سلول و بافت
فصلنامه

تولید داربست پلی‌کاپرولاکتون-ژلاتین به‏منظور تمایز سلو‌های پروژنیتور قلبی

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

زهرا شمس 1
بابک اکبری 1
سارا رجبی 2
ناصر اقدمی 2

1 دانشگاه تهران، دانشکده علوم و فنون نوین، گروه مهندسی علوم زیستی، تهران، ایران

2 پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و فناوری سلول‏های بنیادی جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، گروه سلول‏های بنیادی و زیست شناسی تکوینی، تهران، ایران

https://doi.org/10.52547/JCT.11.2.87
چکیده
هدف: در این پژوهش، تهیه یک داربست ترکیبی با دارا بودن شرایط مورد نیاز جهت رشد، تکثیر و تمایز سلول­های پروژنیتور قلبی، مورد توجه قرار گرفت.
مواد و روش‏ها: داربست ترکیبی با نانوفیبرهای موازی از پلیمرهای پلی کاپرولاکتون و ژلاتین با درصد ترکیبی 70 به 30 و با بیش‏ترین شباهت از لحاظ ساختار موازی نانوفیبرها، قدرت الاستیسیته و هم‏گونی نانوفیبرها با ماتریکس خارج سلولی قلب توسط روش الکتروریسی تهیه شد. با استفاده از تصاویر میکروسکوپ الکترونی و آزمون­های زاویه تماس و آنالیز استحکام مکانیکی در جهت نانوفیبرها، داربست ترکیبی ایجاد شده، به‏منظور دارا بودن بیش‏ترین مشخصات مورد نیاز جهت داربست قلبی، مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت از آزمون Real time-PCR به‏منظور بررسی میزان بیان ژن­های مرتبط با تمایز سلول­های پروژنیتور قلبی (MYH-6, TTN and CX-43) استفاده شد.
نتایج: آزمون­های زاویه تماس و آنالیز استحکام مکانیکی نشان داد که داربست از نظر چسبندگی و  استحکام شرایط مناسبی برای کشت سلول­های پروژنیتور قلبی را دارا بوده و آزمون Real time-PCR نیز نتایج خوبی از بیان ژن­های مرتبط با ضربان سلول­های کشت داده شده بر روی داربست را در برداشت.
نتیجه‏گیری: از آن‏جاکه مهم­ترین تفاوت سلول قلبی با سایر سلول­های بدن در داشتن ضربان است که ژن­های خاصی مسئول هم‏زمان­سازی آن هستند، نتایج این پژوهش نشان داد که داربست تولید شده می­تواند گزینه مناسبی برای القای تمایز سلول­های پروژنیتور قلبی و مهندسی بافت قلب باشد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

بیان ژن­های قلبی
داربست الکتروریسی
سلول‏های پروژنیتور قلبی
مهندسی بافت قلب

عنوان مقاله English

Fabrication of Polycaprolactone-Gelatin scaffold for Cardiac Progenitor Cellsdifferentiation

نویسندگان English

Z Shams 1
B Akbari 1
S Rajabi 2
N Aghdami 2
1 Department of Life Science Engineering, Faculty of New Sciences and Technologies, University of Tehran, Tehran, Iran
2 Department of Cell Engineering, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran
چکیده English

Aim: This research, design and fabrication of a composite scaffold for growth, proliferation and differentiation of Cardiac Progenitor Cells (CPCs) has been considered.
Material and method: Polycaprolactone / Gelatin composite scaffolds with a ratio of 70:30 and with the most similarities to the cardiac extracellular matrix was fabricated with aligned nanofibers. Using scanning electron microscopy (SEM), mechanical strength analysisand also contact angel test, the scaffold was investigated due to have the most necessary characteristics to be proportional for cardiac scaffold. Finally, By Real time-PCR test, the expression of the specific genes related to the Cardiac Progenitor Cells differentiation (MYH-6, TTN and CX-43) has been analyzed.
Results: Based on our results from contact angle test and mechanical strength experiments, we concluded that our designed scaffold is suitable for the culture of Cardiac Progenitor Cells on it. The Real time-PCR analysis also showed the good expression of genes associated with contraction.
Conclusion: What makes the cardiomyocytes different from other cells is their contraction related to specific cardiac genes being responsible for beating synchronization. The results of this study showed that aligned Polycaprolactone / Gelatin composite scaffold has the appropriate potential for induction of cardiac progenitor cells differentiation and application in heart tissue engineering.
 

کلیدواژه‌ها English

Electrospun Scaffold
Cardiac Genes Expression
Cardiac Progenitor Cells
Cardiac Tissue Engineering

