نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه تهران، دانشکده علوم و فنون نوین، گروه مهندسی علوم زیستی، تهران، ایران
2 پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و فناوری سلولهای بنیادی جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، گروه سلولهای بنیادی و زیست شناسی تکوینی، تهران، ایران
چکیده
هدف: در این پژوهش، تهیه یک داربست ترکیبی با دارا بودن شرایط مورد نیاز جهت رشد، تکثیر و تمایز سلولهای پروژنیتور قلبی، مورد توجه قرار گرفت.
مواد و روشها: داربست ترکیبی با نانوفیبرهای موازی از پلیمرهای پلی کاپرولاکتون و ژلاتین با درصد ترکیبی 70 به 30 و با بیشترین شباهت از لحاظ ساختار موازی نانوفیبرها، قدرت الاستیسیته و همگونی نانوفیبرها با ماتریکس خارج سلولی قلب توسط روش الکتروریسی تهیه شد. با استفاده از تصاویر میکروسکوپ الکترونی و آزمونهای زاویه تماس و آنالیز استحکام مکانیکی در جهت نانوفیبرها، داربست ترکیبی ایجاد شده، بهمنظور دارا بودن بیشترین مشخصات مورد نیاز جهت داربست قلبی، مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت از آزمون Real time-PCR بهمنظور بررسی میزان بیان ژنهای مرتبط با تمایز سلولهای پروژنیتور قلبی (MYH-6, TTN and CX-43) استفاده شد.
نتایج: آزمونهای زاویه تماس و آنالیز استحکام مکانیکی نشان داد که داربست از نظر چسبندگی و استحکام شرایط مناسبی برای کشت سلولهای پروژنیتور قلبی را دارا بوده و آزمون Real time-PCR نیز نتایج خوبی از بیان ژنهای مرتبط با ضربان سلولهای کشت داده شده بر روی داربست را در برداشت.
نتیجهگیری: از آنجاکه مهمترین تفاوت سلول قلبی با سایر سلولهای بدن در داشتن ضربان است که ژنهای خاصی مسئول همزمانسازی آن هستند، نتایج این پژوهش نشان داد که داربست تولید شده میتواند گزینه مناسبی برای القای تمایز سلولهای پروژنیتور قلبی و مهندسی بافت قلب باشد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Fabrication of Polycaprolactone-Gelatin scaffold for Cardiac Progenitor Cellsdifferentiation
نویسندگان [English]
- Z Shams 1
- B Akbari 1
- S Rajabi 2
- N Aghdami 2
1 Department of Life Science Engineering, Faculty of New Sciences and Technologies, University of Tehran, Tehran, Iran
2 Department of Cell Engineering, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: This research, design and fabrication of a composite scaffold for growth, proliferation and differentiation of Cardiac Progenitor Cells (CPCs) has been considered.
Material and method: Polycaprolactone / Gelatin composite scaffolds with a ratio of 70:30 and with the most similarities to the cardiac extracellular matrix was fabricated with aligned nanofibers. Using scanning electron microscopy (SEM), mechanical strength analysisand also contact angel test, the scaffold was investigated due to have the most necessary characteristics to be proportional for cardiac scaffold. Finally, By Real time-PCR test, the expression of the specific genes related to the Cardiac Progenitor Cells differentiation (MYH-6, TTN and CX-43) has been analyzed.
Results: Based on our results from contact angle test and mechanical strength experiments, we concluded that our designed scaffold is suitable for the culture of Cardiac Progenitor Cells on it. The Real time-PCR analysis also showed the good expression of genes associated with contraction.
Conclusion: What makes the cardiomyocytes different from other cells is their contraction related to specific cardiac genes being responsible for beating synchronization. The results of this study showed that aligned Polycaprolactone / Gelatin composite scaffold has the appropriate potential for induction of cardiac progenitor cells differentiation and application in heart tissue engineering.
