مقدمه

به‏طور یقین در زیست شناسی حیوانات آبزی، بافت پوششی روده ماهی یکی ازپیچیده‏ترین بافت های بدن جهت حمل ونقل مواد است. این بافت پوششی به گونه‏ای طراحی شده است که به‏طور هم‏زمان انتقال الکترولیت‏ها، اسید و باز، مواد آلی و آب را انجام می‏دهد. روده مکان عمده هضم غذاست و ساختار آن، با توجه به تنوع وسیع عادات غذایی و وظایف آن بسیار گوناگون است. قابل مشاهده‏ترین تفاوت میان ماهیان، طول روده (از اسفنگتر پیلور تا مخرج) است. در بعضی از گونه ها، مشخصا در گونه‏های گوشت خوار طول روده ممکن است تنها حدود 20 درصد طول بدن باشد. در این ماهیان روده مستقیما از معده تا مخرج کشیده شده است. ماهیان بر خلاف سایر مهره‏داران فاقد کولون یا روده بزرگ مشخص هستند و وظایفی را که به‏عنوان مشخصه روده کوچک در نظر گرفته می‏شود مانند هضم و جذب در واقع از اسفنگتر پیلور تا مخرج قابل تشخیص است. جهت افزایش ناحیه سطحی لازم برای هضم و جذب مواد غذایی، تغییرات ساختاری در روده ماهیان مشاهده می‏شود. به‏عنوان مثال در آزاد ماهیان بافت مخاطی روده ضخیم شده و همچنین زوائد پیلوریک یا باب‏المعده‏ای در ابتدای روده واقع شده اند (1 و 2).

اگر چه ساختار روده در بین ماهیان بسیار متفاوت است، اما وظایف مربوط به آن‏ها نسبتا در بین گونه‏ها ثابت است. مواد غذایی که وارد روده می شوند با ترشحات حاصل از خود روده و یا سایر اندام ها نظیر کبد، کیسه صفرا و لوزالمعده مخلوط می‏شوند. این ترشحات برای تجزیه مواد غذایی ضروری هستند و شامل آنزیم های گوارشی و سایر اجزایی هستند که فعالیت‏های آنزیم‏ها را با تغییرات در محیط شیمیایی افزایش می دهند. سایر ترشحات اندازه ذرات را کاهش می‏دهند. برای مثال اسید‏های صفراوی حاصل از کیسه صفرا، چربی‏ها را همگن می‏کنند و همچنین نواحی سطحی قابل دسترس برای تاثیر آنزیم‏های لیپاز را بسیار زیاد می‏کنند. فرآیند‏های هضم که در مجرای داخلی روده اتفاق می‏افتد، پلی‏مرهای پیچیده موجود در مواد غذایی (برای مثال، پروتئین‏ها، چربی‏ها و مواد قندی) را کاهش می‏دهد و آن‏ها را به اجزای کوچک‏تر تبدیل می‏کند (1 و 3). مراحل انتهایی هیدرولیز در سطح غشای سلول‏های روده‏ای (آنترسیت‏ها) یا نزدیک به آن‏ها روی می‏دهد و منجر به آزاد شدن واحد‏های ساختمانی پلی‏مرها (برای مثال، مونوساکاریدها، اسیدهای آمینه، اسیدهای چرب، مونو گلیسریدها) می‏شود که در نتیجه توسط سلول‏های روده‏ای جذب می‏شوند (1 و 4 و 5).

وظایف گوارش شامل سه مورد از جمله تحرک، ترشح و جذب است که نیاز به تنظیم دارد. تنظیم این سه وظیفه دستگاه گوارش توسط فعالیت‏های توام پیام‏های دستگاه عصبی و پیام‏های شیمیایی صورت می‏گیرد. پیام‏های دستگاه عصبی ممکن است از دستگاه عصبی مرکزی منشا گیرد و از طریق دستگاه عصبی مستقل (اتونومیک) اعمال شود اما از دستگاه عصبی روده‏ای مرتبط با دستگاه گوارشی نیز ممکن است صورت گیرد (1 و 5).

