مقدمه

یادگیری فرآیندی است که طی آن اطلاعاتی درباره دنیای پیرامون کسب می‏کنیم و حافظه مکانیسمی برای کدبندی، ذخیره­سازی و فراخوانی دوباره این اطلاعات است (1). حافظه در واقع بازتاب و انعکاس تجربه­ها در مغز است.

حافظه تحت تاثیر عوامل مختلفی است. یکی از این عوامل، خواب می باشد و کاهش میزان خواب می‏تواند باعث تخریب حافظه شود. خواب پدیده ایست که در مهره‏داران فقدانش با رفتارهای غیرعادی مرتبط است (2) شرایط زندگی ماشینی وکاهش میزان خواب در افراد بزرگسال باعث آسیب رساندن به فرآیند حافظه شده است. ارتباط نزدیکی میان حافظه و خواب وجود دارد. خواب برای تثبیت حافظه حیاتی می‏باشد (3) محرومیت از خواب باعث تخریب حافظه کوتاه مدت و بلند مدت می‏شود (4). از طرف‏دیگر، منیزیم چهارمین کاتیون مهم بدن است که نقش‏های متعددی را در بدن برعهده دارد. ازجمله در ارتباط با گیرنده‏های هورمونی، دریچه کانال کلسیمی، جریان یونی غشا، فعالیت‏های عصبی و آزادسازی نوروترانسمیترها نقش داشته و عمل اصلی آن در مغز، تعدیل بلوک وابسته به ولتاژ گیرنده‏های NMDA می‏باشد (5، 6). در انسان کمتر از یک درصد آن در سرم وجود دارد و عمده آن در استخوان و بافت‏های نرم وجود دارد (7). آسیب‏های ناشی از ایسکمی در مغز می‏تواند به‏وسیله استفاده از آنتاگونیست‏های NMDA همچون کتامین و منیزیم کاهش یابد (8). همچنین منیزیم  نقش مهمی در آزاد سازی نوروترانسمیترها، قابلیت تحریک‏پذیری نورونی و انعطاف‏پذیری سیناپسی ایفا می‏کند (9). عبداله زاده و همکارانش (10) نشان دادند که تجویز نانواکسید منیزیم موجب بهبود حافظه دراز مدت می‏گردد و اثر قابل ملاحظه‏ای در جلوگیری از فراموشی ناشی از مورفین اعمال می‏نماید. سرقلی و همکاران (11) نیز نشان دادندکه نانواکسید منیزیم در دوزهای 5/2 و 5 میلی‏گرم در کیلوگرم‏، باعث بهبودی حافظه در مدل یادگیری اجتنابی غیرفعال تا یک هفته می‏گردد. نشان داده شده که اتصالات سیناپسی و Long-Term Potentiation (LTP) نقش مهمی در فرآیند حافظه دارند (12). بنابراین هر فاکتور محیطی که میزان اتصالات را افزایش دهد باعث بهبود حافظه می‏شود. از میان فاکتورهای محیطی می‏توان از منیزیم نام بردکه در درون مغز یکی از اعمال آن، تعدیل مسدود شدن وابسته به ولتاژ گیرنده  NMDAمی‏باشد که به‏نوبه خود، در انعطاف‏پذیری سیناپسی نقش دارد (13). علاوه بر موارد ذکر شده، مطالعات نشان می‏دهند که محرومیت از خواب، فعالیت آنزیم کولین‏استراز که غیرفعال‏کننده استیل‏کولین در شکاف سیناپسی می‏باشد (14) را در ساقه مغزی افزایش می‏دهد (15). M.A.C.Benedito و همکارانش نیز در سال2000 نشان دادند که محرومیت 92 ساعته از خواب  REMباعث افزایش فعالیت آنزیم کولین‏استراز در پل مغزی و مدولا می شود. نویان و همکارانش با بررسی  آناتومیکی و رنگ‏آمیزی در مغز موش های صحرایی که 120 ساعت محرومیت از خواب داشتند، نشان دادند که در ناحیه پری اپتیک آن‏ها، مقدار فعالیت این آنزیم نسبت به گروه کنترل افزایش یافته است.  