نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، کرمان، ایران
2 دانشجوی Ph.D، گروه ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه تخریب ژن کیناز غنی از لوسین شماره 2 LRRK2))، مهم‌ترین ژن درگیر در بیماری پارکینسون با استفاده از تکنولوژی CRISPR-Cas بود.
مواد و روش‌ها: مراحل همسانه سازی قطعات راهنما در این پژوهش با استفاده از کیت کلونینگ gRNAسیستم کریسپر (شماره کاتالوگ C8324K شرکت زاور زیست آزما) انجام شد. ابتدا 4 الیگونوکلئوتید برای توالی اگزون 41 ژن LRRK2 توسط نرم افزارساختRNA راهنمای CRISPR با عنوان CHOCHOPطراحی شدند. این دو RNA) gRNAsراهنما) در دو طرف اگزون فوق در نظر گرفته شدند. مولکول‌های دو رشتهای DNA بر اساس دستورالعمل استاندارد در آزمایشگاه ساخته شدند. قطعات دو رشته ای 20 جفت بازی راهنما که برای تشکیل کمپلکس Cas9-gRNA استفاده می‌شوند، با استفاده از آنزیم DNA لیگاز به وکتور بیانی یوکاریوتی کریسپر Px459 متصل و پلاسمیدهای نوترکیب به درون باکتری E.Coli DH5aمیزبان با روش شوک حرارتی منتقل شدند. نتایج آزمایشها بهوسیله روشهای RCP و تعیین ردیف AND ارزیابی شدند.
نتایج: آزمایشهای چندگانه PCR با استفاده از پلاسمیدهای نوترکیب بهعنوان AND الگو و توالییابی AND، همسانه سازی قطعههای کوچک راهنما در پلاسمید بیانی کریسپر را نشان داد.
نتیجهگیری: نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد، سیستم CRISPR می‌تواند بهعنوان یک ابزار قوی فراگیر برای ویرایش و تنظیم بسیاری از ژنهای موثر در بیماریها از جمله بیماری پارکینسون استفاده شود.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Design and Construction of Recombinant CRISPR Vector Harboring LRRK2 Gene for Parkinson's Disease
نویسندگان [English]
- A Samare Gholami 1
- HA Sasan 1
- M Hashemabadi 2
- H Ravan 1
1 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Shahid Bahonar University of Kerman, KerAman, Iran
2 Ph.D student, Department of Genetics, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: In this study, the alteration of the Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene, as the most important gene involved in Parkinson's disease, was investigated using CRISPR-Cas editing technology.
Material and methods: Cloning the guide molecules of interest was performed using of gRNA CRISPR cloning kit (Catalog No. C8324K, Zaver Zist Azema). Two sets of forward and reversed gRNA oligonucleotides for exon 41 of the LRRK2 gene were designed using the CHOPCHOP CRISPR guide gRNA designing web software. Double-stranded DNA molecules were made according to standard instructions in the laboratory. 20 base-pair DNA segments were used to generate RNA-Cas-9 enzyme complex and then ligated into the Px459 CRISPR eukaryotic expression vector using Fermentas DNA ligase enzyme. Recombinant plasmids were transformed into E. coli DH5a host competent cells using of heat shock method.
Results: findings by multiple PCR experiments and also DNA sequencing blast analysis showed successful cloning the segments of interest into CRISPR plasmids. Clear PCR bands were in agreement with expected values and DNA sequencing results showed 100% similarity.
Conclusion: According to the results, development of CRISPR vector system may be used as a wide and powerful tool for editing and alteration of many encountered genes in different diseases such as Parkinson's disease.