با توجه با مطالب فوق، مطالعه دستگاه گوارش ماهی و به‏ویژه بافت روده به‏عنوان یکی از پیچیده‏ترین بافت‏های بدن ماهی می‏تواند از نظر بافت شناسی، کالبد شناسی مقایسه‏ای، فیزیولوژی و زیست‏شناسی آبزیان بسیار حائز اهمیت باشد. همچنین مطالعه چگونگی عمل‏کرد بافت روده در هنگام برخورد با عوامل بیماری‏زا و غیر بیماری‏زا مانند پروبیوتیک‏ها و پربیوتیک‏ها، مواد غذایی و یا مواد سمی و داروهای گوناگون از نظر فرآیند عملی آن بسیار مهم است. از طرف دیگر مطالعه مستقیم بر روی هر موجود زنده و همچنین ماهی دارای مشکلاتی است که از آن جمله می‏توان به موارد زیر اشاره نمود: یکی از این موارد تاثیر عوامل ناخواسته داخلی و خارجی در حین انجام آزمایش بر روی بدن ماهی زنده است. مورد دوم وجود قانون حمایت از حیوانات (Animal Welfare)، و البته رعایت آن در هنگام انجام آزمایش است. بدین‏گونه که ماهیان به‏خاطر داشتن گیرنده‏های اپیوئیدی و ساختار مغزی، قدرت درک و احساس درد را داشته و بنابراین مطالعه مستقیم بر روی دستگاه‏های مختلف بدن ماهی دردناک بوده، که این امر بر خلاف قانون حمایت از حیوانات است. مورد دیگر آن است که آزمایش بر روی ماهی زنده نیازمند استفاده از تعداد نسبتا زیاد ماهی است و از آنجا که ماهیان دارای حساسیت و ادراک هستند، کوشش می‏شود که در ابتدا تعداد ماهیان مورد آزمایش را کاهش داده و هم‏چنین در تحقیقات از روش‏های آزمایشگاهی جایگزین (Alternative models) به‏جای ماهی زنده به‏منظور کاهش استرس و درد در این گونه جانوری استفاده نمود (4، 5 و6). بدین منظور، امروزه روش‏ها و مدل‏های آزمایشگاهی دستگاه‏های مختلف بدن جانوران، کاربرد بسیاری در تحقیقات پزشکی، دامپزشکی وعلوم زیستی پیدا کرده است. به‏وسیله این روش‏های آزمایشگاهی می‏توان اندام‏ها، بافت‏ها و یا قسمتی از اندام‏های مختلف بدن موجودات گوناگون را در بیرون بدن حیوان در آزمایشگاه، زنده نگه‏داشت و آزمایش‏های مختلفی را بدون ایجاد ناراحتی در حیوان با رعایت حقوق حیوانات بر روی آن‏ها انجام داد (6 و 7 و 8).

تاکنون، مدل‏های مختلف تزریق به روده (perfusion models) مانند مدل باز(open)، نیمه باز (semi-open)، بسته (closed)، تزریق به یک قسمت روده گره‏خورده (tied loop) درطول عمل جراحی و همچنین تزریق کولورکتال (colorectal perfusion) مورد استفاده محققیق قرار گرفته اند. با این حال مشکلات متعددی در حین استفاده از این روش‏های تزریقی مانند نشت محلول تزریقی، بروز ادم و از دست دادن موکوس و بافت مخاطی ممکن است ایجاد شود. ضمنا در اکثر این روش‏ها بررسی بافت‏شناسی بافت روده متعاقب تزریق که می‏تواند یک شناسه بسیار خوب برای مطالعه خصوصیات طبیعی و بقا سلولی بافت روده باشد، نادیده گرفته شده است (9و10 و11و 12و13و14). با توجه به موارد فوق، در مطالعه حاضر، مدلی آزمایشگاهی با هدف، مطالعه بافت شناسی و ریخت شناسی بافت اپی‏تلیوم روده ماهی قزل آلای رنگین کمان در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی طراحی شد.