مقدمه

 بیماری­های قلبی یکی از دلایل عمده مرگ‏ومیر در دنیا محسوب می­شوند به‏طوری‏که تقریبا 40 درصد از مرگ و ناتوانی در کشورهای پیشرفته و جهان سوم را در بر می­گیرند (1). طبق تخمین­های انجام شده در سال 2013، بیش‏تر از 17.3 میلیون از مرگ­های گزارش شده مربوط به بیماری­های قلبی بوده و انتظار می­رود که این میزان در سال 2030 به 6/23 میلیون افزایش یابد (2). قلب یکی از ارگان‏های پیشرفته در بدن ماست که وظیفه پمپاژ خون به سرتاسر بدن را برعهده دارد. زمانی‏که بنا به‏هر دلیلی، خونرسانی به‏قسمتی از بافت قلب به‏خوبی انجام نشود، سلول­های آن قسمت از بافت می­میرند و از آن‏جائی‏که سلول­های قلبی توانایی ترمیم ندارند، شخص دچار نارسایی قلبی می­شد. در نارسایی قلبی، عملکرد قلب نیز مختل می­شود (3). از گذشته تاکنون درمان‏های زیادی در بیماران دارای نارسایی قلبی انجام شده است که برخی از جمله مصرف دارو، غیرتهاجمی و برخی نیز هم‏چون آنژیوپلاستی، دستگاه حمایت‏کننده قلبی، پیس‏میکر و درنهایت پیوند قلب، تهاجمی هستند (4، 5). در این روش­ها هدف اصلی، کمک به قلب است که باوجود این‏که قسمتی از سلول­های خود را از دست داده است، تاحدی عمل‏کرد خود را بهبود بخشد و توسط دارو تا حدی از پیشرفت بیماری جلوگیری شد، ولی هیچ‏کدام راه حلی برای ترمیم بافت از دست رفته ارائه نمی­کنند. در نهایت پیوند قلبی نیز که در بیماران مرحله آخر استفاده می­شود، به‏علت کمبود اهدا کننده و همین‏طور واکنش سیستم ایمنی بدن دچار محدودیت­های زیادی شده است. لذا در سال­های اخیر، دانشمندان به‏سراغ روش­های نوین هم‏چون سلول­درمانی و مهندسی بافت رفته‏اند (5). در روش­های نوین، سعی بر آن است که سلول­های زنده بتوانند جایگزین سلول­های مرده شدند. تزریق سلول­های بنیادی به‏محل آسیب دیده یکی از روش­های مورد استفاده است که می­تواند از طریق تزریق مستقیم به قسمت آسیب­دیده و یا تزریق شریانی صورت گیرد (6).

این روش­ها مشکلاتی نیز در بردارند، به‏طوری‏که در صورت تزریق به شریان کرونری، تنها 15 درصد از سلول­ها به‏محل مورد نظر رسیده (7) و در صورت تزریق مستقیم به بافت نیز با وجود این‏که اکثر سلول­ها به قسمت موردنظر می­رسند ولی به‏علت عدم وجود داربست مناسب برای تغذیه و رشد، میزان کمی از آن­ها دارای عمل‏کرد مناسب خواهند بود. لذا ترکیب داربست و سلول­های پروژنیتور قلبی می­تواند گزینه مناسبی برای درمان باشد (8-10). داربست مناسب جهت مهندسی بافت قلب باید دارای شاخصه‏های ذیل باشد:

از نانوفیبرهای هم‏گون با قطر یک‏نواخت تشکیل شده باشد. توسط روش­های الکتروریسی و یا پرینت سه بعدی می­توان به داربستی با این مشخصه دست یافت (11، 12).

ناهمسان‏گرد باشد، یکی از خواص عضله قلبی آن است که بارهای مکانیکی در جهت خاصی انتقال می­یابند و همین باعث شده که داربست قلبی، خواص ناهمسان‏گردی داشته باشد (13، 14). در روش پرینت سه بعدی می‏توان حرکت نازل را به‏صورتی برنامه‏ریزی کرد که در نهایت داربستی متشکل از نانوفیبرهای موازی داشت (8). الکتروریسی بر روی ماندرول چرخان نیز یکی از روش­های تولید داربست نانوفیبری موازی است که از نظر هزینه نیز مناسب­تر از روش پرینتر سه بعدی می­باشد (13، 15)

چسبندگی و استحکام مناسب داشته باشد، از آن‏جائی‏که بافت قلبی به‏صورت مداوم و سیکل‏وار تحت نیروی کششی حاصل از انقباض و انبساط می­باشد، لذا داربست مناسب باید بتواند این میزان کشش را تحمل کند و در طول زمان ترمیم، از سلول­ها حمایت مکانیکی داشته باشد (16). ماهیچه­ی قلبی، مدول یانگی در حدود 10 تا 20 کیلو پاسکال در زمان دیاستول با کشش کمتر از 10 درصد دارد که در پایان دیاستول تا 50 کیلو پاسکال در عضله قلبی سالم و تا 200 تا 300 کیلوپاسکال در قلب آسیب دیده افزایش می­یابد. بنابراین داشتن یک داربست الاستومر برای استفاده در سیکل­های انقباضی بافت قلب بسیار مناسب است (17). پلیمرهای مصنوعی نه‏تنها خواص مکانیکی خوبی دارند بلکه نرخ تخریب‏پذیری قابل کنترلی را نیز دارا می­باشند (15، 17). پلی کاپرولاکتون(PCL) ، یک پلیمر مصنوعی از خانواده­ی پلی یورتان­هاست که به‏داشتن خواص الاستومری خیلی خوب شناخته شده است (18) ولی در عین حال از آن‏جائی‏که ذاتا هیدروفوب است نمی­تواند شرایط مناسبی جهت چسبندگی سلول مهیا کند، لذا ترکیب آن با یک داربست طبیعی همچون ژلاتین می­تواند هر دو فاکتور چسبندگی و استحکام مکانیکی را ایجاد نماید. البته درصد ترکیب این دو پلیمر نیز اهمیت بسیار بالایی دارد. درصد انتخابی ترکیبی باید به‏گونه­ای باشد که داربست علاوه بر داشتن استحکام مکانیکی، چسبندگی سلولی مناسبی نیز داشته باشد و در عین حال نیز هم‏گون باشد (15، 17).

در این مطالعه با ساخت داربست نانوفیبری ترکیبی از 2 پلیمر PCL و ژلاتین با درصد ترکیب مناسب توسط روش الکتروریسی با ماندرول چرخان، سعی شده که داربست مناسبی جهت کشت سلول­های پروژنیتور قلبی ایجاد شد.

عضله­ی قلبی از چندین لایه که روی هم قرار گرفته­اند، تشکیل شده است که هر لایه که از ماتریکس خارج سلولی ساخته شده است، متشکل از نانوفیبرهای موازی و هم‏راستا می­باشد (19). لذا با استفاده از روش الکتروریسی بر روی ماندرول چرخان می­توان به ساختاری مشابه با ماتریکس خارج سلولی قلبی دست یافت. در شکل 1، بستر نانوفیبری تشکیل دهنده بافت قلبی قابل مشاهده است.

