادامه داده شد. بهاین ترتیب عصاره بهطور یکنواخت جذب سیلیکاژل گشته و قبل از انتقال آن به ستون بر روی کاغذ صافی تمیزی خشک شد. برای آمادهسازی ستون کروماتوگرافی مقدار معینی پودر سیلیکاژل مخصوص ستون را در شرایط خلا وارد ستون کرده تا نصف آن پر شد. سپس پودر عصاره گیاه در شرایط خلا از بالای ستون بهداخل آن ریخته شد و عمل شستوشو با حلال آغاز شد. ازآنجا که پلاریته مواد تشکیل دهنده عصاره با یکدیگر متفاوت میباشند لازم است که پلاریته حلال شستوشو دهنده ستون بهتدریج تغییر داده شود. بهاین منظور از حلالهای مختلف، بهترتیب با افزایش پلاریته، برای عمل جداسازی استفاده شد.
برای جداسازی انواع ترکیبات موجود در هر قسمت حلال مناسب بهکارگرفته و کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography/Camag/Switzerland) انجام گرفت و برای مشاهده لکههای غیر رنگین از لامپ UV با طول موج 254 نانومتر استفاده شد. مقدار تزریق عصاره کلروفرمی 5/0 گرم بر کیلوگرم مشخص شد.
در واقع جهت آنالیز جداسازی و شناسایی مواد موثره موجود در گیاه در نتیجه کروماتوگرافی ستونی، 13 فراکسیون جمعآوری شد. مواد موثره در اجزای 9- 8 وجود داشت. بنابراین برای دستیابی به آن بهکمک کروماتوگرافی لایه نازک و رعایت نسبتهای 97:3 برای حلالهای متانول :کلروفرم، مواد موثر جدا و بهطریق روشهای اسپکتروسکوپی، از جمله طیفسنجی مادون قرمز (IR)، طیفسنجی پروتون (H-NMR) و طیفسنجی تشدید مغناطیسی کربن-13 (13C-NMR) شناسایی شد.
گروه بندیموش های مورد مطالعه: در این تحقیق 75 سر موش بالغ ماده با معادل21-20 گرم تهیه و پس از انتقال بهمحل انجام آزمایش یک هفته به حیوانات فرصت داده شد تا با محیط جدید سازگاری پیدا کنند. حیوانات در شرایط دمای 2±21 درجه سانتیگراد و 12 ساعت روشنایی/تاریکی و آب و غذا بهصورت یکسان نگهداری شدند. حیوانات بهصورت کاملا تصادفی به 5 گروه 15تایی تقسیم شدند: گروه کنترل که بهشکل دستنخورده نگهداری شدند، گروه سم که آب مقطر دریافت کردند و سه گروه تجربی که بهترتیب سه دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم، 9 گرم بر کیلوگرم و 15 گرم بر کیلوگرم از عصاره مورد نظر را که بهطریق درون صفاقی و طی 8 روز پیدرپی دریافت نمودند تقسیم شدند. همه روزه حدود ساعت 9 صبح اسمیر واژن تهیه شد تا مراحل مختلف سیکل استروس آنها بررسی شد. جهت این مطالعه تنها موشهایی انتخاب شدند که دارای هر سه دوره متوالی سیکل استروس منظم بودند.
یک ساعت بعد از آخرین تزریق از موشها خونگیری و سپس بهوسیله کلروفرم کشته و رحم و تخمدان آنها از بدن خارج و در محلول بوئن تثبیت و برای مطالعات بافتشناسی آماده شدند.
لازم بهذکر است که در این مدت سعی شد نکات اخلاقی در تمام زمینهها اعم از نگهداری و اجرای مراحل مختلف آزمایش رعایت شد. (کد کمیته ملی اخلاق در پژوهش های زیستی IR.KHU.REC.1398.039)
روش تهیه سرم خون برای سنجش هورمونهای جنسی: بعد از انجام تزریقات موشهای ماده تجربی و شم با کلروفرم بیهوش شدند و از سیاهرگ باب کبد با سرنگهای انسولینی یکبار مصرف خون موشها گرفته میشد و در لولههای آزمایش بهطور آهسته ریخته شد تا همولیز انجام شود. سپس بعد از یک ساعت بهوسیله سواپ، لخته از جدار لوله آزمایش جدا شد و بهوسیله دستگاه سانتریفیوژ با دور 3000 در دقیقه بهمدت 5 دقیقه نمونههای خون درون لوله آزمایش سانتریفوژ شد و سرم آن بهوسیله سمپلر، درون لولههای اپندرف ریخته و درپوش آن محکم بسته و در فریزر با برودت 18 درجه سانتیگراد (18- درجه سانتیگراد) قرار داده شد و سپس سنجش هورمونهای جنسی استرادیول و پروژسترون با استفاده از کیت Biovendor و با تکنیک الایزا انجام پذیرفت. طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت، بعد از آمادهسازی نمونهها، بافر افزوده شده برای 120دقیقه در دمای اتاق آزمایشگاه انکوبه شد. با افزودن آنزیم کونژوگه رقیق شده بهچاهکها، بار دیگر بهمدت60 دقیقه انکوبه شد. بعد از 4 بار شستوشو، در این مرحله محلول سوبسترا اضافه شد و برای 30 دقیقه در محیط تاریک و بدون تکان دادن انکوبه شد. در نهایت با افزودن محلول متوقف کننده، در عرض 15 دقیقه نتایج با طول موج 450 نانومتر خوانده شد.