Taurineنیز یکی از آمینواسیدهای درون‏زاد است که به‏طور وسیعی در بدن انسان از جمله پلاسما، قلب و بافت‏های عصبی دیده می‏شود. این آمینواسید دارای اثرات محافظت کنندگی در برابر اثرات سمیت تحریکی گلوتامات می‏باشد (16). مشاهده شده که مکمل‏های Taurine در فرآیند تولید سیناپس جدید مفید بوده و پیشنهاد می‏کند که باعث افزایش تغییر پذیری سیناپسی و بهبود حافظه می‏شود (17). مشخص شده که  این آمینواسید اثرات حفاظتی را در بسیاری از حالات پاتولوژی همچون بیماری‏های آلزایمر و هانتینگتون اعمال می‏کند (18، 19). این آمینواسید جهت نمو طبیعی سیستم عصبی مورد نیاز می‏باشد (20). اطلاعات زیادی در ارتباط با اثرات محافظت کنندگی آن در برابر آسیب‏های سلولی در شرایط هیپوکسی و ایسکمی وجود دارد (21). همچنین اطلاعات زیادی در ارتباط با اثرات محافظتی آن بر اعمال شناختی وجود دارد (22). Wenig I نشان داد که (23) Taurine می‏تواند اثرات تخریب حافظه ناشی از آلومینیوم را درمان کند. اکنون روشن شده است که بی‏خوابی باعث اختلال متابولیکی از جمله دیابت و چاقی می‏گردد. مطالعات نشان می‏دهند که کم‏خوابی ممکن است باعث شود تا تحمل به گلوکز پایین بیاید و باعث افزایش قند خون شود. مشخص شده که هومئوستازی گلوکز در انسان، به‏عنوان فاکتور مهمی برای عمل‏کرد سیستم عصبی عمل می‏نماید. نشان داده شده که افزایش و کاهش قند خون با بیماری‏های عصبی محیطی و مرکزی در ارتباط می‏باشد. همچنین نشان دادند که محرومیت از خواب تولید فاکتور رشد مشتق از مغز(BDNF)  که با حافظه رابطه مستقیمی دارد (24) را کاهش می‏دهد که علت آن‏را اثرات التهابی ناشی از محرومیت از خواب و همچنین اثرات کورتیکوسترون (که در هنگام محرومیت از خواب افزایش می‏یابد) بر بیان mRNA و پروتئین سازی می‏دانند. افزایش غلظت گلوکز مغز باعث تولید رادیکال‏های آزاد می‏شود که آن هم باعث نقص در تولید  BDNFمی‏گردد. BDNF نقش حیاتی در بقا نورون‏ها دارد که در رشد آن‏ها و تشکیل و عمل‏کرد سیناپس‏ها بسیار مهم می‏باشد (25). به‏طوری‏که بدون آن و دیگر فاکتورهای رشد مغزی، نورون‏ها ازبین می‏روند. با توجه به اثرگذاری BDNF بر پلاستی سیتی و ارتباط بخش بین نورون‏ها و اثر تغییرات آن بر یادگیری و حافظه، BDNF نقش مهمی در حافظه و یادگیری دارد (26). همچنین مشخص شده که BDNF در شرایط محرومیت از خواب در مغز و سرم کاهش می‏یابد (24). بین میزان BDNF و حافظه رابطه مستقیمی وجود دارد. کاهش آن در سرم افراد دچار بیماری آلزایمر و در استرس اکسیداتیو و پس از محرومیت از خواب دیده شده است (27). Alzoubi و همکارانش نیز نشان دادند که محرومیت از خواب سطح BDNF را کاهش داده و حافظه را مختل می‏نماید (28).

