نویسندگان
1 گروه ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین–پیشوا، تهران، ایران
2 مرکز بیوتکنولوژی پزشکی، عضو هیئت علمی انستیتو پاستور، تهران، ایران
چکیده
هدف: در این تحقیق ارتباط miR-33a، miR-429 و miR-200c با مسیر EMT در سرطان سلول های غیرکوچک ریه، مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها: در این مطالعه از روش Real Time-PCR برای ارزیابی تغییرات بیان miRNAهای مذکور از 30 بافت توموری سلولهای غیرکوچک ریه (NSCLC) (66 درصد در مرحله I و II و 34 درصد بیماران در مرحله III) استفاده شد. پس از استخراجRNA از نمونههای بافتی سنتز cDNAبا استفاده از پرایمرهای ساقه حلقه انجام شد. بررسی کمی میزان بیان ژنهای فوق الذکر با استفاده از پرایمرهای اختصاصی انجام و آنالیز داده ها با فرمول-∆∆ct 2 صورت گرفت.
نتایج: ارزیابی تغییرات بیان برای miR-33a نشان دادکه تعداد 11 نمونه از 30 نمونه توموری افزایش بیان داشتند.miR-429 افزایش بیان در 12 نمونه توموری و miR-200c افزایش بیان در 18 نمونه توموری داشتند. اما این تغییرات معنیدار نبود (بهترتیب 09/0p=، 084/0p= و 072/0p=).
نتیجه گیری: از آنجاییکه نمونههای این مطالعه در مراحل ابتدایی سرطان بودند، شاید توجیه کننده عدم تغییر بیان معنیدار میباشد. همچنین این پژوهش در مقیاس کوچک طراحی شده، لذا برای بهدست آوردن نتایج دقیقتر، تحقیقات بیشتر و افزایش تعداد نمونهها نیاز است.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
miR-33a, miR-429 and miR-200c with EMT pathway was investigated in non-small cell lung cancer
نویسندگان [English]
- Gh Golshan Rad 1
- Sh Zare Karizi 1
- M Karimipoor 2
1 Department of Genetic, Faculty of Basic Science, Islamic Azad University, Pishva Branch, Varamin, Iran
2 Department of Molecular Medicine, Biotechnology Research Center, Pasteur Institute, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: In this study, the correlation of miR-33a, miR-429 and miR-200c with EMT pathway was investigated in the non-small cell lung cancer.
Material and methods: Real-Time PCR was used to evaluate the expression levels of the mentioned miRNA in 30 non-small cell lung tumor tissues (66% of cells were in stages I, II and the rest were in stage III). RNA extraction was performed and cDNA synthesized using stem-loop primers. The quantitative evolution of gene expression were performed using specific primers and data was analyzed by 2-∆∆ct
Results: The evaluation of expression changes for miR-33a showed that 11 samples were up-regulated. miR-429 and miR-200c showed an increased expressions in 12 and 18 tumor samples, respectively. There was no significant difference between the levels of expression (P≤ 0.05).
Conclusion: There was no significant change in the level of expression of miR-33a, miR-429 and miR-200c. These results could be due to sample size or the early stage of samples.