روشهای بررسی هیستولوژیکی و سیتولوژیکی از نمونهها: برای شمارش غدد آندومتر، فولیکولهای اولیه، در حال رشد، گراف، جسم زرد، تعداد هسته و هستک و بررسی تغییر تعداد آنها 20 برش میکروسکوپی بهطور تصادفی از هر یک از گروههای سهگانه تجربی، سم و کنترل انتخاب شد و شمارش شدند. برای اندازهگیری قطر رحم، تخمدان، ضخامت آندومتر، قطر اووسیت و ارتفاع سلولهای اپیتلیوم رحم، 20 برش میکروسکوپی بهطور تصادفی انتخاب شد و بهکمک میکرومتر اندازهگیری شدند.
روش مطالعات برگشت باروری: برای آزمایش برگشت باروری از دو گروه تجربی با دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم و 9 گرم بر کیلوگرم استفاده شد. بهاین ترتیب که در هر گروه 12 موش بعد از آخرین تزریق، زنده نگهداشته شد و بلافاصله با نر بهمدت 8 روز جفت شدند. سپس نرها از قفس خارج شدند و سپس در روزهای آینده موشهای ماده از نظر حاملگی بررسی شدند.
در نهایت نتایج بهصورت میانگین±انحراف معیار مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. برای مقایسه دادههای گروهها با یکدیگر از آزمونهای تحلیل واریانس یکطرفه و تست تعقیبی توکی استفاده شد و 05/0p< بهعنوان ملاک معنیدار بودن اختلاف درنظر گرفته شد.
نتایج
بررسی هیستولوژیکی در گروههای تجربی علاوه بر بینظمی، آشفتگی و کمخونی حالت پلیاوولار در دوز 5/7 و 9 گرم بر کیلوگرم وزن بدن حیوان در تخمدان نشان داد (شکل 1).
شکل 1: دو اووسیت در یک فولیکول تخمدان گروه تجربی دوز g/kg 5/7 عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده، به بینظمی و آشفتگی سلولها توجه شود. O : اووسیت، بزرگنمایی : 350×
همچنین در دوز 9 گرم بر کیلوگرم اووسیتهای تخریب شده و زونا پلوسیدای روی هم چینخورده مشاهده شد (شکل 2).
شکل 2: زونا پلوسیدای چین خورده اطراف اووسیت در تخمدان گروه تجربی با دوز g/kg 9 عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده
بزرگنمایی : 053×
در دوز 15 گرم بر کیلوگرم علاوه بر کوچک شدن اندازه تخمدان، اووسیتهای واکوئوله شده درحال مرگ نیز دیده شد. در بررسیهای آماری تعداد جسم زرد و فولیکول درحال رشد در گروههای تجربی با دوز 9 گرم بر کیلوگرم افزایش ولی تعداد فولیکول گراف در گروههای تجربی نسبت به گروه سم کاهش معنیداری را نشان داد .
بررسی تغییرات بافتی در رحم نشان داد تزریق دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم برروی بافت رحم باعث کاهش ضخامت آندومتر و تعداد غدد ترشحی آن شده است. افزایش ارتفاع سلولهای اپیتلیوم نسبت به گروه سم مشهود بود. همچنین با بررسی دقیق سلولهای اپیتلیوم رحمها در گروه سم وزیکولهای مشاهده شد در حالیکه سلولهای اپیتلیوم رحمهای گروه تجربی با دوز 9 گرم بر کیلوگرم فاقد این وزیکول بودند (شکل 3).
شکل3 : رحم گروه شاهد، به وزیکولهای موجود در داخل سلولهای اپیتلیوم توجه شود.
