فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، اهواز، ایران

2 دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده دامپزشکی، گروه بیوشیمی و بیولو‍‍‍‍ژی مولکولی، اهواز، ایران

چکیده

هدف: هدف از مطالعه‏ی حاضر بررسی اثرات سمی و اکسیداتیو عصاره هیدروالکلی مریم‏گلی بر سلول­های سرطانی رده A549 می‏باشد.  
مواد و روش‏ها: برای بررسی غلظت­های عصاره مریم­گلی، سلول­ها در ظروف مخصوص کشت و سنجش MTT برای تعیین IC50 و توان زیستی سلول در روزهای 1، 3، 5 و 7 انجام شد. هم‏چنین برای بررسی اثرات تیمار غلظت IC50 بر القای آپوپتوزیس، از سنجش آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز دخیل در مسیر استرس اکسیداتیو و رنگ‏آمیزی اکریدین اورنج استفاده شد. به‏علاوه، از رنگ‏آمیزی گیمسا و DAPI به‏منظور بررسی تغییرات مورفولوژیکی سلول و هسته استفاده شد.
نتایج: غلظت IC50 عصاره مریم­گلی برای سلول­های A549 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر به‏دست آمد. براساس نتایج، عصاره مریم‏گلی به‏صورت معنی­داری تاثیر سیتوتوکسیک بیش‏تری بر رده سلولی A549 در مقایسه با نمونه کنترل داشت. سلول­های A549 تحت تیمار با عصاره، در زمان­های مختلف تفاوت بارز و وابسته به دوزی را نشان دادند. نتایج حاصل از رنگ‏آمیزی­ها، تاییدی بر القای آپوپتوزیس در گروه­ تیمار بود. هم‏چنین نتایج بیان آنزیمی نشان داد که فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در گروه­ تیمار در مقایسه با گروه کنترل به‏طور معنی­داری افزایش یافت.
نتیجه‏گیری: براساس نتایج فوق، عصاره هیدروالکلی مریم‏گلی ضمن القا فعالیت آنتی اکسیدانتی، اثر آپوپتوتیک قابل ملاحظه‏ای به‏صورت وابسته به دوز و زمان بر سلول­های سرطانی ریه دارد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Induction of Apoptosis in Human Cancer A549 Cells Through Hydroalcoholic Extract of Salvia officinalis

نویسندگان [English]

  • E Hoveizi 1
  • F Pouratar 1
  • M Kesmati 1
  • A Shahriari 2

1 Department of biology, Faculty of Science, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran

2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Chamran University of Ahvaz, Iran

چکیده [English]

Aim: The purpose of the current study is to investigate the cytotoxic and oxidative effects of Salvia officinalis hydroalcoholic extract on cancer A549 cells.
Material and Methods: The cells were seeded in plates to investigate concentrations of Salvia officinalis extract and MTT measurement was done to determine IC50 concentration and cell viability on days 1, 3, 5, and 7. Moreover, analyses of superoxide dismutase and catalase enzymes involved in oxidative stress pathway, and AO/EB staining for a qualitative investigation of cell lines has been conducted in order to explore the effects of IC50 concentration on apoptosis induction. Also, Giemsa and DAPI stainings were utilized to explore the morphological changes of cell and nucleus..
Results: IC50 concentration of Salvia extract for A549 cells was determined 5 mg/mL. According to the results, Salvia extract reduced the cell viability of A549 cells. Based on the results, Salvia extract had a significantly greater cytotoxic effect compared to the control sample of A549 cell line. Treatment cells indicated some clear and dose-dependent differences at different times. The results of stainings proved the apoptosis induction in the treatment group. Furthermore, regarding the enzyme expression results the activity of superoxide dismutase and catalase enzymes in the cell groups treated by Salvia extract was significantly increased, compared to the control group.
Conclusion: Consistent with the results of this study, in addition to the anti-oxidative activity Salvia officinalis hydroalcoholic extract revealed significant apoptotic effects on lung cancer cells, considering a time and dose-dependent method.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lung Cancer
  • Salvia officinalis
  • Apoptosis
  • Oxidative Stress

مقدمه

سرطان یکی از عوامل اصلی مرگ در جوامع توسعه یافته و کمتر توسعه یافته است به‏طوری‏که انتظار می­رود با رشد و افزایش سن جمعیت در کشور­های کمتر توسعه یافته که تقریبا 82 درصد از جمعیت جهان را شامل می­شوند، مرگ ‏و میر ناشی از سرطان افزایش یابد (1).

سرطان ریه یکی از مرگ‏بارترین نوع این بیماری برای مردان و زنان است و بدون در نظر گرفتن جنسیت، از نظر شیوع انواع سرطان دومین رتبه و هم‏چنین از نظر میزان کشندگی اولین رتبه در جهان را داراست (2). سرطان ریه براساس اندازه و بروز سلول­های بدخیم به‏ دو گروه اصلی طبقه‏بندی می‏شود که شامل سرطان ریه با سلول­های کوچک (SCLC) که 15 درصد از موارد سرطانی را شامل می­شود و سرطان ریه با سلول­های غیرکوچک (NSCLC) که 85 درصد موارد باقیمانده را در بر میگیرد و خود به سه زیرگروه پاتولوژیکی عمده تقسیم می­شود که شامل: 1- سلول­های کارسینومای سنگ‏فرشی 2-  سلولهای آدنوکارسینوما و  3- کارسینومای ریه با سلول­های بزرگ می‏باشند. درمان سرطان ریه بستگی به نوع سلول سرطانی، وضعیت بیمار و مقدار پیشرفت آن دارد. طی دهه­های اخیر معمولا از روش­های شیمی درمانی، پرتو درمانی و جراحی برای بهبودی بیماران استفاده شده است. جراحی زمانی موثر است که تومور به‏طور کامل قابل برداشت باشد و بیمار تحمل عمل جراحی را داشته باشد. بنابراین ابداع راهکارهای درمانی جدید و بدون عوارض جانبی، ضروری به‏نظر می­رسد (3، 4). یکی از روش­های موثر در کنترل سرطان، القا آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی می‏باشد. آپوپتوزیس یک فرآیند کلیدی در بیماری سرطان است و توانایی فرار سلول­های سرطانی از آپوپتوزیس و ادامه­ی تکثیر یکی از ویژگی­های اولیه­ی سلول­های سرطانی محسوب می­شود و بنابراین توانایی القای آپوپتوزیس در این سلول­ها یک هدف اصلی و مهم در درمان سرطان می‌باشد (5). فرآیند آپوپتوزیس یا مرگ برنامه‏ریزی شده­ی سلول به‏عنوان روشی حفاظت شده و تحت کنترل ژن­هاست که به‏منظور حذف سلول­های ناخواسته در موجودات زنده به‏کار می‌رود. این فرآیند در تنظیم میزان رشد، تکثیر سلول­ها، تکوین و سلامت بدن بسیار مهم است (6). هم‏چنین با وجود این‏که عوامل متعددی در ایجاد و پیشرفت سرطان دخیل می­باشند، اخیرا نقش استرس اکسیداتیو در بیماری­زایی انواع سرطان­ها مورد توجه قرار گرفته است. شواهد متعددی حاکی از آن است که سلول‏های سرطانی در مقایسه با سلول­های نرمال، گونه‏های فعال اکسیژن بیشتری تولید می­کنند و در معرض استرس اکسیداتیو قرار دارند. در سلول­های سرطانی سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی سرکوب می­شود و یا مقادیر زیادی گونه‏های فعال اکسیژن تولید می­شود. شواهد بسیار زیادی نشان داده‏اند که تعادل اکسیداسیون احیا در سلول­های سرطانی در مقایسه با سلول­های طبیعی مختل می­شود. تغییر در سطوح آنزیم­های آنتی اکسیدانت (سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز) و آنتی اکسیدانت‏های غیرآنزیمی (گلوتاتیون، ویتامین C و تیوردوکسین) و هم‏چنین تغییراتی در مسیرهای پیام‏رسانی مرتبط، مشهود است (7).