کلیدواژهها [English]
- non-small cell lung cancer
- Epithelial–mesenchymal transition. miRNA
مقدمه
سرطان ریه از علل شایع مرگ مرتبط باسرطان و در نتیجه یک مشکل عمده برای سلامت عمومی جامعه است (1). سرطان ریه به دو نوع سرطان سلولهای کوچک (SCLC) و سرطان سلولهای غیرکوچک (NSCLC) تقسیم میشود که تقریبا 85 درصد سرطان ریه مربوط به انواع NSCLCاست. این نوع سرطان از نظر بافت شناسی به سه نوع آدنوکارسینوم (AdC)، کارسینوم سلول سنگفرشی (SCC) و کارسینوم سلول بزرگ (LCC) طبقهبندی میشود (2،3). برآوردهای انجمن سرطان آمریکا در زمینه سرطان ریه در ایالات متحده تا سال 2017 حدود 222500 مورد جدید سرطان ریه و 155870 مرگ و میر ناشی از آن بود (4). از عواملی که باعث سرطان ریه میشوند میتوان به سیگارکشیدن، قرارگرفتن در معرض دود تنباکو، نیکل، کروم، آزبست و آرسنیک اشاره کرد (5). سرطان ریه اغلب در مراحل پیشرفته تشخیص داده میشود زمانیکه درمان علاجبخش دیگر امکانپذیر نیست (6). درمان سرطان فردمحور مبتنی بر پایه ژنتیکی در 10 سال گذشته بهخصوص در NSCLC پیشرفت کرده است (7). بنابراین، نیاز فوری به کشف اهداف تشخیصی و درمانی جدید بر پایه مطالعات مولکولی برای بیماران مبتلا بهسرطان وجود دارد (8، 9). شواهد نشان میدهد که پیشرفت تومور با عوامل ژنتیکی، اپیژنتیکی و محیطی کنترل میشود (10). مسیر EMTدر ایجاد تهاجم و متاستاز سرطان نقش دارد، تهاجم باعث متاستاز سرطان به ماتریکس خارج سلولی (ECM) میشود. EMTیکی از مهمترین فعالیتهایی است که موجب انتقال سلول به استروما شده، همچنین مولکولهای وابسته به EMT آبشاری از سیگنالهای داخل سلولی را میسازند که در کاهش فعالیت E-cadherin دخالت دارند. بهدنبال کاهش فعالیتE-cadherine، چسبندگی بین سلولی نیز کاهش یافته و سلول بهسمت متاستاز پیش میرود (11). مطالعات نشان داده که microRNAها از طریق تنظیم EMT به متاستاز کمک میکنند. همچنین شواهد اخیر نشان میدهد که عوامل رونویسی مرتبط با EMT ممکن است بهطور مستقیم در متاستاز دخیل باشند (12). میکروRNAها میتوانند بهعنوان انکوژن و یا مهارکننده تومور از طریق مهار بیان ژنهای هدف وابسته بهسرطان عمل کنند (13، 14). در دهه گذشته مطالعات بسیاری، نقش میکروRNAهای موثر در مسیر EMT را در سرطان مختلف از جمله ریه نشانداده است (15، 17). لذا در تحقیق حاضر، مطالعه این سهmiRNA که دارای اهداف ژنی بسیار مهمی در مسیر EMT میباشند در دستور کار قرار گرفت.
miR-33 aدر متاستاز سرطان سلولهای غیر کوچک ریه در سطوح پایین بیان شده و مهار بیان miR-33a موجب القا EMT و بیان بالای miR-33a توسط تنظیم بیان Twist1موجب توقف EMT در سلولهای NSCLCمیشود. همچنین miR-33a بهعنوان سرکوبگر تومور شناخته شده، زیرا بیان بیش از حدmiR-33a برای مهار رشد سلولهای سرطانی گزارش شده است (18).
miR-200 c و miR-429 از اعضای خانواده miR-200 میباشند و اعضای این خانواده تنظیم کنندههای مهمEMT و متاستاز هستند. miR-200 cیک سرکوبکننده تومور در انواع مختلف سرطان بهشمار میرود (15). یافتههای اخیر نشان داده است که miR-200 c حداقل تا حدی از طریق تحریک USP25، که یکی از اعضای خانواده پروتئازهای ubiquitin است تهاجم را سرکوب میکند (19). miR-200 cتغییرات اپیتلیال- مزانشیمی را با کاهش مقادیر ZEB1/2و افزایش مقادیر E-cadherin، تنظیم میکند که بهعنوان نشانگر اپیتلیال شناخته شده است. E-cadherin اصلی مورد نیاز برای اتصال بین سلولی است. miR-200 c میتواند موجب مهار پس از رونویسی این فاکتورهای رونویسی گردد و از این طریق موجب کنترل EMT شود (20). گزارش شده است که miR-429 در سرطان کولورکتال،کارسینوم هپاتوسلولار،کارسینوم مری،سرطان پستان و سرطان ریه نقش دارد (21). مطالعات اولیه گزارش دادند که سطح پایین miR-429 بابقای کلی کوتاه در بیماران NSCLC ارتباط دارد و همچنین نقش miR-429 درتنظیم سلولهای NSCLC بهطور بالقوه ناشی از مهار بیانDLC-1 است (22).