E: اپیتلیوم v : وزیکول بزرگنمایی :350×
تغییرات بافتی در اویداکت نشان داد با تزریق دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم، بافت اویداکت و سلولهای مژهدار ظاهرا سالم میباشند. ولی در دوز 9 گرم بر کیلوگرم مژهها متلاشی و سلولهای میخی شکل که در تغذیه اووسیت نقش دارند، تخریب شدهبودند (اشکال 4 و 5).
شکل 4: اوویداکت گروه شاهد برش پلاستیک نیمه نازک. به نظم سلولهای مژهدار و سلولهای میخی شکل توجه شود.
C : مژهها، PC: سلولهای میخی شکل، بزرگنمایی : 350×
شکل 5: اوویداکت گروه تجربی دوز g/kg9 عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده برش پارافینی. به مژههای متلاشی شده و تخریب سلولهای مژهدار و میخی شکل توجه شود. بزرگنمایی : 350×
بهطوریکه شدت تخریب در دوز 9 گرم بر کیلوگرم بیشتر از دوز 15 گرم بر کیلوگرم بود.
بررسی تغییرات هورمونهای جنسی از نظر آماری نشان داد که هورمون استرادیول در همه گروههای تجربی بخصوص در دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم دارای کاهش معنیدار (نمودار 1) و هورمون پروژسترون در همه گروههای تجربی افزایش معنیدار داشته است که در دوز 9 گرم بر کیلوگرم این افزایش بسیار چشمگیر بود (نمودار 2).
نمودار1 : تغییرات هورمون استرادیول در گروه های تجربی با دوزهای مختلف عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده
نمودار2 : تغییرات هورمون پروژسترون در گروه های تجربی با دوز های مختلف عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده
افزایش تعداد جسم زرد و فولیکولهای در حال رشد در دو گروه های تجربی با دوز 5/7 گرم بر کیلو گرم و 9 گرم بر کیلو گرم نیز مشاهده شد. همچنین جسم زرد در دوز بالا 15 گرم بر کیلو گرم کاهش معنیداری را نشان داد (نمودارهای 3، 4 و 5)
نمودار3: مقایسه جسم زرد در گروه های کنترل و تجربی با دوزهای مختلف عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده
نمودار 4: مقایسه تعداد فولیکول ها در گروه های کنترل و تجربی با دوزهای مختلف عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده
نمودار 5: مقایسه تعداد فولیکول گراف در گروه های تجربی با دوزهای مختلف عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده
افزایش ارتفاع سلولهای اپیتلیوم رحم در دوزهای 5/7 گرم بر کیلو گرم و 9 گرم بر کیلو گرم (شکل 6) بود که به علاوه تخریب سلولهای اپیتلیوم و غدد ترشحی آندومتر در دوز 9 گرم بر کیلو گرم نیز مشاهده گردید (شکل7).
شکل 6 : سلولهای اپیتلیوم رحم گروه تجربی دوز g/kg 9 عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده ، افزایش ارتفاع کاملا مشاهده می گردید. E : اپیتلیوم بزرگنمایی : 350×
شکل 7 : اپیتلیوم رحم گروه تجربی دوز g/kg 9 عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده که در حال تخریب مشاهده گردید.
E: اپیتلیوم بزرگنمایی : 350×
نتایج بررسیهای برگشت باروری نشان داد در گروه تجربی با دوز 5/7 گرم بر کیلو گرم در حدود 67 درصد از موشها نابارور و 33 درصد بارور بودند؛ موشهای گروه تجربی با دوز 9 گرم بر کیلو گرم در ابتدا 100 درصد موشها نابارور بودند ولی با گذشت یک ماه از آخرین تزریق، وقتی دوباره با نر جفت گردیدند در حدود 5/16 درصد موشها بارور شده بودند. همچنین در پژوهش فوق مواد موثر فیزالین F و D مشخص شد. ( شکل8).
شکل8: طیف پروتون NMR فیزالینهای F و D
بحث
الف- تغییرات بافتی در تخمدان
در بررسی مطالعات میکروسکوپ نوری تغییرات متنوع و زیادی در بافت تخمدان مشاهده شد.
بینظمی و آشفتگی در کل بافت تخمدان و سلول های گرانولوزا در تزریق دوزهای 5/7 گرم بر کیلو گرم و 9 گرم بر کیلو گرم مشاهده شد. احتمالا عصاره روی اتصالات سلولی (اتصالات محکم) و سنتز پروتئین اثر گذاشته و آن را متوقف نموده است و باعث شده سلولها در حال مرگ و دژنرسانس باشند (12).