از سوی دیگر داروهای گیاهی به‏علت وجود عوارض جانبی کمتر نسبت به داروهای شیمیایی، اهمیت بیش‏تری در پیشگیری انواع سرطان دارند (8). بدین منظور مطالعات گسترده‏ای بر روی گیاهان مختلف صورت گرفته و اثرات سمیت سلولی و ضدسرطانی آن‏ها مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفته است. در این خصوص، سنجش میزان بقا و تکثیر سلولی در تعیین میزان اثر داروهای ضدسرطانی بر روی سلول­ها امری مهم به‏نظر می­رسد؛ که در این خصوص روش­های متعددی استاندارد شده است. گیاه مریم­گلی با نام علمی‌Salvia officinalis  گیاهی است گلدار، نهاندانه، دو لپه‏ای پیوسته گلبرگ، بوته‏ای با ریشه­های چوبی و پایا به ارتفاع 30 الی 60 سانتی‏متر، برگ­هایی ساده و از تیره­ی نعناع، بومی‌ مناطق خاورمیانه و مدیترانه است که امروزه در سراسر جهان رایج شده است (9). این گیاه به‏دلیل خواص و طعم منحصر به‏فرد آن در بسیاری از غذاها و به‏عنوان دم‏نوش مورد استفاده قرار می‌گیرد. در طب سنتی آسیا و آمریکای لاتین از مریم­گلی برای درمان انواع اختلالاتی مانند تشنج، زخم، التهاب و اسهال و در اروپا نیز برای درمان اختلالات شناختی مرتبط با سن استفاده می‌کنند. مریم­گلی آلزایمر را بهبود می­بخشد و قند خون را کاهش می­دهد. در سال­های اخیر مطالعات بسیاری در خصوص پیدا کردن اثرات زیستی جدید برای مریم­گلی انجام شده است، که این مطالعات طیف گسترده‏ای از فعالیت­های دارویی شامل اثرات آنتی اکسیدانتی، ضدالتهابی، ضدسرطانی و ضددردی را نشان می‌دهد و اجزای شیمیایی موجود در عصاره­های آبی و هیدروالکلی این گیاه مانند سینئول، پنین، فلاونوئید­ها به‏خصوص رزمارینیک اسید، ساپونین‏ها، ویتامین­های E و C و غیره را مسئول این اثرات زیستی می‌دانند (10، 11).

شواهدی وجود دارد که نشان می‏دهد رزمارینیک اسید، یکی از ترکیبات مریم­گلی می‌تواند پیشرفت تومور در چندین اندام بدن شامل کولون، سینه، کبد، شکم و هم‏چنین ملانوما و سلول­های سرطان خون را سرکوب کند. این ماده هم‏چنین می­تواند فعالیت آنزیم­های کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز را افزایش دهد (12). با توجه به اهمیت سرطان ریه و خاصیت آنتی اکسیدانتی مریم گلی، اطلاعات چندانی در خصوص اثر این داروی گیاهی در آزمایشات درون و برون تنی سلول‏های سرطانی ریه مشاهده نشد. هم‏چنین در سال 2020 ونگ و همکاران اعلام داشتند که درمان ترکیبی دارویی به‏نام پالکی­تاکسل با کربوپلاتین در درمان نوعی سرطان ریه پیشرفته موفق­آمیز بوده و برای درمان کلینیک پیشنهاد شد.  پالکی­تاکسل از جمله دارویی از دسته آلکالوئیدهای گیاهی بوده که عموما از گیاه سرخدار مشتق می شود و به‏عنوان یکی از مهمترین ترکیبات طبیعی ضدسرطان در سرارسر دنیا برای درمان از جمله سرطان پوست، مری و ریه به‏طور موثر استفاده می‏شود (13). به‏علاوه نشان داده شده که داروهایی با منشا گیاهی مانند وین بلاستین و اتوپوساید همراه با ترکیبات سیکلوپلاتین نقش چشم‏گیری در درمان سرطان ریه با منشا سلول­های کوچک دارد. اتوپوساید جز داروهای ضروری سازمان بهداشت است که از جمله موثرترین و بی‏خطرترین داروها در ارتباط با سلامت هستند (14). وین بلاستین یک ترکیبآلکالوئیدبا خاصیت ضدنئوپلاسم است که در درمان انواع خاصی از سرطان از جمله سرطان ریه به‏کار می‏رود (15، 16).

لذا هدف از پژوهش حاضر بررسی اثرات عصاره­ی هیدروالکلی گیاه مریم­گلی در دوز­های مختلف در القای آپوپتوزیس و هم‏چنین میزان القای آنزیم­های موثر بر استرس اکسیداتیو در سلول­های سرطانی ریه رده A549 می‏باشد.