کلیدواژه‌ها [English]
- CRISPR
- Parkinson's disease
- LRRK2 gene
مقدمه
برخی باکتری‌ها دارای سیستم ایمنی اکتسابی شامل تکرارهای پالیندرومی فاصلهدار منظم خوشهایClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR) همراه با ژن پروتئینیCas می‌باشند. این سیستم مقاومت اکتسابی در برابر هجوم عوامل بیگانه شامل باکتریوفاژ یا هر DNAخارجی وارد شده را ایجاد می‌کند (1،2،3). CRISPR شامل توالیهای تکراری محافظت شده در ژنوم میباشدکه توسط قطعات DNA متغییر منحصربهفرد تحت عنوان فاصلهانداز (Spacer) که از DNA عامل بیگانه منشا میگیرند، از هم جدا شدهاند. ایمنی در برابر حملات بعدی عوامل بیگانهای که ردیف‌های نوکلئوتیدی یکسان با قطعات ادغام شدهSpacer مربوط به ژنوم آنراحمل می‌کند، ایجاد می‌شود (4،5،6،7) .تا به امروز سه نوع سیستم CRISPR باکتریایی شناسایی شده است. سیستم کریسپر نوع I برای برش از ریبونوکلئوپروتئینهای Cas1،Cas6 و Cas5 بههمراه پروتئینهای متعدد کمکی دیگری استفاده می‌کند. همچنین قادر به برش فقط یک رشته DNA هدف می‌باشد. سیستم کریسپر نوع III نیز برای فعالیت به پروتئینهای زیادی از جمله Cas2، Cas6 و پروتئینهای دیگری نیاز دارد. بهعلاوه این نوع سیستم کریسپر فقط DNA تک رشتهای و در مواردی RNA را برش میدهد. در مقابل سیستم کریسپر نوع II برای فعالیت به پروتئینهای کمتری از جمله Cas9 نیاز داشته و قادر به برش DNA دورشتهای می‌باشد (4،8،10). سیستم CRISPR یک تکنولوژی قدرتمند و یرایش ژنوم است که انقلابی را در زمینه تحقیقات زیست پزشکی ایجاد کرده است (5،11،13). این سیستم امکان انجام انواع تغییرات در سطح ژنوم شامل اصلاح، روشن و خاموش کردن ژنها را بادقت، سرعت، ارزان و نسبتا ساده را بهوجود آورده است.با استفاده از این تکنولوژی ایجاد انواع مدلهای سلولی، حیوانی و همچنین بررسی سیستماتیک ژنوم فراهم شده است (14،19).
بیماری پارکینسون (PD) یک اختلال عصبی-حرکتی پیشرونده شایع می‌باشد. این بیماری بهدلیل انحطاط نورونهای دوپامینرژیک منجر به کاهش سطح انتقال دهنده عصبی دوپامین می‌شود. از ویژگیهای اصلی کلینیکی این بیماری میتوان لرزش اعضای بدن از جمله دست و پا در حالت استراحت، کندی حرکات، بیثباتی در راه رفتن و سفتی عضلات را نام برد (20،23). میزان بروز این اختلال مزمن عصبی با بالارفتن سن، افزایش می‌یابد شیوع این بیماری یک درصد در جمعیت بالای 65 سال و4 درصد در جمعیت بالای 85 سال است. PD یک اختلال پیچیده است که احتمالا ناشی از تعاملات بین عوامل خطر محیطی و ژنتیکی است (24،26). با بررسی‌های مولکولی انجام گرفته چندین ژن دخیل در بروز PD شناسایی شدهاند. ژنهایATP13A2 ، PARKIN، PINK1، DJ-1، SNCA و LRRK2 ازجمله مهم‌ترین این ژنها هستند (22).
ژن LRRK2 ژن بزرگی است که برروی کروموزوم شماره 15 موش قرار گرفته است. شامل 51 اگزون و طولی به اندازهی 7584 نوکلئوتید دارد .این ژن پروتئینی را شامل 2527 آمینواسید همراه با دومین‌های عملکردی متعدد کد‌گذاری می‌کند (27،28). در بیماران پارکینسونی حاصل از جهش در این ژن معمولا میزان بیان آن بالا می‌رود. LRRK2 یک پروتئین سیتوزولی است که در رشد نورونی، فرایندهای سلولی پیچیده در نورون‌ها و همچنین بهعلت داشتن تعداد زیادی دومین بهعنوان مرکز مسیرهای متعدد سیگنالینگ که برای عملکرد نورون‌ها حیاتی است، دخیل می‌باشد. این ژن در مغز و دیگر اندامها بیان می‌شود. بیان آن عمدتا در مناطق گره‌های قاعده‌ای که با اختلالات حرکتی در بیماری پارکینسون ارتباط دارد و همچنین در داخل نواحی غیرحرکتی مثل هیپوکامپ صورت میگیرد. در بیماری پارکینسون حاصل از جهش در ژن LRRK2، تجمع نوروفیبریلاری، آسیب به سلول‌های شاخه‌ای قدامی و تخریب مسیرهای عصبی در بخش جسم سیاه مغز رخ میدهد (29،32).
