نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه ملایر، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، ملایر، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر آپوپتوتیک عصاره الکلی سیاهدانه بر روی سلولهای سرطانی HL-60 بود..
مواد و روشها: دراین مطالعه تجربی غلظتهای350، 650، 950 و 1250 میکروگرم/میلیلیتر عصاره الکلی سیاهدانه در محیط کشت، روی سلولهای سرطانی HL-60 بهمدت 24 ساعت اثر داده شد. برای بررسی درصد سلولهای زنده از آزمون MTT استفاده شد. همچنین برای تعیین اینکه آیا عصاره الکلی سیاه دانه تکثیر سلولهای HL-60 را از طریق تنظیم پیشرفت چرخه سلولی و آپوپتوزیس مهار میکند، ابتدا با استفاده از رنگآمیزی PI فلوسایتومتری انجام شد، سپس رنگآمیزی AO/EB سلولهای HL-60 برای تشخیص الگوهای آپوپتوزیس و نکروزیس انجام شد.
نتایج: آزمون MTT نشان داد که در مقایسه با گروه کنترل، عصاره الکلی سیاه دانه در غلظت 650 میکروگرم/میلیلیتر باعث مرگ50 درصد سلولهای HL-60 شد و در غلظتهای بالاتر وابسته به غلظت باعث مرگ بیشتر سلولها شد، همچنین افزایش معنیداری در سلولهای فاز G0/G1 از 2/15 درصد در گروه کنترل به 65/51 درصد در گروه تیمار شده با غلظت 650 میکروگرم/میلیلیتر باعث مشاهده شد. بهعلاوه مشخص شد که غلظت 650 میکروگرم/میلیلیترباعث القا آپوپتوزیس در سلولهای HL-60 شد در حالی که در غلظتهای بالاتر باعث نکروزیس سلولهای HL-60 نسبت به گروه کنترل شدند.
نتیجهگیری: با توجه به نتایج بهدست آمده میتوان نتیجه گرفت که داروی تاموکسیفن از طریق افزایش بیان ژن CTNNBIP1 بر روی مسیر سیگنالی Wnt و پروتئین بتا کاتنین اثر مهاری دارد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Comparison of anti-inflammatory effects of dexamethasone and thiamine on Wallerian degeneration after sciatic nerve transection in rat
نویسندگان [English]
- M Rahimi
- A Babaei
Biology Department, Faculty of Science, Malayer University, Malayer, Iran
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to investigate the apoptotic effect of the alcoholic extract of black seed on HL-60 cancer cells.
Material and Methods: In this study, concentrations of 350, 650, 950 and 1250 µgml
-1
of Nigella sativa alcoholic extract were added to HL-60 cancer cells for 24 h. MTT assay was applied to find out the portion of living cells. Likewise, PI staining for flow cytometry was performed to determine whether black seed extract inhibits the proliferation of HL-60 cells by modulating cell cycle progression and apoptosis, then AO/EB staining of HL-60 cells was performed to detect apoptosis and necrosis patterns.
Results: MTT assay showed that in comparison with the control group, alcoholic extract of black seed killed 50% of HL-60 cell in the concentration of 650 µgml
-1
and based on the concentration, more cell death was caused at the higher concentration. Also, a substantial increase in G0/G1 phase cells was observed from 15. 2% in the control group, up to 51. 65% in the group was treated with 650 µgml
-1
. It was also found that the concentration of 650 µgml
-1
induced apoptosis in HL-60 cells, while at higher concentrations of 950 and 1250 µgml
-1
caused HL-60 cells necrosis compared to the control group.