کلیدواژه‌ها [English]
- Electrospun Scaffold
- Cardiac Genes Expression
- Cardiac Progenitor Cells
- Cardiac Tissue Engineering
مقدمه
بیماریهای قلبی یکی از دلایل عمده مرگومیر در دنیا محسوب میشوند بهطوریکه تقریبا 40 درصد از مرگ و ناتوانی در کشورهای پیشرفته و جهان سوم را در بر میگیرند (1). طبق تخمینهای انجام شده در سال 2013، بیشتر از 17.3 میلیون از مرگهای گزارش شده مربوط به بیماریهای قلبی بوده و انتظار میرود که این میزان در سال 2030 به 6/23 میلیون افزایش یابد (2). قلب یکی از ارگانهای پیشرفته در بدن ماست که وظیفه پمپاژ خون به سرتاسر بدن را برعهده دارد. زمانیکه بنا بههر دلیلی، خونرسانی بهقسمتی از بافت قلب بهخوبی انجام نشود، سلولهای آن قسمت از بافت میمیرند و از آنجائیکه سلولهای قلبی توانایی ترمیم ندارند، شخص دچار نارسایی قلبی میشد. در نارسایی قلبی، عملکرد قلب نیز مختل میشود (3). از گذشته تاکنون درمانهای زیادی در بیماران دارای نارسایی قلبی انجام شده است که برخی از جمله مصرف دارو، غیرتهاجمی و برخی نیز همچون آنژیوپلاستی، دستگاه حمایتکننده قلبی، پیسمیکر و درنهایت پیوند قلب، تهاجمی هستند (4، 5). در این روشها هدف اصلی، کمک به قلب است که باوجود اینکه قسمتی از سلولهای خود را از دست داده است، تاحدی عملکرد خود را بهبود بخشد و توسط دارو تا حدی از پیشرفت بیماری جلوگیری شد، ولی هیچکدام راه حلی برای ترمیم بافت از دست رفته ارائه نمیکنند. در نهایت پیوند قلبی نیز که در بیماران مرحله آخر استفاده میشود، بهعلت کمبود اهدا کننده و همینطور واکنش سیستم ایمنی بدن دچار محدودیتهای زیادی شده است. لذا در سالهای اخیر، دانشمندان بهسراغ روشهای نوین همچون سلولدرمانی و مهندسی بافت رفتهاند (5). در روشهای نوین، سعی بر آن است که سلولهای زنده بتوانند جایگزین سلولهای مرده شدند. تزریق سلولهای بنیادی بهمحل آسیب دیده یکی از روشهای مورد استفاده است که میتواند از طریق تزریق مستقیم به قسمت آسیبدیده و یا تزریق شریانی صورت گیرد (6).
این روشها مشکلاتی نیز در بردارند، بهطوریکه در صورت تزریق به شریان کرونری، تنها 15 درصد از سلولها بهمحل مورد نظر رسیده (7) و در صورت تزریق مستقیم به بافت نیز با وجود اینکه اکثر سلولها به قسمت موردنظر میرسند ولی بهعلت عدم وجود داربست مناسب برای تغذیه و رشد، میزان کمی از آنها دارای عملکرد مناسب خواهند بود. لذا ترکیب داربست و سلولهای پروژنیتور قلبی میتواند گزینه مناسبی برای درمان باشد (8-10). داربست مناسب جهت مهندسی بافت قلب باید دارای شاخصههای ذیل باشد:
از نانوفیبرهای همگون با قطر یکنواخت تشکیل شده باشد. توسط روشهای الکتروریسی و یا پرینت سه بعدی میتوان به داربستی با این مشخصه دست یافت (11، 12).
ناهمسانگرد باشد، یکی از خواص عضله قلبی آن است که بارهای مکانیکی در جهت خاصی انتقال مییابند و همین باعث شده که داربست قلبی، خواص ناهمسانگردی داشته باشد (13، 14). در روش پرینت سه بعدی میتوان حرکت نازل را بهصورتی برنامهریزی کرد که در نهایت داربستی متشکل از نانوفیبرهای موازی داشت (8). الکتروریسی بر روی ماندرول چرخان نیز یکی از روشهای تولید داربست نانوفیبری موازی است که از نظر هزینه نیز مناسبتر از روش پرینتر سه بعدی میباشد (13، 15)
چسبندگی و استحکام مناسب داشته باشد، از آنجائیکه بافت قلبی بهصورت مداوم و سیکلوار تحت نیروی کششی حاصل از انقباض و انبساط میباشد، لذا داربست مناسب باید بتواند این میزان کشش را تحمل کند و در طول زمان ترمیم، از سلولها حمایت مکانیکی داشته باشد (16). ماهیچهی قلبی، مدول یانگی در حدود 10 تا 20 کیلو پاسکال در زمان دیاستول با کشش کمتر از 10 درصد دارد که در پایان دیاستول تا 50 کیلو پاسکال در عضله قلبی سالم و تا 200 تا 300 کیلوپاسکال در قلب آسیب دیده افزایش مییابد. بنابراین داشتن یک داربست الاستومر برای استفاده در سیکلهای انقباضی بافت قلب بسیار مناسب است (17). پلیمرهای مصنوعی نهتنها خواص مکانیکی خوبی دارند بلکه نرخ تخریبپذیری قابل کنترلی را نیز دارا میباشند (15، 17). پلی کاپرولاکتون(PCL) ، یک پلیمر مصنوعی از خانوادهی پلی یورتانهاست که بهداشتن خواص الاستومری خیلی خوب شناخته شده است (18) ولی در عین حال از آنجائیکه ذاتا هیدروفوب است نمیتواند شرایط مناسبی جهت چسبندگی سلول مهیا کند، لذا ترکیب آن با یک داربست طبیعی همچون ژلاتین میتواند هر دو فاکتور چسبندگی و استحکام مکانیکی را ایجاد نماید. البته درصد ترکیب این دو پلیمر نیز اهمیت بسیار بالایی دارد. درصد انتخابی ترکیبی باید بهگونهای باشد که داربست علاوه بر داشتن استحکام مکانیکی، چسبندگی سلولی مناسبی نیز داشته باشد و در عین حال نیز همگون باشد (15، 17).