مواد و روشها

تعداد 20 قطعه ماهی قزل آلای رنگین کمان با میانگین وزن 750 گرم و میانگین طول 38 سانتی‏متر تهیه شد. ماهی‏ها در تانک‏های جداگانه با ظرفیت تقریبا1000 لیتر که دارای سیستم جریان آب (14 تا 16 درجه سانتی‏گراد) هوا دهی شده نیز بود، به مدت یک هفته قبل از شروع آزمایش، نگهداری شدند.ماهی‏ها تا مدت دو روز قبل از شروع آزمایش، روزانه به‏وسیله خوراک تجاری تغذیه می‏شدند. برای اطمینان از سلامت ماهیان، از پوست، باله و آبشش آن‏ها گسترش مرطوب تهیه گردید و هیچ‏گونه آلودگی انگلی مشاهده نشد. برای بی‏هوش کردن ماهیان از محلول بنزوکائین (اتیل آمینو بنزوات) در اتانول (1/0 گرم در 1 میلی‏لیتر) استفاده شد .ماهیان به‏طور متوسط ظرف مدت 4 تا 5 دقیقه بی‏هوش شدند. سپس به‏صورت داخل صفاقی در فاصله بین باله سینه‏ای و باله شکمی با زاویه 45 درجه،  (IU/kg) 5000 هپارین به آن‏ها تزریق شد. در ادامه ماهیان را در آب تازه و هوادهی شده قرار داده تا به‏هوش آمدند. ماهیان به‏طور متوسط ظرف مدت 5 دقیقه به‏هوش آمده و به‏مدت 40 دقیقه رها شدند تا هپارین وارد دستگاه گردش خون شده و در بدن ماهی پخش شود. سپس ماهی‏هابا استفاده از دوز بالای محلول بنزوکائین کشته و به میز جراحی انتقال داده شدند.

با هدف خارج کردن روده‏ها، محوطه بطنی را از سطح جانبی باز کرده و در عین حال به این نکته باید توجه کرد که به روده آسیب نرسد. سپس با دقت روده را به‏منظور پیدا کردن عروق خونی از محوطه بطنی بیرون کشیده و دو سرخرگ روده‏ای پشتی و شکمی بعد از زوائد باب المعدی نمایان شدند. سپس سرخرگ پشتی یا شکمی هر قطعه روده را با لوله پلی اتلین بلندی (20 سانتی‏متر) که در انتهای آن سر سوزنی (5/1 سانتی‏متر) با درجه 22 قرار داده شده بود، کانال گذاری کرده به‏گونه ای که در حدود 3/0 تا 4/0 سانتی‏متر از طول سر سوزن در داخل سرخرگ قرار گیرد و سپس با نخ ابریشم 0/2 روده محکم گره زده شد تا سر سوزن خارج نشود. قطعات روده متعاقبا برای تزریق محلول‏های جایگزین شونده خون مورد استفاده واقع شدند. مایعات تزریقی گوناگون مانند رینگر، کورتلند، رینگر+ آدرنالین (3/0 میلی‏گرم در لیتر) و کورتلند+ آدرنالین (3/0 میلی‏گرم در لیتر) مورد آزمایش قرار گرفتند (جدول 1).

محلول نمکی کورتلند، محلولی است که برای بافت های ماهیان آب شیرین طراحی شده و مورد استفاده قرار می گیرد (6 و19). قطعه‏ای از روده به‏عنوان قطعه‏ای که در آن هیچ مایعی تزریق نشد در محلول رینگر در دمای 14 تا 16 درجه سانتی‏گراد به‏عنوان کنترل منفی قرار داده شد. هر قطعه روده به‏صورت مجزا داخل حمامی که هوا دهی میشد، به‏صورت معلق

جدول1: ترکیبات محلول های رینگر و کورتلند مورد استفاده در مطالعه حاضر

قرار گرفته شد. این حمام شامل محفظه‏ای بود که با محلول رینگر پرشده و به‏وسیله محفظه آبی (آکواریوم) با درجه حرارت 14 تا 16 درجه سانتی‏گراد احاطه می‏شد. سپس از یک ست سرم که تقریبا در ارتفاع 60 سانتی‏متر بالای حمام واقع شده بود، استفاده شد تا مایع جایگزین مورد نظر از طریق سرخرگ به قطعه روده تزریق شود (شکل 1).

شکل 1: نمای طرح کلی مدل آزمایشگاهی تزریق به روده ماهی A: کیسه مایع تزریقی، B: پیچ کنترل، C: سیستم سرد کننده، D: حمام رینگر، E: هواده، F: آکواریوم، G: قطعه روده ماهی

همان طور که قبلا بیان شد، در این مطالعه از چهار محلول جایگزین شونده خون برای زنده ماندن بافت روده ماهی در حالت آزمایشگاهی (in vitro) استفاده گردید و هر آزمایش 3 بار تکرار شد.