با استفاده از سیستم CRISPR ژن LRRK2 در رده سلولی انسانی دچار جهش کسب عملکرد شد. در مقایسه با نمونههای کنترل اثرات مخرب سلول‌های ترانسفورم شده بر فرایند سیستم عصبی مشاهده شد. این امر نقش مهم ژن فوق را در مکانیزم بیماری پارکینسون نشان داد. همچنین اهمیت سیستم ویرایشی کریسپر را در ایجاد مدلهای سلولی و حیوانی بهمنظور کاربردهای احتمالی درمانی مشخص کرد (33،34). تعداد 28 لکوس ژنی بهعنوان فاکتورهای اصلی درگیر در بیماری پارکینسون دخالت دارند. از میان این ردیف‌های ژنی، موتاسیونهای ویژه ژن LRRK2 بهعنوان اصلیترین عوامل ایجاد بیماری فوق شناخته شده اند. با توجه به پیچیدگی مکانیزم ایجاد بیماری پارکینسون، دخالت ژنهای متعدد و الگوهای متفاوت وراثت غالب و مغلوبی ژنهای فوق، سیستم ویرایشی کریسپر برای غربالگری، تشخیص و استفادههای احتمالی دارویی برای این بیماری و سایر بیماریهای مشابه تحلیل برنده سیستم عصبی پیشنهاد شده است (35،38). در پژوهش حاضر هدف ساخت ناقل نوترکیب CRISPR ویژه ژنLRRK2 با طراحی gRNA برای ناحیه‌ای از اگزون 41 ژن فوق و کلونینگ آن در باکتریE.coli DH5α می‌باشد.
مواد و روش‌ها
سویه باکتری، طراحی پیش سازهای قطعه راهنما، پرایمرها و پلاسمید: درمطالعه حاضر، از سویه اشرشیاکلی DH5α از بخش زیستشناسی دانشگاه شهید باهنرکرمان بهعنوان میزبان بیانی کلونینگ و همچنین از پلاسمید pSpCas9(BB)-2A-Puro (Add gene) به عنوان ناقل کلونینگ و بیان ژن LRRK2 استفاده شدند. برای طراحی پیشسازهای gRNAها، ناحیه‌ای از اگزون 41 ژن LRRK2 از ژنوم موش سویه CL57BL6 استفاده شد. در ابتدا بهمنظور یافتن توالی اگزون 41 از سایتهای ENSEMBL و NCBI انتخاب شد. پس از بارگذاری توالی ژن مورد نظر بهمنظور تایید صحیح بودن ردیف بازی توالی، از سایت CLUSTALW2 برای بررسی همردیفی استفاده شد. سپس با استفاده از نرمافزارCHOPCHOP طراحی پیشسازهاgRNA ها انجام شد. این سایت تعدادی gRNA را معرفی مینماید که از این بین، بایستی gRNA مناسبی که دارای ویژگی‌هایی همچون بالابودن Score و کم بودن تعدادOff target را انتخاب نمود. gRNAهای انتخاب شده دارایScore برابر با96 بودند. توالی پرایمرهای پیشساز gRNA درجدول1 نشان داده شده است. بهمنظور تایید همسانه سازی قطعه DNA با اندازه 20 جفت بازی مربوط به gRNAدر ناقل و تکثیر آن در باکتری میزبان واکنش PCR انجام شد. علاوه بر الیگونوکلئوتیدهای مکمل رفت و برگشت gRNA، آغازگرهای لازم برای تکثیر یک قطعه حدود 400 جفت بازی در دو طرف DNA مربوط به gRNA برروی پلاسمید نیز با عناوین PPF و PPR طراحی شدند. از ترکیب متفاوت آغازگرهای قطعه فوق و پرایمرهای راهنما در واکنش PCR در صورت تکثیر قطعات سهگانه با اندازههای مورد انتظار (400، 150 و 270 جفت بازی) همسانه سازی اثبات می‌شود (جدول 1).