 

مواد و روش‌ها

 کشت سلول­های رده A549:سلول­های A549 از موسسه پاستور تهران به‏صورت سلول کشت شده در فلاسک خریداری شد. پس از این‏که تراکم سلول­ها در محیط کشتGibco, USA) ) DMEM محتوی 10 درصد سرم جنین گاوی FBS, Gibco, USA) ) به‏حدود 70 تا 80 درصد رسید به‏منظور مضاعف‏سازی سلول­ها پاساژ سلولی به‏این‏ترتیب انجام گرفت که محیط رویی فلاسک خارج و سطح رویی سلول­ها با 2 میلیلیترSigma, USA) ) PBS شسته شد آنگاه به‏هر فلاسک T25 حدود 2 میلی‏لیتر تریپسین Gibco, USA) ) اضافه و 1 الی 2 دقیقه در انکوباتور قرار داده شد. در ادامه 5/2 میلی‏لیتر محیط کشت به فلاسک اضافه و محتویات فلاسک به فالکون 15 میلیلیترمنتقل و با دور rpm 1500 به‏مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد.  

طرز تهیه عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی: پودر عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی (سها جیسا، ایران) را به‏میزان 500 میلی‏گرم وزن کرده و با 5 میلی‏لیتر محیط کشت DMEM (modification of Basal Medium Eagle) فاقد سرم ترکیب و به‏شدت تکان داده شد تا پودر کاملا در محیط کشت حل شود. سپس زیر هود لامینار با فیلتر سر سرنگی با قطر منافذ 22/0 میکرون در فالکون 15 سی‏سی فیلتر شد و در دمای 20- درجه سانتی‏گراد به‏عنوان استوک اصلی با غلظت 100 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر نگهداری شد.

ساخت محلول MTT: برای ساخت محلول MTT، 25 میلی‏گرم از پودر MTT ((Sigma, USA در 5 میلیلیترسالین بافرفسفات حل و با فیلتر سرسرنگی با قطر 22/0 میکرون فیلتر شد و در دمای 20- درجه سانتی‏گراد به‏عنوان استوک اصلی نگه‏داری شد.

انجام تست MTT: بدین منظور سلول­های مورد نظر در تراکم 104 × 1 سلول در هر چاهک، در ظرف کشت 96 خانه کشت داده شدند. پس از 24 ساعت، محیط رویی هر چاهک با غلظت‌­های عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی 10، 8، 6، 4، 3 و 1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تعویض که همراه با محیط کشت DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی به چاهک­ها اضافه شد. برای نمونه کنترل سلول­ها در محیط کشت و بدون تیمار با مریم گلی درنظر گرفته شد. پس از 24 ساعت تیمار محیط رویی خارج و هر چاهک با 100 میکرولیتر PBS شست‏وشو داده شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول MTT (9 قسمت محیط کشت و 1 قسمت محلول MTT) به‏هر چاهک اضافه شد و پلیت به‏مدت 3 الی 4 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. سپس محتویات هر چاهک با احتیاط دور ریخته شد و 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید (DMSO) به‏منظور حل کردن کریستال­های فورمازان به‏هر چاهک اضافه شد. محتویات هر چاهک به‏آرامی با سمپلر پیپتاژ شد و به‏مدت 15 دقیقه در دمای انکوباتور نگه‏داری شد. در ادامه جذب نوری هر چاهک در طول موج 570 نانومتر با دستگاه الایزا (FAX STAT 2100, USA) خوانده شد. این تست در روزهای 1، 3، 5، و 7 انجام شد.

رنگ آمیزی سلول­ها با روش گیمسا: به‏منظور رنگ‏آمیزی گیمسا پس از 24 ساعت تیمار سلولی با غلظت IC50 از عصاره­ی هیدروالکلی انجام شد. سلول­ها پس از شست‏وشو با PBS به‏وسیله­ی اضافه کردن 100 میکرولیتر متانول (مخلوطی از استیک اسید و متانول با نسبت 1 به 3) به‏مدت 5 دقیقه تثبیت شدند. آن‏گاه میزان 100 میکرولیتر رنگ گیمسا با غلظت 4 درصد به سلول­ها اضافه و پس از گذشت 20 دقیقه شست‏وشو با PBS انجام شد. سلول­ها با استفاده از میکروسکوپ معکوس (Biored, USA) مشاهده و عکس‏برداری شدند.

رنگ‏آمیزی سلول­ها با اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید: ابتدا سلول­ها در ظروف کشت 96 خانه کشت و تیمار شدند. بعد از گذشت 24 ساعت از تیمار به نمونه­ها محلول اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر اضافه شد. پس از گذشت 5 دقیقه به‏وسیله­ی میکروسکوپ فلوئورسانس (Olympus, Japan) مشاهده و عکس‏برداری صورت گرفت.

رنگ آمیزی DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride): به‏منظور رنگ‏آمیزی دپی (Sigma, USA) سلول­ها در ظروف مخصوص 96 خانه کشت و تیمار شدند. پس از گذشت 24 ساعت از تیمار سلول­ها با پارا فرمالدهید 4 درصد به‏مدت 15 دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند و پس از شست‏وشو به‏مدت 1 الی 5 دقیقه در دمای اتاق تحت اثر رنگ دپی قرار داده شدند در نهایت پس از شست‏وشو با میکروسکوپ فلوئورسانس بررسی شدند.

سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی: برای بررسی اثر عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در رده­ی سلولی A549 ابتدا سلول­ها در فلاسک­های سلولی به‏تعداد 105×9 سلول کشت داده شد و با غلظت IC50 مریم گلی به‏مدت 24 ساعت تیمار شدند. سپس با استفاده از تریپسین EDTA جدا و  500 میکرولیتر بافر لیز کننده سرد به رسوب سلول­ها اضافه و به‏مدت 30 دقیقه روی یخ نگه‏داری شد. بعد از گذشت این زمان نمونه­ها 15 دقیقه با دور rpm 10000 در دمای 4 درجه­ی سانتی‏گراد سانتریفیوژ شدند. در آخر محلول رویی حاصل جهت اندازه­گیری میزان پروتئین و سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز به‏روش دستی با استفاده از روش کونو و  میزان فعالیت کاتالاز  نیز به‏روش کورولیوک و همکاران انجام شد (16).

 

تحلیل آماری

آنالیز آماری با استفاده از نرم‌افزار آماری Graph Pad Prism، آزمون one-way ANOVA و T-test انجام شد. رسم نمودار در ‌Excel 2016 انجام گرفت. 05/0 p<برای سطح اختلاف معنی‌دار بین گروه‏ها در نظر گرفته شد و هر آزمایش حداقل سه بار تکرار شد.