زمان برای هر آزمایش 60 و 180 دقیقه در نظر گرفته شد. پس از اتمام هر آزمایش برای بررسی وضعیت ریخت شناسی و بافت شناسی روده‏ها، از قطعات روده که در آن مایع جایگزین شونده تزریق شده بود و همچنین نمونه‏های کنترل (کنترل مثبت، کنترل منفی)، نمونه‏های بافت شناسی و میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) تهیه شد. جهت تهیه نمونه‏های بافت شناسی، یک قطعه کوچک از روده قطع شده و داخل بافر فرمالین 10 درصد به مدت 24 ساعت قرار داده شد. سپس بعد از آماده سازی بافت از آن‏ها برش‏هایی به عرض 5 میکرومتر تهیه و با رنگ هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ‏آمیزی شد. نمونه‏های تهیه شده با میکروسکوپ نوری مورد بررسی بافت شناختی قرار گرفتند.

برای تهیه نمونه‏های میکروسکوپ الکترونی روبشی، نمونه‏ها تا حد 5 میلی‏متر برش داده شدند زیرا محلول‏های تثبیت کننده و خشک کننده به‏سرعت قادر به نفوذ در نمونه‏های ضخیم‏تر نیستند. سپس نمونه‏ها در هیدروکسیل اتیل پیپرازین اتان سولفونیک اسید (HEPES) بافر (3/7  , pH1/0 مولار) حاوی 5/2 درصد گلوتارآلدهاید ((glutaraldehyde و 2 درصد پارافورمالدهاید (paraformaldehyde) قرار داده شدند و در آب مقطر حاوی 1 درصد اسمیم تتراکسید(osmium tetroxide) ثابت شد. بعد آب نمونه‏ها به‏وسیله الکل و استون گرفته شده و توسط دی اکسید کربن مایع مواد خشک کننده به‏طور کامل از نمونه‏ها جدا شدند. سپس نمونه‏ها با لایه‏ای از کربن و آلومینیوم آغشته شده و با لایه‏ای از پلاتین اندود شدند. بعد هر نمونه در یک قاب استوار قرار داده شده و سپس به‏وسیله میکروسکوپ الکترونی روبشی(JEOL, Tokyo, Japan)   مورد مطالعه قرارگرفتند.

نتایج

مطالعه حاضر به‏‏منظور ارزیابی، قابلیت زنده نگه‏داشتن بافت روده در بیرون بدن ماهی، با استفاده از محلول‏های جایگزین شونده خون و مقایسه این محلول‏ها، در دو فاصله زمانی 60 و 180 دقیقه صورت گرفت. نتایج به‏دست آمده از این مطالعه به‏طور مختصر در جدول 2 نشان داده شده است.  قطعاتی از روده که بلافاصله پس از کشتن ماهی، برش خورده و داخل بافر فرمالین قرار گرفتند (کنترل مثبت)، دارای اپی‏تلیوم سالم به‏همراه سلول‏های جامی  (Goblet cells)کاملا مشخص و حاشیه مسواکی سالم و دست نخورده (Intact brush border) بودند (شکل2و 3).

شکل2:  بافت طبیعی روده (کنترل مثبت)، که در آن اپی‏تلیوم سالم A))، سلول‏های جامی (Goblet cells) (B) و حاشیه مسواکی سالم و دست نخورده  (C) مشخص شده اند. رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین. بزرگنمایی × 160.

شکل3: بافت طبیعی روده (کنترل مثبت)، که در آن اپی‏تلیوم سالم و دست نخورده(A) و موکوس( B)مشخص شده‏اند و ساختار کلی بافت روده سالم و بدون صدمه است (µm20 = مقیاس)

در قطعات روده تزریق نشده، که بعد از 60 دقیقه در داخل بافر فرمالین 10درصد قرار گرفتند (کنترل منفی)، دژنراسیون شدید، جدا شدگی شدید در اپی‏تلیوم روده و نهایتا نکروز بافتی مشاهده گردید. در بعضی نمونه‏ها حالت پیکنوز و کاریورکسی متعاقب نکروز بافتی نیز دیده شد (شکل 4). همچنین در این نمونه‏ها بعد از 180 دقیقه، تقریبا به‏طور کامل ساختار بافت روده از بین رفته بود و نکروز به‏طور وسیع مشاهده گردید ( جدول 2).