در این مطالعه با ساخت داربست نانوفیبری ترکیبی از 2 پلیمر PCL و ژلاتین با درصد ترکیب مناسب توسط روش الکتروریسی با ماندرول چرخان، سعی شده که داربست مناسبی جهت کشت سلولهای پروژنیتور قلبی ایجاد شد.
عضلهی قلبی از چندین لایه که روی هم قرار گرفتهاند، تشکیل شده است که هر لایه که از ماتریکس خارج سلولی ساخته شده است، متشکل از نانوفیبرهای موازی و همراستا میباشد (19). لذا با استفاده از روش الکتروریسی بر روی ماندرول چرخان میتوان به ساختاری مشابه با ماتریکس خارج سلولی قلبی دست یافت. در شکل 1، بستر نانوفیبری تشکیل دهنده بافت قلبی قابل مشاهده است.
علاوه بر ساختار فیزیکی داربست، یکی از عوامل مهم دیگر در بررسی کاربردی بودن داربست ایجاد شده جهت کشت سلولهای قلبی، بررسی میزان بیان ژنهای مرتبط با همزمانسازی انقباض قلبی میباشند. زیرا یکی از ویژگیهای مهم سلولهای قلبی انقباض همزمان آنها جهت خونرسانی به کلیه اعضا میباشد. در این پژوهش میزان بیان سه ژن TTN (تشکیلدهنده پروتئین Titin)، MYH-6 (تشکیلدهنده پروتئین Alpha-MHC) و GJAI (تشکیلدهنده پروتئین Connexn-43) در سلولهای پرونیتور قلبی کشت شده بر روی داربست، توسط روش Real time-PCR بررسی شد.
مواد و روشها
مواد: پلی کاپرولاکتون (PCL (MW 80,000 g/mol))، ژلاتین خوکی نوع A و محیط کشت IMDM تهیه شده از سیگما آلدریچ، اسیداستیک، اسیدفرمیک، گلوتارآلدهید، اتانول و فسفات بافرسالین (PBS) تهیه شده از مرک و آمینواسید، پنیسیلین و ال گلوتامین تهیه شده از اینویتروژن و در نهایت سرم جنین گاوی (FBS) خریداری شده از Gibco مواد مورد استفاده در این پژوهش میباشند. سلولهای پروژنیتور قلبی نیز از پژوهشگاه رویان تهیه شدند.
بهدست آوردن پارامترهای بهینه الکتروریسی جهت تهیه داربست نانوفیبری جهت دار: در ابتدا برای بهدست آوردن محلولی با غلظت پلیمر 14 درصد، حلال را که ترکیبی از اسیدفرمیک و اسیداستیک تهیه شده از MERK آلمان با نسبتهای 7 به 3 است را آماده کرده (20) (از آنجاکه اسید فرمیک ثابت دی الکتریک بالاتری دارد و برای الکتروریسی مناسبتر است بهمیزان بیشتری در حلال استفاده شد). سپس برای بهدست آوردن پارامترهای بهینه جهت الکتروریسی و داشتن نانوفیبرهای موازی و همگون، پلیمرهای PCL و ژلاتین نوع A خوکی که هر دو از کمپانی Sigma Aldrich تهیه شده بودند با نسبت PCL/Gelatin=70/30 مخلوط شده و بهحلال اضافه شد و سپس بهمدت 1 ساعت بر روی استیرر با سرعت 500 دور بر دقیقه و بدون اعمال حرارت قرار داده شد. برای تهیه داربست از محلول تهیه شده، از روش الکتروریسی استفاده شد. برای داشتن نانوفیبرهای موازی از ماندرول چرخان استفاده شد. ماندرول چرخان یکی از بهترین انتخابها برای سیستم جمع‌کننده دستگاه الکتروریسی است که با توجه چرخش، امکان تولید نانوالیاف یکنواخت را میدهد. از جمله مزایای این روش میتوان به امکان دستیابی به یکنواختی بالا و امکان تنظیم میزان آرایش‌یافتگی نانوالیاف با تنظیم سرعت چرخش ماندرول اشاره کرد. در حال حاضر انواع ماندرولها با ابعاد مختلف و با سرعتهای چرخش متغیر تا 3500 دور در دقیقه ساخته شده و آماده ارائه هستند. در این روش جهت بهدست آوردن پارامترهای بهینه الکتروریسی، با تغییر نرخ تغذیه، فاصله سوزن تا کالکتور، ولتاژ و سرعت چرخش ماندرول (21) طبق جدول 1، تعداد 6 نمونه بهدست آمد. نمونهها بهمنظور مشخص شدن مورفولوژی، میزان همگون بودن و جهتدار بودن نانوفیبرها برای تهیه تصاویر میکروسکوپ الکترونی (SEM) فرستاده شدند. برای اینکه با تابش الکترونی بتوان از سطح پلیمر تصویر تهیه کرد، بایستی روی سطح آن پوششی از طلا ایجاد میشد تا سطح رسانا شد. سپس با اعمال ولتاژ 2000 ولت از نمونهها تصویر برداری شد.