 

نتایج

بررسی مورفولوژی سلولی در رده­ی سلولی A549

یکی از روش­های بررسی اثرات سمیت بر روی سلول­ها، مشاهده مورفولوژی سلولی می­باشد. بدین منظور بعد از کشت رده سلولی A549 در پلیت 96 خانه و تیمار با غلظت IC50 از عصاره هیدروالکلی مریم­گلی پس از 24 ساعت نمونه­های تیمار و کنترل با میکروسکوپ معکوس مشاهده و عکس‏برداری شدند. در مورفولوژی سلولی گروه­های تیمار در مقایسه با گروه کنترل تغییراتی مشاهده شد که شامل کروی شدن سلول، چروکیده شدن، جمع شدن سلولی و دانه دار شدن سلول­ها بود (شکل1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل1: مورفولوژی رده سلولی  A549(20×): در تصویر "الف"، مورفولوژی طبیعی سلول­های A549 بدون تیمار قابل مشاهده می­باشد. در تصویر "ب"، تغییرات مورفولوژیکی سلول­ها پس از تیمار با غلظت  mg/mL5 عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی نشان داده شده است. کاهش حجم سلول، گرانوله شدن سلول­ها و همچنین چروکیده شدن غشا سلول­ها در نمونه تیمار قابل مشاهده می­باشد که به‏واسطه فلش در تصویر مشخص شده‏اند.

 

اثر عصاره هیدروالکلی مریم­گلی روی بقای رده سلولی سرطان A549

آزمایش MTT جهت بررسی اثر عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر زیست‏پذیری سلول­های A549 در زمان 24 ساعت و با غلظت‌‏های (10، 8، 6، 4، 3 و 1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) انجام شد. نتایج آماری نشان داد که زیست‏پذیری سلول­های A549  بعد از مواجهه با دوز­های مختلف عصاره­ی مریم­گلی به‏طور معنی­داری نسبت به نمونه­ی کنترل کاهش یافت به‏طوری‏که بقای سلولی به‏ترتیب به‏میزان (74/26، 53/28، 65/43، 36/66، 16/72 و 67/76 درصد) رسید (شکل2). زیست‏پذیری سلول­های A549 در تمامی دوز­ها دارای اختلاف معنی­داری نسبت به گروه کنترل بود و IC50 به‏دست آمده برای سلول­های A549 در دوز 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تعیین شد.

 

 

شکل 2: نمودار اثر غلظت‌­های مختلف عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر زیست‏پذیری سلول­های A549 در زمان 24 ساعت.

نتایج با استفاده از آزمون­های ANOVA و Tukey به‏صورت MEAN±SEM بیان شد) 001/0 (p<

*** نشان­دهنده تفاوت معنی­دار درصد بقای گروه­های تیمار با کنترل در سطح (001/0 > (pاست.

IC50 به‏دست آمده برای سلول­های A549 در دوز 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر در نظر گرفته شد (3=n).

 

رنگ آمیزی سلول­های A549 با رنگ گیمسا

پس از گذشت 24 ساعت از تیمار سلولی، سلول­ها با رنگ گیمسا رنگ‏آمیزی شده و به‏وسیله­ی میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرار گرفتند. مورفولوژی سلول­ها پس از این مدت در نمونه­ی شاهد کاملا طبیعی بود به‏طوری‏که، سلول­ها کاملا کشیده با غشای سالم و برخی در حال تقسیم دیده شدند. اما سلول­های تحت تیمار تغییرات مورفولوژیکی شامل چروکیدگی سیتوپلاسم سلولی، کاهش حجم سلولی، گرانوله شدن سلول­ها، از دست دادن چسبندگی سلولی و جدا شدن تعدادی از سلول­ها از کف چاهک و شناور بودن در محیط سلولی، تراکم کروماتین درون هسته و تولید اجسام آپوپتوزیسی را از خود نشان دادند (شکل 3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: رنگ‏آمیزی با رنگ گیمسا در رده سلولی A549 (20×): درتصویر "الف" مورفولوژی طبیعی سلول­های A549 بدون هیچ تیمار ویژه‏ای، به‏وسیله­ی رنگ‏آمیزی گیمسا قابل مشاهده می­باشد. در تصویر "ب"، تغییرات مورفولوژیکی سلول­ها پس از تیمار با غلظت IC50، 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر عصاره هیدروالکلی مریم­گلی نشان داده شده است. در نمونه تیمار چروکیدگی سیتوپلاسم سلولی، کاهش حجم سلولی، گرانوله شدن سلول­ها، تراکم کروماتین درون هسته قابل مشاهده می­باشد که با فلش در شکل مشخص شده‏اند.

 

 

رنگ آمیزی رده­ی سلولی A549 با روش اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید

الف

ب

200 µm

200 µm

به‏منظور تعیین نوع مرگ سلولی القا شده توسط عصاره هیدروالکلی مریم­گلی در رده سلولی A549 از روش رنگ‏آمیزی اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید استفاده شد. اکریدین اورنج یک رنگ حیاتی است و توسط سلول­های زنده جذب می­شود. اکریدین اورنج وارد DNA سلول زنده می­شود و در زیر میکروسکوپ یک نمای سبز رنگ به کروماتین سلول زنده می­دهد. اما اتیدیوم بروماید فقط سلول­های آسیب دیده و آپوپتوزی را رنگ می­کند. اتیدیوم بروماید وارد DNA سلول آسیب‏دیده شده و در زیر میکروسوپ فلوئورسانس، رنگ نارنجی به کروماتین سلول مرده می­دهد. در گروه­های تحت تیمار با عصاره هیدروالکلی مریم­گلی و تعداد سلول­ها با کروماتین رنگ نارنجی افزایش چشم‏گیری در مقایسه با کنترل داشتند (شکل 4).

شکل 4: رنگ‏آمیزی اکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید رده سلولی A549

 

 (40×): در تصویر" الف"، که نشان­دهنده­ی گروه کنترل است، بیشتر سلول­ها سبز رنگ می­باشند و در حالت نرمال قرار دارند. در تصویر "ب"، سلول­ها پس از تیمار با غلظت IC50، 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر عصاره هیدروالکلی مریم­گلی نشان داده شده‏اند. در نمونه تیمار تعداد کمی از سلول­ها زنده با کروماتین سبز رنگ و بیشتر آن­ها سلول­های آپوپتوزی با کروماتین نارنجی رنگ با تراکم بالا و قطعه قطعه شده قابل مشاهده می‏باشد.