جدول 1: الیگونوکلئوتیدهای لازم برای پیش سازgRNA و تکثیر قطعات پلاسمید نوترکیب طراحی شده برای دست ورزی در ژن LRRK2
|
Amplicon size (dsDNA) |
Score |
(5' →3') |
نام |
|
20 bps, guide fragment |
96 |
GTTGCGAAGATTGCGGACTA TAGTCCGCAATCTTCGCAAC |
gRNAF gRNAR |
|
~ 400 bps |
|
GGGCCTATTTCCCATGATTCCT CGCGCTAAAAACGGACTAGC |
PPF PPR |
|
~150 bps |
|
GTTGCGAAGATTGCGGACTA CGCGCTAAAAACGGACTAGC |
gRNAF PPR |
|
~270 bps |
|
GGGCCTATTTCCCATGATTCCT TAGTCCGCAATCTTCGCAAC |
PPF gRNAR |
طراحی پرایمرهای مربوط به پلاسمید با استفاده از نرم افزار Primer 3 صورت گرفت. اختصاصیت پرایمرهای طراحی شده با نرم افزار BLAST در پایگاه NCBIتاییدشد. توالی پرایمرهای پلاسمید در جدول 1 نشان داده شده است.
آنیلینگ یا اتصال پرایمرهای پیشساز gRNA:فرایند ساخت ناقل نوترکیب کریسپر در این مطالعه با استفاده از کیت کلونینگgRNA سیستم کریسپر شرکت زاور زیست آزما (شماره کاتالوگ C8324K، شماره ثبت اختراع 98785) انجام شد. بهطور خلاصه، مقدار 3 میکرولیتر پرایمر رفت با غلظت 100 میکرومولار، 3 میکرولیتر پرایمر برگشت با غلظت 100 میکرومولار مربوط به پیشسازهایgRNA ، 4 میکرولیتر نمک NaClنیممولار، 3 میکرولیتر بافر آنزیم T4 DNA Ligase و 7 میکرولیتر آب را براساس دستورالعمل با حجم نهایی 20 میکرولیتر مخلوط کرده و سپس محلول حاصل را در دستگاه PCR بهمدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد و بهمدت 2 ثانیه در دمای 92 درجه سانتیگراد قرار داده شد. در مرحله بعد بهمنظور سرد شدن تا دمای 25 درجه سانتیگرادحرارت دستگاه PCR بهگونهای تنظیم شد که دما یک درجه یک درجه به فاصله زمانی ایستایی هر درجه سانتیگراد بهمدت20 ثانیه کاهش یافت. در ادامه بهمنظور رقیق‌سازی یک میکرولیتر از نمونه را به 50 میکرولیتر بافر آنزیم T4 DNA Ligase اضافه و بهعنوان پیشسازهای gRNA استفاده شدند.
هضم آنزیمی پلاسمید :pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)بهمنظور خطی کردن پلاسمید حلقوی مقادیر 5 میکرولیتر بافر آنزیم برشگر BBS1، 5 میکرولیتر وکتور حلقوی (غیربرشی) و 1 میکرولیترآنزیم برشگرBBS1 رامخلوط و با استفاده از آب مقطرحجم نمونهها در سطح 50 میکرولیترتنظیم شدند. سپس بهمدت 90 دقیقه دردمای 37 درجه سانتیگراد و بعد از آن بهمدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. در مرحله بعد محصول برش آنزیمی پلاسمید برروی ژل آگارز 1 درصد سیستم الکتروفورز منتقل و توسط کیت Bioneer بر اساس دستور العمل استخراج از ژل قطعه موردنظر خالصسازی شد.
