مقدمه

سرطان یکی از عوامل اصلی مرگ در جوامع توسعه یافته و کمتر توسعه یافته است به‏طوری‏که انتظار می­رود با رشد و افزایش سن جمعیت در کشور­های کمتر توسعه یافته که تقریبا 82 درصد از جمعیت جهان را شامل می­شوند، مرگ ‏و میر ناشی از سرطان افزایش یابد (1).

سرطان ریه یکی از مرگ‏بارترین نوع این بیماری برای مردان و زنان است و بدون در نظر گرفتن جنسیت، از نظر شیوع انواع سرطان دومین رتبه و هم‏چنین از نظر میزان کشندگی اولین رتبه در جهان را داراست (2). سرطان ریه براساس اندازه و بروز سلول­های بدخیم به‏ دو گروه اصلی طبقه‏بندی می‏شود که شامل سرطان ریه با سلول­های کوچک (SCLC) که 15 درصد از موارد سرطانی را شامل می­شود و سرطان ریه با سلول­های غیرکوچک (NSCLC) که 85 درصد موارد باقیمانده را در بر میگیرد و خود به سه زیرگروه پاتولوژیکی عمده تقسیم می­شود که شامل: 1- سلول­های کارسینومای سنگ‏فرشی 2-  سلولهای آدنوکارسینوما و  3- کارسینومای ریه با سلول­های بزرگ می‏باشند. درمان سرطان ریه بستگی به نوع سلول سرطانی، وضعیت بیمار و مقدار پیشرفت آن دارد. طی دهه­های اخیر معمولا از روش­های شیمی درمانی، پرتو درمانی و جراحی برای بهبودی بیماران استفاده شده است. جراحی زمانی موثر است که تومور به‏طور کامل قابل برداشت باشد و بیمار تحمل عمل جراحی را داشته باشد. بنابراین ابداع راهکارهای درمانی جدید و بدون عوارض جانبی، ضروری به‏نظر می­رسد (3، 4). یکی از روش­های موثر در کنترل سرطان، القا آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی می‏باشد. آپوپتوزیس یک فرآیند کلیدی در بیماری سرطان است و توانایی فرار سلول­های سرطانی از آپوپتوزیس و ادامه­ی تکثیر یکی از ویژگی­های اولیه­ی سلول­های سرطانی محسوب می­شود و بنابراین توانایی القای آپوپتوزیس در این سلول­ها یک هدف اصلی و مهم در درمان سرطان می‌باشد (5). فرآیند آپوپتوزیس یا مرگ برنامه‏ریزی شده­ی سلول به‏عنوان روشی حفاظت شده و تحت کنترل ژن­هاست که به‏منظور حذف سلول­های ناخواسته در موجودات زنده به‏کار می‌رود. این فرآیند در تنظیم میزان رشد، تکثیر سلول­ها، تکوین و سلامت بدن بسیار مهم است (6). هم‏چنین با وجود این‏که عوامل متعددی در ایجاد و پیشرفت سرطان دخیل می­باشند، اخیرا نقش استرس اکسیداتیو در بیماری­زایی انواع سرطان­ها مورد توجه قرار گرفته است. شواهد متعددی حاکی از آن است که سلول‏های سرطانی در مقایسه با سلول­های نرمال، گونه‏های فعال اکسیژن بیشتری تولید می­کنند و در معرض استرس اکسیداتیو قرار دارند. در سلول­های سرطانی سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی سرکوب می­شود و یا مقادیر زیادی گونه‏های فعال اکسیژن تولید می­شود. شواهد بسیار زیادی نشان داده‏اند که تعادل اکسیداسیون احیا در سلول­های سرطانی در مقایسه با سلول­های طبیعی مختل می­شود. تغییر در سطوح آنزیم­های آنتی اکسیدانت (سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز) و آنتی اکسیدانت‏های غیرآنزیمی (گلوتاتیون، ویتامین C و تیوردوکسین) و هم‏چنین تغییراتی در مسیرهای پیام‏رسانی مرتبط، مشهود است (7).