بهدست آوردن درصد ترکیبی بهینه برای دو پلیمر PCLو ژلاتین:پس از مشخص شدن پارامترهای مناسب جهت الکتروریسی و بهدست آوردن داربست با نانوفیبرهای موازی و توزیع یکنواخت، درصدهای ترکیبی مختلف از لحاظ میزان آبدوستی و همینطور استحکام مکانیکی مورد آزمایش قرار گرفتند. برایاینمنظور، 3 داربست با درصدهای ترکیبی PCL/Gelatin=80/20، PCL/Gelatin=70/30 و PCL/Gelatin=60/40 با درنظر گرفتن پارامترهای بهینه الکتروریسی تولید شدند.
بررسی خواص فیزیکی و شیمیایی داربست:با استفاده از تصاویر میکروسکوپ الکترونی، توزیع قطری داربستها و میزان پراکندگی آنها، توسط نرم افزار تحلیل آماری SPSS با هم مقایسه شد تا همگونترین حالت مشخص شد. میزان آبدوستی داربستها نیز با استفاده از روش ارزیابی زاویه تماس در 3 داربست با درصدهای ترکیبی مختلف بهدست آمد. زاویه تماس استاتیک بهروش قطره–سسایل اندازهگیری شد که در آن یک قطره بهحجم 3 میکرولیتر بر روی پلیمر قرار داده شده و هنگامی که قطره بر روی سطح پایدار شد، با دوربین از آن عکسبرداری شد. مقایسه استحکام مکانیکی در 3 درصد ترکیبی مختلف با استفاده از دستگاه اینسترون مدل TM-SM ساخت کشور انگلستان انجام شد. در ابتدا طول و ضخامت نمونهها اندازهگیری و سپس با نرخ کرنش 5 میلیمتر در دقیقه، نیروی کششی در جهت نانوفیبرها به نمونهها وارد شد (22). پس از 5 بار تکرار برای هر نمونه، نمودارهای تنش-کرنش بهدست آمده و با یکدیگر مقایسه شد.
تست سمیت سلولی:در قدم اول، رده سلولی موردنظرکه سلولهای پروژنیتور قلبی بودند، در پژوهشگاه رویان در محیط کشت IMDM برند سیگما حاوی 1 درصد ال گلوتامین اینویتروژن، آمینواسید اینویتروژن، آنتیبیوتیک اینویتروژن و 10 درصد FBS گیبکو کشت یافتند. پیش از استفاده از داربست در محیط کشت سلولی، بهمنظور جلوگیری از بههم ریختن مورفولوژی نانوفیبری آن در محیط آبی به سبب وجود پلیمر آبدوست ژلاتین، داربست در محیط حمام بخار گلوتارآلدهید 25 درصد، بهمدت 6 روز شبکهای شد. بمنظور بررسی اندرکنش سلول با داربست، در روزهای 2، 4 و 6 پس از کشت، از نمونهها تست سمیت سلولی MTS (Promega, G5421) گرفته شد تا میزان زندهمانی سلولها بررسی شد. از آنجائیکه رنگ ارغوانی حاصل از زنده مانی سلولها در طول موج 490 تا 540 نانومتر جذب میشد، لذا نمونه را تحت جذب در طول موج 490 نانومتر اشعه فرابنفش قرار دادیم تا میزان زندهمانی از روی میزان جذب در مقایسه با داربست PCL مقایسه شد.
کشت ثابت سلول بر روی داربست با نانوفیبرهای موازی: سلولهای پروژنیتور قلبی تهیه شده از پژوهشگاه رویان، بر روی داربست کامپوزیتی نانوفیبری بهتعداد 2 میلیون در مساحت 2 سانتیمتر مربعی داربست، تزریق شده و در محیط کشت قرار گرفتند. بهمنظور فراهم آوردن شرایط محیطی مناسب جهت رشد و تمایز سلولها، دما، رطوبت، اکسیژن و pH محیط نیز باید کنترل میشد. بهمدت 7 روز سلولهای کشت داده شده بر روی داربست در داخل انکوباتور قرار گرفتند. پس از گذشت یک هفته از کشت سلولی، قسمتی از داربست برای تهیه تصاویر میکروسکوپ الکترونی و قسمتی نیز برای انجام تست Real Time PCR فرستاده شد.