مواد و روشها
جمعیت مورد مطالعه:جهت بررسی الگوی بیان miR-33a، miR-429 و miR-200c، پس از اخذ رضایتنامه تعداد ۳۰ نمونه بافت تومور ریه و بافت نرمال حاشیه تومور از بیماران مبتلا به سرطان ریه غیر سلول کوچک در اطاق عمل توسط جراح در بیمارستان مسیح دانشوری تهران گرفته شد. نوع تومور توسط پاتولوژیستها تشخیص داده شد. بیمارانی که وارد مطالعه شدند قبل از جراحی هیچگونه درمانی اعم از شیمیدرمانی و رادیوتراپی روی آنها انجام نشده بود. نمونههایی که تحت درمان بودند و یا پاتولوژی آنها غیر از NSCLC بود از مطالعه خارج شدند، نمونهها در داخل ازت مایع دراطاق عمل قرارداده شد و به آزمایشگاه منتقل شدند. پس از انتقال به آزمایشگاه نمونه تا زمان استفاده در دمای۷۰- درجه سانتیگراد ذخیره شد. استخراج RNA و سنتز cDNA از هر کدام ازنمونههای توموری و نمونه نرمال مجاور توموری (بهعنوان کنترل)،RNA با استفاده از کیت ((Gene All, Korea باتوجه به پروتکل شرکت سازنده استخراج شد. غلظت و کیفیت RNA استخراج شده با اسپکتروفتومتری در طول موج 260 و 260 به 280 نانومترمورد بررسی قرار گرفت. از نمونههایی که نسبت جذب نوری 280/260 نانومتر بین 2/2-8/1 داشتند جهت سنتز cDNA استفاده شد. سنتز cDNAبا استفاده از پرایمرهای ساقه حلقه اختصاصی توسط (Prime Script RT reagent kit ,Takara, Japan, Cat. NO RR037A) برطبق پروتکل شرکت سازنده صورت گرفت. نمونهها تا زمان استفاده در دمای۸۰- درجه سانتیگراد ذخیره شدند. از RNU44 بهعنوان کنترل داخلی استفاده شد. توالی پرایمرهای ساقه-حلقه اختصاصی جهت سنتز cDNA درجدول۱ ارایه شده است.
جدول1: پرایمرهای ساقه-حلقه طراحی شده جهت سنتز cDNA.
ژن |
توالی (`۳ →`۵) |
|||
miR-200c-3p |
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACTCCATC |
|
||
|
miR-429 |
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACACGGTT |
|
|
miR-33a-5p |
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACTGCAAT |
|
||
RNU44 |
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGACCGGTATTCGCACTGGATACGACAGTCAG |
|
||
توالیهایی که زیر آنها خط کشیده شده اختصاصی هر miRNA می باشد و بقیه توالی ساقه-حلقه مشترک می باشد.
ارزیابی بیانmiR-33a ، miR-429 وmiR-200c:
واکنش Real-time PCRدرحجم 15 µLشامل: 7.5μl ازRealQ Plus 2x Master Mix Green High ROX™ (Ampliqon, Denmark) ، 10 نانوگرمcDNA ، 5/5 میکرولیتر آب و یک میکرولیتر (۳ پیکومول) از مخلوط پرایمر رفت و برگشت صورت گرفت. برنامه دمایی و زمانی شامل: دناتوراسیون اولیه بهمدت ۱۵دقیقه، سپس بهمدت ۴۰ سیکل: ۹۵درجهی سانتیگراد بهمدت ۱۵ ثانیه و ۵۸ درجه بهمدت یک دقیقه. همهی نمونهها بهصورت duplicate و روش بررسی سایبرگری نبود. جهت طراحی پرایمر از نرم افزار AlleleID v7.4 (Premier Biosoft, US و سایت (NCBIاستفاده شد. پرایمرهای مورد استفاده برای واکنش فوق در جدول ۲ ارایه شده است.