شکل4: بافت روده تزریق نشده بعد از 60 دقیقه (کنترل منفی)، دژنراسیون شدید، جدا شدگی شدید در اپی‏تلیوم روده و در نهایت پیکنوز(A) و کاریورکسی (B) متعاقب نکروز بافتی. رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین. بزرگنمایی × 1000.

قطعات روده که محلول رینگر به مدت 60 دقیقه در آن تزریق شده بود، شباهت زیادی با نمونه‏های مربوط به قطعه‏های روده که هیچ‏گونه تزریقی در آن‏ها نشده بود (کنترل منفی) داشتند. در این نمونه‏ها ادم، نکروز و از دست رفتن ساختار روده دیده شد و بعد از گذشت 180 دقیقه، ضایعات بسیار شدید شده و ساختار روده به‏طور کامل از بین رفته بود (شکل5 و جدول 2).

شکل 5: بافت روده تزریق شده با رینگر پس از گذشت 180 دقیقه. در این نمونه‏های بافتی، ضایعات شدید در اپی‏تلیوم (A)، نکروز وسیع (B) و از دست رفتن ساختار روده دیده شد (µm20 = مقیاس).

قطعات روده که محلول رینگر+ آدرنالین به‏مدت 60 دقیقه در آن تزریق شده بود، شباهت زیادی با نمونه‏های مربوط به قطعه‏های روده که فقط محلول رینگر در آن‏ها تزریق شده بود، داشتند. در این نمونه‏ها، ضایعات شدیدی شامل ادم، دژنراسیون و نکروز مشاهده گردید و بعد از گذشت 180 دقیقه از تزریق محلول رینگر + آدرنالین به بافت روده، ضایعات بافتی شامل دژنراسیون و نکروز تشدید گردید و ساختار روده کاملا از بین رفته بود (جدول 2). در بافت روده که محلول کورتلند به مدت 60 دقیقه در آن تزریق شده بود، ادم ملایم و جدا شدگی خفیف در اپی‏تلیوم روده دیده شد و سلول‏های جامی و حاشیه مسواکی سالم و دست نخورده  به‏خوبی دیده شد. پس از گذشت 180 دقیقه تزریق محلول کورتلند، ادم و جدا شدگی خفیف در اپیتلوم روده دیده شد و در نهایت ساختار روده به خوبی حفظ شده بود (شکل6 و جدول 2).

شکل 6: بافت روده تزریق شده با محلول کورتلند به مدت 180 دقیقه. در این نمونه‏های بافتی، ادم و جدا شدگی خفیف در  اپی‏تلیوم روده دیده شد (A) و سلول های جامی  (B)و حاشیه مسواکی سالم و  دست نخورده  (C)به‏خوبی مشخص بود. رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین. بزرگنمایی × 160.

در بافت‏های روده که کورتلند + آدرنالین به مدت 60 دقیقه در آن تزریق شده بود، ادم مشاهده شد ولی ساختار طبیعی روده به خوبی حفظ شده بود (شکل 7).

شکل 7: بافت روده تزریق شده با محلول کورتلند+ آدرنالین به‏مدت 60 دقیقه. در این نمونه‏های بافتی، ادم ، جدا شدگی در اپی‏تلیوم روده(A) و سلول‏های جامی  (B)دیده شد و ساختار طبیعی روده به‏خوبی حفظ شد.  رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین. بزرگنمایی × 160.

پس از گذشت 180 دقیقه از تزریق کورتلند + آدرنالین به‏داخل بافت روده، همچنان ساختار روده حالت طبیعی خود را حفظ کرده بود و ادم خفیفی به همراه اندکی جدا شدگی و همچنین  ت عداد بسیار کمی سلول نکروزه در آن‏ها دیده می‏شد (شکل 8 و جدول 2).

شکل8:  بافت روده تزریق شده با محلول کورتلند+ آدرنالین  به‏مدت 180 دقیقه. در این نمونه‏های بافتی اپی‏تلیوم سالم و دست نخورده روده(A ) و موکوس( B)مشخص شده‏اند و فقط تعداد کمی سلول نکروزه دیده شد (C) (µm10  = مقیاس)

جدول 2: نتایج بدست آمده از مطالعه قابلیت زنده نگه‏داشتن نمونه‏های روده در بین چهار محلول جایگزین شونده خون در دو فاصله زمانی 60 و 180 دقیقه