علاوه بر ساختار فیزیکی داربست، یکی از عوامل مهم دیگر در بررسی کاربردی بودن داربست ایجاد شده جهت کشت سلول‏های قلبی، بررسی میزان بیان ژن­های مرتبط با هم‏زمان‏سازی انقباض قلبی می‏باشند. زیرا یکی از ویژگی‏های مهم سلول‏های قلبی انقباض هم‏زمان آن‏ها جهت خون‏رسانی به کلیه اعضا می‏باشد. در این پژوهش میزان بیان سه ژن TTN (تشکیل‏دهنده پروتئین Titin)، MYH-6 (تشکیل­دهنده پروتئین Alpha-MHC) و GJAI (تشکیل­دهنده پروتئین Connexn-43) در سلول‏های پرونیتور قلبی کشت شده بر روی داربست، توسط روش Real time-PCR بررسی شد.

 

مواد و روش‌ها

­­ مواد: پلی کاپرولاکتون (PCL (MW 80,000 g/mol))، ژلاتین خوکی نوع A و محیط کشت IMDM تهیه شده از سیگما آلدریچ، اسیداستیک، اسیدفرمیک، گلوتارآلدهید، اتانول و فسفات بافرسالین (PBS) تهیه شده از مرک و آمینواسید، پنی‏سیلین و ال گلوتامین تهیه شده از اینویتروژن و در نهایت سرم جنین گاوی (FBS) خریداری شده از Gibco مواد مورد استفاده در این پژوهش می­باشند. سلول­های پروژنیتور قلبی نیز از پژوهشگاه رویان تهیه شدند.

به‏دست آوردن پارامترهای بهینه الکتروریسی جهت تهیه داربست نانوفیبری جهت دار: در ابتدا برای به‏دست آوردن محلولی با غلظت پلیمر 14 درصد، حلال را که ترکیبی از اسیدفرمیک و اسیداستیک تهیه شده از MERK آلمان با نسبت‏های 7 به 3 است را آماده کرده (20) (از آن‏جاکه اسید فرمیک ثابت دی الکتریک بالاتری دارد و برای الکتروریسی مناسب­تر است به‏میزان بیش‏تری در حلال استفاده شد). سپس برای به‏دست آوردن پارامترهای بهینه جهت الکتروریسی و داشتن نانوفیبرهای موازی و هم‏گون، پلیمرهای PCL و ژلاتین نوع A خوکی که هر دو از کمپانی Sigma Aldrich تهیه شده بودند با نسبت PCL/Gelatin=70/30 مخلوط شده و به‏حلال اضافه شد و سپس به‏مدت 1 ساعت بر روی استیرر با سرعت 500 دور بر دقیقه و بدون اعمال حرارت قرار داده شد. برای تهیه داربست از محلول تهیه شده، از روش الکتروریسی استفاده شد. برای داشتن نانوفیبرهای موازی از ماندرول چرخان استفاده شد. ماندرول چرخان یکی از بهترین انتخاب‏ها برای سیستم جمع‌کننده دستگاه الکتروریسی است که با توجه چرخش، امکان تولید نانوالیاف یکنواخت را می‌دهد. از جمله مزایای این روش می‌توان به امکان دست‏یابی به یک‏نواختی بالا و امکان تنظیم میزان آرایش‌یافتگی نانوالیاف با تنظیم سرعت چرخش ماندرول اشاره کرد. در حال حاضر انواع ماندرول‏ها با ابعاد مختلف و با سرعت‏های چرخش متغیر تا 3500 دور در دقیقه ساخته شده و آماده ارائه هستند. در این روش جهت به‏دست آوردن پارامترهای بهینه الکتروریسی، با تغییر نرخ تغذیه، فاصله سوزن تا کالکتور، ولتاژ و سرعت چرخش ماندرول (21) طبق جدول 1، تعداد 6 نمونه به‏دست آمد. نمونه­ها به‏منظور مشخص شدن مورفولوژی، میزان هم‏گون بودن و جهت‏دار بودن نانوفیبرها برای تهیه تصاویر میکروسکوپ الکترونی (SEM) فرستاده شدند. برای این‏که با تابش الکترونی بتوان از سطح پلیمر تصویر تهیه کرد، بایستی روی سطح آن پوششی از طلا ایجاد می­شد تا سطح رسانا شد. سپس با اعمال ولتاژ 2000 ولت از نمونه­ها تصویر برداری شد.

به‏دست آوردن درصد ترکیبی بهینه برای دو پلیمر  PCLو ژلاتین:پس از مشخص شدن پارامترهای مناسب جهت الکتروریسی و به‏دست آوردن داربست با نانوفیبرهای موازی و توزیع یک‏نواخت، درصدهای ترکیبی مختلف از لحاظ میزان آب‏دوستی و همین‏طور استحکام مکانیکی مورد آزمایش قرار گرفتند. برای‏این‏منظور، 3 داربست با درصدهای ترکیبی  PCL/Gelatin=80/20، PCL/Gelatin=70/30 و PCL/Gelatin=60/40 با درنظر گرفتن پارامترهای بهینه الکتروریسی تولید شدند.