جدول2: پرایمرهای طراحی شده و توالی آنها.
نام miRNA |
طول محصول توالی (`۳ →`۵) |
||||
|
miR-200c-3p |
CACGCCTAATACTGCCGGGT |
Forward |
pb ۸۵ |
|
|
GTATGCAGAGCAGGGTCC |
Reverse |
|||
|
miR-429 |
AGCCGCCTAATACTGTCTGGTA |
Forward |
pb ۹۱ |
|
|
GTATGCAGAGCAGGGTCC |
Reverse |
|||
|
miR-33a-5p |
CATCCGCAGTGCATTGTAGTTG |
Forward |
pb ۸۹ |
|
|
GTATGCAGAGCAGGGTCC |
Reverse |
|||
|
RNU44 |
CCTGGATGATGATAGCAAATG |
Forward |
bp ۸۰ |
|
|
GTATGCAGAGCAGGGTCC |
Reverse |
|||
پرایمر Reverse برای همه forwardها مشترک است.
آنالیز آماری
جهت آنالیز نتایج PCR Real-time از فرمول-∆∆ct 2 و از آزمون T-test و نرم افزارGraphPad Prism v7.03 (GraphPad Software Inc., USA) جهت مقایسه معنیدار بود نتایج در دو گروه توموری و نرمال استفاده شد. همچنین برای همهی آزمونها میزان 05/0p< بهعنوان سطح معنیداری تست درنظر گرفته شد.
نتایج
30 نمونه بافت توموری و بافت نرمال مجاور توموری بارضایت بیماران از بیمارستان مسیح دانشوری تهیه شد. بیماران از نظر سیگاری و غیرسیگاری بودن و پاتولوژی تومور شامل هر دو نوع سرطان سلول غیرکوچک ریه (سلول سنگفرشی و ادنوکارسینوما) دستهبندی شدند. بهطوریکه بیماران از نظر نوع زیرگروه بافتی 57 درصد مبتلا به آدنوکارسینوما و 43 درصد مبتلا به سرطان سلولهای سنگفرشی، 66 درصد در مرحله I و II و 34درصد بیماران در مرحله III بودند. از نظر جنسیت، 27 درصد زن و 73 درصد مرد و از نظر سنی، 3 درصد زیر 40 سال، 3 درصد بین 40 تا 50 سال، 47 درصد بین 50 تا 60 سال و 47 درصد بین 60 تا 70 سال داشتند، همچنین از نظر استعمال دخانیات 73 درصد غیرسیگاری و 27 درصد سیگاری بودند.
نتایج ارزیابی بیانmiR-33a در بیماران مبتلا به سرطان سلولهای غیر کوچک ریه
میزان بیان miR-33aبا استفاده از روش Real Time-PCR در 30 نمونه بافت NSCLC و 30 نمونه بافت مجاور سالم آن بررسی شد. بررسیها نشاندهنده افزایش بیان در 37 درصد نمونهها و کاهش بیان در 63 درصد نمونهها میباشد ( شکل 1).
شکل1: نمودار مربوط به تغییرات بیان miR-33a در نمونه های توموری
تجزیه و تحلیل آماری دادههای این ژن با 09/0p=، بیانگر عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح بیان این میکروRNA در نمونههای توموری در مقایسه بانمونههای سالم است (شکل –a2).