از سوی دیگر داروهای گیاهی به‏علت وجود عوارض جانبی کمتر نسبت به داروهای شیمیایی، اهمیت بیش‏تری در پیشگیری انواع سرطان دارند (8). بدین منظور مطالعات گسترده‏ای بر روی گیاهان مختلف صورت گرفته و اثرات سمیت سلولی و ضدسرطانی آن‏ها مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفته است. در این خصوص، سنجش میزان بقا و تکثیر سلولی در تعیین میزان اثر داروهای ضدسرطانی بر روی سلول­ها امری مهم به‏نظر می­رسد؛ که در این خصوص روش­های متعددی استاندارد شده است. گیاه مریم­گلی با نام علمی‌Salvia officinalis  گیاهی است گلدار، نهاندانه، دو لپه‏ای پیوسته گلبرگ، بوته‏ای با ریشه­های چوبی و پایا به ارتفاع 30 الی 60 سانتی‏متر، برگ­هایی ساده و از تیره­ی نعناع، بومی‌ مناطق خاورمیانه و مدیترانه است که امروزه در سراسر جهان رایج شده است (9). این گیاه به‏دلیل خواص و طعم منحصر به‏فرد آن در بسیاری از غذاها و به‏عنوان دم‏نوش مورد استفاده قرار می‌گیرد. در طب سنتی آسیا و آمریکای لاتین از مریم­گلی برای درمان انواع اختلالاتی مانند تشنج، زخم، التهاب و اسهال و در اروپا نیز برای درمان اختلالات شناختی مرتبط با سن استفاده می‌کنند. مریم­گلی آلزایمر را بهبود می­بخشد و قند خون را کاهش می­دهد. در سال­های اخیر مطالعات بسیاری در خصوص پیدا کردن اثرات زیستی جدید برای مریم­گلی انجام شده است، که این مطالعات طیف گسترده‏ای از فعالیت­های دارویی شامل اثرات آنتی اکسیدانتی، ضدالتهابی، ضدسرطانی و ضددردی را نشان می‌دهد و اجزای شیمیایی موجود در عصاره­های آبی و هیدروالکلی این گیاه مانند سینئول، پنین، فلاونوئید­ها به‏خصوص رزمارینیک اسید، ساپونین‏ها، ویتامین­های E و C و غیره را مسئول این اثرات زیستی می‌دانند (10، 11).

شواهدی وجود دارد که نشان می‏دهد رزمارینیک اسید، یکی از ترکیبات مریم­گلی می‌تواند پیشرفت تومور در چندین اندام بدن شامل کولون، سینه، کبد، شکم و هم‏چنین ملانوما و سلول­های سرطان خون را سرکوب کند. این ماده هم‏چنین می­تواند فعالیت آنزیم­های کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز را افزایش دهد (12). با توجه به اهمیت سرطان ریه و خاصیت آنتی اکسیدانتی مریم گلی، اطلاعات چندانی در خصوص اثر این داروی گیاهی در آزمایشات درون و برون تنی سلول‏های سرطانی ریه مشاهده نشد. هم‏چنین در سال 2020 ونگ و همکاران اعلام داشتند که درمان ترکیبی دارویی به‏نام پالکی­تاکسل با کربوپلاتین در درمان نوعی سرطان ریه پیشرفته موفق­آمیز بوده و برای درمان کلینیک پیشنهاد شد.  پالکی­تاکسل از جمله دارویی از دسته آلکالوئیدهای گیاهی بوده که عموما از گیاه سرخدار مشتق می شود و به‏عنوان یکی از مهمترین ترکیبات طبیعی ضدسرطان در سرارسر دنیا برای درمان از جمله سرطان پوست، مری و ریه به‏طور موثر استفاده می‏شود (13). به‏علاوه نشان داده شده که داروهایی با منشا گیاهی مانند وین بلاستین و اتوپوساید همراه با ترکیبات سیکلوپلاتین نقش چشم‏گیری در درمان سرطان ریه با منشا سلول­های کوچک دارد. اتوپوساید جز داروهای ضروری سازمان بهداشت است که از جمله موثرترین و بی‏خطرترین داروها در ارتباط با سلامت هستند (14). وین بلاستین یک ترکیبآلکالوئیدبا خاصیت ضدنئوپلاسم است که در درمان انواع خاصی از سرطان از جمله سرطان ریه به‏کار می‏رود (15، 16).

لذا هدف از پژوهش حاضر بررسی اثرات عصاره­ی هیدروالکلی گیاه مریم­گلی در دوز­های مختلف در القای آپوپتوزیس و هم‏چنین میزان القای آنزیم­های موثر بر استرس اکسیداتیو در سلول­های سرطانی ریه رده A549 می‏باشد.