آنالیز تصاویر میکروسکوپ الکترونی حاصل از جهتگیری سلولهای پروژنیتور قلبی بر روی داربست: قسمتهایی از نمونه اصلی داخل محلول فیکساتور قرار گرفت تا جای سلولها بر روی داربست ثابت شود. سپس بهترتیب با الکلهای 30 درصد، 50 درصد، 70 درصد، 80 درصد و 90 درصد هر کدام بهمدت 10 دقیقه و سپس دوبار و هربار بهمدت 10 دقیقه نیز در الکل 100 درصد قرار داده شد تا آب داخل سلولها با الکل جایگزین شود. پس از خشک شدن کامل نمونه ، از آن تصاویر میکروسکوپ الکترونی تهیه شد.
آنالیز بیان ژنهای قلبی با روش Real Time PCR:در این پژوهش، 3 ژن TTN، MYH-6 و GJA1 در سلولهای کشت داده شده بر روی داربست، توسط تست Real Time PCR مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفتند. طراحی پرایمرها جهت انجام تست طبق جدول 3 انجام شد.
در انجام این تست از کیت استخراج RNA برند Qiagen و کیت سنتز cDNA برند Thermo استفاده شد. تستReal Time PCR برای دو نمونه کنترل (سلولهای قلبی فاقد داربست) و نمونه اصلی(کشت بر روی داربست)، با 4 بار تکرار انجام شد و باتوجه به واریانس کمتر از 1 درصد، داده ها در سطح 1 درصد معنیدار شدند.
نتایج
بررسی تصاویر میکروسکوپ الکترونی حاصل از تغییر پارامترهای الکتروریسی
همانطور که در بخش قبل توضیح داده شد الکتروریسی بر روی ماندرول چرخان، یکی از روشهای کاربردی برای ساخت داربستهای نانوفیبری دو بعدی با نانوفیبرهای یکنواخت و جهتدار میباشد. در تنظیمات دستگاه عواملی همچون نرخ تغذیه، فاصله سوزن تا کالکتور، ولتاژ و سرعت چرخش ماندرول باید بهینه شد. در این مطالعه از آنجاییکه بافت هدف، ماتریکس خارج سلولی قلبی میباشد، باید با انتخاب پارامترهای الکتروریسی مناسب بتوانیم تا حد امکان به داربستی با نافیبرهای موازی و همگون دست پیدا کنیم که با بیشترین شباهت را از نظر فیزیکی و ساختار با ماتریکس قلبی (شکل 1) داشته باشد.
شکل 1: تصویر بستر فیبری تشکیل دهنده‌ی بافت قلبی بهکمک تصویربرداری رزونانس مغناطیس با تنسور نفوذ کننده (17)
لذا، با تغییر پارامترهای الکتروریسی طبق جدول 1، داربست های شکل 2 تولید شد تا بتوان با اطمینان، بهترین داربست را جهت کشت سلولی انتخاب کرد.
جدول1:ساخت 6 داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30با تغییر پارامترهای مختلف الکتروریسی. غلظت داربست (w/v)14 درصد بوده و فرآیند الکتروریسی در دمای محیط انجام گرفت.
|
نمونه |
نرخ تغذیه |
فاصله سوزن تا کالکتور |
ولتاژ |
سرعت چرخش ماندرول |
|
الف - 1 |
0.1 |
15 |
17 |
2000 |
|
الف - 2 |
0.2 |
12 |
15 |
2000 |
|
ب - 1 |
0.1 |
12 |
12 |
1800 |
|
ب - 2 |
0.3 |
10 |
17 |
1500 |
|
ج - 1 |
0.3 |
10 |
17 |
2000 |
|
ج - 2 |
0.3 |
10 |
17 |
2500 |
شکل2:تصاویر میکروسکوپ الکترونی داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30 با پارامترهای مختلفالکتروریسی مشخص شده در جدول (1)
بررسی توزیع قطری نانوفیبرها با درصدهای ترکیبی مختلف
یکیدیگر از نتایج جالب در این مطالعه رابطه ناهمگونی الیاف با افزایش ژلاتین میباشد. در نمونههای حاصل از الکتروریسی با پارامترهای بهینه و با درصدهای ترکیبی مختلف PCL/Gelatin=80/20، PCL/Gelatin=70/30 و PCL/Gelatin=60/40، پس از تهیه تصاویر میکروسکوپ الکترونی طبق شکل3، نمودارهای توزیع قطری تهیه شد.
شکل3:تصاویر میکروسکوپ الکترونی و درصد توزیع قطری داربست ترکیبی پلی کاپرولاکتون-ژلاتین با درصدهای ترکیبی (الف)PCL/Gelatin=60/40، (ب) PCL/Gelatin=70/30و (ج)PCL/Gelatin=80/20
نتایج حاصل از ارزیابی زاویه تماس و استحکام مکانیکی
علاوه بر همگونی و جهت دار بودن نانوفیبرها، برای دستیابی به بهینهترین درصد ترکیبی لازم بود که داربستها از لحاظ استحکام مکانیکی و میزان چسبندگی سلولی نیز مورد بررسی قرار گیرند.
چسبندگی سلولی داربست توسط آزمون زاویه تماس اندازه گیری شد و نتایج حاصل از ارزیابی زاویه تماس در شکل (4-الف) نشان داده شده است.