کلیدواژهها [English]
- Black seed
- Apoptotic
- HL-60 cells
- Flow cytometry
- AO/EB staining
مقدمه
لوسمی حاد پرومیلوسیتییکی از زیر گروههای لوسمی حاد میلوییدی است که طبق آمار سایت سازمان بهداشت جهانی در سال 2018 درصد افراد مبتلا به این بیماری در مردها 1/6 درصد و در خانمها 3/ 4در همه سنین جمعیت جهان است
©International Agency for Research on Cancer 2018)). دراین بیماری ابتدا اختلال در سلولهای پیشساز خونی بهوجود آمده و باعث مشکلات فراوانی در عملکرد سایر اعضای بدن نیز میشد و در نهایت عوارض بسیار وخیمی در بیمار ایجاد میشود (1، ۲). درسالهای اخیر پروتکلهای درمانی مطرح شده و در مراکز تحقیقاتی مورد بررسی و تجزیه و تحلیل قرارگرفته است. یکی از پروتکلهای درمانی که تا به امروز مورد استفاده قرارگرفته است شیمی درمانی میباشد. استفاده از داروهای سیتوتوکسیک جهت از بین بردن سلولهای بلاست بدخیم در طیف وسیعی استفاده میشود. اما مهمترین نقص این روش استفاده از داروهای شیمی درمانی است که دارای اثرات جانبی زیادی هستند. عوامل سیتوتوکسیک کیفیت زندگی بیماران سرطانی را تحت تاثیر قرار میدهد بنابراین بهبود کیفیت زندگی بیماران سرطانی بستگی به داروهای شیمی درمانی با کارایی بالا و سمیت پایین روی سلولهای سالم دارد (۳). در سالهای اخیر استفاده از عصاره گیاهان بهعنوان مواد طبیعی برای از بین بردن سلولهای سرطانی و جلوگیری از عود سرطان بسیار مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته است. ازجمله این گیاهان، گیاه سیاهدانه است که تاریخچه غنی طبی و مذهبی دارد (۴، 5). این گیاه بومی اروپای جنوبی، آفریقای شمالی و آسیا است. گیاه سیاهدانه با نام علمی Nigella sativa L. از خانواده Ranunculaceae است با گلهای سفید یا آبی کمرنگ تا آبی پررنگ دارای دانههای سفید شیری رنگ که در تماس با هوا سیاه رنگ میشوند (۵، ۶). اثرات فارماکولوژیک سیاهدانه شامل اثرات ضدالتهابی وآنتیاکسیدانتی (۷، ۸)کاهش قند (9، 10)، چربی (1۱) و فشارخون بالا (1۲)، محافظ بافتهای کبد و کلیه (16- 13) و قلب و عروق (1۷) و همچنین اثرات ضدمیکروبی (1۸) و ضدانگلی (1۹) ازاین گیاه گزارش شده است. همچنین مطالعات گستردهای در زمینهی خواص ضدسرطانی سیاهدانه و ترکیبات کینونی آن مثل تیموکینون بر روی سرطانهای مختلف از جمله کولون (20)، سینه (21 و 22)، سارکوما (23)، معده (24، 25)، خون (2۶، 27)، ریه (28) و رحم (29) صورت گرفته است. در مورد مقایسه اینکه ترکیب اصلی عصاره سیاهدانه (تیموکینون) روی کدام یک از انواع سرطانها فعالتر بوده است تا بهحال مقایسه کاملی انجام نگرفته است و بیشتر در مورد مسیرهای سیگنالینگی که باعث از بین بردن سلولهای سرطانی میشود بحث شده است. اما در سال 1992، Salomi و همکارانش نشان دادند که در شرایط آزمایشگاهی غلظتهای 5/1، 3 و 5/1 میکروگرم از عصاره سیاهدانه باعث کشته شدن 50 درصد از سلولهای سرطانی Ehrlich ascites carcinoma (EAC)، (DLA) Dalton's lymphonia ascites و Sarcoma-180(S-180) بهترتیب شد در حالیکه روی سلولهای K-562 اثر بسیار کمی داشت. همچنین مطالعاتin vivo آنها نشان داد که خوراندن 2 میلیگرم از عصاره سیاهدانه بهمدت 10 روز در موشهای (EAC)، رشد این تومور را مهار کرد (30). تاکنون در مورد اثرات آپوپتوتیک و سایتوتوکسیک عصاره الکلی سیاهدانه بر سلولهای سرطانی HL-60 گزارشی منتشر نشده است، لذا در این مطالعه اثر عصاره الکلی سیاهدانه بر رشد سلولهای سرطانی HL-60 مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
کشت سلول و آماده سازی غلظت های مختلف مواد:برای انجام آزمایش رده سلولی HL-60را از موسسه پاستور تهیه و در محیط کشت RPMI1640همراه با FBS ۱۰ درصد و ۱۰۰واحد/میلیلیتر پنیسیلین و ۱۰۰ میلیگرم/میلیلیتر استرپتومایسین در فشار5 درصد CO2 و دمای 37 درجه کشت داده شد. دراین مطالعه تجربی عصارهگیری با استفاده از روش شناخته شده سوکسله انجام شده برای این منظور 100 گرم از پودر سیاهدانه با 490 میلیلیتر الکل 96 درصد با دستگاه سوکسله عصارهگیری شد. عصاره از فیلتر سرنگی 2/0 میکرومتری عبور داده تا استریل شود. برای تعیین وزن خشک عصاره استریل، 10 میلیلیتر از آن در پلیت با وزن معلوم ریخته و روی بنماری 70 درجه سانتیگراد الکل آن تبخیر شد و سپس با ترازوی دیجیتال بادقت 0001/0گرم توزین شد. بااستفاده، ازمحیط کشت استریل از عصاره سیاهدانه غلظتهای 350، 650، 950 و 1250 میکروگرم/میلیلیتر تهیه شد.