اتصال قطعه الیگونوکلئوتید راهنما با پلاسمید pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)-V2-0 و ساخت DNA نوترکیب:بهمنظور اتصال قطعه راهنما به ناقل مقدار 5/4 میکرولیتر پلاسمید خطی، 5/2 میکرولیتر بافر آنزیم T4 DNA Ligase (لیگاز)، یک میکرولیتر آنزیم T4 DNA Ligaseو یک میکرولیتر محلول رقیق شده پیشساز gRNA را باهم ترکیب و پس از تنظیم حجم نهایی بهوسیله آب مقطر تا حجم 20 میکرولیتر نمونهها بهمدت یک ساعت در دمای 22 درجه سانتیگراد و سپس 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد قرار داده شدند.
ترانسفورماسیون:برای انتقال وکتور نوترکیب در سلول‌های باکتری E.coli مستعد، از روش شوک حرارتی استفاده شد. بدینترتیب که پس از مایع شدن میکروتیوپ حاوی 100 میکرولیتر سلول مستعد میزبان (کلرید کلسیم 1/0 مولار) برروی یخ، میزان 7 میکرولیتر از محصول ناقل نوترکیب را به نمونه سلولی در میکروتیوپ افزوده و بهمدت 30 دقیقه بر روی یخ قرار داده شد. سپس بهمدت 60 ثانیه میکروتیوپ را در دمای 42 درجه سانتیگراد قرار داده و مجددا نمونهها را بهمدت 1 دقیقه برروی یخ نگهداری شدند. در گام آخرمیزان 008 میکرولیتر محیط کشت مایع BL فاقدآنتیبیوتیک را به هر میکروتیوب اضافه و بهمدت 2 ساعت در دمای 73 درجه سانتیگراد در انکوباتور با چرخش 051 دور در دقیقه قرارداده شدند. در ادامه میزان 001 میکرولیتر از محلول باکتریهای ترانسفورم شده را بر روی محیط کشت جامد حاوی آنتیبیوتیک آمپیسیلین (غلظت یک میلی‌گرم درمیلیلیتر) توزیع و بهمدت 61 ساعت در انکوباتور در دمای 73 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. کلنیهای رشد داده شده در محیط کشت مایع حاوی آنتیبیوتیک جهت استخراج پلاسمید و اثبات همسانه سازی مورد استفاده قرار گرفتند.
واکنش PCR و تعیین ردیف DNA:بهمنظورتایید همسانه سازی و غربالگری باکتریهای نوترکیب از روش PCR استفاده شد. واکنش PCR در حجم نهایی 50 میکرولیتر حاوی 5 میکرولیتر از بافر 10X، 1.5 میکرولیتر MgCl2 (50 میلیمولار)، یک میکرولیتر از dNTPs (10 میلیمولار)، یک میکرولیتر از هر پرایمر (100 میکرومولار)، یک میکرولیتر از آنزیمTaq DNA polymerase، 2 میکرولیتر از DNA الگو و 5/37 میکرولیتر آب انجام شد. برنامه PCR شامل 5 دقیقه جهت دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد و سپس 33 سیکل شامل یک دقیقه 95 درجه سانتیگراد، یک دقیقه 57 درجه سانتیگراد، یک دقیقه 72 درجه سانتیگراد و نهایتا 5 دقیقه 72 درجه سانتیگراد با استفاده از دستگاه ترموسایکلر شرکت Bioneer کره جنوبی انجام شد. نمونههای پلاسمیدی نوترکیب بههمراه آغازگرهای جلوبرنده و برگشت قطعه راهنما بهمنظور تایید همسانه سازی به شرکت تکاپو زیست برای تعیین ردیف DNA ارسال شدند.