مواد و روش‌ها

 کشت سلول­های رده A549:سلول­های A549 از موسسه پاستور تهران به‏صورت سلول کشت شده در فلاسک خریداری شد. پس از این‏که تراکم سلول­ها در محیط کشتGibco, USA) ) DMEM محتوی 10 درصد سرم جنین گاوی FBS, Gibco, USA) ) به‏حدود 70 تا 80 درصد رسید به‏منظور مضاعف‏سازی سلول­ها پاساژ سلولی به‏این‏ترتیب انجام گرفت که محیط رویی فلاسک خارج و سطح رویی سلول­ها با 2 میلیلیترSigma, USA) ) PBS شسته شد آنگاه به‏هر فلاسک T25 حدود 2 میلی‏لیتر تریپسین Gibco, USA) ) اضافه و 1 الی 2 دقیقه در انکوباتور قرار داده شد. در ادامه 5/2 میلی‏لیتر محیط کشت به فلاسک اضافه و محتویات فلاسک به فالکون 15 میلیلیترمنتقل و با دور rpm 1500 به‏مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد.  

طرز تهیه عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی: پودر عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی (سها جیسا، ایران) را به‏میزان 500 میلی‏گرم وزن کرده و با 5 میلی‏لیتر محیط کشت DMEM (modification of Basal Medium Eagle) فاقد سرم ترکیب و به‏شدت تکان داده شد تا پودر کاملا در محیط کشت حل شود. سپس زیر هود لامینار با فیلتر سر سرنگی با قطر منافذ 22/0 میکرون در فالکون 15 سی‏سی فیلتر شد و در دمای 20- درجه سانتی‏گراد به‏عنوان استوک اصلی با غلظت 100 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر نگهداری شد.

ساخت محلول MTT: برای ساخت محلول MTT، 25 میلی‏گرم از پودر MTT ((Sigma, USA در 5 میلیلیترسالین بافرفسفات حل و با فیلتر سرسرنگی با قطر 22/0 میکرون فیلتر شد و در دمای 20- درجه سانتی‏گراد به‏عنوان استوک اصلی نگه‏داری شد.

انجام تست MTT: بدین منظور سلول­های مورد نظر در تراکم 10⁴ × 1 سلول در هر چاهک، در ظرف کشت 96 خانه کشت داده شدند. پس از 24 ساعت، محیط رویی هر چاهک با غلظت‌­های عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی 10، 8، 6، 4، 3 و 1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تعویض که همراه با محیط کشت DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی به چاهک­ها اضافه شد. برای نمونه کنترل سلول­ها در محیط کشت و بدون تیمار با مریم گلی درنظر گرفته شد. پس از 24 ساعت تیمار محیط رویی خارج و هر چاهک با 100 میکرولیتر PBS شست‏وشو داده شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول MTT (9 قسمت محیط کشت و 1 قسمت محلول MTT) به‏هر چاهک اضافه شد و پلیت به‏مدت 3 الی 4 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. سپس محتویات هر چاهک با احتیاط دور ریخته شد و 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید (DMSO) به‏منظور حل کردن کریستال­های فورمازان به‏هر چاهک اضافه شد. محتویات هر چاهک به‏آرامی با سمپلر پیپتاژ شد و به‏مدت 15 دقیقه در دمای انکوباتور نگه‏داری شد. در ادامه جذب نوری هر چاهک در طول موج 570 نانومتر با دستگاه الایزا (FAX STAT 2100, USA) خوانده شد. این تست در روزهای 1، 3، 5، و 7 انجام شد.

رنگ آمیزی سلول­ها با روش گیمسا: به‏منظور رنگ‏آمیزی گیمسا پس از 24 ساعت تیمار سلولی با غلظت IC50 از عصاره­ی هیدروالکلی انجام شد. سلول­ها پس از شست‏وشو با PBS به‏وسیله­ی اضافه کردن 100 میکرولیتر متانول (مخلوطی از استیک اسید و متانول با نسبت 1 به 3) به‏مدت 5 دقیقه تثبیت شدند. آن‏گاه میزان 100 میکرولیتر رنگ گیمسا با غلظت 4 درصد به سلول­ها اضافه و پس از گذشت 20 دقیقه شست‏وشو با PBS انجام شد. سلول­ها با استفاده از میکروسکوپ معکوس (Biored, USA) مشاهده و عکس‏برداری شدند.

رنگ‏آمیزی سلول­ها با اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید: ابتدا سلول­ها در ظروف کشت 96 خانه کشت و تیمار شدند. بعد از گذشت 24 ساعت از تیمار به نمونه­ها محلول اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر اضافه شد. پس از گذشت 5 دقیقه به‏وسیله­ی میکروسکوپ فلوئورسانس (Olympus, Japan) مشاهده و عکس‏برداری صورت گرفت.

رنگ آمیزی DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride): به‏منظور رنگ‏آمیزی دپی (Sigma, USA) سلول­ها در ظروف مخصوص 96 خانه کشت و تیمار شدند. پس از گذشت 24 ساعت از تیمار سلول­ها با پارا فرمالدهید 4 درصد به‏مدت 15 دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند و پس از شست‏وشو به‏مدت 1 الی 5 دقیقه در دمای اتاق تحت اثر رنگ دپی قرار داده شدند در نهایت پس از شست‏وشو با میکروسکوپ فلوئورسانس بررسی شدند.

سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی: برای بررسی اثر عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در رده­ی سلولی A549 ابتدا سلول­ها در فلاسک­های سلولی به‏تعداد 10⁵×9 سلول کشت داده شد و با غلظت IC50 مریم گلی به‏مدت 24 ساعت تیمار شدند. سپس با استفاده از تریپسین EDTA جدا و  500 میکرولیتر بافر لیز کننده سرد به رسوب سلول­ها اضافه و به‏مدت 30 دقیقه روی یخ نگه‏داری شد. بعد از گذشت این زمان نمونه­ها 15 دقیقه با دور rpm 10000 در دمای 4 درجه­ی سانتی‏گراد سانتریفیوژ شدند. در آخر محلول رویی حاصل جهت اندازه­گیری میزان پروتئین و سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز به‏روش دستی با استفاده از روش کونو و  میزان فعالیت کاتالاز  نیز به‏روش کورولیوک و همکاران انجام شد (16).

تحلیل آماری

آنالیز آماری با استفاده از نرم‌افزار آماری Graph Pad Prism، آزمون one-way ANOVA و T-test انجام شد. رسم نمودار در ‌Excel 2016 انجام گرفت. 05/0 p<برای سطح اختلاف معنی‌دار بین گروه‏ها در نظر گرفته شد و هر آزمایش حداقل سه بار تکرار شد.

نتایج

بررسی مورفولوژی سلولی در رده­ی سلولی A549

یکی از روش­های بررسی اثرات سمیت بر روی سلول­ها، مشاهده مورفولوژی سلولی می­باشد. بدین منظور بعد از کشت رده سلولی A549 در پلیت 96 خانه و تیمار با غلظت IC50 از عصاره هیدروالکلی مریم­گلی پس از 24 ساعت نمونه­های تیمار و کنترل با میکروسکوپ معکوس مشاهده و عکس‏برداری شدند. در مورفولوژی سلولی گروه­های تیمار در مقایسه با گروه کنترل تغییراتی مشاهده شد که شامل کروی شدن سلول، چروکیده شدن، جمع شدن سلولی و دانه دار شدن سلول­ها بود (شکل1).

شکل1: مورفولوژی رده سلولی  A549(20×): در تصویر "الف"، مورفولوژی طبیعی سلول­های A549 بدون تیمار قابل مشاهده می­باشد. در تصویر "ب"، تغییرات مورفولوژیکی سلول­ها پس از تیمار با غلظت  mg/mL5 عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی نشان داده شده است. کاهش حجم سلول، گرانوله شدن سلول­ها و همچنین چروکیده شدن غشا سلول­ها در نمونه تیمار قابل مشاهده می­باشد که به‏واسطه فلش در تصویر مشخص شده‏اند.

اثر عصاره هیدروالکلی مریم­گلی روی بقای رده سلولی سرطان A549

آزمایش MTT جهت بررسی اثر عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر زیست‏پذیری سلول­های A549 در زمان 24 ساعت و با غلظت‌‏های (10، 8، 6، 4، 3 و 1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) انجام شد. نتایج آماری نشان داد که زیست‏پذیری سلول­های A549  بعد از مواجهه با دوز­های مختلف عصاره­ی مریم­گلی به‏طور معنی­داری نسبت به نمونه­ی کنترل کاهش یافت به‏طوری‏که بقای سلولی به‏ترتیب به‏میزان (74/26، 53/28، 65/43، 36/66، 16/72 و 67/76 درصد) رسید (شکل2). زیست‏پذیری سلول­های A549 در تمامی دوز­ها دارای اختلاف معنی­داری نسبت به گروه کنترل بود و IC50 به‏دست آمده برای سلول­های A549 در دوز 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تعیین شد.

رنگ آمیزی سلول­های A549 با رنگ گیمسا

پس از گذشت 24 ساعت از تیمار سلولی، سلول­ها با رنگ گیمسا رنگ‏آمیزی شده و به‏وسیله­ی میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرار گرفتند. مورفولوژی سلول­ها پس از این مدت در نمونه­ی شاهد کاملا طبیعی بود به‏طوری‏که، سلول­ها کاملا کشیده با غشای سالم و برخی در حال تقسیم دیده شدند. اما سلول­های تحت تیمار تغییرات مورفولوژیکی شامل چروکیدگی سیتوپلاسم سلولی، کاهش حجم سلولی، گرانوله شدن سلول­ها، از دست دادن چسبندگی سلولی و جدا شدن تعدادی از سلول­ها از کف چاهک و شناور بودن در محیط سلولی، تراکم کروماتین درون هسته و تولید اجسام آپوپتوزیسی را از خود نشان دادند (شکل 3).