 

 

 

 

 

رنگ‏آمیزی سلول­های A549 با رنگ دپی

به‏منظور بررسی تغییرات هسته در سلول­های A549 حاصل از تیمار با عصاره هیدروالکلی مریم­گلی این سلول­ها با رنگ دپی رنگ‏آمیزی شدند. 4′,6-diamidino-2-phenylindole یک رنگ فلوئورسنت است که برای مشاهده هسته سلول به‏کار می­رود و می­تواند اتصال قوی و محکمی با ناحیه بازهای A-T در دو رشته DNA برقرار کند. در گروه­های سلولی تیمار عصاره مریم­گلی تغییراتی مانند چروک خوردن هسته­ی سلولی، کروماتین فشرده و یا قطعه قطعه دیده شد. این تغییرات از خصوصیات سلول­های آپوپتوزیسی می­باشد و نشان­دهنده­ی آغاز روند مرگ سلول­ها در گروه­های تیمار بود. در حالی‏که در گروه کنترل، هسته سلولی کاملا گرد و سالم دیده می­شد (شکل 5).

 

شکل5: رنگ‏آمیزی دپی رده سلولی A549 (40×): درتصویر "الف" مورفولوژی طبیعی هسته سلول­های A549 بدون هیچ تیمار ویژه‏ای، به‏وسیله­ی رنگ‏آمیزی دپی قابل مشاهده می­باشد. در تصویر "ب"، تغییرات مورفولوژیکی هسته سلول­ها پس از تیمار با غلظت IC50، 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر عصاره هیدروالکلی مریم­گلی و رنگ‏آمیزی دپی، نشان داده شده است. در نمونه تیمار چروک خوردن هسته­ی سلولی و کروماتین فشرده و قطعه قطعه قابل مشاهده می­باشد.

 

سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در رده سلولی A549

با محاسبه­ی میزان آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در گروه کنترل و گروه­ تحت تیمار با عصاره هیدروالکلی مریم­گلی با غلظت IC50 و آنالیز آماری پس از آن، نمودار آن رسم شد (شکل6). نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و همچنین آنزیم کاتالاز در گروه تیمار با عصاره مریم­گلی در مقایسه با گروه کنترل به‏صورت معنی­داری افزایش نشان داد (001/0>p).

 

الف

ب

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


نمودار6: مقایسه فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز ( SOD) و کاتالاز (CAT) در گروه­های کنترل و تیمار با مریم گلی در سلول­های A549

نتایج با استفاده از آزمون­های ANOVA و t-test به‏صورت MEAN±SEM بیان شد (n=3).

*** نشان­دهنده تفاوت معنی­دار میزان فعالیت آنزیم گروه­ تیمار با کنترل در سطح (001/0 > (pاست.

* نشان­دهنده تفاوت معنی­دار میزان فعالیت آنزیم گروه­های تیمار با کنترل در سطح (05/0 > (pاست.

 

بحث

در این مطالعه اثرات سمیت سلولی عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر رده­ی سلولی سرطان آدنوکارسینوما ریه مورد بررسی قرار گرفت. زیستایی و تکثیر سلول­ها توسط روش MTT بررسی شد. در این روش ابتدا رده­­ی سلولی سرطانی در مواجهه با غلظت‌­های مختلفی از عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی قرار گرفت. تیمار مریم گلی دارای اثرات سیتوتوکسیک بر رده سلول سرطانی A549 به‏صورت وابسته به‏دوز بود، به‏گونه ای که در غلظت‌­های پایین تیمار رشد سلول­ها نسبت به گروه کنترل، تغییر کمتری یافته بود اما در غلظت‌­های بالاتر به‏طور معنی­داری باعث مهار رشد این سلول­ها نسبت به گروه کنترل شد. با توجه به نتایج، غلظت موثر بر مهار 50 درصد رشد سلول­ها IC50، برای عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر رده­ی سرطانی A549 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر به‏دست آمد. از سوی‏دیگر، غلظت IC50 در نمونه تیمار در روزهای 1، 3، 5 و 7، رشد رده­ی سلولی را به‏طور معنی­داری با گذشت زمان کاهش داد، که نشان‏گر وابسته به زمان بودن اثر سمیت عصاره بر روی سلول­های سرطانی بود. به‏علاوه نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و همچنین آنزیم کاتالاز در گروه تیمار با عصاره مریم­گلی در مقایسه با گروه کنترل به‏صورت معنی­داری افزایش داشت.