بررسی خواص فیزیکی و شیمیایی داربست:با استفاده از تصاویر میکروسکوپ الکترونی، توزیع قطری داربست­ها و میزان پراکندگی آن­ها، توسط  نرم افزار تحلیل آماری SPSS با هم مقایسه شد تا همگون­ترین حالت مشخص شد. میزان آب‏دوستی داربست­ها نیز با استفاده از روش ارزیابی زاویه تماس در 3 داربست با درصدهای ترکیبی مختلف به‏دست آمد. زاویه تماس استاتیک به‏روش قطره–سسایل اندازه­گیری شد که در آن یک قطره به‏حجم 3 میکرولیتر بر روی پلیمر قرار داده شده و هنگامی که قطره بر روی سطح پایدار شد، با دوربین از آن عکس­برداری شد. مقایسه استحکام مکانیکی در 3 درصد ترکیبی مختلف با استفاده از دستگاه اینسترون مدل TM-SM ساخت کشور انگلستان انجام شد. در ابتدا طول و ضخامت نمونه­ها اندازه­گیری و سپس با نرخ کرنش 5 میلی­متر در دقیقه، نیروی کششی در جهت نانوفیبرها به نمونه­ها وارد شد (22). پس از 5 بار تکرار برای هر نمونه، نمودارهای تنش-کرنش به‏دست آمده و با یکدیگر مقایسه شد.

تست سمیت سلولی:در قدم اول، رده سلولی موردنظرکه سلول‌های پروژنیتور قلبی بودند، در پژوهشگاه رویان در محیط کشت IMDM برند سیگما حاوی 1 درصد ال گلوتامین اینویتروژن، آمینواسید اینویتروژن، آنتی‏بیوتیک اینویتروژن و 10 درصد FBS گیبکو کشت یافتند. پیش از استفاده از داربست در محیط کشت سلولی، به‏منظور جلوگیری از به‏هم ریختن مورفولوژی نانوفیبری آن در محیط آبی به سبب وجود پلیمر آب‏دوست ژلاتین، داربست در محیط حمام بخار گلوتارآلدهید 25 درصد، به‏مدت 6 روز شبکه‏ای شد. بمنظور بررسی اندرکنش سلول با داربست، در روزهای 2، 4 و 6 پس از کشت، از نمونه‏ها تست سمیت سلولی MTS (Promega, G5421) گرفته شد تا میزان زنده­مانی سلول­ها بررسی شد. از آن‏جائی‏که رنگ ارغوانی حاصل از زنده مانی سلول­ها در طول موج 490 تا 540 نانومتر جذب می­شد، لذا نمونه را تحت جذب در طول موج 490 نانومتر اشعه فرابنفش قرار دادیم تا میزان زنده­مانی از روی میزان جذب در مقایسه با داربست PCL مقایسه شد.

کشت ثابت سلول بر روی داربست با نانوفیبرهای موازی: سلول­های پروژنیتور قلبی تهیه شده از پژوهشگاه رویان، بر روی داربست کامپوزیتی نانوفیبری به‏تعداد 2 میلیون در مساحت 2 سانتی­متر مربعی داربست، تزریق شده و در محیط کشت قرار گرفتند. به‏منظور فراهم آوردن شرایط محیطی مناسب جهت رشد و تمایز سلول­ها، دما، رطوبت، اکسیژن و pH محیط نیز باید کنترل می­شد. به‏مدت 7 روز سلول­های کشت داده شده بر روی داربست در داخل انکوباتور قرار گرفتند.  پس از گذشت یک هفته از کشت سلولی، قسمتی از داربست برای تهیه تصاویر میکروسکوپ الکترونی و قسمتی نیز برای انجام تست Real Time PCR فرستاده شد.

 

 

آنالیز تصاویر میکروسکوپ الکترونی حاصل از جهت‏گیری سلول­های پروژنیتور قلبی بر روی داربست: قسمت­هایی از نمونه اصلی داخل محلول فیکساتور قرار گرفت تا جای سلول­ها بر روی داربست ثابت شود. سپس به‏ترتیب با الکل­های 30 درصد، 50 درصد، 70 درصد، 80 درصد و 90 درصد هر کدام به‏مدت 10 دقیقه و سپس دوبار و هربار به‏مدت 10 دقیقه نیز در الکل 100 درصد قرار داده شد تا آب داخل سلول­ها با الکل جایگزین شود. پس از خشک شدن کامل نمونه ، از آن تصاویر میکروسکوپ الکترونی تهیه شد.

آنالیز بیان ژن­های قلبی با روش Real Time PCR:در این پژوهش، 3 ژن TTN، MYH-6 و GJA1 در سلول­های کشت داده شده بر روی داربست، توسط تست Real Time PCR مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفتند. طراحی پرایمرها جهت انجام تست طبق جدول 3 انجام شد.

در انجام این تست از کیت استخراج RNA برند Qiagen و کیت سنتز cDNA برند Thermo استفاده شد. تستReal Time PCR برای دو نمونه کنترل (سلول‏های قلبی فاقد داربست) و نمونه اصلی(کشت بر روی داربست)، با 4 بار تکرار انجام شد و باتوجه به واریانس کمتر از 1 درصد، داده ها در سطح 1 درصد معنی‏دار شدند.

 

نتایج

بررسی تصاویر میکروسکوپ الکترونی حاصل از تغییر پارامترهای الکتروریسی

همان‏طور که در بخش قبل توضیح داده شد الکتروریسی بر روی ماندرول چرخان، یکی از روش‏های کاربردی برای ساخت داربست‏های نانوفیبری دو بعدی با نانوفیبرهای یک‏نواخت و جهت‏دار می‏باشد. در تنظیمات دستگاه عواملی همچون نرخ تغذیه، فاصله سوزن تا کالکتور، ولتاژ و سرعت چرخش ماندرول باید بهینه شد. در این مطالعه از آن‏جایی‏که بافت هدف، ماتریکس خارج سلولی قلبی می‏باشد، باید با انتخاب پارامترهای الکتروریسی مناسب بتوانیم تا حد امکان به داربستی با نافیبرهای موازی و هم‏گون دست پیدا کنیم که با بیش‏ترین شباهت را از نظر فیزیکی و ساختار با ماتریکس قلبی (شکل 1) داشته باشد.