بررسی درصد سلولهای زنده: برای بررسی درصد سلولهای زنده از آزمون MTT استفاده شد. بهطورخلاصه، روش MTT بهاین صورت انجام گرفت: ابتدا، تعداد مناسب 105× 5 سلول در هر میلیلیتر و غلظت مواد مورد نظر در خانههای یک پلیت 24 خانه تنظیم شد و برای هر غلظت از ماده مورد نظر سه خانه درنظر گرفته شد. بعد از 24 ساعت به هر خانه از پلیتهای 24 خانه 200 میکرولیتر محلول MTTبا غلظت 5 میلیگرم در میلیلیتر (Sigma)افزوده شد و سپس 4 ساعت در دمای 37درجه سانتیگراد انکوبه شد. بعد از این مرحله، پلیتها برای 5 دقیقه با دور rpm 800 سانتریفوژ شدند. سپس، محیط رویی با احتیاط خارج شد و بعد به هر خانه 200 میکرولیتر DMSO (Merck) اضافه شد پس از گذشت 30 دقیقه، محتوای خانهها چندینبار مخلوط شد تا رسوب داخل سلولها بیرون بریزد. سرانجام میزان جذب نوری (OD) در طول موج 570 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا ریدر (BioTek,Germany) ثبت شد. سپس، درصد سلولهای زنده در هر چاهک از تقسیم OD آزمون بر OD کنترل ضرب درصد بهدست آمد.
تجزیه و تحلیل چرخه سلولی: سلولهای HL-60 با غلظتهای مختلف350، 650، 950و 1250 میکروگرم/میلی لیتر عصاره الکلی سیاه دانه برای 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند. پس از 24 ساعت، سلولها در اتانول 70 درصد در دمای 4 درجه سانتیگراد در طول یک شب تا صبح ثابت شدند. سلولهای ثابت با ۵۰ میکرولیتر PI (۱۰میلیگرم/میلیلیتر) بهمدت 20 دقیقه روی یخ در تاریکی رنگآمیزی شدند. در نهایت، فلورسانس ساطع شده توسط مجموعه PI-DNA در488 نانومتر مورد آزمایش قرار گرفت. درصد سلولها در مراحل مختلف چرخه سلول، یعنی، G0، G1، S، و G2/M، با استفاده فلوسایتومتری و توسط نرمافزار Cell Quest مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
رنگآمیزی AO/EB: رنگآمیزی AO/EB سلولهای HL-60 برای تشخیص الگوهای آپوپتوزیس و نکروزیس انجام شد، همانطور که قبلا گزارش شده است (۳1) بهطور خلاصه، سلولهایHL-6 بهمدت 24 ساعت تحت تاثیر عصاره سیاهدانه با غلظتهای 350، 650، 950 و 1250 میکروگرم/میلی لیتر قرار گرفتند و سپس سه بار با بافر فسفات (PBS) شسته شدند. سلولها با 100 میکروگرم در میلیلیترAO/EB بهمدت 5 دقیقه رنگآمیزی شدند. حداقل 200 سلول در زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شد. سلولها بهشرح زیر طبقهبندی شدند: زنده، آپوپتوزیس یا نکروزیس. درصد سلولهای آپوپتوتیک با استفاده از فرمول: درصد سلولهای آپوپتوزیس (%) = (تعداد سلول آپوپتوزیس/کل سلول مورد بررسی) 100 درصد محاسبه شد.
تحلیل آماری
جهت تجزیه و تحلیل آماری دادهها از نرمافزار INSTAT-3 و آزمون تحلیل واریانس یکطرفه استفاده شده و نمودارها ازطریق برنامه EXCEL رسم شدند. 05/0>p معنیدار بودن دادهها تلقی شد و هر آزمایش دستکم سه مرتبه تکرار شد. دادهها نشاندهنده means ± SD از سه آزمایش جداگانه است.