رنگ آمیزی رده­ی سلولی A549 با روش اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید

به‏منظور تعیین نوع مرگ سلولی القا شده توسط عصاره هیدروالکلی مریم­گلی در رده سلولی A549 از روش رنگ‏آمیزی اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید استفاده شد. اکریدین اورنج یک رنگ حیاتی است و توسط سلول­های زنده جذب می­شود. اکریدین اورنج وارد DNA سلول زنده می­شود و در زیر میکروسکوپ یک نمای سبز رنگ به کروماتین سلول زنده می­دهد. اما اتیدیوم بروماید فقط سلول­های آسیب دیده و آپوپتوزی را رنگ می­کند. اتیدیوم بروماید وارد DNA سلول آسیب‏دیده شده و در زیر میکروسوپ فلوئورسانس، رنگ نارنجی به کروماتین سلول مرده می­دهد. در گروه­های تحت تیمار با عصاره هیدروالکلی مریم­گلی و تعداد سلول­ها با کروماتین رنگ نارنجی افزایش چشم‏گیری در مقایسه با کنترل داشتند (شکل 4).

رنگ‏آمیزی سلول­های A549 با رنگ دپی

به‏منظور بررسی تغییرات هسته در سلول­های A549 حاصل از تیمار با عصاره هیدروالکلی مریم­گلی این سلول­ها با رنگ دپی رنگ‏آمیزی شدند. 4′,6-diamidino-2-phenylindole یک رنگ فلوئورسنت است که برای مشاهده هسته سلول به‏کار می­رود و می­تواند اتصال قوی و محکمی با ناحیه بازهای A-T در دو رشته DNA برقرار کند. در گروه­های سلولی تیمار عصاره مریم­گلی تغییراتی مانند چروک خوردن هسته­ی سلولی، کروماتین فشرده و یا قطعه قطعه دیده شد. این تغییرات از خصوصیات سلول­های آپوپتوزیسی می­باشد و نشان­دهنده­ی آغاز روند مرگ سلول­ها در گروه­های تیمار بود. در حالی‏که در گروه کنترل، هسته سلولی کاملا گرد و سالم دیده می­شد (شکل 5).

سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در رده سلولی A549

با محاسبه­ی میزان آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در گروه کنترل و گروه­ تحت تیمار با عصاره هیدروالکلی مریم­گلی با غلظت IC50 و آنالیز آماری پس از آن، نمودار آن رسم شد (شکل6). نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و همچنین آنزیم کاتالاز در گروه تیمار با عصاره مریم­گلی در مقایسه با گروه کنترل به‏صورت معنی­داری افزایش نشان داد (001/0>p).

بحث

در این مطالعه اثرات سمیت سلولی عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر رده­ی سلولی سرطان آدنوکارسینوما ریه مورد بررسی قرار گرفت. زیستایی و تکثیر سلول­ها توسط روش MTT بررسی شد. در این روش ابتدا رده­­ی سلولی سرطانی در مواجهه با غلظت‌­های مختلفی از عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی قرار گرفت. تیمار مریم گلی دارای اثرات سیتوتوکسیک بر رده سلول سرطانی A549 به‏صورت وابسته به‏دوز بود، به‏گونه ای که در غلظت‌­های پایین تیمار رشد سلول­ها نسبت به گروه کنترل، تغییر کمتری یافته بود اما در غلظت‌­های بالاتر به‏طور معنی­داری باعث مهار رشد این سلول­ها نسبت به گروه کنترل شد. با توجه به نتایج، غلظت موثر بر مهار 50 درصد رشد سلول­ها IC50، برای عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر رده­ی سرطانی A549 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر به‏دست آمد. از سوی‏دیگر، غلظت IC50 در نمونه تیمار در روزهای 1، 3، 5 و 7، رشد رده­ی سلولی را به‏طور معنی­داری با گذشت زمان کاهش داد، که نشان‏گر وابسته به زمان بودن اثر سمیت عصاره بر روی سلول­های سرطانی بود. به‏علاوه نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و همچنین آنزیم کاتالاز در گروه تیمار با عصاره مریم­گلی در مقایسه با گروه کنترل به‏صورت معنی­داری افزایش داشت.