 

 

شکل 1: تصویر بستر فیبری تشکیل دهنده‌ی بافت قلبی به‏کمک تصویربرداری رزونانس مغناطیس  با تنسور نفوذ کننده (17)

لذا، با تغییر پارامترهای الکتروریسی طبق جدول 1، داربست های شکل 2 تولید شد تا بتوان با اطمینان، بهترین داربست را جهت کشت سلولی انتخاب کرد.

 

جدول1:ساخت 6 داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30با تغییر پارامترهای مختلف الکتروریسی. غلظت داربست  (w/v)14 درصد بوده و فرآیند الکتروریسی در دمای محیط انجام گرفت.

نمونه

نرخ تغذیه
(میلی لیتر/ ساعت)

فاصله سوزن تا کالکتور
(سانتی متر)

ولتاژ
(کیلو ولت)

سرعت چرخش ماندرول
(دور بر دقیقه)

الف - 1

0.1

15

17

2000

الف - 2

0.2

12

15

2000

ب - 1

0.1

12

12

1800

ب - 2

0.3

10

17

1500

ج - 1

0.3

10

17

2000

ج - 2

0.3

10

17

2500

 

شکل2:تصاویر میکروسکوپ الکترونی داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30  با پارامترهای مختلفالکتروریسی مشخص شده در جدول (1)

 

 

 

بررسی توزیع قطری نانوفیبرها با درصدهای ترکیبی مختلف

یکی‏دیگر از نتایج جالب در این مطالعه رابطه ناهم‏گونی الیاف با افزایش ژلاتین می‏باشد. در نمونه­های حاصل از الکتروریسی با پارامترهای بهینه و با درصدهای ترکیبی مختلف PCL/Gelatin=80/20، PCL/Gelatin=70/30 و PCL/Gelatin=60/40، پس از تهیه تصاویر میکروسکوپ الکترونی طبق شکل3، نمودارهای توزیع قطری تهیه شد.

 

 

 

شکل3:تصاویر میکروسکوپ الکترونی و درصد توزیع قطری داربست ترکیبی پلی کاپرولاکتون-ژلاتین با درصدهای ترکیبی (الف)PCL/Gelatin=60/40، (ب) PCL/Gelatin=70/30و (ج)PCL/Gelatin=80/20

 

نتایج حاصل از ارزیابی زاویه تماس و استحکام مکانیکی

علاوه بر هم‏گونی و جهت دار بودن نانوفیبرها، برای دستیابی به بهینه‏ترین درصد ترکیبی لازم بود که داربست­ها از لحاظ استحکام مکانیکی و میزان چسبندگی سلولی نیز مورد بررسی قرار گیرند.

چسبندگی سلولی داربست توسط آزمون زاویه تماس اندازه گیری شد و نتایج حاصل از ارزیابی زاویه تماس در شکل (4-الف) نشان داده شده است.

در ادامه به‏منظور ارزیابی استحکام مکانیکی، داربست­ها تحت کشش 5 میلی­متر در دقیقه در جهت نانوفیبرهای موازی قرار گرفتند. پس از 5 بار تکرار برای هرنمونه، نتایج به‏صورت نمودار تنش-کرنش برای هر یک از نمونه­ها مورد بررسی قرار گرفت (شکل4-ب).

نتایج حاصل از تست‏های استحکام مکانیکی و زاویه تماس به‏صورت مقایسه ای نیز در جدول 2 آورده شده است.

جدول 2:مدول یانگ و زاویه تماس داربست های ترکیبی پلی کاپرولاکتون- ژلاتین با درصدهای مختلف

نسبت ترکیب
(ژلاتین / پلی کاپرولاکتون)

مدول یانگ
(مگا پاسگال)

زاویه تماس

60/40

200

97/38˚

70/30

460

96/46˚

80/20

504

71/68˚

 

نتایج حاصل از تست سمیت سلولی

جهت انجام کشت سلول بر روی داربست، لازم است که قبل از آن ثابت شد که تست سمیت سلولی برای داربست بررسی شود. نتایج حاصل از تست سمیت سلولی MTS، در شکل(4-ج) مشخص می‏باشد.

 

 

شکل 4:ویژگی‏های فیزیکی و شیمیایی داربست، (الف) اندازه‏گیری زاویه تماس در داربست‏های ترکیبی 1) PCL/Gelatin=60/40، 2) PCL/Gelatin=70/30و 3) PCL/Gelatin=80/20، (ب) نمودار تنش-کرنش داربست‏های نانوفیبری ترکیبی و(ج)نمودار زنده‏مانی سلول‏ها بر روی داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30 در روزهای دوم، چهارم و ششم با واریانس کمتر از 1 درصد،PCL به‏عنوان داربست کنترل استفاده شد(تعداد تکرار=12).

 

نتایج حاصل از اندرکنش سلول با داربست

تصاویر میکروسکوپ الکترونی در روز هفتم از داربست طبق شکل 5 تهیه شد که چسبندگی سلول­های پروژنیتور قلبی بر روی داربست را در جهت نانوفیبرها نشان می­دهد.

 

 

 

شکل 5: تصاویر میکروسکوپ الکترونی حاصل از سلول‏های پروژنیتور قلبی کشت داده شده بر روی داربست نانوفیبری ترکیبی PCL/Gelatin=70/30 پس از هفت روز کشت ثابت در داخل انکوباتور

 

نتایج حاصل از آزمون Real time-PCR

پس از کشت 7 روزه سلول­های پروژنیتور قلبی بر روی داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30 در داخل انکوباتور، سلول‏ها جهت انجام آزمون Real Time PCR آماده شد و طبق نمودار شکل 6، میزان بیان ژن­های TTN (تشکیل دهنده پروتئین Titin) و MYH-6 (تشکیل­دهنده پروتئین Alpha-MHC) و همین­طور ژن  GJAI(تشکیل­دهنده پروتئین Connexn-43 بررسی شد. توالی پرایمرهای تهیه شده جهت آزمون Real Time PCR، به‏شرح جدول 3 می‏باشد.