نتایج
اثرضدتکثیری عصاره الکلی سیاه دانه بر سلولهایHL-60
آزمون MTT نشان داد که در مقایسه با گروه کنترل، عصاره الکلی سیاهدانه در غلظت IC50650 میکروگرم/میلی لیتر باعث مرگ 50 درصد سلولهایHL-60 شد در حالیکه در این غلظت رو سلولهای سالم تاثیری نداشت. در غلظتهای بالاتر وابسته به غلظت باعث مرگ بیشتر سلولها شد، در حالیکه در غلظت 350 میکروگرم/میلیلیتر نسبت به گروه کنترل تاثیر معنیداری روی تکثیر سلولهای HL-60 نداشت (شکل 1).
شکل1:سلولهای HL-60 با غلظتهای مختلف 350، 650، 950و1250 میکروگرم/ میلیلیتر تحت تیمار قرار گرفتند و درصد زنده بودن سلولها بعد از 24 ساعت با روش MTT بررسی شد. این آزمایش بیش از 3 بار تکرار شد. ∗p< 0.001 در مقایسه با نمونه کنترل
اثر عصاره الکلی سیاه دانه بر سیکل سلولهای HL-60
برای تعیین اینکه آیا عصاره الکلی سیاهدانه تکثیر سلولهای HL-60 را از طریق تنظیم پیشرفت چرخه سلولی و آپوپتوزیس مهار میکند، ابتدا با استفاده از رنگآمیزی PI فلوسایتومتری انجام شد. ما افزایش معنیداری در سلولهای G0/G1 از ۲/۱۵ درصد در گروه کنترل به ۶۵/۵۱ درصد گروه تیمار شده با غلظت 650 میکروگرم/میلی لیترمشاهده کردیم. با این حال، در غلظتهای 950 و 1250 میکروگرم/میلیلیترنسبت سلولها در فازG0/G1 افزایش معنیداری نسبت به نمونه کنترل نداشت (شکل 2، 3). این اثرات نشان میدهد که عصاره الکلی سیاه دانه قادر به ایجاد توقف سیکل سلولی در فازG0/G1 است.
شکل۲:سلولهای HL-60 با استفاده از غلظتهای مختلف 350، 650، 950و 1250 میکروگرم/میلیلیتر بهمدت 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند و نسبت سلولهای فازG0/G1 براساس فلوسایتومتری محاسبه شد. ∗p< 0.001 در مقایسه با نمونه کنترل
شکل 3: نمودار مربوط به فلوسایتومتری با استفاده از رنگ PI جهت بررسی چرخه سلولی، A: میزان سلولهای متوقف شده در فاز G0/G1 را نشان میدهد، :B سلولهای متوقف شده در فاز Sو C: سلولهای متوقف شده در فاز G2/Mرا نشان میدهد. تصویر Iسلولها HL-60 را بدون تاثیر دارو، تصویر II سلولهای HL-60 تیمار شده با غلظت650، میکروگرم/میلی لیتر بهمدت 24 ساعت
اثر عصاره الکلی سیاه دانه بر القا آپوپتوزیس در سلولهای HL-60
رنگآمیزی AO/EB نشان داد که سلولهای زنده سبز بهطور یکنواخت با مورفولوژی طبیعی در سلولهای کنترل HL-60 مشاهده میشوند، در حالیکه سلولهای آپوپتوزیس نارنجی با کروماتین تکه تکه شده و اجسام آپوپتیک در سلولهای HL-60 تحت درمان با 650 میکروگرم/میلیلیترعصاره الکلی سیاهدانه مشاهده شدند و در مقایسه با گروه کنترل، درصد سلولهای آپوپتوتیک بهطور معنیداری افزایش یافته است. با این حال، غلظتهای 950 و 1250 میکروگرم/میلی لیتر، بیشتر باعث نکروزیس سلولها نسبت به آپوپتوزیس آنها شدند این اثرات نشان میدهد که عصاره الکلی سیاهدانه در غلظت 650 میکروگرم/میلی لیترمیتواند باعث القا آپوپتوزیس در سلولهای HL-60 شود (شکل 4، 5).
شکل 4: سلولهای HL-60 با استفاده از غلظتهای مختلف 350، 650، 950و 1250 میکروگرم/میلیلیتر بهمدت 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند و درصد سلولهای آپوپتوزیس براساس رنگآمیزی AO/EB برآورد شد. ∗p< 0. 001 در مقایسه با نمونه کنترل
شکل 5: سلولهای HL-60 با استفاده غلظت 650میکروگرم/میلی لیتر بهمدت 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند و رنگآمیزی AO/EB سلولهای HL-60 کنترل و تحت تیمار انجام شد (بزرگنمایی۴۰۰). الف: سلولهای کنترل ، ب: سلولهای تیمار شده با عصاره الکلی سیاه دانه – فلش نشان دهنده سلولهای آپوپتوزیک است.