هدف از تحقیق: به‏دلیل اثرات خواب برحافظه، به‏بررسی اثر محرومیت ازخواب بر حافظه و همزمان به‏بررسی میزان چند فاکتور مهم در حافظه یعنی قند خون،آمینواسید تاورین، فعالیت آنزیم کولین‏استراز و فاکتور رشد مشتق از مغز، در حالت محرومیت از خواب و در زمان به کارگیری نانواکسید منیزیم، پرداخته شد. دراین مطالعه موش‏ها قبل از انجام آموزش، دوره 72 ساعته محرومیت از خواب را گذرانده‏اند.

مواد و روش‌ها

حیوانپات و مواد: پژوهش حاضر از نوع تجربی با طرح پیش آزمون (همراه با گروه کنترل) و به‏شیوه آزمایشگاهی انجام خواهد شد. در این پژوهش از موش صحرایی نر بالغ با وزن 200 تا 250 گرم استفاده شده است. موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی که مورد تایید کمیته اخلاق گروه زیست شناسی دانشگاه شهید چمران اهواز بود، هنگام کار با موش‏ها رعایت شد. موش‏ها به‏مدت 72 ساعت از خواب متناقض، محروم شده‏اند و سپس مراحل سازگاری و آموزش انجام گرفته و پس از آن دارو دریافت کرده‏اند. داروی مورد استفاده، نانواکسید منیزیم (در سه دوز 1، 5 و 10میلی‏گرم بر کیلوگرم) بوده که به‏صورت درون صفاقی و یک‏بار درست بعد از آموزش تزریق شده است.

گروه‏بندی موش‏ها: در این مطالعه موش‏ها در گروه‏های شش‏تایی به‏شرح زیر قرار گرفته اند.

گروه 1-گروه کنترل. این گروه از خواب محروم نشده‏اند. به‏عبارت ‏دیگر چرخه خواب وبیداری عادی داشته‏اند.

گروه 2-گروه محرومیت از خواب. این گروه به‏مدت 72 ساعت از خواب متناقض محروم شده‏اند و دارویی دریافت نکرده‏اند

گروه 3-گروه محروم شده از خواب که نانواکسید منیزیم در دوز 1 میلی‏گرم بر کیلوگرم  به‏صورت درون صفاقی دریافت کرده‏اند.

گروه 4- گروه محروم شده از خواب که نانواکسید منیزیم در دوز 5 میلی گرم بر کیلوگرم  به‏صورت درون صفاقی دریافت کرده‏اند.

گروه 5- گروه محروم شده از خواب که نانواکسید منیزیم در دوز 10 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏صورت درون صفاقی دریافت کرده‏اند.

بررسی رفتاری: در این تحقیق، جهت ارزیابی حافظه احترازی غیر فعال از دستگاه  Shuttle boxاستفاده شده است. این دستگاه متشکل از دو بخش روشن و تاریک می‏باشد. در این روش یادگیری، آزمایش‏ها در سه مرحله انجام می‏گیرد. 1-مرحله اول سازگاری که در آن حیوان با دستگاه آشنا می‏شود. 2-مرحله دوم آموزش که بعد از 30 دقیقه حیوان را مجددا به بخش روشن منتقل شده و پس از گذشت ده ثانیه، دریچه باز می شود. بلافاصله پس از ورود حیوان به بخش تاریک، دریچه بسته شده و شوک الکتریکی به‏شدت یک و نیم میلی‏آمپر به‏مدت سه ثانیه با فرکانس 50 هرتز، به دست و پای حیوان داده می‏شود. 3-مرحله سوم آزمون حافظه بلند مدت: 24 ساعت پس از آموزش، زمان تاخیر ورود حیوان به بخش تاریک ثبت می‏گردد (29).

محرومیت از خواب: جهت محرومیت از خواب از روش پلت فرم چندتایی برای القای محرومیت از خواب استفاده شد. این دستگاه (95 سانتیمتر × 44 سانتی متر × 44 سانتی متر) حاوی 10 ستون (10 سانتی متر ارتفاع، 7 سانتی متر قطر، 2 سانتی متر بالاتر از سطح آب واقع شده) است که در دو ردیف طراحی شده‌اند و 10 سانتیمتر از هم فاصله دارند (لبه به لبه). دستگاه اجازه حرکت موش از یک پلت فرم به پلت فرم دیگر را می‌دهد. حیوان بر روی پلت فرم کوچک قرار داده می‌شد (شکل 5 و6). هنگامی که حیوان به خواب با حرکات سریع چشم (REM) وارد می‌شود، محرومیت از خواب اعمال می‌شود، زیرا با از دست رفتن تنوس عضلانی موش با آب تماس پیدا کرده و باعث بیدار شدن آن می‌شود. در طول مطالعه، موش دسترسی به بطری‌های تمیز آب و مواد غذایی موجود بر بالای محفظه دارد. در پژوهش حاضر، محرومیت از خواب به‏مدت 72 ساعت القا شد (30).