در ادامه بهمنظور ارزیابی استحکام مکانیکی، داربستها تحت کشش 5 میلیمتر در دقیقه در جهت نانوفیبرهای موازی قرار گرفتند. پس از 5 بار تکرار برای هرنمونه، نتایج بهصورت نمودار تنش-کرنش برای هر یک از نمونهها مورد بررسی قرار گرفت (شکل4-ب).
نتایج حاصل از تستهای استحکام مکانیکی و زاویه تماس بهصورت مقایسه ای نیز در جدول 2 آورده شده است.
جدول 2:مدول یانگ و زاویه تماس داربست های ترکیبی پلی کاپرولاکتون- ژلاتین با درصدهای مختلف
|
نسبت ترکیب |
مدول یانگ |
زاویه تماس |
|
60/40 |
200 |
97/38˚ |
|
70/30 |
460 |
96/46˚ |
|
80/20 |
504 |
71/68˚ |
نتایج حاصل از تست سمیت سلولی
جهت انجام کشت سلول بر روی داربست، لازم است که قبل از آن ثابت شد که تست سمیت سلولی برای داربست بررسی شود. نتایج حاصل از تست سمیت سلولی MTS، در شکل(4-ج) مشخص میباشد.
شکل 4:ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی داربست، (الف) اندازهگیری زاویه تماس در داربستهای ترکیبی 1) PCL/Gelatin=60/40، 2) PCL/Gelatin=70/30و 3) PCL/Gelatin=80/20، (ب) نمودار تنش-کرنش داربستهای نانوفیبری ترکیبی و(ج)نمودار زندهمانی سلولها بر روی داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30 در روزهای دوم، چهارم و ششم با واریانس کمتر از 1 درصد،PCL بهعنوان داربست کنترل استفاده شد(تعداد تکرار=12).
نتایج حاصل از اندرکنش سلول با داربست
تصاویر میکروسکوپ الکترونی در روز هفتم از داربست طبق شکل 5 تهیه شد که چسبندگی سلولهای پروژنیتور قلبی بر روی داربست را در جهت نانوفیبرها نشان میدهد.
شکل 5: تصاویر میکروسکوپ الکترونی حاصل از سلولهای پروژنیتور قلبی کشت داده شده بر روی داربست نانوفیبری ترکیبی PCL/Gelatin=70/30 پس از هفت روز کشت ثابت در داخل انکوباتور
نتایج حاصل از آزمون Real time-PCR
پس از کشت 7 روزه سلولهای پروژنیتور قلبی بر روی داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30 در داخل انکوباتور، سلولها جهت انجام آزمون Real Time PCR آماده شد و طبق نمودار شکل 6، میزان بیان ژنهای TTN (تشکیل دهنده پروتئین Titin) و MYH-6 (تشکیلدهنده پروتئین Alpha-MHC) و همینطور ژن GJAI(تشکیلدهنده پروتئین Connexn-43 بررسی شد. توالی پرایمرهای تهیه شده جهت آزمون Real Time PCR، بهشرح جدول 3 میباشد.
جدول3:توالی پرایمرها جهت سه ژن TTN، MYH-6 و GJA1 بهمنظور استفاده در آنالیز Real Time PCR.
|
Primer Name |
Oligo Sequence 5'………3' |
Length (bp) |
Tm (°C) |
Product length |
|
TTN-F |
ATCATCAATGTAGCACCGAGT |
21 |
59.1 |
120 |
|
TTN-R |
AAAAGCCCAAGAAATCAACCAAC |
23 |
59.2 |
|
|
MYH6-F |
GCCCACTTCTCCCTGATCCAC |
21 |
62.2 |
195 |
|
MYH6-R |
CTTGCCTCCTTTGCTTTTACCAC |
23 |
61.2 |
|
|
CX43-F (GJA1) |
CCAATCTCTCATGTGCGCTTC |
21 |
59.0 |
105 |
|
CX43-R (GJA1) |
CAGTTTCTCTTCCTTTCGCATC |
22 |
58.1 |
شکل6: نمودار نتایج آنالیز Real Time PCR برای سه ژن MYH-6، TTN و CX-43 در سلولهای پروژنیتور قلبی کشت داده شده بر روی داربست الکتروریسی ترکیبی با نانوفیبرهای موازی و مقایسه با نمونه کنترل (سلول های پروژنیتور قلبی) p<0.01، n=4.
بحث
بررسی تصاویر میکروسکوپ الکترونی حاصل از تغییر پارامترهای الکتروریسی
با بررسی تصاویر میکروسکوپ الکترونی حاصل از داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30 با تغییر پارامترهای مختلف الکتروریسی(شکل2)، میتوانیم بهنتایج زیر دست یابیم:
با کاهش نرخ تغذیه پلیمر و افزایش فاصله سوزن تا کالکتور، همانطورکه در نمونههای (الف-1) و (الف-2) از شکل2 مشخص است، قطر نانوفیبرها بهمیزان زیادی کاهش پیدا کرده و تا حدی همگون بودن الیاف از دست رفته است.