مشاهده کمخونی در بافت تخمدان تجربی با دوز 5/7 گرم بر کیلو گرم احتمالا بیانگر این مطالب است که عصاره بر روی سیستم خونساز اثر گذاشته و باعث همولیزشدن گلبولهای قرمز و درنتیجه کمخونی شده است (13).
در بافت تخمدان تعداد زیادی اووسیتهای درحال تخریب، زوناپلوسیدای چینخورده و اووسیتهای واکوئولی در دوز 9 گرم بر کیلو گرم و 15 گرم بر کیلو گرم مشاهده شد که این نتایج نشان دهنده آترزی فولیکولها میباشد.
نقش هورمونهای استروژن و پروژسترون بر عمل رشد فولیکولها، باروری و بارداری و ادامه موفقیتآمیز آن کاملا" مشخص می باشد و اختلال در تعادل میان آنها میتواند سبب اختلال در رشد فولیکول، باروری و ادامه حاملگی گردد.
احتمالا ترکیب موجود در عصاره گیاه Physalis alkekengiبر روی رشد و نمو و تمایز اووسیتها اثر گذاشته و مانع رشد آنها و موجب آتروفیه و واکوئولی شدن اووسیتها شده است (14).
تحقیقات انجام شده توسط وصال و همکاران نشان داد که تزریق عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده به رتهای حامله، سبب کاهش تعداد تولد نوزادان به میزان 96 درصد و کاهش استروژن و پروژسترون میشود (15). از سوی دیگر تحقیق انجام شده توسط موهانا و همکاران نشان داد که ترکیبات فیزالین موجود در عصاره آبی گیاه aminim.P سبب سقط جنین در بیش از 75 درصد رتهای حامله میشود (61).
همچنین وجود جنینهای آتروفی نشان دهنده نقش عصاره در جلوگیری از تقسیم و تمایز سلولی میباشد بهطوری که برخی از بررسیها برای فیزالینها و عصاره آبی گیاه نقش آنتیتوموری سیتوتوکسیسیته از طریق تخریب AND و مهار آنزیم توپوایزومراز ΙΙ را توضیح می دهند (71).
در تحقیق حاضر نیز به دنبال تزریق عصاره آبی به مدت 8 روز پیدرپی به موشهای حامله Balb/c، 100 درصد آتروفی جنین ها رخ داد؛ که وصال و همکاران احتمال دادند که در عصاره آبی میوه گیاه عروسک پشت پرده نوعی ماده آنتاگونیست استروژن وجود دارد که بر روی ایزوزیم کراتینکیناز موجود در رحم که به عنوان نوعی پروتئین القاکننده استروژن شناخته شده، تاثیر میگذارد و با مهار آن سبب کاهش تولید استروژن میشود (18).
در تحقیق حاضر نیز در سلولهای اپیتلیوم رحم کنترل وزیکولهای مشاهده شد. این وزیکولها در اپیتلیوم رحم تجربی با دوز 9 گرم بر کیلوگرم مشاهده نشد که احتمالاً این وزیکولها آنزیمهای القاکننده استروژن میباشند. به علاوه گروه وصال و همکاران نیز احتمال دادند که ترکیبات موجود در عصاره آبی میوه گیاه عروسک پشت پرده، بهعنوان یک آنتی LH در سطح هیپوفیز عمل کرده و از تولید هورمونهای استروئیدی تخمدان (استروژن و پروژسترون) جلوگیری میکند (18).
همچنین گزارش پژوهش های صورت گرفته نشان میدهد که عصاره آبی میوه این گیاه موجب کاهش فعالیت G6PD رحم و کبد (یک پروتئین القاکننده استروژن) بهمیزان 52 درصد میشود. این گزارش به طور واضح حضور یک آنتاگونیست استروژن را در عصاره آبی میوه گیاه نشان می دهد. بررسی تغییرات هورمونهای جنسی در تحقیق حاضر کاهش استرادیول و افزایش پروژسترون را در همه گروههای تجربی نشان داد که احتمالا این کاهش استرادیول باعث آترزی در فولیکولها شده است (91). هنگامی که از وقوع این مرحله جلوگیری می شود که مقادیر کافی دو هورمون HL و HSF به طور مستمر در خون جریان یابند. این ها گنادوتروپین های آزاد شده از هیپوفیز قدامی هستند که القای رشد فولیکول را باعث می شوند. حذف تولید استرادیول و آروماتاز یک خصوصیت اولیه آپوپتوزی در سلولهای گرانولوزا و آترزی فولیکول آنترال در تمام مراحل سیکل استروس است. حذف فعالیت آروماتاز خصوصیت مهم آترزی فولیکولهای orcineP است که در سطح ترانس گریپت میانجی میشود. غلظت استرادیول مایع فولیکولی معرف قابل اعتماد آترزی نیست و براساس مطالعات فارماکولوژیک استرادیول و یا آندروژنها در تنظیم آترزی و آپوپتوزی سلولهای گرانولوزا نقش مهمی دارند (02).