هم‏راستا با پژوهش ما پژوهش­های قبلی نیز حاکی از آن می­باشد که عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر برخی سلول­های سرطانی طی شرایط وابسته به زمان و غلظت اثر سمیت سلولی دارند  برای نمونه چرنوا و همکاران (17، 18) ، در تحقیقات خود نشان دادند که کامفور (یکی از ترکیبات موجود در عصاره­ی مریم­گلی)، سمیت را در سلول­های کارسینومای سنگفرشی انسان HSC-2 القا می­کند. جیانگ و همکارانش در مطالعه‏ای نشان دادند که عصاره­ی اتانولی از برگ گیاه مریم­گلی توانست تکثیر سلول­های سرطانی کبد HepG2 را به‏صورت وابسته به دوز و زمان مهار کند. از طرف‏دیگر این عصاره میزان زنده ماندن سلول­های نرمال کبد WRL-68 را در طی 24 ساعت به‏طور معنی­داری تغییر نداد؛ که نشان­دهندهی این است که سلول­های GpeH2 به اثرات سمیت سلولی بسیار حساس‏تر بودند (9). هم‏چنین گارسیا و همکاران (91) به‏ بررسی اثر سمیت سلولی عصاره هیدروالکلی مریم­گلی بر روی رده­های سلولی توموری و غیرتوموری پرداختند. نتایج حاصل نشان داد که عصاره هیدروالکلی مریم­گلی بر رده‏های سلولی سرطانی خاصیت انتخابی بودن را دارد. در مطالعات اخیر گوزل و همکارانش از عصاره الکلی مریم گلی در شرایط درون تنی و برون تنی استفاده کردند و نتایج آن‏ها تاکید کننده فعالیت آنتی اکسیدانتی قابل توجه مریم گلی بود (02). همچنین در مطالعه دیگر ژو و همکاران (12) سالویانولیک اسید را به‏عنوان مشتقی با فعالیت بالای آنتی اکسیدانتی  و کاهنده گونه­های فعال اکسیژن از گیاه مریم گلی جدا ساخته و به‏بررسی خواص آنتی اکسیدانتی آن در شرایط درون تنی پرداختند و نتایج آن‏ها تاکید کرد که این ترکیب دارای اثرات آنتی اکسیدانتی بالایی می‏باشد و در همین راستا برخی محققین گیاه مریم گلی را به‏عنوان گیاهی با خواص فروانی زیستی از جمله آنتی اکسیدانتی، ضدمیکروبی، ضدالتهاب و ضدسرطان معرفی کردند (11، 22). به‏علاوه در مطالعه‏ای فعالیت سمیت سلولی عصاره­ی متانولی گیاه مریم­گلی را بر رده­های سلولی سرطانی Raji، 739U و A1-GK و سلول­های غیرسرطانی CEVUH سنجیدند و نشان داده شده است که این عصاره می­تواند به‏طور قابل توجهی تکثیر سلول­های سرطانی را در محیط برون تنیسرکوب کند. این خواص ضدتکثیری عصاره­ی مریم­گلی به‏صورت وابسته به‏دوز و زمان و انتخابی بود. به‏گونه ای که در غلظت‌­های 008 میکروگرم بر میلی‏لیتر تاثیری بر تکثیر سلول­ها نداشت (32 و 42). در همین راستا ما نیز در این مطالعه به تاثیر عصاره مریم گلی بر سلول‏های غیرسرطانی CEVUH پرداختیم و 05CI به‏دست آمده برای سلول­های CEVUH در دوز 1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تعیین شد. دلیل این سمیت بیشتر احتمالا سرعت بالای تکثیر این سلول­ها نسبت به سلول‏های A549 است و احتمالا نقش سلولهای CEVUH در رگ‏زایی و تاثیر مهار عصاره مریم گلی در رگ‏زایی و مهار رشد سلول­های CEVUH باشد. اختلاف بین نتایج ما و آن­ها می­تواند با این واقعیت مرتبط باشد که ممکن است حساسیت سلول­های سرطانی با هم تفاوت داشته باشد و سمیت عصاره­های مریم گلی وابسته به عوامل مختلف از جمله موقعیت جغرافیایی گیاه، بخشی از گیاه مورد استفاده برای آماده‏سازی عصاره­ها و نوع استخراج است. بسیار جالب‏تر که حتی روش­های خشک کردن گیاهان مورد استفاده برای آماده‏سازی این عصاره­ها نیز موثر است. هم‏چنین ژانگ و همکاران (52) گزارش دادند که رزمارینیک اسید در عصاره­های آبی و هیدروالکلی مریم­گلی یافت می­شود. این ماده با کاهش 2-lcB و بیان سایکلین 1D از فسفریلاسیون 3TATS جلوگیری کرده و باعث القای آپوپتوزیس در سلول­های تومور 6TCSH و 2-ocaC می­شود. ترکیب دیگری که در هر دو عصاره­ی آبی و هیدروالکلی مریم­گلی یافت می­شود، کافئیک اسید است. مطالعات قبلی با استفاده از سلول 945A نشان دادند که کافئیک اسید می­تواند با افزایش xaB و کاهش 2-lcB  آپوپتوزیس را در این سلول­ها القا کند. یکی‏دیگر از ترکیبات مهم موجود در عصاره­ی گیاه مریم­گلی، اورسولیک اسید است. این ماده قادر بود تا آپوپتوزیس را در سلول­های سرطان رحم از طریق فعال‏سازی کاسپاز القا کند و منجر به کاهش گلیکوژن و سنتز پروتئین به‏وسیله­ی فسفریلاسیون گلیکوژن سینتاز کیناز 3β شد (62). این مولکول هم‏چنین از طریق افزایش سطح xaB ، کاهش 2-lcB  و آزادسازی سیتوکروم C به سیتوزول پتانسیل غشا میتوکندری را کاهش داد و مسیرهای آپوپتوز داخلی و خارجی را در رده­ی سلولی سرطان سینه­ی انسان فعال کرد (72).