نتایج ارزیابی بیانmiR-429 در بیماران مبتلا به سرطان سلولهای غیر کوچک ریه
تغییرات بیان miR-429 در نمونههای توموری در مقایسه با نمونههای سالم نشان داد که اختلاف معنیداری بین بیان miR-429 در نمونههای توموری و نمونههای سالم وجود ندارد (084/0p=) ( شکل-b2). بهطوریکه از 30 نمونه توموری، 12 نمونه (40 درصد) افزایش بیان و بقیه نمونههای توموری (60 درصد) نشاندهنده کاهش بیان miR-429بودند (شکل3).
شکل3: نمودار مربوط به تغییرات بیان miR-429 در نمونه های توموری
نتایج ارزیابی بیانmiR-200c در بیماران مبتلا به سرطان سلولهای غیر کوچک ریه
ارزیابی بیان miR-200cدر 30 نمونه توموری و 30 نمونه سالم مجاور آن براساس شکل 4، بیانگر کاهش بیان 12 نمونه (40 درصد) و افزایش بیان 18 نمونه از 30 نمونه توموری (60 درصد) میباشد. در نهایت با آنالیزهای آماری هیچ اختلاف معنیداری بین سطح بیان این میکروRNA درنمونههای توموری در مقایسه با نمونههای سالم مشاهده نشد (072/0p=) (شکل –c2).
شکل4: نمودار مربوط به تغییرات بیان miR-200c در نمونه های توموری
شکل2: نمودار (a) مربوط به مقایسه بیان miR-33a ،(b) مربوط به مقایسه بیانmiR-429 و (c) مربوط به مقایسه بیان miR-200c میان نمونه های توموری و نمونه های سالم.
بحث
یکی از مسیرهای مهم در پیشروی سرطانی شدن سلول، مسیر EMT میباشد. EMT دارای نقش مهم در افزایش پتانسیل بدخیمی و کاهش حساسیت به درمانهای معمول در سلولهای NSCLC است. از دست دادن بیان مارکرهای EMTمانند E-cadherin وcytokeratin و بهدست آوردن بیان مارکرهای مزانشیمی مانندN-cadherin وvime ntin بهطور قابل توجهی با پیشرفت مرحله NSCLC ارتباط دارد. اکنون مشخص شده است کهRNAهای غیرکدکننده از قبیلmicroRNAها از طریق تنظیمEMT در ایجاد و یا جلوگیری از متاستاز کمک میکنند (10). بههمین منظورmiR-33 a ، miR-429 وmiR-200 c در این مطالعه، بهعنوان میکروRNAهای درگیر در این مسیر بررسی شدند، زیرا این miRNAها هدفهای ژنی مهمی در مسیر EMT ازجمله ZEB2، Snail-1،TWIST ،N-cadherin ،PI3K ، Akt دارند. مطالعات پیشین روی اینmicroRNA ها نتایج مختلفی را در سرطانهای مختلف نشان دادهاند. Changو همکاران با تحقیق روی ردهی سلولی MCF-7 پیشنهاد کردند که miR-200 c تهاجم و مهاجرت را در سرطان پستان را از طریق هدف قرار دادن بیان HMGB1 مهار میکند (23). نتایج مطالعهای دیگر روی این miRNA در ۷۹ بیمار نشان داد که بیان سطح miR-200 c در بافتهای NSCLC پایینتر از بافتهای غیرتوموری بود. این کاهش بیان سبب برداشته شدن اثر مهاری miR-200 c روی ژنهای ZEB1/2و کاهش بیانE-cadherin و در نهایت کاهش چسبندگی سلولی میشود. اما در تحقیق حاضر این کاهش بیان معنیدارنبود. ازجمله دلایلی که میتوان برای این تناقض مطرح کرد میتوان به کمبودن تعداد نمونهها اشاره کرد. همچنین نمونهها در مراحل ابتدایی سرطان ریه بودند و شاید همین امر توجیهکننده عدم تغییر بیان mir-200 c باشد.