برخلاف ارتباط بین آترزی و غلظت استرادیول، پروژسترون فولیکول در فولیکول آترتیک (AF) بیشتر از NAF (فولیکول غیر آترتیک) میباشد و غلظت آندروستندیون تفاوتی در NAF و AF ندارد. اینها نشان میدهند که AF پس از حذف توانایی تولید استرادیول، به تولید پروژسترون و آندروژن ادامه میدهد. در خوک درشرایط vivo In این تولید تایید میشود. منشاء آندروستندیون مایع فولیکولی بدون شک از تکای داخلی است؛ با این حال در تجمع پروژسترون دخالت جسم زرد را نمیتوان نادیده گرفت (21).
در پژوهش حاضر مقدار پروژسترون در همه گروههای تجربی افزایش معنیداری را نشان داد که این افزایش در دوز 9 گرم بر کیلوگرم بیشتر بود. با وجود اینکه وصال و همکارانش کاهش پروژسترون را عنوان کرده بودند، به نظر میرسد گزارش ما منطقیتر باشد زیرا تزریق عصاره آبی باعث ازدیاد پروژسترون شده و این افزایش موجب آترزی فولیکولها و ناباروری شده است. چنانچه این مطلب در آزمایش برگشت باروری نیز مورد تایید میباشد؛ زیرا در دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم در حدود 67 درصد از موشها و در دوز 9 گرم بر کیلوگرم به میزان 100 درصد موشهای ماده نابارور شده بودند. همچنین باتوجه به اینکه جسم زرد هورمون پروژسترون را تراوش مینماید و از رشد فولیکولهای جدید و تخمکگذاری جلوگیری میکنند؛ شمارش جسم زرد در دوزهای 5/7 گرم بر کیلوگرم و 9 گرم بر کیلوگرم افزایش معنیداری را نشان داد میتوان چنین تفسیر نمود که بهعلت، ازدیاد پروژسترون مانع رسیدگی فولیکولهای درحال رشد گردیده و درنتیجه باعث کاهش تعداد فولیکول درحال رسیدگی و گراف شده است.
جسم زرد در دوز بالا 15گرم بر کیلوگرم کاهش معنیداری را نشان داد ولی با این وجود پروژسترون افزایش نشان داد. این نتیجه میتواند بیانگر این مطلب باشد که فولیکولها با وجود حذف توانایی تولید استرادیول، به تولید پروژسترون ادامه میدهند. در تزریق دوز 51 گرم بر کیلوگرم ، قطر بزرگ تخمدان کاهش یافته بود. علت آن میتواند ناشی از اثرات عصاره آبی بر روی بافت تخمدان، عدم تمایز اووسیتها و کاهش فولیکول گراف باشد. درحالی است که تحت تاثیر دوز 51 گرم بر کیلوگرم تعداد فولیکولهای درحال رشد افزایش یافته بود که نشان دهنده عدم تمایز فولیکولها میباشد. احتمالاً علت کاهش چشمگیر تعداد فولیکول اولیه، اثرات عصاره برروی سلولهای گرانولوزا و حساس بودن فولیکول اولیه به مواد موثر در عصاره میباشد.