هم‏راستا با پژوهش ما پژوهش­های قبلی نیز حاکی از آن می­باشد که عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی بر برخی سلول­های سرطانی طی شرایط وابسته به زمان و غلظت اثر سمیت سلولی دارند  برای نمونه چرنوا و همکاران (17، 18) ، در تحقیقات خود نشان دادند که کامفور (یکی از ترکیبات موجود در عصاره­ی مریم­گلی)، سمیت را در سلول­های کارسینومای سنگفرشی انسان HSC-2 القا می­کند. جیانگ و همکارانش در مطالعه‏ای نشان دادند که عصاره­ی اتانولی از برگ گیاه مریم­گلی توانست تکثیر سلول­های سرطانی کبد HepG2 را به‏صورت وابسته به دوز و زمان مهار کند. از طرف‏دیگر این عصاره میزان زنده ماندن سلول­های نرمال کبد WRL-68 را در طی 24 ساعت به‏طور معنی­داری تغییر نداد؛ که نشان­دهندهی این است که سلول­های GpeH2 به اثرات سمیت سلولی بسیار حساس‏تر بودند (9). هم‏چنین گارسیا و همکاران (91) به‏ بررسی اثر سمیت سلولی عصاره هیدروالکلی مریم­گلی بر روی رده­های سلولی توموری و غیرتوموری پرداختند. نتایج حاصل نشان داد که عصاره هیدروالکلی مریم­گلی بر رده‏های سلولی سرطانی خاصیت انتخابی بودن را دارد. در مطالعات اخیر گوزل و همکارانش از عصاره الکلی مریم گلی در شرایط درون تنی و برون تنی استفاده کردند و نتایج آن‏ها تاکید کننده فعالیت آنتی اکسیدانتی قابل توجه مریم گلی بود (02). همچنین در مطالعه دیگر ژو و همکاران (12) سالویانولیک اسید را به‏عنوان مشتقی با فعالیت بالای آنتی اکسیدانتی  و کاهنده گونه­های فعال اکسیژن از گیاه مریم گلی جدا ساخته و به‏بررسی خواص آنتی اکسیدانتی آن در شرایط درون تنی پرداختند و نتایج آن‏ها تاکید کرد که این ترکیب دارای اثرات آنتی اکسیدانتی بالایی می‏باشد و در همین راستا برخی محققین گیاه مریم گلی را به‏عنوان گیاهی با خواص فروانی زیستی از جمله آنتی اکسیدانتی، ضدمیکروبی، ضدالتهاب و ضدسرطان معرفی کردند (11، 22). به‏علاوه در مطالعه‏ای فعالیت سمیت سلولی عصاره­ی متانولی گیاه مریم­گلی را بر رده­های سلولی سرطانی Raji، 739U و A1-GK و سلول­های غیرسرطانی CEVUH سنجیدند و نشان داده شده است که این عصاره می­تواند به‏طور قابل توجهی تکثیر سلول­های سرطانی را در محیط برون تنیسرکوب کند. این خواص ضدتکثیری عصاره­ی مریم­گلی به‏صورت وابسته به‏دوز و زمان و انتخابی بود. به‏گونه ای که در غلظت‌­های 008 میکروگرم بر میلی‏لیتر تاثیری بر تکثیر سلول­ها نداشت (32 و 42). در همین راستا ما نیز در این مطالعه به تاثیر عصاره مریم گلی بر سلول‏های غیرسرطانی CEVUH پرداختیم و 05CI به‏دست آمده برای سلول­های CEVUH در دوز 1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تعیین شد. دلیل این سمیت بیشتر احتمالا سرعت بالای تکثیر این سلول­ها نسبت به سلول‏های A549 است و احتمالا نقش سلولهای CEVUH در رگ‏زایی و تاثیر مهار عصاره مریم گلی در رگ‏زایی و مهار رشد سلول­های CEVUH باشد. اختلاف بین نتایج ما و آن­ها می­تواند با این واقعیت مرتبط باشد که ممکن است حساسیت سلول­های سرطانی با هم تفاوت داشته باشد و سمیت عصاره­های مریم گلی وابسته به عوامل مختلف از جمله موقعیت جغرافیایی گیاه، بخشی از گیاه مورد استفاده برای آماده‏سازی عصاره­ها و نوع استخراج است. بسیار جالب‏تر که حتی روش­های خشک کردن گیاهان مورد استفاده برای آماده‏سازی این عصاره­ها نیز موثر است. هم‏چنین ژانگ و همکاران (52) گزارش دادند که رزمارینیک اسید در عصاره­های آبی و هیدروالکلی مریم­گلی یافت می­شود. این ماده با کاهش 2-lcB و بیان سایکلین 1D از فسفریلاسیون 3TATS جلوگیری کرده و باعث القای آپوپتوزیس در سلول­های تومور 6TCSH و 2-ocaC می­شود. ترکیب دیگری که در هر دو عصاره­ی آبی و هیدروالکلی مریم­گلی یافت می­شود، کافئیک اسید است. مطالعات قبلی با استفاده از سلول 945A نشان دادند که کافئیک اسید می­تواند با افزایش xaB و کاهش 2-lcB  آپوپتوزیس را در این سلول­ها القا کند. یکی‏دیگر از ترکیبات مهم موجود در عصاره­ی گیاه مریم­گلی، اورسولیک اسید است. این ماده قادر بود تا آپوپتوزیس را در سلول­های سرطان رحم از طریق فعال‏سازی کاسپاز القا کند و منجر به کاهش گلیکوژن و سنتز پروتئین به‏وسیله­ی فسفریلاسیون گلیکوژن سینتاز کیناز 3β شد (62). این مولکول هم‏چنین از طریق افزایش سطح xaB ، کاهش 2-lcB  و آزادسازی سیتوکروم C به سیتوزول پتانسیل غشا میتوکندری را کاهش داد و مسیرهای آپوپتوز داخلی و خارجی را در رده­ی سلولی سرطان سینه­ی انسان فعال کرد (72).