دیگر عضو متعلق بهخانوادهیmiR-200 ، یعنی miR-429 نیز در این پژوهش مورد بررسی قرارگرفت که تغییر بیان هدفداری را در نمونههای NSCLC نشان نداد. هر چند که پیشتر افزایش بیان آن در سرطان روده گزارش شده بود (24). درسال 2014،Lang و همکاران بررسی کردند که افزایش mir-429 باعث ایجاد تومور در سرطان سلولهای غیر کوچک ریه میشود و چندین ژن سرکوبکننده تومور را هدف قرار میدهد. بیان بیش از حد miR-429 در ردهی سلولهای (A549 NSCLC) بهطور قابل توجهی باعث مهاجرت و تهاجم سلول شده، درحالیکه مهار miR-429 مانع از این اثرات میشود. miR- 429 با هدف قرار دادن ژنهای PTEN، RASSF8 و TIMP2، بیان آنها را کاهش میدهد. این ژنها جز سرکوبکنندههای تومور هستند و به این ترتیب باعث متاستاز و سرطانی شدن سلولها میشوند (22). اما در تحقیق حاضر تغییر بیان معنیداری برایmiR429 مشاهده نشد، ازجمله دلایلی که برای عدم تغییر بیان میتوانیم مطرح کنیم این است که بیانmiR429 وابسته به بافت است و در بافتهای مختلف ژنهای متفاوتی هدف قرار میدهد. باتوجه به گزارش کاهش بیان این miRNA در مطالعهی Lang و همکاران افزایش تعداد نمونهها میتواند راهکاری منطقی برای بهدستآوردن نتایج قابل اطمینان در این زمینه باشد.
تغییرات نابهجا در الگوی بیان miR-33 aنیز در سرطانهای متعددی گزارش شده است. مطالعات نشان داده است که miR-33a میتواند با تنظیم بیان β-catenin مانع از گسترش سلولهای سرطانی ریه و تهاجم در ردهی سلولی بافت ریه A549شود. β-catenin در پیشرفت چرخه سلولی نقش دارد و بیان غیرطبیعی آن در سلولهای مختلف تومور مشاهده شده است. همچنین MiR-33a با کاهش بیان نابهجای خود سبب متاستاز سرطان ریه سلول غیر کوچک میشود و با بیان Twist1 رابطه معکوس دارد (25). درسال 2017،Li-Kun Hou و همکاران بهبررسی بیان microRNA-33 a در NSCLCsو بافت نرمال ریه پرداختند. در مطالعه مذکور ۱۴۷ نمونه توموری که در مراحل انتهایی سرطان قرار داشتند و ۳۲ نمونه طبیعی ریه گنجانده شدند. تجزیه و تحلیل miR-33a در این نمونهها توسط qRT-PCR نشان داد که میزان بیان آن در بیوپسیهای تومور NSCLC نسبت به بافتهای غیر سرطانی مجاور پایینتر است. این تفاوت از نظر آماری معنیدار بود (05/0p<). علاوهبراین، سطح بیان miR-33 a در هر در جهاز بیوپسی تومور NSCLC بهطور قابل توجهی پایینتر از بافت ریه طبیعی بود (26). درمطالعه حاضر تغییر بیان معنیداری در miR-33a مشاهده نشد. شاید بتوان با افزایش تعداد نمونهها نتایج دقیقتری را برای miR-33 a بهدست آورد.
درنهایت، برایmicroRNA های انتخابی در این پژوهش تغییر بیان معنیداری مشاهده نشد. ازآنجاییکه این پژوهش در مقیاس کوچک طراحی شده، لذا برای بهدستآوردن نتایج دقیقتر، تحقیقات بیشتر و افزایش تعداد نمونهها نیاز است. این یافتهها میتواند سطح اهمیتmicroRNA ها را ارتقا داده وکمکی به درک مکانیسمهای مولکولی سرطان ریه باشد.
تشکر و قدردانی
این مقاله بخشی از پایاننامه دانشجویی در مقطع کارشناسی ارشد میباشد که با حمایت دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین-پیشوا به انجام رسیده است، بدین وسیله از کلیهی افرادی که ما را در انجام این تحقیق یاری کردند تشکر و قدردانی میشود.