تزریق دوز 15 گرم بر کیلوگرم موجب افزایش هسته و هستک و درواقع عدم اوولاسیون شده بود زیرا GVBD (شکست کیسه ژرمینال) یکی دیگر از عوامل مهم رسیدگی تقسیم میوز و اوولاسیون میباشد که در گروه کنترل و شم انجام میگیرد. یکی دیگر از نتایج مطالعات میکروسکوپی در بافت تخمدان مشاهده حالت پلیاوولار دو اووسیت در یک فولیکول در دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم و 9 گرم برکیلوگرم و سه اووسیت در یک فولیکول در دوز 9 گرم برکیلوگرم بود که این غیرعادی بود. احتمالا مواد موثره موجود در عصاره باعث عدم جدایی فولیکولها بهطور طبیعی گشته و باعث شد حالت پلیاوولار مشاهده شود. در بررسی تعداد جسم زرد در دوز 5/7 گرم برکیلوگرم و 9 گرم برکیلوگرم از عصاره آبی گیاه افزایش معنیداری مشاهده شد
سلولهای تک خارجی که در اطراف فولیکول قرار دارند شبیه سلولهای عضله صاف (میوئید) میباشند که احتمالاً انقباض آنها در عمل تخمکگذاری دخالت دارد. در بررسیهای انجام شده توسط دیالمیدا برای عصاره آبی گیاه P. edulis فعالیت کولینومیمتیک گزارش شده است. در این تجربیات اثر عصاره آبی گیاه در محیط In vitroسبب انقباض عضلات صاف ژوژنوم و رکتوم وزغ شده است. وجود استیلکولین در عصاره آبی میوههای P. alkekengi باعث انقباض سلولهای تک خارجی گشته و اووسیت آن خارج و باعث افزایش جسم زرد شده که نتیجه آن افزایش پروژسترون و در نهایت فولیکولها رشد نیافته می باشد.
ب-تغییرات بافتی در رحم
مهمترین تغییراتی که در بافت رحم تحت تاثیر عصاره بهوجود آمده بود:
- افزایش ارتفاع سلولهای اپیتلیوم رحم در دوزهای 5/7 گرم برکیلوگرم و 9 گرم برکیلوگرم بود که احتمالا علت افزایش ارتفاع میتواند رشد میکروفیلامانها باشد و این افزایش ارتفاع سلولهای اپی تلیوم رحم در ایجاد ناباروری میتواند موثر باشد.
- به علاوه تخریب سلولهای اپیتلیوم و غدد ترشحی آندومتر در دوز 9 گرم برکیلوگرم
- کاهش ضخامت آندومتر در دوزهای 5/7 گرم برکیلوگرم و 9 گرم برکیلوگرم
- عدم وجود وزیکولهای در داخل سلولهای اپیتلیوم مشاهده شد.
در رابطه با مکانیسم اثر کاهش ضخامت آندومتر میتواند به علت کاهش استرادیول باشد زیرا افزایش ضخامت مصادف با رشد فولیکولهای تخمدان و ترشح استروژن میباشد؛ همچنین به محض برداشتن تخمدانها، آندومتریوم آتروفی میشود. در اثر مصرف استروژن، افزایش سریعی ازجریان خون به رحم انجام میشود و آندومتر به صورت ادم درمیآید و سلولهای آن شروع به تکثیر و هیپرتروفی میشوند چرا که استروژنها محرک رشد آندومتر رحم میباشند. کاهش غدد ترشحی در همه دوزها و بسته بودن منافذ غدد نیز مشاهده گردید. درحالیکه در حالت نرمال غدد ترشحی دندانهدارشده منافذ وسیعتر میگرد که علت بسته بودن منافذ غدد ترشحی میتواند کاهش استرادیول باشد (22).
احتمالا بهعلت وجود آنتاگونیست استروژن در عصاره گیاه توقف سنتز آنزیمهای G6PD و القاکننده استروژن صورت گرفته است.
ج-تغییرات بافتی در اوویداکت
نتایج نشان داد تزریق دوز 5/7 گرم برکیلوگرم برروی بافت اوویداکت ظاهرا اثری نداشته و بافت و مژهها سالم بودند ولی در تزریق دوز 9 گرم برکیلوگرم مژهها و حتی سلولهای مژهدار و سلولهای میخی شکل که نقش تغذیه اووسیت را دارند متلاشی شده بودند. در تزریق دوز 15گرم برکیلوگرم سلولهای مژهدار درحال تخریب بودند و متلاشی شدن مژهها به شدت تزریق دوز 9 گرم برکیلوگرم نبود که علت این امر را میتوان کاهش استرادیول و افزایش پروژسترون در همه گروههای تجربی دانست. زیرا اگر تخمدانها برداشته شود اپیتلیوم لوله به سرعت آتروفی میشود و در عرض چند هفته عاری از مژه خواهد شد. در مدت یک هفته بعداز مصرف استرادیول در بافت لوله هیپرتروفی قابل توجهی به وقوع میپیوندد و مژهها و فعالیت ترشحی به حال اولیه بازمیگردند.