به‏علاوه پژوهش­ها نشان می‏دهد که مرگ سلولی به فعالیت میتوکندری­ها وابسته است، که در این میان گونه‏های فعال اکسیژن میتوکندریایی به‏عنوان آغاز مسیر نقش بسیار مهمی را ایفا می­کند. مقاومت سلول­های سرطانی در برابر مرگ سلولی آپوپتوتیک اغلب ناشی از باز نشدن منافذ MPT (انتقال نفوذپذیری میتوکندری) و عدم کارآیی در مسیر داخلی میتوکندریایی سیگنالینگ آپوپتوز است. نکته حائز اهمیت، بالابودن گونه‏های فعال اکسیژن درون سلول­های سرطانی است که علی‏رغم این موضوع مهم به‏دلیل بسته بودن منافذ میتوکندری مسیر­های مرگ سلولی فعال نشده و سلول به بقای خود ادامه می­دهد. بنابراین چنانچه بتوان تولید و خروج گونه‏های فعال اکسیژن درون میتوکندریایی را افزایش داد، اختلاف پتانسیل غشا خارج میتوکندری­ها افزایش یافته و منافذ MPT باز می­شوند. در نتیجه سیگنالینگ­های مرگ سلولی نیز افزایش یافته و موجب از بین رفتن سلول­های سرطانی خواهد شد (28). استرس اکسایشی می­تواند تعدادی از آنزیم­های آنتی اکسیدانت را در سلول فعال یا مهار کند. در ادامه­ی کار فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز را که جزیی از سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی هستند و در سرکوب گونه­های فعال اکسیژن نقش بسیار مهمی را ایفا می­کنند، به‏عنوان بیومارکر­هایی از استرس اکسایشی بررسی شد. نتایج نشان داد که فعالیت آنزیم کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز در گروه­های سلولی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی مریم­گلی در رده­ی سلولی نسبت به گروه­های کنترل به‏طور قابل توجهی افزایش یافت، که این نتیجه احتمالا به خواص آنتی اکسیدانتی ترکیبات مریم­گلی مربوط می­شود. این نتیجه نیز در راستای نتایج MTT تاییدی بر اثر عصاره هیدروالکلی مریم­گلی بود. آنتی اکسیدانت­ها از بدن در مقابل استرس اکسیداتیو و آسیب­های ناشی از رادیکال آزاد محافظت می­کنند. بیماری­های مختلفی مانند دیابت، امراض قلبی، سرطان، اختلالات مغزی، ضعف سیستم ایمنی و غیره ناشی از استرس اکسیداتیو می­باشند. در مطالعات انجام شده روی فعالیت آنتی اکسیدانتی بسیاری از گیاهان مانند مریم­گلی مشاهده شد که ترکیب­های فنولی و فلاوونوئیدی موجود در آن­ها مسئول عمده­ی خواص آنتی اکسیدانتی و آثار مانده‏یابی رادیکال آزاد هستند ترکیب­های فنولی مانند کارنوسول، کارنوسیک اسید و رزمارینیک اسید، رزماریال، رزمانول، اپی رزمانول، متیل کارنوسات و لوتئولین فعالیت آنتی اکسیدانتی بالایی دارند و معمولا از عصاره­ی اتانولی مریم­گلی استخراج می­شوند (10). ترکیب­های فنولی می­توانند سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی آنزیمی را فعال نموده یا این‏که خود، گونه­های واکنش‏پذیر را مسیریابی کنند. در پژوهش­های پیشین نشان داده شد که خواص آنتی اکسیدانتی مریم­گلی به‏حضور رزمارینیک اسید و کارنوسیک اسید مرتبط می­باشد به‏علاوه سالویالونیک اسید (که یک دیمر رزمارینیک اسید ایزوله شده از عصاره­ی مریم­گلی است) فعالیت آنتی اکسیدانتی بالایی از خود نشان داده است (10). در یک تحقیق مشاهده شد که پس از نوشیدن چای مریم­گلی به‏مدت دو هفته وضعیت آنتی اکسیدانتی کبد بهبود یافت (11). در مطالعه‏ای که توسط کوزیکس و همکارانش در سال 2013 صورت گرفت نشان داده شد که عصاره هیدروالکلی مریم­گلی اثر مهاری بر رشد سلول­های سرطانی کبد HepG2 دارد. آن­ها هم‏چنین نشان دادند که در سلول­های تیمار شده با عصاره­ی مریم­گلی، فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز افزایش قابل توجهی داشت اما فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز روند رو به کاهش از خود نشان داد. آن­ها بیان داشتند که ممکن است بالا رفتن فعالیت یک آنزیم کافی ­باشد و یا این‏که سلول­ها به‏جای بالا بردن فعالیت آنزیمی، از ویژگی­های آنتی اکسیدانتی خود گیاه مریم‏گلی استفاده کرده‏اند (23). هم‏چنین هورواتووا و همکاران (29)، یافتند که عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی فعالیت آنتی اکسیدانتی قوی دارد و غنی‏سازی آب آشامیدنی موش­ها با آن باعث افزایش مقاومت هپاتوسیت­های موش در برابر استرس اکسیداتیو می‌شود. نعیمی و همکاران (12) بیان کردند رزمارینیک اسید که یکی از ترکیبات مریم­گلی است می‌تواند پیشرفت تومور در چندین اندام بدن شامل کولون، سینه، کبد، شکم و همچنین ملانوما و سلول­های سرطان خون را سرکوب کند. این ماده هم‏چنین می­تواند فعالیت آنزیم­های کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز را افزایش دهد. تحقیقات بسیاری حاکی از تاثیر محصولات گیاهی در مهار سلول­های سرطانی به‏واسطه­ی افزایش بیان یا فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی می­باشند. به‏عنوان مثال نوعی ایزوفلاوونوئید ضدسرطان، با افزایش بیان آنزیم­های آنتی اکسیدانتی در رده سلولی سرطان پروستات باعث مهار موثر این سلول­ها شد (30). در مطالعه­ی ما نیز فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در سلول­های سرطانی ریه A549 تیمار شده با مریم­گلی نسبت به گروه کنترل افزایش معنی‏داری داشت. از این رو می­توان گفت که عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی از طریق افزایش فعالیت این آنزیم­ها سبب مهار سلول­های A549 شدند. در مطالعه‏ای دیگر که اثر لوتئولین روی رده­ی سلولی سرطانی HepG2 انجام گرفت، مشخص نمود که لوتئولین قادر است در سلول­های سرطانی HepG2 آپوپتوزیس را القا کند (31). در نهایت می­توان چنان نتیجه گرفت که ترکیبات موثر موجود در عصاره­ی هیدروالکلی مریم­گلی مسئول القا مرگ سلولی (احتمالا از نوع آپوپتوزیس) در سلول­های سرطانی ریه بودند. اگرچه بررسی های بیشتر به‏ویژه در زمینه سیگنالینگ­های سلولی و مولکولی پیشنهاد می‏شد.

 

نتیجه­گیری

نتایج نشان دادند که عصاره هیدروالکلی مریم­گلی قادر است مرگ سلولی را به‏صورت وابسته به‏دوز و زمان در سلول­های سرطان ریه A549 القا کند و غلظت مناسب IC50 عصاره مریم­گلی برای این سلول­ها  5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تعیین شد. به‏علاوه نتایج نشان داد که فعالیت آنزیم کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز در گروه­های سلولی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی مریم­گلی نسبت به گروه­های کنترل به‏طور قابل توجهی افزایش یافت، که این نتیجه احتمالا به‏خواص آنتی اکسیدانتی ترکیبات مریم­گلی مربوط می‏شود.

 

تشکر و قدردانی

هزینه این تحقیق از محل اعتبارات پژوهانه سال 98 معاونت پژوهشی دانشگاه شهیدچمران اهواز تامین شده است. نویسندگان مراتب قدردانی خود را از معاونت پژوهشی و فن­آوری دانشگاه شهید چمران اهواز برای حمایت­های مالی اعلام می­دارند.