 

جدول3:توالی پرایمرها جهت سه ژن TTN، MYH-6 و GJA1 به‏منظور استفاده در آنالیز Real Time PCR.

Primer Name

Oligo Sequence 5'………3'

Length

(bp)

Tm

(°C)

Product

length

TTN-F

ATCATCAATGTAGCACCGAGT

21

59.1

120

TTN-R

AAAAGCCCAAGAAATCAACCAAC

23

59.2

MYH6-F

GCCCACTTCTCCCTGATCCAC

21

62.2

195

MYH6-R

CTTGCCTCCTTTGCTTTTACCAC

23

61.2

CX43-F

(GJA1)

CCAATCTCTCATGTGCGCTTC

21

59.0

105

CX43-R

(GJA1)

CAGTTTCTCTTCCTTTCGCATC

22

58.1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل6: نمودار نتایج آنالیز Real Time PCR  برای سه ژن MYH-6، TTN و CX-43 در سلول­های پروژنیتور قلبی کشت داده شده بر روی داربست الکتروریسی ترکیبی با نانوفیبرهای موازی و مقایسه با نمونه کنترل (سلول های پروژنیتور قلبی)  p<0.01، n=4.

 

بحث

بررسی تصاویر میکروسکوپ الکترونی حاصل از تغییر پارامترهای الکتروریسی

با بررسی تصاویر میکروسکوپ الکترونی حاصل از داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30 با تغییر پارامترهای مختلف الکتروریسی(شکل2)، می‏توانیم به‏نتایج زیر دست یابیم:

با کاهش نرخ تغذیه پلیمر و افزایش فاصله سوزن تا کالکتور، همان­طورکه در نمونه‏های (الف-1) و (الف-2) از شکل2 مشخص است، قطر نانوفیبرها به‏میزان زیادی کاهش پیدا کرده و تا حدی هم‏گون بودن الیاف از دست‏ رفته است.

با کاهش ولتاژ، همان‏طور که در نمونه (ب-1) مشخص است، نانوفیبرها تا حد بسیار زیادی به‏صورت از هم گسسته و با توزیع قطری ناهم‏گون بر روی جمع کننده قرار گرفتند و این نشان می­دهد که این ولتاژ برای تشکیل مخلوط تیلور در فرآیند الکتروریسی کافی نبوده است (21).

وقتی از منظر سرعت چرخش ماندرول، به تصاویر نگاه می­کنیم، این نتیجه حاصل می‏شد که افزایش سرعت چرخش ماندرول وقتی که از حدی بیشتر شده است، نه‏تنها باعث جهت دار شدن بیشتر نمونه‏ها نشده بلکه باعث پخش شدن پلیمر در اطراف کالکتور شده و همان­طور که در تصویر (ج-2) مشخص است، نانوفیبرهایی در خلاف جهت نانوفیبرهای موازی به‏صورت ناهم‏گون بر روی سطح داربست تشکیل شده است. متقابلا اگر سرعت چرخش ماندرول از حدی کمتر باشد، همانند نمونه (ب-2)، شاهد داربستی با درصد کمی از جهت آرایی خواهیم بود.

با توجه به‏مطالب مذکور، نمونه (ج-1) به‏عنوان مناسب‏ترین داربست انتخاب شده و بهترین پارامترهای الکتروریسی به‏این روش مشخص شدند.

بررسی توزیع قطری نانوفیبرها با درصدهای ترکیبی مختلف

همان­طور که در نمودارها و تصاویر SEM شکل3 مشخص است، با افزایش درصد ژلاتین، ناهم‏گونی نانوفیبرها افزایش پیدا کرده است (15). بنابراین با توجه به این موضع مشخص است که با وجود این‏که با افزایش ژلاتین در ترکیب داربست، می‏توان به‏میزان موثرتری از چسبندگی سلولی دست پیدا کرد، ولی هم‏گونی داربست کاهش می‏یابد. لذا می‏بایست درصد مشخصی از میزان ژلاتین انتخاب شد تا داربست ایجاد شده علاوه بر هم‏گونی نانوفیبرها، چسبندگی قابل قبولی را نیز دارا باشد.

علاوه بر هم‏گونی و جهت‏دار بودن نانوفیبرها، برای دستیابی به بهینه‏ترین درصد ترکیبی لازم بود که داربست­ها از لحاظ استحکام مکانیکی و میزان چسبندگی سلولی نیز مورد بررسی قرار گیرند.

 

نتایج حاصل از ارزیابی زاویه تماس و استحکام مکانیکی

همان­طور که انتظار می­رفت، نتایج حاصل از ارزیابی زاویه تماس در شکل (4-الف) نشان داد که با افزایش میزان ژلاتین که یک پلیمر آب‏دوست است، زاویه تماس کاهش پیدا کرده و بنابراین چسبندگی سلولی افزایش یافته است (15). نمودار (4-ب) نشان داد که با افزایش درصد PCL، شیب نمودار تنش-کرنش و مدول الاستیسیته افزایش یافته است (15، 23). نقطه شکست در داربست با درصد PCL بیشتر نیز با میزان درصد کشش بیشتری اتفاق می­افتد (23). درنهایت با بررسی نتایج حاصل از آزمایش­های زاویه تماس و استحکام مکانیکی و همین طور تصاویر SEM، باید بهترین درصد ترکیبی برای داربست تعیین می­شد. با توجه به تصاویر SEM شکل 3 و همین‏طور داده­های موجود در جدول 3، داربست PCL/Gelatin=70/30 هم از لحاظ هم‏گون بودن نانوفیبرها مناسب بود و هم از لحاظ میزان چسبندگی سلولی و استحکام مکانیکی می­توانست داربست مناسبی جهت مهندسی بافت قلب باشد. بنابراین داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30، با زاویه تماس 96/46 درجه و نقطه شکست با 17 درصد کشش به‏عنوان داربست مورد استفاده جهت کشت سلولی انتخاب شد. از آن‏جائی‏که ماهیچه­ قلبی مدول یانگی در حدود 10 تا 20 کیلو پاسکال در زمان دیاستول با کشش کمتر از 10درصد دارد (17)، بنابراین داربست ایجاد شده برای استفاده در سیکل­های انقباضی بافت قلب مناسب است.