هورمونهای استروئیدی برروی میزان نوسان مژهها تاثیر میگذارند. استروژن ظاهرا سطح مژهدار را آماده میسازد تا برای انتقال تخمک اختصاص یابد. پروژسترون نوسان مژهها را در زمانی که تخمک برای انتقال قابل حصول است تسریع میکند. مصرف پروژسترون در تخمدان مجهز شده به استرادیول باعث افزایش قابل ملاحظه در نوسان مژهها میباشد. در مراحل بعدی سیکل، پروژسترون به از دست دادن مژهها یاری میرساند. در این تحقیق نیز کاهش استرادیول و افزایش پروژسترون باعث متلاشی شدن مژهها و سلولهای مژهدار و سلولهای میخیشکل شده بود. درنتیجه ایجاد 100 درصد ناباروری در دوز 9 گرم برکیلوگرم شده بود. علت اینکه در دوز 15 گرم برکیلوگرم تخریب مژهها و بافت اوویداکت به شدت دوز 9 گرم برکیلوگرم نبود را میتوان اینگونه تفسیر نمود که احتمالا به علت وجود ماده آنتاگونیست استروژن در عصاره آبی گیاه و اشغال همه گیرندههای استروژنی، دوز 51 گرم برکیلوگرم موثر واقع نشده و شدت تخریب را افزایش نمیدهد. همچنین علت تأثیر عصاره گیاه فوق را در دوز 5/7 گرم برکیلوگرم و دوز 9 گرم برکیلوگرم نسبت به دوز 51 گرم برکیلوگرم میتوان چنین تفسیر نمود که گیرندههای استروئیدی توسط فیزالینها اشغال میشود و زمانی که تمام گیرندهها اشغال شدند دیگر دوز 51 گرم برکیلوگرم نخواهد داشت به همین خاطر دور 51 گرم برکیلوگرم دوز موثری نبود.
با توجه به ساختمان فیزالین F ، چیانگ و همکارانش نیز وجود گروه اپوکسی در فیزالین F را مسئول ارائه این اثرات معرفی کردهاند (23).
همچنین در پژوهش فوق با بهکارگیری انواع متدهای اسپکتروسکوپی و تعیین ساختمان مولکولی، مشخص گردید که مواد موثر فیزالین F و D میباشند.
نتیجهگیری
طبق یافتههای پژوهش فوق میتوان نتیجه گرفت که فیزالینها، ساختمان شبه استروئیدی دارند و قادرند بهراحتی از غشا سلولها عبور کرده و به گیرندههای استروئیدی داخل سیتوپلاسم متصل شوند و به رسپتور خود در داخل هسته وارد و به بخشی از DNA متصل شود و در سنتز پروتئین و یا آنزیم اختلال ایجاد کند، همچنین ترکیبات این عصاره میتواند باعث ایجاد ناباروری شده ولی با گذشت زمان، برگشت باروری داشته باشند که نشاندهنده ترمیم بافت رحم و برگشت هورمونها به وضعیت طبیعی میباشد. از دیگر اثرات این عصاره نقش سقطزایی و جلوگیری از حاملگیهای ناخواسته میباشد که البته باید به زمان و مقدار مصرف عصاره توجه داشت.
در پایان میتوان امیدوار بود که از این گیاه بهعنوان یک داروی ضدبارداری بدون داشتن عوارض جانبی استفاده کرد زیرا مصرف قرصهای ضدآبستنی که معمولا حاوی پروژسترون بوده و گاهی مخلوط پروژسترون و استروژن است، باعث عقیمی زن میشد.
تشکر و قدردانی
از کلیه اساتید محترم و دوستانی که ما را در اجرای این پژوهش یاری نمودند کمال تشکر و قدردانی را داریم.
1. Nassimi M, Heydari Nasrabadi M, Shirvi A. Effects of (Physalis alkekengi) fruit’s alcoholic extract on development of placentas in pregnant wistar rats. Journal of Animal Biology. 2009;1(2): 51-60.
- Mahdieh H, Manijeh M, Mahnaz A and Majid A.M. An investigation of antioxidant activity of Physalis alkekengi methanolic extracts in different phenolegical stages. Journal of Plant Biology. 2012;4(4):101-114.
- Pop_Mitrol D, popa_Mitrol GH, Nicu C, Manda M. study on behavior of physalis alkekengi L.species in spontsneous flora and culture in order to evaluate its decorative quality south western journal of hortic ulture. Biology and environment.2012;1.3(2): 185-202.
- Rahimi Shokouh A, Naghdi Badi H, Abdossi V, Mehrafarin A. Overview on the Agronomic, Phytochemical and Therapeutic traits of Bladder Cherry (Physalis alkekengi L.). Journal of Medicinal Plants.2019;18(4):1-13.
- Javadan N, Gstakhr J. Effect of physalis alkekengi extract on the histology of the liver in male albino rat. pharmacologyonline.2011;3:311-316.