ارزیابی بیوشیمیایی:

اندازه گیری گلوکز: در این تحقیق برای سنجش میزان قند خون از دستگاه گلوکومتر استفاده شده است. بعد از اعمال محرومیت از خواب با ایجاد زخم درناحیه دم حیوان، یک قطره خون گرفته می‏شد و به‏وسیله گلوکومتر، قند خون اندازه‏گیری می‏شد.

تاورین: اندازگیری تاورین به‏وسیله کیت آزمایشگاهی: کیت الایزا، آزمونی است که با استفاده از آنتی‏بادی‌ها و تغییر رنگ، ماده‌ی مورد نظر شناسایی می‌شود. در ارتباط با کیت تاورین (MBS744370 محصول شرکت Mybiosourse) اساس سنجش، تکنیک ایمنی رقابتی آنزیم به‏کمک یک آنتی‏بادی ضد Taurine و یک کونژوگیت (ترکیب جفت) Taurine -HRP می‏باشد.

اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم آنزیم کولین‏استراز: برای سنجش میزان آنزیم کولین‏استراز، از روش المن که روشی سریع برای ارزیابی میزان فعالیت آنزیم می‏باشد، استفاده شده است (31). در این روش از یک بافر)فسفات1/0مولار در PH برابر 8( و استیل تیوکولین یا اس-بوتریل تیوکولین  به‏عنوان سوبسترا، استفاده شده است.

اندازه‏گیریBDNF:در این ارتباط، BDNF مربوط به هیپوکامپ را پس از هموژنیزه کردن بافت هیپوکمپ، با استفاده از کیت الایزا (CK-E30666 محصولEast Bio pharm) اندازه‌گیری گردید. به‏طورکل، الایزا روش بیوشیمیایی است که با استفاده از یک آنزیم ایمونواسی فاز جامد (EIA) برای تشخیص حضور یک ماده، معمولا یک آنتی ژن، در یک نمونه مایع استفاده می‌گردد. 

 آنالیز آماریدر این تحقیق از نرم افزار  spssاستفاده شده است که در آن از آزمون T-testبرای بررسی تفاوت بین گروه کنترل و گروه محروم شده از خواب استفاده شد و برای بررسی تفاوت بین گروه محروم شده از خواب و گروه‏هایی که دوزهای مختلفی از نانواکسید منیزم دریافت کرده بودن، از آنالیز  ANOVA یک‏طرفه استفاده شده است.

نتایج

بررسی اثر محرومیت از خواب بر حافظه

مطابق شکل 1، آنالیز آماری T-test نشان می‏دهد که محرومیت از خواب 72 ساعته باعث کاهش حافظه طولانی مدت  می‏شود. ( 001/0p

شکل 1: اثرمحرومیت بر حافظه بلند مدت. محرومیت از خواب به‏صورت معنی‏داری (001/0p<) باعث کاهش  حافظه شده است.گروه کنترل، تحت بی‏خوابی قرار نگرفته‏اند اما گروه محروم از خواب، به‏مدت 72 ساعت از خواب REM محروم شده اند.

بررسی اثردوزهای مختلف نانو اکسید منیزیم بر حافظه تخریب شده به وسیله محرومیت از خواب

شکل 2 آنالیز ANOVA یکطرفه را در ارتباط با اثردوزهای مختلف نانو اکسید منیزیم بر حافظه تخریب شده به‏وسیله محرومیت از خواب را نشان می دهد و همان‏طور که مشاهده می‏شود دوزهای 1 و 5 میلی‏گرم بر کیلوگرم، اثری برحافظه تخریب شده، نداشته این درحالی است که دوز 01 میلی‏گرم بر کیلوگرم آن می‏تواند باعث بهبود حافظه بلند مدت شود (50/0<p): 03/4=(3,23)f).