به‏علاوه پژوهش­ها نشان می‏دهد که مرگ سلولی به فعالیت میتوکندری­ها وابسته است، که در این میان گونه‏های فعال اکسیژن میتوکندریایی به‏عنوان آغاز مسیر نقش بسیار مهمی را ایفا می­کند. مقاومت سلول­های سرطانی در برابر مرگ سلولی آپوپتوتیک اغلب ناشی از باز نشدن منافذ MPT (انتقال نفوذپذیری میتوکندری) و عدم کارآیی در مسیر داخلی میتوکندریایی سیگنالینگ آپوپتوز است. نکته حائز اهمیت، بالابودن گونه‏های فعال اکسیژن درون سلول­های سرطانی است که علی‏رغم این موضوع مهم به‏دلیل بسته بودن منافذ میتوکندری مسیر­های مرگ سلولی فعال نشده و سلول به بقای خود ادامه می­دهد. بنابراین چنانچه بتوان تولید و خروج گونه‏های فعال اکسیژن درون میتوکندریایی را افزایش داد، اختلاف پتانسیل غشا خارج میتوکندری­ها افزایش یافته و منافذ MPT باز می­شوند. در نتیجه سیگنالینگ­های مرگ سلولی نیز افزایش یافته و موجب از بین رفتن سلول­های سرطانی خواهد شد (28). استرس اکسایشی می­تواند تعدادی از آنزیم­های آنتی اکسیدانت را در سلول فعال یا مهار کند. در ادامه­ی کار فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز را که جزیی از سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی هستند و در سرکوب گونه­های فعال اکسیژن نقش بسیار مهمی را ایفا می­کنند، به‏عنوان بیومارکر­هایی از استرس اکسایشی بررسی شد. نتایج نشان داد که فعالیت آنزیم کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز در گروه­های سلولی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی مریم­گلی در رده­ی سلولی نسبت به گروه­های کنترل به‏طور قابل توجهی افزایش یافت، که این نتیجه احتمالا به خواص آنتی اکسیدانتی ترکیبات مریم­گلی مربوط می­شود. این نتیجه نیز در راستای نتایج MTT تاییدی بر اثر عصاره هیدروالکلی مریم­گلی بود. آنتی اکسیدانت­ها از بدن در مقابل استرس اکسیداتیو و آسیب­های ناشی از رادیکال آزاد محافظت می­کنند. بیماری­های مختلفی مانند دیابت، امراض قلبی، سرطان، اختلالات مغزی، ضعف سیستم ایمنی و غیره ناشی از استرس اکسیداتیو می­باشند. در مطالعات انجام شده روی فعالیت آنتی اکسیدانتی بسیاری از گیاهان مانند مریم­گلی مشاهده شد که ترکیب­های فنولی و فلاوونوئیدی موجود در آن­ها مسئول عمده­ی خواص آنتی اکسیدانتی و آثار مانده‏یابی رادیکال آزاد هستند ترکیب­های فنولی مانند کارنوسول، کارنوسیک اسید و رزمارینیک اسید، رزماریال، رزمانول، اپی رزمانول، متیل کارنوسات و لوتئولین فعالیت آنتی اکسیدانتی بالایی دارند و معمولا از عصاره­ی اتانولی مریم­گلی استخراج می­شوند (10). ترکیب­های فنولی می­توانند سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی آنزیمی را فعال نموده یا این‏که خود، گونه­های واکنش‏پذیر را مسیریابی کنند. در پژوهش­های پیشین نشان داده شد که خواص آنتی اکسیدانتی مریم­گلی به‏حضور رزمارینیک اسید و کارنوسیک اسید مرتبط می­باشد به‏علاوه سالویالونیک اسید (که یک دیمر رزمارینیک اسید ایزوله شده از عصاره­ی مریم­گلی است) فعالیت آنتی اکسیدانتی بالایی از خود نشان داده است (10). در یک تحقیق مشاهده شد که پس از نوشیدن چای مریم­گلی به‏مدت دو هفته وضعیت آنتی اکسیدانتی کبد بهبود یافت (11). در مطالعه‏ای که توسط کوزیکس و همکارانش در سال 2013 صورت گرفت نشان داده شد که عصاره هیدروالکلی مریم­گلی اثر مهاری بر رشد سلول­های سرطانی