1.Boyle P, Langman JS. ABC of colorectal cancer: Epidemiology. BMJ. 2000; 321(7264): 805-8.
2. Kang SM, Sung HJ, Ahn JM, Park JY, et al. The Haptoglobin beta chain as a supportive biomarker for human lung cancers. Mol Biosyst. 2011; 4(7): 1167-75.
3. Liu Y, Bhattarai P, Dai Z, Chen X. Photothermal therapy and photoacoustic imaging via nanotheranostics in fighting cancer. Chem Soc Rev. 2019; 48(7): 2053-108.
4. Yan Y, Liu L, Xiong H, Miller JB, et al. Functional polyesters enable selective siRNA delivery    to lung cancer over matched normal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016; 113(39): E5702-10.
5. Ferrone E, Araneo R, Notargiacomo A, Pea M, et al. ZnO Nanostructures and Electrospun ZnO-Polymeric Hybrid Nanomaterials in Biomedical, Health, and Sustainability Applications. Nanomaterials (Basel). 2019; 9(10): 1449.
6. D'Arcy MS. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biol Int. 2019; 43(6): 582-92.
7. Ben Mahmoud L, Mdhaffar M, Ghozzi H, Ammar M, et al. Oxidative Stress in Tunisian Patients With Acute Lymphoblastic Leukemia and Its Involvement in Leukemic Relapse. J Pediatr Hematol Oncol. 2017; 39(3): e124-e30.
8. Graidist P, Martla M, Sukpondma Y. Cytotoxic activity of Piper cubeba extract in breast cancer cell lines. Nutrients. 2015; 7(4): 2707-18.
9.  Jiang Y, Zhang L, Rupasinghe HP. Antiproliferative effects of extracts from Salvia officinalis L. and Saliva miltiorrhiza Bunge on hepatocellular carcinoma cells. Biomed Pharmacother. 2017; 85: 57-67.
10. Ghorbani A, Esmaeilizadeh M. Pharmacological properties of Salvia officinalis and its components. J Tradit Complement Med. 2017; 7(4): 433-40.
11. Poulios E, Giaginis C,Vasios GK. Current Advances on the Extraction and Identification of Bioactive Components of Sage (Salvia spp.). Curr Pharm Biotechnol. 2019; 20(10): 845-57.
12. Naimi M, Vlavcheski F, Shamshoum H, Tsiani E. Rosemary Extract as a Potential Anti-Hyperglycemic Agent: Current Evidence and Future Perspectives. Nutrients. 2017; 9(9): 968.
13. Wang H, Mou S, Tu M. Study on the Effect of Nano Albumin Paclitaxel Combined with Carboplatin in the Treatment of Lung Squamous Cell Carcinoma. J Nanosci Nanotechnol. 2020; 20(12): 7439-43.
14. Karachiwala H, Tilley D, Abdel-Rahman O, Morris D. Comparison of Oral versus Intravenous Etoposide in the Management of Small Cell Lung Cancer; A Real-World, Population-Based Study. Clin Respir J. 2020.
15. Abramson JS, Arnason JE, LaCasce AS, Redd R, et al. Brentuximab vedotin, doxorubicin, vinblastine, and dacarbazine for nonbulky limited-stage classical Hodgkin lymphoma. Blood. 2019; 134(7): 606-13.
16. Erfani Majd N, Azizian H, Tabandeh MR ,Shahriari A. Effect of Abelmoschus esculentus Powder on Ovarian Histology, Expression of Apoptotic Genes and Oxidative Stress in Diabetic Rats Fed with High Fat Diet. Iran J Pharm Res. 2019; 18(1): 369-82.
17. Cherneva E, Pavlovic V, Smelcerovic A, Yancheva D. The effect of camphor and borneol on rat thymocyte viability and oxidative stress. Molecules. 2012; 17(9): 10258-66.
18. Pavlovic V, Cekic S, Kamenov B, Ciric M, et al. The Effect of Ascorbic Acid on Mancozeb-Induced Toxicity in Rat Thymocytes. Folia Biol (Praha). 2015; 61(3): 116-23.
19. Garcia CS, Menti C, Lambert AP, Barcellos T, et al. Pharmacological perspectives from Brazilian Salvia officinalis (Lamiaceae): antioxidant, and antitumor in mammalian cells. An Acad Bras Cienc. 2016; 88(1): 281-92.
20. Guzel S, Ozay Y, Kumas M, Uzun C, et al. Wound healing properties, antimicrobial and antioxidant activities of Salvia kronenburgii Rech. f. and Salvia euphratica Montbret, Aucher & Rech. f. var. euphratica on excision and incision wound models in diabetic rats. Biomed Pharmacother. 2019; 111: 1260-76.
21. Zhou R, Long H, Zhang B, Lao Z, et al. Salvianolic acid B, an antioxidant derived from Salvia militarize, protects mice against gammaradiationinduced damage through Nrf2/Bach1. Mol Med Rep. 2019; 19(2): 1309-17.
22. Abu-Darwish MS, Cabral C, Ali Z, Wang M, et al. Salvia ceratophylla L. from South of Jordan: new insights on chemical composition and biological activities. Nat Prod Bioprospect. 2020; 10: 307-316.
23. Kozics K, Klusova V, Srancikova A, Mucaji P, et al. Effects of Salvia officinalis and Thymus vulgaris on oxidant-induced DNA damage and antioxidant status in HepG2 cells. Food Chem. 2013; 141(3): 2198-206.
24. Zare Shahneh F, Valiyari S, Baradaran B, Abdolalizadeh J, et al. Inhibitory and cytotoxic activities of salvia officinalis L. Extract on human lymphoma and leukemia cells by induction of apoptosis. Adv Pharm Bull. 2013; 3(1): 51-5.
25. Zhang Y, Smuts JP, Dodbiba E, Rangarajan R, et al. Degradation study of carnosic acid, carnosol, rosmarinic acid, and rosemary extract (Rosmarinus officinalis L.) assessed using HPLC. J Agric Food Chem. 2012; 60(36): 9305-14.
26. Akaberi M, Mehri S, Iranshahi M. Multiple pro-apoptotic targets of abietane diterpenoids from Salvia species. Fitoterapia. 2015; 100: 118-32.
27. Feng XM, Su XL. Anticancer effect of ursolic acid via mitochondria-dependent pathways. Oncol Lett. 2019; 17(6): 4761-7.
28. Bao F, Kang X, Xie Q, Wu J. HIF-alpha/PKM2 and PI3K-AKT pathways involved in the protection by dexmedetomidine against isoflurane or bupivacaine-induced apoptosis in hippocampal neuronal HT22 cells. Exp Ther Med. 2019; 17(1): 63-70.
59. Horvathova E, Srancikova A, Regendova-Sedlackova E, Melusova M, et al. Enriching the drinking water of rats with extracts of Salvia officinalis and Thymus vulgaris increases their resistance to oxidative stress. Mutagenesis. 2016; 31(1): 51-9.
30. Vaiserman A, Koliada A, Zayachkivska A, Lushchak O. Nanodelivery of Natural Antioxidants: An Anti-aging Perspective. Front Bioeng Biotechnol. 2019; 10(7): 447.
31. Lee HJ, Wang CJ, Kuo HC, Chou FP, et al. Induction apoptosis of luteolin in human hepatoma HepG2 cells involving mitochondria translocation of Bax/Bak and activation of JNK. Toxicol Appl Pharmacol. 2005; 203(2): 124-31.