شکل 2: بررسی اثر دوزهای مختلف نانواکسید منیزیم بر حافظه تخریب شده به‏وسیله محرومیت از خواب. دوزهای 1 و5میلی‏گرم بر کیلوگرم، نانواکسید منیزیم اثر معنی‏داری بر تخریب حافظه نداشته‏اند. اما دوز 10 میلی‏گرم بر کیلوگرم، باعث شده تا حافظه بلندمدت نسبت به گروهی که تحت بی‏خوابی قرار گرفته و دارویی دریافت نکرده‏اند، بهبود یابند. در این‏جا علاوه برگروه کنترل که به‏مدت 72 ساعت از خواب  REMمحروم شده‏اند، بقیه گروه‏هایی هم که دارو دریافت کرده‏اند همگی به‏مدت 72 ساعت از خواب REM محروم شده‏اند.

بررسی اثر محرومیت از خواب بر میزان آمینواسید تاورین هیپوکمپ

در شکل 3، آنالیز آماری T-test نشان می‏دهد که محرومیت از خواب 72 ساعته باعث کاهش میزان آمینواسید تاورین هیپوکمپ درگروه محروم شده از خواب در مقایسه با گروه کنترل شده است (05/0p<).

شکل 3: اثر محرویت از خواب بر روی آمینواسید تاورین موجود در هیپوکمپ را نمایش می‏دهد. میزان این آمینواسید در هیپوکمپ گروه محروم شده از خواب نسبت به گروه کنترل، دچار کاهش شده است (05/0p<). گروه کنترل، تحت بی‏خوابی قرار نگرفته‏اند اما گروه محروم از خواب، به‏مدت 72 ساعت از خواب  REMمحروم شده‏اند.

بررسی اثردوزهای مختلف نانو اکسید منیزیم بر میزان آمینواسید تاورین هیپوکمپ

شکل 4 آنالیز آماری ANOVA یک‏طرفه میزان آمینواسید تاورین هیپوکمپ رابعد از اثر دوزهای مختلف نانو اکسید بر گروه محرومیت از خواب را نشان می‏دهد. که نشان می‏دهد اختلاف معنی‏داری بین گروه محروم شده از خواب و گروه‏های محروم شده از خوابی که دوزهای مختلف نانواکسید منیزیم را دریافت کرده‏اند، دیده نمی‏شود.

شکل 4: اثر دوزهای مختلف نانواکسید منیزیم بر آمینواسید تاورین در هیپوکمپ را نشان می‏د‏هد. این نمودار نشان می‏دهدکه استفاده از نانواکسید منیزیم اثرات معنی‏داری بر میزان این آمینواسید ندارند. همه گروه‏ها به‏مدت 72 ساعت از خواب  REMمحروم شده‏اند. اما گروه کنترل دارویی دریافت نکرده است ولی بقیه گروه‏ها دوزهای مختلفی از نانواکسید منیزیم را دریافت کرده‏اند.

بررسی اثر محرومیت از خواب بر میزان فعالیت آنزیم کولین‏استراز در هیپوکمپ

شکل 5، آنالیز آماری T-test رانشان می‏دهد که همان‏طور که دیده می‏شود، محرومیت از خواب 72 ساعته باعث افزایش فعالیت این آنزیم در هیپوکمپ درگروه محروم شده از خواب در مقایسه با گروه کنترل شده است (001/0p<).

شکل 5: اثرات بی‏خوابی بر فعالیت آنزیم کولین‏استراز  (Ache)را نشان می‏دهد که نشان می‏دهدگروه محروم شده ازخواب دچار افزایش چشم‏گیری در فعالیت این آنزیم نسبت گروه کنترل، شده است.گروه محروم از خواب، به‏مدت 72 ساعت از خواب REM محروم شده‏اند. این درحالی است که گروه کنترل چرخه خواب–بیداری عادی داشته‏اند.

بررسی اثر دوزهای مختلف نانو اکسید منیزیم بر میزان فعالیت آنزیم کولین استراز هیپوکمپ

همان‏طوری‏که شکل 6 نشان می‏دهد به‏کارگیری دوز 10 میلی‏گرم بر کیلوگرم نانواکسید منیزیم  باعث کاهش فعالیت آنزیم کولین استراز شده است (01/0p<): 42/8=(3,14)f).