با کاهش ولتاژ، همانطور که در نمونه (ب-1) مشخص است، نانوفیبرها تا حد بسیار زیادی بهصورت از هم گسسته و با توزیع قطری ناهمگون بر روی جمع کننده قرار گرفتند و این نشان میدهد که این ولتاژ برای تشکیل مخلوط تیلور در فرآیند الکتروریسی کافی نبوده است (21).
وقتی از منظر سرعت چرخش ماندرول، به تصاویر نگاه میکنیم، این نتیجه حاصل میشد که افزایش سرعت چرخش ماندرول وقتی که از حدی بیشتر شده است، نهتنها باعث جهت دار شدن بیشتر نمونهها نشده بلکه باعث پخش شدن پلیمر در اطراف کالکتور شده و همانطور که در تصویر (ج-2) مشخص است، نانوفیبرهایی در خلاف جهت نانوفیبرهای موازی بهصورت ناهمگون بر روی سطح داربست تشکیل شده است. متقابلا اگر سرعت چرخش ماندرول از حدی کمتر باشد، همانند نمونه (ب-2)، شاهد داربستی با درصد کمی از جهت آرایی خواهیم بود.
با توجه بهمطالب مذکور، نمونه (ج-1) بهعنوان مناسبترین داربست انتخاب شده و بهترین پارامترهای الکتروریسی بهاین روش مشخص شدند.
بررسی توزیع قطری نانوفیبرها با درصدهای ترکیبی مختلف
همانطور که در نمودارها و تصاویر SEM شکل3 مشخص است، با افزایش درصد ژلاتین، ناهمگونی نانوفیبرها افزایش پیدا کرده است (15). بنابراین با توجه به این موضع مشخص است که با وجود اینکه با افزایش ژلاتین در ترکیب داربست، میتوان بهمیزان موثرتری از چسبندگی سلولی دست پیدا کرد، ولی همگونی داربست کاهش مییابد. لذا میبایست درصد مشخصی از میزان ژلاتین انتخاب شد تا داربست ایجاد شده علاوه بر همگونی نانوفیبرها، چسبندگی قابل قبولی را نیز دارا باشد.
علاوه بر همگونی و جهتدار بودن نانوفیبرها، برای دستیابی به بهینهترین درصد ترکیبی لازم بود که داربستها از لحاظ استحکام مکانیکی و میزان چسبندگی سلولی نیز مورد بررسی قرار گیرند.
نتایج حاصل از ارزیابی زاویه تماس و استحکام مکانیکی
همانطور که انتظار میرفت، نتایج حاصل از ارزیابی زاویه تماس در شکل (4-الف) نشان داد که با افزایش میزان ژلاتین که یک پلیمر آبدوست است، زاویه تماس کاهش پیدا کرده و بنابراین چسبندگی سلولی افزایش یافته است (15). نمودار (4-ب) نشان داد که با افزایش درصد PCL، شیب نمودار تنش-کرنش و مدول الاستیسیته افزایش یافته است (15، 23). نقطه شکست در داربست با درصد PCL بیشتر نیز با میزان درصد کشش بیشتری اتفاق میافتد (23). درنهایت با بررسی نتایج حاصل از آزمایشهای زاویه تماس و استحکام مکانیکی و همین طور تصاویر SEM، باید بهترین درصد ترکیبی برای داربست تعیین میشد. با توجه به تصاویر SEM شکل 3 و همینطور دادههای موجود در جدول 3، داربست PCL/Gelatin=70/30 هم از لحاظ همگون بودن نانوفیبرها مناسب بود و هم از لحاظ میزان چسبندگی سلولی و استحکام مکانیکی میتوانست داربست مناسبی جهت مهندسی بافت قلب باشد. بنابراین داربست ترکیبی PCL/Gelatin=70/30، با زاویه تماس 96/46 درجه و نقطه شکست با 17 درصد کشش بهعنوان داربست مورد استفاده جهت کشت سلولی انتخاب شد. از آنجائیکه ماهیچه قلبی مدول یانگی در حدود 10 تا 20 کیلو پاسکال در زمان دیاستول با کشش کمتر از 10درصد دارد (17)، بنابراین داربست ایجاد شده برای استفاده در سیکلهای انقباضی بافت قلب مناسب است.
نتایج حاصل از تست سمیت سلولی
نتایج حاصل از تست سمیت سلولی MTS، در شکل (4-ج) که در روزهای دوم، چهارم و ششم بر روی داربست ترکیبی PCL/Gelatin و داربست کنترل PCL بهدست آمده است، نشان داد که تعداد سلولهای کشت داده شده بر روی داربستها بهمرور زمان افزایش پیدا کرده و البته در مقایسه با داربست کنترل، میتوان فهمید که افزودن ژلاتین، باعث افزایش چسبندگی سلولی شده است.