نتایج
ساخت قطعه راهنمای دو رشته ای و همسانه سازی قطعات راهنما با استفاده از پلاسمید سیستم کریسپر و باکتری های شایسته میزبان E. coli DH5a
شکل 1 نتایج اتصال الیگونوکلئوتیدهای جلو برنده و برگشت جهت ایجاد قطعه راهنمای دو رشتهای برای تولید RNA راهنما را نشان میدهد. خط شماره 2 حالت تک رشتهای و خط شماره 3 حالت جفت شده یا دو رشتهای قطعه راهنما را با اندازه کمی سنگینتر مشخص می‌کند. M بهعنوان مارکر استفاده شده است.
شکل 1: ساخت قطعه راهنمای دورشتهای را نشان می دهد. خط :M مارکر، خط 1: حالت تک رشتهای و خط 2: فرم دو رشتهای قطعه راهنما را با اندازه کمی سنگینتر نشان میدهد.
در شکل 2 کلنیهای باکتری ترانسفورم شده نوترکیب و غیرنوترکیب بر روی محیط کشت لوریا - برتانی LB (Luria-Bertani) حاوی آنتی بیوتیک آمپیسیلین دیده می‌شوند. تعداد نسبتا زیاد کلنیهای تک ایجاد شده نشان از دقت و موفقیت مراحل همسانه سازی شامل برش، اتصال، تهیه سلول‌های شایسته میزبان، و انتقال است.DNA پلاسمیدی از باکتریهای نوترکیب و غیرنوترکیب با روش لیز قلیایی موجود در آزمایشگاه استخراج شدند. شکل 3 نقشه پلاسمیدهای نوترکیب pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)-V2-0-LRRK2-gRNA حاوی قطعه راهنما برای ویرایش ژن LRRK2 بیماری پارکینسون را نشان میدهد. قطعه راهنما بعد از محل Scaffold وارد شده است تا با استفاده از پروموتور موجود بیان آن صورت گیرد.
شکل 2: کلنیهای نوترکیب و غیرنوترکیب رشد داده شده بر روی محیط کشت جامد حاوی آنتی بیوتیک آمپیسیلین را نشان میدهد.
شکل3: نفشه پلاسمید نوترکیب pSpCas9(BB)-2A-Puro ( PX459)-V2-0-LRRK2-gRNA حاوی بخش راهنمای اضافه شده بعد ازScaffold RNA با عنوان LRRK2-gRNA با رنگ فرمز را نشان میدهد. قطعه اضافه شده بیست جفت باز اندازه دارد.
نتایج آزمایش های PCR و تعیین ردیف DNA برای تایید همسانه سازی قطعه راهنما
نتایج آزمایشات PCR در شکل 4 نشان داده شده است. با توجه به قطعه بسیار کوچک همسانه سازی شده راهنما، حدود 20 جفت باز، تایید همسانه سازی با روش برش آنزیمی امکانپذیر نبود. از مکانیزم‌های تعیین ردیف DNA و PCR چندگانه برای اثبات این امر استفاده شد. آغازگرها بهصورتی طراحی شدند که پرایمرهای جلوبرنده و برگشت PPF و PPR یک قطعه حدود 400 جفت بازی را در دو طرف قطعه راهنما در پلاسمید تکثیر کنند. همچنین پرایمر جلوبرنده PPF و الیگونوکلئوتید آنتی سنس قطعه راهنما، gRNAR، یک قطعه 270 جفت بازی و بالاخره پرایمر برگشت PPR و الیگونوکلئوتید سنس قطعه راهنما، gRNAF، یک قطعه 150 جفت بازی را در صورت همسانه سازی موفقیت آمیز قطعه راهنما تکثیر کنند. در آزمایشات PCR از پلاسمیدهای استخراج شده احتمالی نوترکیب بهعنوان DNA الگو استفاده شد. شکل 4 تکثیر قطعات سهگانه فوق را که تایید کننده همسانه سازی قطعه راهنما در پلاسمید مورد نظر است، نشان میدهد. توضیحات در زیر نویس شکل آورده شده است.