بحث
در این پژوهش مشخص شد که غلظت 650 میکروگرم/میلیلیتر عصاره الکلی سیاهدانه باعث القا آپوپتوزیس در سلولهایHL-60 شد در حالی که در غلظتهای بالاتر یعنی 950 و 1250 میکروگرم/میلی لیتر باعث نکروزیس سلولهایHL-60 نسبت به گروه کنترل شدند. برای توجیه اثرات ضدسرطانی عصاره سیاهدانه ترکیبات موجود در آن استخراج شدند و مشخص شده که ترکیب اصلی که خاصیت ضدسرطانی دارد تیموکینون میباشد (32). تا به امروز برای اثرات ضد سرطانی تیموکینون مکانیسمهای مختلفی پیشنهاد شده است. Badary و همکاران (33) و همچنین Burits و همکاران (34) نشان دادند که فعالیت آنتیاکسیدانتی عصاره الکلی سیاه دانه مانع تکثیر سلولهای سرطانی میشد. Gali-Muhtasib و همکاران (35) برروی سلولهای کلورکتال نشان دادند که تیموکینون استخراج شده از سیاه دانه از طریق مکانیسم وابسته بهP53 باعث القا آپوپتوزیس در این سلولها شد (35). Mahdy و همکاران (36) نشان دادند که تیموکینون با غلظت ۱۰۰میکرومولار از طریق فعال سازیcaspase-8 و رخدادهای میتوکندریایی در سلولهای HL-60 باعث القا آپوپتوزیس میشوند. محمود الحسین و همکاران (37) نشان دادند، تیموکینون تا غلظت 100 میکرومولار برروی سلولهای لوکمی از طریق ژنهای P53 و P73 باعث القا آپوپتوزیس میشوند (37). که نتایج پژوهش ما نیز هم راستا با این تحقیقات و نشان دهنده القا آپوپتوزیس در سلولهای HL-60 بود. Kooti و همکاران (38) خصوصیات فیتوشیمی، داروسازی و کاربردهای درمانی سیاهدانه (Nigella sativa) بهویژه خاصیت ضدسرطانی آن را از طریق القا آپوپتوزیس نشان دادند. Majdalawieh و همکاران (39)گزارش کردند در دو دهه گذشته عصاره سیاهدانه میتواند، بهتنهایی یا همراه با داروهای شیمی درمانی، بهعنوان عوامل موثر برای کنترل شروع تومور، رشد و متاستاز باشد و از اینرو، میتواند در درمان گستردهای از انواع سرطانها موثر باشد. همچنین ایشان و همکاران (40) نشان دادند که تیموکینون از طریق مسیرهای سیگنالینگp53, NF-κB, PPARγ, STAT3, MAPK and PI3K/AK عملکرد ضدسرطانی دارد. بهنظر میرسد که در میان این مکانیسمها، القای مرگ برنامهریزی شده سلولی از مهمترین مکانیسمهای موثر در فعالیت ضدسرطانی عصاره الکلی سیاهدانه میباشد که یافتههای ما نیز آن را تایید میکند. از طرفدیگر مطالعات گستردهای درباره اینکه سیاهدانه بهعنوان یک افزایش دهنده فعالیت داروهای شیمی درمانی بهکار رود نیز صورت گرفته است. Effenberger و همکاران (41) نشان دادند که ترپن همراه با سیاهدانه اثر بیشتری در خاصیت ضدتکثیری سلولهای سرطانی HL-60 از طریق القا آپوپتوزیس و همچنین فعالیت آنتیاکسیدانتی دارد. همچنین در مطالعه ای دیگر هم نشان دادند که عصاره سیاهدانه اثر ضدسرطانی غلظتهای پایین دوکسوروبیسین را افزایش میدهد (42). در این پژوهش ما غلظت IC50 عصاره الکلی سیاهدانه را روی سلولهای سرطانی بهدست آورده تا در پژوهشهای بعدی اثر همافزایی آن را بر روی داروهای ضدسرطانی بررسی کنیم. البته مطالعات بیشتر در مورد عصاره سیاهدانه بر اساس آزمایشات بالینی برای کشف فواید آن در مدیریت سرطان بسیار لازم است.
نتیجهگیری
یافتههای ما برای اولین بار نشان داد که عصاره الکلی سیاهدانه در غلظت 650 میکروگرم/میلی لیتر باعث توقف سیکل سلولی شد و در غلظتهای بالاتر باعث ایجاد نکروزیس در این سلولها شد.