نتایج حاصل از تست سمیت سلولی

نتایج حاصل از تست سمیت سلولی MTS، در شکل (4-ج) که در روزهای دوم، چهارم و ششم بر روی داربست ترکیبی PCL/Gelatin و داربست کنترل PCL به‏دست آمده است، نشان داد که تعداد سلول­های کشت داده شده بر روی داربست‏ها به‏مرور زمان افزایش پیدا کرده و البته در مقایسه با داربست کنترل، می­توان فهمید که افزودن ژلاتین، باعث افزایش چسبندگی سلولی شده است.

نتایج حاصل از اندرکنش سلول با داربست

تصاویر میکروسکوپ الکترونی در روز هفتم از داربست طبق شکل 5 تهیه شد که چسبندگی سلول­های پروژنیتور قلبی بر روی داربست را در جهت نانوفیبرها نشان می­دهد. تصاویر میکروسکوپ الکترونی در روز هفتم، با مشخص بودن چسبندگی سلول‏های پروژنیتور قلبی بر روی داربست در جهت نانوفیبرها، نشان داد که سلول­ها به‏میزان مناسبی بر روی داربست مورد نظر رشد و تکثیر یافته‏اند و این نشان‏گر آن است که داربست تهیه شده شرایط مطلوب مشابه با ماتریکس خارج سلولی را برای سلول­ها فراهم نموده است.

نتایج حاصل از آزمون Real time-PCR

پس از هفت روز کشت سلولی، میزان بیان ژن­های TTN (تشکیل دهنده پروتئین Titin) و  MYH-6(تشکیل­دهنده پروتئین Alpha-MHC) که هر دو موثر در انقباض عضله قلبی هستند و همین­طور ژن GJAI (تشکیل­دهنده پروتئین Connexn-43) که یکی از ترکیبات Gap-Junction بوده و در منظم­سازی روابط بین سلولی و همین­طور انقباض همزمان سلول­های قلبی نقش به‏سزایی دارد، بررسی شد (24، 25). در نتایج حاصل، واضح است که بیان ژن­های مذکور در سلول­های پروژنیتور قلبی کشت داده شده بر روی داربست به‏خوبی انجام شده و این نشان‏گر تمایز مناسب این سلول­ها به‏سمت سلول‏های بالغ قلبی می­باشد. سه ژن مورد بررسی در این پژوهش، با بررسی و مقایسه مقالات قبلی در زمینه تمایز سلول های قلبی انتخاب شد. در سایر مقالات به‏میزان زیادی به بحث بیان بیشتر و موثرتر ژن  GJAI(تشکیل­دهنده پروتئین Connexn-43) پرداخته شده است (26، 27). ولی در هیچ کدام به‏صورت جامع، اثر داربست مناسب بر میزان بیان هر سه ژن موثر در انقباض و ضربان عضله قلبی شامل TTN، MYH-6 و GJAI در سلول‏های پروژنیتور قلبی مورد بحث و بررسی قرار نگرفته است.

نتیجه­گیری

هدف از این آزمایش، ساخت یک داربست به‏منظور شبیه­سازی مناسب ماتریکس خارج سلولی قلبی در محیط آزمایشگاه بود. ماتریکس خارج سلولی قلبی از لایه‏های نانوفیبری روی هم قرار گرفته، تشکیل شده است. همان‏طورکه از تصاویر حاصل از تصویربرداری رزونانس مغناطیس با تنسور نفوذ کننده (شکل 1)، مشخص است هر یک از لایه های تشکیل دهنده این ماتریکس از نانوفیبرهای موازی و هم جهت تشکیل شده که وظیفه انتقال نیروی الکتریکی حاصل از انقباض سلولی را در یک جهت خاص برعهده دارند. داربست دو بعدی متشکل از نانوفیبرهای موازی اگر بتواند از نظر چسبندگی سلولی و استحکام مکانیکی مشابه با ماتریکس خارج سلولی قلبی عمل کند، می‏تواند شرایط مناسبی برای رشد، تکثیر و تمایز سلول‏های پروژنیتور قلبی را ایجاد نماید.

با استفاده از الکتروریسی پلیمرهای PCL و ژلاتین بر روی ماندرول چرخان، توانستیم داربستی دوبعدی با نانوفیبرهای موازی با توزیع قطری یک‏نواخت و هم‏گون و همین‏طور با چسبندگی سلولی و استحکام مکانیکی مناسب تولید کنیم که از نظر خواص شیمیایی و فیزیکی تا حدی شبیه به ماتریکس خارج سلولی قلبی باشد. سپس با کشت سلول­های پروژنیتور قلبی بر روی داربست و بررسی تصاویر میکروسکوپ الکترونی پس از 7 روز کشت سلولی، شاهد جهت­گیری سلول­ها در جهت نانوفیبرهای موازی بودیم و هم‏چنین رشد و تکثیر سلول­ها نیز از تصاویر حاصل شده کاملا مشهود بود. جهت­گیری منظم سلول­ها بر روی داربست دو بعدی و تقویت روابط بین سلولی توانست به تمایز سلول­های پروژنیتور قلبی کمک کند به‏طوری‏که پس از بررسی نتایج حاصل از آزمون Real-time PCR و میزان بیان ژن‏های TTN، MYH-6 و Connexn-43 مشخص شد که که ژن­های مربوط به هم‏زمان‏سازی انقباض قلبی و رابطه منظم بین سلولی، به‏میزان بیشتری در این سلول­ها بیان شده و لذا این داربست سلولی می‏توانند گزینه مناسبی برای پیوند به بافت آسیب دیده قلبی باشند.