شکل 4: نتایج آزمایشات PCR بهمنظور تایید همسانه سازی قطعه راهنمای 20 جفت بازی ویژه ژن LRRK2 بیماری پارکینسون در پلاسمید کریسپر. pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)-V2-0M: مارکر 100 جفت بازی، خط 2: قطعه 270 جفت بازی حاصل تکثیر پرایمر جلوبرنده پلاسمید و الیگونوکلئوتید آنتی سنس راهنما، خط 1: حاصل تکثیر یک بخش 150 جفت بازی با اثر پرایمر برگشت پلاسمید و رشته سنس راهنما. خط 3: قطعه 400 جفت بازی حاصل تکثیر پرایمرهای رفت و برگشت (سنس و آنتی سنس) پلاسمید. تکثیر قطعات سه گانه فوق تایید کننده همسانه سازی موفقیت آمیز است. برای توضیح جزئیات بیشتر به متن و جدول 1 مراجعه شود.
شکل 5 نتایج تعیین ردیف DNA قطعه راهنمای همسانه سازی شده در پلاسمید کریسپرpSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)-V2-0 با درجه همخوانی تشابه 100 درصد نشان میدهد. با توجه به نتایج حاصل، همسانه سازی قطعه راهنمای ژن LRRK2 بیماری پارکینسون در پلاسمید ویرایشی کریسپر در این مطالعه بهوسیله آزمایشهای PCR و تعیین ردیف DNA اثبات شد (شکلهای 4 و 5).
شکل 5: نتایج تعیین ردیف DNA قطعه همسانه سازی شده راهنما مربوط به ژن LRRK2 بیماری پارکینسون در پلاسمید ویرایشیpSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)-V2-0 را نشان میدهد. درجه همخوانی تشابه 100 درصد است که نشان دهنده همسانه سازی قطعه فوق است.
بحث
در پژوهش حاضر ابتدا پیشسازهای لازم برای قطعه 20 جفت بازی dsDNA تولید کننده gRNA مخصوص ژن LRRK2 بیماری پارکینسون با استفاده از نرم افزارهای کامپیوتری طراحی شدند. پس از تشکیل قطعه دورشتهای راهنما، با استفاده از آنزیم برشگر BBS1 و آنزیم DNA لیگاز ناقل نوترکیب pSpCas9(BB)-2A-PuroPX459)-LRRK2) ساخته شد. عمل ترانسفورماسیون با کمک روش شوک حرارتی انجام و همسانه سازی قطعه راهنما در سلول‌های باکتری E. coli DH5a میزبان با موفقیت انجام شد. همسانه سازی با استفاده از روش PCR و تعیین ردیف DNA اثبات شد.
ژن LRRK2 یکی از شایع‌ترین ژنهای درگیر در بیماری پارکینسون می‌باشد. این بیماری یکــی از مهمتریــن اختلالات مزمــن سیســتم اعصــاب مرکــزی در انسان است که تاکنون هیچ درمان کاملی برای این بیماری پیدا نشده است (26). بیان بیش از حد یا زیاد این پروتئین آثار تخریبی نرونها را در مگس سرکه آشکار کرده است (37). خاموش کردن این ژن ممکن است در بهبود بیماری مغزی-عصبی پارکینسون مفید واقع شود (38). جهشهای ژنتیکی بر روی ژن LRRK2 با استفاده از روشهای ZFN، TALEN، CRISPR و حتی پیش بینیهای بیوانفورماتیکی صورت گرفته است (39،40،41،42،43،44). این بررسیها برروی برخی ژنهای دیگر بیماری پارکینسون و سایر بیماریهای تحلیل برنده عصبی نیز انجام شده است. مثلا با ایجاد جهش در ژن LRRK2 عملکرد و مسیر این ژن در بیماری پارکینسون مشخص شد (33،47). همچنین نتایج حاصل از عمل سیستم ZFN، برخی اثرات ضد جهشی بر روی ژنهای میتوکندری را نشان داد. جهش در ژنوم میتوکندری نیز ازجمله عوامل بیماری پارکینسون است (41، 48). استفاده از روشی راحت، مقرون بهصرفه، سریع و اختصاصی همچون CRISPR جهت ایجاد تغییر ژنتیکی در ژن LRRK2 بهعنوان یک گزینه داروی زیستی یا بیوتکنولوژی با هدف ژندرمانی بیماری پارکینسون و موارد مشابه می‌تواند مد نظر قرار گیرد.