نتایج حاصل از اندرکنش سلول با داربست
تصاویر میکروسکوپ الکترونی در روز هفتم از داربست طبق شکل 5 تهیه شد که چسبندگی سلولهای پروژنیتور قلبی بر روی داربست را در جهت نانوفیبرها نشان میدهد. تصاویر میکروسکوپ الکترونی در روز هفتم، با مشخص بودن چسبندگی سلولهای پروژنیتور قلبی بر روی داربست در جهت نانوفیبرها، نشان داد که سلولها بهمیزان مناسبی بر روی داربست مورد نظر رشد و تکثیر یافتهاند و این نشانگر آن است که داربست تهیه شده شرایط مطلوب مشابه با ماتریکس خارج سلولی را برای سلولها فراهم نموده است.
نتایج حاصل از آزمون Real time-PCR
پس از هفت روز کشت سلولی، میزان بیان ژنهای TTN (تشکیل دهنده پروتئین Titin) و MYH-6(تشکیلدهنده پروتئین Alpha-MHC) که هر دو موثر در انقباض عضله قلبی هستند و همینطور ژن GJAI (تشکیلدهنده پروتئین Connexn-43) که یکی از ترکیبات Gap-Junction بوده و در منظمسازی روابط بین سلولی و همینطور انقباض همزمان سلولهای قلبی نقش بهسزایی دارد، بررسی شد (24، 25). در نتایج حاصل، واضح است که بیان ژنهای مذکور در سلولهای پروژنیتور قلبی کشت داده شده بر روی داربست بهخوبی انجام شده و این نشانگر تمایز مناسب این سلولها بهسمت سلولهای بالغ قلبی میباشد. سه ژن مورد بررسی در این پژوهش، با بررسی و مقایسه مقالات قبلی در زمینه تمایز سلول های قلبی انتخاب شد. در سایر مقالات بهمیزان زیادی به بحث بیان بیشتر و موثرتر ژن GJAI(تشکیلدهنده پروتئین Connexn-43) پرداخته شده است (26، 27). ولی در هیچ کدام بهصورت جامع، اثر داربست مناسب بر میزان بیان هر سه ژن موثر در انقباض و ضربان عضله قلبی شامل TTN، MYH-6 و GJAI در سلولهای پروژنیتور قلبی مورد بحث و بررسی قرار نگرفته است.
نتیجهگیری
هدف از این آزمایش، ساخت یک داربست بهمنظور شبیهسازی مناسب ماتریکس خارج سلولی قلبی در محیط آزمایشگاه بود. ماتریکس خارج سلولی قلبی از لایههای نانوفیبری روی هم قرار گرفته، تشکیل شده است. همانطورکه از تصاویر حاصل از تصویربرداری رزونانس مغناطیس با تنسور نفوذ کننده (شکل 1)، مشخص است هر یک از لایه های تشکیل دهنده این ماتریکس از نانوفیبرهای موازی و هم جهت تشکیل شده که وظیفه انتقال نیروی الکتریکی حاصل از انقباض سلولی را در یک جهت خاص برعهده دارند. داربست دو بعدی متشکل از نانوفیبرهای موازی اگر بتواند از نظر چسبندگی سلولی و استحکام مکانیکی مشابه با ماتریکس خارج سلولی قلبی عمل کند، میتواند شرایط مناسبی برای رشد، تکثیر و تمایز سلولهای پروژنیتور قلبی را ایجاد نماید.
با استفاده از الکتروریسی پلیمرهای PCL و ژلاتین بر روی ماندرول چرخان، توانستیم داربستی دوبعدی با نانوفیبرهای موازی با توزیع قطری یکنواخت و همگون و همینطور با چسبندگی سلولی و استحکام مکانیکی مناسب تولید کنیم که از نظر خواص شیمیایی و فیزیکی تا حدی شبیه به ماتریکس خارج سلولی قلبی باشد. سپس با کشت سلولهای پروژنیتور قلبی بر روی داربست و بررسی تصاویر میکروسکوپ الکترونی پس از 7 روز کشت سلولی، شاهد جهتگیری سلولها در جهت نانوفیبرهای موازی بودیم و همچنین رشد و تکثیر سلولها نیز از تصاویر حاصل شده کاملا مشهود بود. جهتگیری منظم سلولها بر روی داربست دو بعدی و تقویت روابط بین سلولی توانست به تمایز سلولهای پروژنیتور قلبی کمک کند بهطوریکه پس از بررسی نتایج حاصل از آزمون Real-time PCR و میزان بیان ژنهای TTN، MYH-6 و Connexn-43 مشخص شد که که ژنهای مربوط به همزمانسازی انقباض قلبی و رابطه منظم بین سلولی، بهمیزان بیشتری در این سلولها بیان شده و لذا این داربست سلولی میتوانند گزینه مناسبی برای پیوند به بافت آسیب دیده قلبی باشند.
)