- Matsuura T, Kawai M, Makashima R. Structures of physalin A and physalin B, 13,4-seco-16,24 cyclosteroids from Physalis alkekengi var. francheti. J Chem Soc.1970; 5: 664-70.
- Chiang H.C, Jaw S.M, Chen C.F, Kan W.S. Antitumor agent, Physalin F from Physalis angulata L., Anticancer Res;1992; 12(3): 837-843.
- Rezanejad F, Hosseini A. The effect of growth factors on direct micropropagation of Physalis alkekengi L. (Solanaceae) through buds and stems explants to transfer to the greenhouse and flowering phase .Modares Journal of Biotechnology.2019;10(3):441-446.
- 9. Montazeri A, Pourheydar M, Khazaei M, Ghorbani R. Anti-Fertility effects of physalis alkakengi alcoholic extract in female rat. Iranian jornal of reproductive medicine. 2007; l.5(1): 13-16.
- Zarei A, Shariati M, Shekar SH, Changizi ashtiyani S. the effect of physalis alkekengi extract on the physiologic function of organ tissues. Journal of Arak University of Medical Sciences. 2012;15(66):94-104.
- Vessal M, Mehrani H, Omrani G. Effects of an aqueous extract of Physalis alkekengi on estrue cyclo reproduction and uterine creatine kinase BB-isozyme in rats. J.Ethnopharmacol. 1991;34(1):69-78.
- Nozhat F, Alaee S, Behzadi kh, Azadi chegini N. Evaluation of possible toxic effects of spearmint ( menthe spicata ) on the reproductive system fertility and number of qffspring in adult male rats. Avicenna Journal phytomed.2014;4(6):420-429.
- Fazelipour S, Adhami Moghadam F, Davodi P, Tootian I. et al. Hio stometrical study of ovarian follicales of immature mice treated with methylaphenidate. Journal of veterinary Research. 2012;70(3):301-307.
- Andressa G, Daryl D.M, Liying G, Michael J.P, Jodi A.F. Iodoacetic acid inhibits follicle growth and alters expression of genes that regulate apoptosis, the cell cycle, estrogen receptors and ovarian steroidogenesis in mouse ovarian follicles.Reproductive Toxicology.2020;91(1):101-108.
- Vessal M, Fathi N, Khoshdel Z. Effect of aqueous extract of Physalis alkekengi fruits on the activity of ovarian 3beta- and 20alpha-hydroxysteroid dehydrogenases in late pregnancy in rat.2004; 29:175-179.
- Mohana K, Uma R, Purusothaman K.K. Abortifacient activity of Physalin–X. Ind J Exp Biol 1979;17:690-691.
- .Li Ai, Chen B, Li G, Zhou M. Li Y. et al. Physalis alkekengi L.var. franchetii (Mast.) Makino: An ethnomedical, phytochemical and pharmacological review.Journal of Ethnopharmacology.2018;210:260-274.
- Vessal M, Mehrani H.A, Omrani GH. Effect of an aqueous extract of Physalis alkekengi fruits on estrus cycle, reproduction and uterine creatinekinase BB-isozyme in rats. J Ethnopharmaco.1991; 34: 69-78.
- Manjanatha M.G, Shelton S.D, Dobrovokky V.K, Shaddock J.G. et al. pharmacokinetic,doesrange and mutagenicity studies of methylphenidate hydrochloride in B6C3Fl mice, Environ molmutagen. 2008;49:585-593.
- Moshfegh F, Baharar J, Namvar F, Zafar_Balanezhad S. et al. Effects of date plam pollen on fertility and development of reproductive system in female Balb/C mice. Journal of herbmed pharmacology.2016;5(1):23-28.
- Shekar Foroosh SH, Changizi Ashtiyani S, Akbarpour B, Attari M . et al. the Effect of Alcoholic Extract of Physalis alkekengi on Serum Concentration of Thyroid Hormones in Rats. Zahedan Journal of Research in Medical Sciences. 2012;14(5):7-11.
- Torabzadeh P, Ghosi M, Parivar K. Study of the teratogenic effects of active ingredients in the physalis alkekengi extract and development of Balb/C mouse embryos. Journal of Physiological Research and Animal Development. 2013; 6(3):1-15.
19. Bahmani M, Rafieian-Kopaei M, Neghdi N, Mozaffari Nejad A. et al. Physalis alkekengi: A review of Its Therapeutic Effects. journal of chemical and pharmaceutical sciences.2016;9(3):1472-1475.