تغییر ژنتیکی مواد ژنومی مبتنی بر سیستم ویرایش ژنی CRISPR با توجه به فاکتورهایی همچون هزینه پایین، دقت زیاد، کارآیی مطلوب و سرعت بالا تاکنون موفقیت‌های زیادی حاصل کرده است (49، 50). از سیستم ویرایشی فوق جهت تخریب یا تغییر ژنهای درگیر در بیماریهای گوناگون ازجمله انواع سرطانهای مختلف مانند سرطان ریه و همچنین بیماریهای سیستم عصبی مانند دیستروفی عضلانی، بیماری اسکلروز جانبی آمیوتروفیک استفاده شده است (43،44،49،50). در مقایسه سیستمهای ویرایش ژنی همچون ZFN، TALEN و CRISPR، اگرچه نحوه عمل همهی این سیستمها یکسان است و با راهاندازی مکانیسم‌های ترمیم موجب ایجاد جهش در ژنوم می‌شوند، ولی سیستم CRISPR دارای مزایای بیشتری است. ازلحاظ حساسیت به متیله بودن DNA، سیستم کریسپر به این تغییر در ژنوم حساس نیست و توانایی برش DNA متیله و غیرمتیله را دارد. در مقابل TALEN و ZNF بهشدت به این تغییر حساس هستند و توانایی برش جایگاه متیله را ندارند. علاوهبراین، برای طراحی جایگاههای برش متفاوت، در سیستم کریسپر فقط یک قطعه‌ی 20 نوکلوتیدی را میتوان تغییر داد، درصورتیکه این تغییر برای ZNF و TALEN در سطح پروتئین با تغییر اسید آمینه‌های دخیل در جایگاه تشخیصی سیستم امکانپذیر است. این فرایند زمانبر، همراه با هزینه بیشتر و پیچیدهتر است (51،52). در مقایسه جهشزایی سیستمهای ZFN، TALEN و CRISPR در ژن بتاکازئین گوساله و بز، میزان کارایی سیستم ZFN حدود 7 درصد، سیستم TALEN حدود 25 درصد و برای سیستم CRISPR حدود 75 درصد مشخص شد (53). مزیت و کارایی قدرت ترمیم روش CRISPR نسبت به دو روش دیگر با اثر بر روی ژن بتاگلوبین انسانی نیز مشاهده شد (54). بهرهوری بیشتر سیستم CRISPR حتی نسبت به روشهای ویرایش ژنی همچون microRNA و iRNAها بهدلیل کارایی بالا، سادگی و کاربردهای چندگانه کلینیکی مورد تایید قرار گرفته است (55). استفاده از روش CRISPR-Cas9 که در این مطالعه بهطور کاملا دقیق منجر به ایجاد ناقل نوترکیب ژن LRRK2 دخیل در بیماری پارکینسون شد، می‌تواند روزنه امیدی برای درک هرچه بهتر مکانیسم‌های دخیل در ایجاد بیماری، تولید حیوانات مدل و درمان احتمالی بیماریهای مهمی از جمله پارکینسون باشد.
نتیجهگیری
با توجه به مزایای بسیار سودمند و کاربردی روش CRISPR در ویرایش ژنوم (Gene Targeting)، ساخت ناقل نوترکیب کریسپیر ویژه ژن LRRK2 درگیر در بیماری عصبی پارکینسون که در این تحقیق انجام گرفت، می تواند در صورت توسعه و تکامل بهعنوان یک گزینه مهم در امر ژن درمانی مورد توجه قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
نتایج مطالعه اخیر برگرفته از بخشی از پایان نامه کارشناسی ارشد رشته ژنتیک خانم آزاده ثمره غلامی از دانشگاه شهید با هنر کرمان می باشد. بدینوسیله از معاونت محترم پژوهشی و فناوری دانشگاه متبوع قدردانی می گردد.
)