کبد HepG2 دارد. آن­ها هم‏چنین نشان دادند که در سلول­های تیمار شده با عصاره­ی مریم­گلی، فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز افزایش قابل توجهی داشت اما فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز روند رو به کاهش از خود نشان داد. آن­ها بیان داشتند که ممکن است بالا رفتن فعالیت یک آنزیم کافی ­باشد و یا این‏که سلول­ها به‏جای بالا بردن فعالیت آنزیمی، از ویژگی­های آنتی اکسیدانتی خود گیاه مریم‏گلی استفاده کرده‏اند (23). هم‏چنین هورواتووا و همکاران (29)، یافتند که عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی فعالیت آنتی اکسیدانتی قوی دارد و غنی‏سازی آب آشامیدنی موش­ها با آن باعث افزایش مقاومت هپاتوسیت­های موش در برابر استرس اکسیداتیو می‌شود. نعیمی و همکاران (12) بیان کردند رزمارینیک اسید که یکی از ترکیبات مریم­گلی است می‌تواند پیشرفت تومور در چندین اندام بدن شامل کولون، سینه، کبد، شکم و همچنین ملانوما و سلول­های سرطان خون را سرکوب کند. این ماده هم‏چنین می­تواند فعالیت آنزیم­های کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز را افزایش دهد. تحقیقات بسیاری حاکی از تاثیر محصولات گیاهی در مهار سلول­های سرطانی به‏واسطه­ی افزایش بیان یا فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی می­باشند. به‏عنوان مثال نوعی ایزوفلاوونوئید ضدسرطان، با افزایش بیان آنزیم­های آنتی اکسیدانتی در رده سلولی سرطان پروستات باعث مهار موثر این سلول­ها شد (30). در مطالعه­ی ما نیز فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در سلول­های سرطانی ریه A549 تیمار شده با مریم­گلی نسبت به گروه کنترل افزایش معنی‏داری داشت. از این رو می­توان گفت که عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی از طریق افزایش فعالیت این آنزیم­ها سبب مهار سلول­های A549 شدند. در مطالعه‏ای دیگر که اثر لوتئولین روی رده­ی سلولی سرطانی HepG2 انجام گرفت، مشخص نمود که لوتئولین قادر است در سلول­های سرطانی HepG2 آپوپتوزیس را القا کند (31). در نهایت می­توان چنان نتیجه گرفت که ترکیبات موثر موجود در عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی مسئول القا مرگ سلولی (احتمالا از نوع آپوپتوزیس) در سلول­های سرطانی ریه بودند. اگرچه بررسی های بیشتر به‏ویژه در زمینه سیگنالینگ­های سلولی و مولکولی پیشنهاد می‏شد.

نتیجه­گیری

نتایج نشان دادند که عصاره هیدروالکلی مریم­گلی قادر است مرگ سلولی را به‏صورت وابسته به‏دوز و زمان در سلول­های سرطان ریه A549 القا کند و غلظت مناسب IC50 عصاره مریم­گلی برای این سلول­ها  5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تعیین شد. به‏علاوه نتایج نشان داد که فعالیت آنزیم کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز در گروه­های سلولی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی مریم­گلی نسبت به گروه­های کنترل به‏طور قابل توجهی افزایش یافت، که این نتیجه احتمالا به‏خواص آنتی اکسیدانتی ترکیبات مریم­گلی مربوط می‏شود.

تشکر و قدردانی

هزینه این تحقیق از محل اعتبارات پژوهانه سال 98 معاونت پژوهشی دانشگاه شهیدچمران اهواز تامین شده است. نویسندگان مراتب قدردانی خود را از معاونت پژوهشی و فن­آوری دانشگاه شهید چمران اهواز برای حمایت­های مالی اعلام می­دارند.