شکل 6: اثر دوزهای مختلف نانواکسید منیزیم بر فعالیت آنزیم کولین‏استراز (Ache) را نشان می‏دهدکه البته فقط دوز 10 میلی‏گرم برکیلوگرم توانسته است. باعث کاهش مجدد (01/0p<) آنزیم کولین‏استراز شود. در این‏جا علاوه برگروه کنترل که به‏مدت 72 ساعت از خواب  REMمحروم شده‏اند، بقیه گروه‏هایی هم که دارو دریافت کرده‏اند همگی به‏مدت 72 ساعت از خواب REM محروم شده‏اند.

بررسی اثر محرومیت از خواب بر میزان قند خون

در شکل 7 آنالیز T-test اختلاف معنی‏دار میان گروه محروم شده از خواب و گروه کنترل از نظر میزان قند 

خون را نشان می‏دهد و همان‏طورکه مشاهده می‏شود، محرومیت 72 ساعته سبب افزایش قند خون (001/0p<) شده است.

شکل 7: اثرمحرومیت از خواب بر قند خون را نشان می‏دهد. همان‏طورکه نشان داده شده است، محرومیت ازخواب باعث افزایش معنی‏داری درقند خون شده است (001/0p<). گروه محروم از خواب، به‏مدت 72 ساعت از خواب REM محروم شده‏اند. این درحالی است که گروه کنترل چرخه خواب –بیداری عادی داشته‏اند.

بررسی اثردوزهای مختلف نانو اکسید منیزیم بر میزان قند خون

شکل 8 اثر دوزهای مختلف نانواکسید منیزیم را بر میزان قند خون موش‏های محروم شده از خواب را نمایش می‏دهد. همان‏طورکه دیده می‏شود دوزهای 5 و 10 میلی‏گرم بر کیلوگرم نانواکسید منیزیم باعث کاهش معنی‏داری در میزان قند خون موش‏های محروم شده از خواب شده‏اند (001/0p<).

شکل 8: اثر دوزهای مختلف نانواکسید منیزیم بر روی قند خون را نشان می‏دهد: در این‏جا دوز 1 نانواکسید منیزم اثر معنی‏داری بر قند خون نداشته. اما دوز 5 با 01/0p< و دوز 10 با 001/0p< باعث کاهش معنی‏داری در میزان قند خون می‏شودp

بررسی اثر محرومیت از خواب بر میزان فاکتور رشد مشتق شده از مغز، ( BDNF)در هیپوکمپ

شکل 9 نشان می‏دهد که محرومیت از خواب اثر معنی‏داری بر میزان این فاکتور رشد در هیپوکمپ نمی‏گذارد.

شکل 9: اثر محرومیت از خواب بر فاکتور رشد مشتق شده از مغز (BDNF) را نشان می‏دهد که مشخص می‏سازد محرومیت 72 ساعته از خواب متناقض اثر معنی‏داری بر این فاکتور نداشته است.گروه کنترل به‏ اندازه کافی در طول شبانه روز خوابیده اند اما گروه محروم از خواب به‏مدت 72ساعت بیدار مانده‏اند.

بررسی اثردوزهای مختلف نانو اکسید منیزیم بر میزان فاکتور رشد مشتق شده از مغز،BDNF) هیپوکمپ)

شکل 10 آنالیز ANOVA یک‏طرفه را میان گروه محروم شده از خواب و گروه‏های محروم شده از خوابی که دوزهای مختلف نانواکسید منیزم را دریافت کرده‏اند را نشان می‏دهد که اثر معنی‏داری بر میزان این فاکتور نداشته‏اند.

شکل 10: اثر دوزهای مختلف نانواکسید منیزیم را بر فاکتور رشد مشتق شده از مغز (BDNF) در هیپوکمپ را نشان می‏دهد که اثر معنی‏داری را نشان نمی‏دهند. همه گروه‏ها به‏مدت 72 ساعت از خواب REM محروم شده‏اند. اما گروه کنترل دارویی دریافت نکرده است ولی بقیه گروه‏ها دوزهای مختلفی از نانواکسید منیزیم را دریافت کرده‏اند.