1. Sidney S., Rosamond WD, Howard VJ, Luepker RV, et al. The “heart disease and stroke statistics—2013 update” and the need for a national cardiovascular surveillance system, ed: Am Heart Assoc. 2013. 127(1): e6–e245.
2. Henderson K, Sligar AD, Le VP, Lee J.et al. Biomechanical Regulation of Mesenchymal Stem Cells for Cardiovascular Tissue Engineering. Advanced healthcare materials.2017; 6(22): 1700556.
3. Gallagher GL, Jackson CJ, Hunyor SN. Myocardial extracellular matrix remodeling in ischemic heart failure. Front Biosci. 2007; 12(1): 1410-1419,.
4. Remme W, Swedberg K. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic heart failure. European heart journal.2001; 22(17): 1527-156.
5. Chen Q-Z, Harding SE, Ali NN, Lyon AR, et al. Biomaterials in cardiac tissue engineering: ten years of research survey. Materials Science and Engineering: R: Reports. 2008; 59(1-6): 1-37.
6. Jawad H, Ali N, Lyon A, Chen Q, et al. Myocardial tissue engineering: a review. Journal of tissue engineering and regenerative medicine.2007; 1(5): 327-342.
7. Donato BB. Addressing the heart failure epidemic: frommechanical circulatory support to stem cell therapy. 2014.
8. Gaetani R. Cardiac tissue engineering using tissue printing technology and human cardiac progenitor cells. Biomaterials.2012; 33(6): 1782-1790.
9. Rajabi S. Human embryonic stem cell-derived cardiovascular progenitor cells efficiently colonize in bFGF-tethered natural matrix to construct contracting humanized rat hearts. Biomaterials. 2018; 154: 99-112.
10. Jalili‐Firoozinezhad S, Rajabi‐Zeleti S, Marsano A, Aghdami N, et al. Influence of decellularized pericardium matrix on the behavior of cardiac progenitors. Journal of Applied Polymer Science. 2016; 133(14):43255.
11. Teo WE, Ramakrishna S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 2006; 17(14): R89.
12. Gross BC, Erkal JL, Lockwood SY, Chen C, et al. Evaluation of 3D printing and its potential impact on biotechnology and the chemical sciences. ed: ACS Publications. 2014; 86(7):3240-53.
13. Wu H, Fan J, Chu CC, Wu J. Electrospinning of small diameter 3-D nanofibrous tubular scaffolds with controllable nanofiber orientations for vascular grafts. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2010; 21(12): 3207-3215.
14. Ayaz HGŞ, Perets A,  Ayaz  H,  Gilroy KD,et al. Textile-templated electrospun anisotropic scaffolds for regenerative cardiac tissue engineering. Biomaterials.2014;35(30): 8540-8552.
15. Ghasemi-Mobarakeh L, Prabhakaran MP, Morshed M, Nasr-Esfahani M.-H, et.al. Electrospun poly (ɛ-caprolactone)/gelatin nanofibrous scaffolds for nerve tissue engineering. Biomaterials. 2008; 29(34): 4532-4539.
16. KhaitL, Hecker L, Blan NR, Coyan G, et al. Getting to the heart of tissue engineering. Journal of cardiovascular translational research. 2008; 1(1): 71-84.
17. Boffito M, Sartori S Ciardelli G. Polymeric scaffolds for cardiac tissue engineering: requirements and fabrication technologies. Polymer International. 2014; 63(1): 2-11.
18. Ma PX. Biomimetic materials for tissue engineering. Advanced drug delivery reviews. 2008; 60(2): 184-198.
19. Wu Y, Wang L, Guo B, Ma PX. Interwoven aligned conductive nanofiber yarn/hydrogel composite scaffolds for engineered 3D cardiac anisotropy. Acs Nano. 2017; 11(6): 5646-5659.
20. Van der Schueren L, Steyaert I, De Schoenmaker B, De Clerck K. Polycaprolactone/chitosan blend nanofibres electrospunfrom an acetic acid/formic acid solvent system. Carbohydrate Polymers. 2012; 88(4): 1221-1226.
21. Pham QP, Sharma U, Mikos AG. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review. Tissue engineering. 2006; 12(5): 1197-1211.
22. Kai D, Prabhakaran MP, Jin G, Ramakrishna S. Guided orientation of cardiomyocytes on electrospun aligned nanofibers for cardiac tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 2011; 98(2): 379-386,.
23. Zheng R. The influence of Gelatin/PCL ratio and 3-D construct shape of electrospun membranes on cartilage regeneration. Biomaterials. 2014; 35(1): 152-164.
24. Shimko VF, Claycomb WC. Effect of mechanical loading on three-dimensional cultures of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 2008; 14(1): 49-58.
25. Radisic M., Park H., Gerecht S., Cannizzaro C, et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 2007; 362(1484): 1357-1368.
26. Allison S. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B.2017; 5(13): 2402-2406.
27. Tsui JH. Conductive silk–polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. 2018; 6(44): 7185-7196.
سلول و بافت
دوره 11، شماره 2
تابستان 1399
صفحه 87-99

  • تاریخ دریافت 24 شهریور 1399

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما