نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
- مریم قدرتی سیاهمزگی 1
- محمد علی نصیری خلیلی 1
- مهدی زین الدینی 2
- سیروس خدادادی 2
- نسرین زرکار 2
- نسرین فرامرزی 1
1 - دانشگاه صنعتی مالک اشتر ، تهران ، ایران.
2 - دانشگاه صنعتی مالک اشتر ، تهران ، ایران
چکیده
هدف: هدف از مطالعه‌ی حاضر، تولید پروتئین نوترکیب هیبریدی DT389GCSF به فرم فعال محلول در باکتری E. coli Bl-21(DE3) ، تخلیص و ارزیابی سمیت سلولی آن می‌باشد.
مواد و روش‌ها: پروتئین DT389GCSF، با دنباله‌ی 6 هیستیدین در باکتری E. coli BL-21(DE3) در دمای 28 درجه سانتیگراد به فرم محلول بیان شد. سپس از طریق ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل سفاروز تخلیص شد. در نهایت عملکرد پروتئین نوترکیب خالص شده با استفاده از آزمون TTM بر روی سلول سرطانی 06-LH مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج: میزان بیان و خلوص پروتئین DT389GCSF با استفاده از نرم‌افزار Image J، بهترتیب در حدود 12 و 80 درصد تخمین زده شد. میزان IC50 پس از 48 ساعت قرارگیری پروتئین DT389GCSF در معرض رده‌ی سلولی، در حدود 000019/0±00017/0 مولار بود.
نتیجهگیری: با کاهش دما و استفاده از مکانیسم درون سلولی، می‌توان بازتاخوردگی پروتئین هیبریدی DT389GCSF را به شکل مناسب و به فرم فعال مشاهده نمود. در نتیجه در مراحل تولید آزمایشگاهی ایمونوتوکسینهای مربوطه می‌توان با استفاده از این روش، از مراحل تولید به صورت اینکلوژن‌بادی صرفنظر کرد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Lab-Scale Production of Biologically Active Form of Immunotoxin Targeted against Granulocyte Colony Stimulating Factor
نویسندگان [English]
- M Ghodrati Siahmazgi 1
- MA Nasiri Khalili 1
- M Zeinoddini 2
- S khodadadi 2
- N Zarkar 2
- N Faramarzi 1
1 - Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, MalekAshtar University of Technology, Tehran, Iran
2 - Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, MalekAshtar University of Technology, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: This study aimed to produce recombinant hybrid protein, DT389GCSF, in E. coli BL-21(DE3) in a soluble and active form and to purify it and evaluate its cytotoxicity.
Material and Methods: The protein, His6-tagged DT389GCSF was expressed in E. coli BL-21(DE3) in a soluble form at 28 °C. Then it was purified by affinity chromatography on nickel sepharose column. Finally, the function of purified recombinant protein was evaluated by MTT assay on HL-60 cancer cell line.
Results: The yield of expression and purification of DT389GCSF were determined at about 12 and 80 percent, respectively, using Image J software. The IC50 value upon 48 hours of exposure of DT389GCSF toward cell line was about 0.00017±0.000019 M.
Conclusion: By reducing the temperature and using the intracellular mechanism, the refolding of hybrid protein, DT389GCSF, can be observed in a proper and active form. As a result, in vitro production of relevant immunotoxins, by using this method, the steps of inclusion body production can be neglected.
کلیدواژه‌ها [English]
- Immunotoxin
- Granulocyte Colony Stimulating Factor
- Expression
- purification
- active form
مقدمه
سرطان، یک عامل مهم و اساسی مرگ و میر در جهان است. با توجه به مشکلات استفاده از روش‌های مرسوم شیمی‌درمانی و پرتودرمانی از جمله مقاومت سلولهای سرطانی به برخی داروهای شیمی‌درمانی و دارا بودن عوارض جانبی و سمیت این داروها بر روی بافت‌های سالم، ارائه‌‌ی راهکارهای جدید برای درمان اختصاصی و موثرتر سرطان ضروری بهنظر می‌رسد (1-3). امروزه استفاده از پروتئین‌های نوترکیب که بتواند بافت‌ها و سلولهای اختصاصی را ردیابی، شناسایی و نابود کند، مورد توجه محققین می‌باشد. نتیجه تحقیقات صورت گرفته، دستیابی به نوعی پروتئین هیبریدی هوشمند به نام ایمونوتوکسین است. دنیلوکین دیفتیتوکس یا اونتاک (DT389IL2)، اولین ایمونوتوکسین نوترکیب است که در سال 1999، توانست از سازمان غذا و داروی آمریکا تاییدیه دریافت کند. این ایمونوتوکسین با ایدهبرداری از توکسین دیفتری طراحی شده است. که در آن بخش اتصالی توکسین دیفتری حذف و جایگزین آن اینترلوکین 2 انسانی شده است (4-6). در ساختار ایمونوتوکسین DT389GCSF توکسین دیفتری (DT) ناقص (بدون بخش اتصالی) به فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیت یا G-CSF به روش مهندسی ژنتیک متصل شده است. توکسین دیفتری طبیعی، یک پروتئین تک زنجیره‌ای با 535 ریشه‌ی آمینواسیدی می‌باشد که به‌وسیله گونههای مولد سم کورینه باکتریوم دیفتریا تولید می‌شود و از نظر ساختاری از سه دمین تشکیل شده است: دمینA (آمینو اسیدهای 193-1) با عملکرد آنزیمی آدنوزین دی‌فسفات ریبوزیل ترانسفرازی، دمین T (آمینواسیدهای 378-205) با عملکرد تشکیل کانال و کمک به فرآیند انتقال دمین آنزیمی به سیتوزول و دمین B (آمینواسیدهای 535-386) با عملکرد اتصال به گیرنده می‌باشد (7-12). در طراحی DT389GCSF، دمین B سم دیفتری در بخش انتهای کربوکسیل که محل اتصال توکسین دیفتری به گیرنده سلول است، با G-CSF جایگزین و برای سلولهای سرطان خون، هدف‌گذاری شده است. FSCG983TD با 475 ریشه‌ی آمینواسیدی، از قطعه‌ی توکسین دیفتری با 983 ریشه‌ی آمینواسیدی و توالی فاکتور محرک رشد گرانولوسیتی انسانی با 471 ریشه‌ی آمینواسیدی تشکیل یافته است که از طریق رابط پپتیدی 7 آمینواسیدی teMreS4ylGreS بههم متصل شده‌اند و بهمنظور سهولت در تخلیص، در انتهای ′5 به ′3 آن توالی 6 هیستیدین طراحی شده است (شکل 1).
شکل 1: تصویر شماتیک از دمینهای توکسین دیفتری و ایمونوتوکسین DT389GCSF
پروتئین هیبریدی DT389GCSF از جایگاه گیرنده‌ی سیتوکین G-CSF، که عمدتا توسط اندوتلیال و فیبروبلاستها تولید می‌شود و تکثیر و تمایز سلول های خونی را تحریک می‌کند، به سلولهای سرطانی اتصال می‌یابد (13-15). گیرنده‌ی GCSF بههمراه اینترلوکین-3 (IL-3) و فاکتور محرک رشد کلنی ماکروفاژ (GM-CSF) بر روی سطح سلولهای سرطانی میلوئیدی حاد یا AML (Acute Meyloid Lukemia) به میزان زیادی تولید می‌شوند و در نتیجه این گیرنده‌ها می‌توانند هدفی برای توکسین درمانی سرطان AML باشند (16, 17).
یکی از گلوگاههای اصلی در تولید پروتئین‌های نوترکیب با منشا پروکاریوتی، مسئله بازیابی فرم فعال و بازتاخورده آنها در شرایط اینکلوژن‌بادی است. چرا که در سیتوپلاسم باکتری‌ها، پروتئین‌ها بهدلیل بیان بالا و نیز عدم وجود شرایط لازم برای تاخوردن صحیح بهصورت اینکلوژن‌بادی در می‌آیند. درنتیجه برای به‌دست آوردن فرم فعال پروتئین، نیاز است که با انتخاب روشی مناسب بازتاخورده شوند. یکی از ساده‌ترین روش‌ها برای بهحداقل رساندن شکل‌گیری اینکلوژن‌بادی‌ها کاهش دما است. عموما بیان در دمای پایین منجر به افزایش حلالیت و تاخوردن صحیح می‌شود. این امر ناشی از این مسئله است که برهمکنش‌های هیدروفوبیک که تعیینکننده اینکلوژن‌بادی‌ها هستند وابسته به دما می‌باشند. از سویی احتمالا کاهش دما سرعت رونویسی، ترجمه و بازتاخوردن را پایین می‌آورد و بنابراین اجازه شکل‌گیری ساختار صحیح را می‌دهد. همچنین در دمای پایین افزایش بیان و فعالیت شماری از چاپرون‌ها درE. coli گزارش شده است. همچنین گزارشات نشان می‌دهد که پروتئازهای شوک حرارتی که طی افزایش بیان القا می‌شوند در شرایط دمایی پایین فعالیت کمتری پیدا می‌کنند. بنابراین این مسئله منجر به کاهش قابل توجه تخریب پروتئین نوترکیب می‌شود (5, 18). براین اساس در مطالعه حاضر، بهمنظور حذف مرحله‌ی بازتاخوردگی پروتئین هیبریدی نوترکیب DT389GCSF، در باکتری E. coli BL-21(DE3) بهفرم محلول بیان و سپس از طریق ستون تمایلی نیکل سفاروز تخلیص گردید و عملکرد آن با استفاده از سنجش سمیت DT389GCSF بر روی رده‌ی سلولی لوکمیای انسانی HL-60، مورد مطالعه قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
مواد شیمیایی و زیستی مورد استفاده: مواد شیمیایی مورد استفاده شامل پودر آماده محیط کشت LB از شرکتApplichem ، ایمیدازول، بیس‌اکریل‌آمید، مرکاپتواتانول، بروموفنل‌بلو، کوماسی‌بلو R250، اسیداستیک‌گلاسیال و متانول از شرکت Merck تهیه گردید. تریس‌باز، ایزوپروپیل-بتا-دی-1-تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)، آمونیوم‌پرسولفات (APS) و پلی‌اکریل‌آمید از شرکت سیناژن تهیه شد. آمونیوم‌کلرید، سدیم‌دودسیل‌سولفات (SDS)، از شرکت Aldrich-Sigma خریداری شد. فنیل‌متان‌سولفونیل‌فلوراید (PMSF) از شرکت Fluka و رزینChelating Sepharose Fast Flow از شرکت GE Healthcare Life Sciences و محیط کشت RPMI 1640 و سرم جنین‌گاوی (FBS) و پنی‌سیلین از شرکت Gibco تهیه شد.
باکتری E. coli BL-21(DE3) حاوی پلاسمید pET- DT389GCSF که در تحقیقات قبلی بدست آمده بود، مورد استفاده قرار گرفت (8, 11). رده‌ی سلولی لوکمیای انسانی HL-60 (PCC No.C217 ) از انیستیتو پاستور ایران خریداری شد.
بیان و تخلیص پروتئین DT389GCSF: بهمیزان 50 میکرولیتر از بانک مربوط به باکتریE. coli (BL21) ، حاوی وکتور pET-DT389GCSF در 20 میلی‌لیتر محیط LB-Broth حاوی آنتیبیوتیک آمپیسیلین با غلظت نهایی 100 میکروگرم در میلی‌لیتر، در شرایط استریل کشت داده شد. پس از تلقیح، درون شیکر انکوباتور 200 دور در دقیقه و دمای 37 درجه سانتیگراد بهمدت یک شب گرماگذاری شد. بهمنظور تازهسازی کشت، محیط کشت حاوی باکتری رشد یافته به 200 میلی‌لیتر محیط کشت LB-Broth، حاوی آنتیبیوتیک آمپیسیلین ، اضافه و تا رسیدن به جذب 7/0 در طول موج 600 نانومتر، درون شیکر انکوباتور 200 دور در دقیقه و دمای 37 درجه سانتیگراد، گرماگذاری شد. پس از رشد باکتری و رسیدن به جذب نوری مورد نظر، جهت القا بهمیزان 200 میکرولیتر IPTG، 1 مولار با غلظت نهایی 1 میلیمولار به محیط کشت اضافه و در شیکر انکوباتور با دمای 28، 200 درجهسانتیگراد دور در دقیقه، گرماگذاری گردید. پس از گذشت 4 ساعت از القا، محیط کشت، طی سانتریفوژ (8000 دور در دقیقه) بهمدت 5 دقیقه از کشت سلولی رسوبگیری گردید. برای ارزیابی میزان بیان به‌وسیله روش SDS-PAGE، نمونه‌های قبل از القا و پس از القا برداشت شد. پس از انجام SDS-PAGE، درصد بیان پروتئین توسط نرم‌افزار Image J، مورد بررسی قرار گرفت. این نرم افزار نوعی نرم افزار قدرتمند برای آنالیز تصاویر ژل الکتروفورز از منظر نحوه توزیع باندهای موجود در ژل می‌باشد. میزان بیان پروتئین در آن براساس دانسیته باند ظاهر شده و مقایسه آن با سایر باندها، تخمین زده می‌شود. خالص‌سازی پروتئین بهجهت داشتن دنباله‌ی هیستیدینی با ستون کروماتوگرافی تمایلی Ni-NTA، انجام گرفت. بهمنظور شکست سلولی بهروش سونیکاسیون، رسوب سلولی در یخ قرار داده شده و بهازای هرگرم رسوب، 10 میلی لیتر بافر تعادل حاوی ( ایمیدازول50 میلی مولار، تریس 20 میلی مولار، کلرید سدیم 5/0 مولار، PMSF 1 میلی مولار در pH 7.8) اضافه و بهمنظور مخلوط شدن کامل و ایجاد سوسپانسیون، از دستگاه هموژنایزر استفاده شد. سلولها در دستگاه سونیکاتور بهمدت 10 دقیقه، در 10 سیکل، با توان200 وات شکسته شدند. سوسپانسیون مذکور، بهمدت 25 دقیقه، در دمای 4 درجه سانتیگراد و با 13000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ و پس از آن، محیط رویی که حاوی پروتئین محلول بود از رسوب، جداسازی شد. برای آمادهسازی ستون‌های کروماتوگرافی، ابتدا رزین Chelating Sepharose Fast Flow با سولفات نیکل 2/0 مولار شارژ شد. پس از مرحله‌ی عبور پروتئین از ستون، پروتئین اتصال یافته محلول به رزین، با ایجاد شیب غلظت 50 تا 700 میلیمولار ایمیدازول از آن جداسازی گردید. در این مرحله نمونه‌های حاوی پروتئین در حجمهای 1500 میکرولیتر جمع‌آوری شدند. پس از تخلیص اولیه، بهمنظور فرمولاسیون ایمونوتوکسین مربوطه، تعویض بافر با PBS با استفاده از سنتریکون انجام و ایمیدازول از محلول پروتئینی حذف گردید. بهمنظور بررسی میزان بیان و خلوص پروتئین نوترکیب DT389GCSF، از ژل 10 درصد SDS-PAGE استفاده شد و رنگ آمیزی با کوماسی بلو R-250صورت گرفت.
سنجش سمیت سلولی DT389GCSF: سنجش سمیت سلولی DT389GCSF، از طریق قدرت کشندگی پروتئین در معرض سلولهای لوکمیای انسانی HL-60 با آزمون MTT مورد ارزیابی قرار گرفت. تست MTT، یک روش رنگ‌سنجی برای سنجش میزان سمیت داروها می‌باشد که اساس آن تشکیل رنگ فورمازان بهدلیل احیای ترکیبMTT (دی‌متیل‌تیازول– ۲ و ۵ دی‌فنیل‌تترازولیوم بروماید) و یا دیگر نمک‌های تترازولیوم است. با گسستگی حلقه تترازولیوم از طریق آنزیم‌های میتوکندریایی در سلولهای زنده، بلورهای فورمازان غیرمحلول تشکیل می‌شود که بنفش رنگ می‌باشند. ایجاد این بلورها حاکی از فعال بودن آنزیم‌های زنجیره تنفسی و معیاری برای زنده بودن سلولها است. با اندازه گیری میزان جذب توسط طیف سنجی در طول موج‌های معین، می‌توان درصد سلولهای زنده مانده را مشخص کرد. کشت سلولهای HL-60 که از نوع محلول (غیرچسبنده) هستند در محیط کشت RPMI 1640 حاوی 10 درصد FBS و 1 درصد پنی‌سیلین-استرپتومایسین انجام گرفت. حجم 180 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی حاوی cell/ml103 به هر چاهک پلیت 96 خانه اضافه شد. 20 میکرولیتر از مقادیر مختلفDT389GCSF ( 600 و 450 و 300 و 60 و 0) میکروگرم به هر چاهک اضافه و در دمای 37 درجه سانتیگراد، 2OC 5 درصد بهمدت 48 ساعت گرماگذاری شد. پس از 48 ساعت، 02 میکرولیتر محلول TTM (با غلظت 5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر SBP) به هر چاهک اضافه گردید و بهمدت 4 ساعت در دمای 73 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. سلولهای زنده بهواسطهی داشتن آنزیم ردوکتاز میتوکندری فعال، با تترازولیوم معرف TTM واکنش داده و ایجاد کریستال‌های فورمازان کردند. پس از آن پلیت 69 خانه، بهمدت 5 دقیقه با 0002 دور در دقیقه برای ته‌نشینی کریستال‌های فورمازان سانتریفوژ شد. سپس 002 میکرولیتر محیط کشت محلول‌رویی جداسازی گردید و 002 میکرولیتر دی‌متیل‌سولفوکسید (OSMD) به هر چاهک بهمنظور محلول‌سازی بلورهای فورمازان افزوده شد و پس از 01 دقیقه جذب نمونه‌ها در 075 نانومتر در دستگاه الایزا ریدر niapS (ledom 0012-xaF etatS) قرائت شد. مقدار رنگ تولید شده و جذب بهطور مستقیم با تعداد سلول زنده متناسب بود. تمام آزمون‌ها در سه تکرار برای هر غلظت FSCG983TD انجام شد.
نتایج
تولید فرم محلول پروتئین DT389GCSF
طبق شرایط ذکر شده در قسمت مواد و روش‌ها، میزان بیان پروتئین DT389GCSF با استفاده از ژل SDS-PAGE مورد بررسی قرار گرفت. مشاهده‌ی باند 63 ~ کیلودالتونی بیان پروتئین هیبریدی DT389GCSF در زمان 4 ساعت پس از القا و عدم مشاهده‌ی باند در نمونه‌ی زمان صفر قبل از القا، که در شکل 2 نشان داده شده است، موید بیان پروتئین است. با استفاده از نرم افزار Image J، بیان 12 درصدی پروتئین هیبریدی DT389GCSF، پس از القا محاسبه و تخمین زده شد.
شکل2: ارزیابی بیان پروتئین DT389GCSF با استفاده از روش SDS-PAGE. M) مارکر وزن مولکولی پروتئینی. 1) باکتری نوترکیب در زمان صفر القا، 3) باکتری نوترکیب در زمان 4 ساعت پس از القا.
ازسویدیگر روش‌های مختلفی جهت خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب وجود دارد که در این پژوهش بهدلیل برچسب هیستیدینی طراحی شده در ابتدای توالی ایمونوتوکسین، از روش کروماتوگرافی تمایلی نیکل جهت تخلیص فرم محلول DT389GCSF بهره گرفته شد. بررسی میزان خلوص پروتئین DT389GCSF، پس از عبور از ستون نیکل-سفاروز، از ژل 10 درصد SDS-PAGE استفاده شد. همان‌طورکه در شکل 3 مشاهده می‌شود، از چاهک 5 به سمت چاهک 8 با افزایش غلظت ایمیدازول، بر خلوص پروتئین افزوده شده است. با استفاده از نرم افزار Image J میزان خلوص نهایی DT389GCSF، 80 درصد برآورد شد.
شکل3: ارزیابی تخلیص پروتئین DT389GCSFبا استفاده ازروش SDS-PAGE. 1) نمونه ورودی به ستون، 2) نمونه خروجی از ستون، 3) مارکر وزن مولکولی برحسب کیلودالتون، 8-4) نمونه های خروجی از ستون حاوی DT389GCSF از شیب غلظت 50 میلی مولار تا غلظت 700 میلیمولار ایمیدازول.
ارزیابی عملکرد فرم محلول پروتئین DT389GCSF
برای بررسی اثر سمیت سلولیDT389GCSF خالص‌شده بر روی سلولهای لوکمیای انسانی HL-60 که حامل گیرنده‌ی G-CSF هستند، از آزمونMTT استفاده شد. آزمون سنجش‌زیستی در شکل 4 برحسب میانگین جذب در570 نانومتر برای مقادیر (600 و 450 و 300 و 60 و0) میکروگرم DT389GCSF نشان داده شده است. (آزمایشات سه بار تکرار انجام شد.( نتایج بیانگر این بود که 48 ساعت بعد از تیمار تا میزان 60 میکروگرم DT389GCSF، تاثیر معنیداری بر مرگ سلولی نداشته اما پس از این مقدار، میزان بقای سلولی به صورت وابسته به آن، کاهش داشته و میزان 600 میکروگرم از ایمونوتوکسین تولیدی (6-10 مولار) نسبت به سایر غلظتها، بیشترین سمیت را نشان داده است.
شکل 4: ارزیابی سمیت سلولی پروتئین DT389GCSFتخلیص شده با استفاده از آزمون MTT. میانگین جذب خوانده شده در 570 نانومتر در مقادیر صفر تا 600 میکروگرم پروتئین. (آزمایشات با سه بار تکرار انجام شده است).
بحث
ایمونوتوکسین‌تراپی یک راهکار جدید و هوشمند برای مهار و غیرفعال‌سازی سلولهای سرطانی محسوب می‌شود که می‌تواند برای درمان هدفمند سلولهای سرطانی مورد استفاده قرار گیرد. پروتئین هیبریدی DT389GCSF، محصول فناوری DNA نوترکیب است که در آن G-CSF جایگزین دمین اتصالی توکسین طبیعی دیفتری شده است. براین اساس پروتئین طراحی شده از جایگاه گیرنده‌اش وارد سلولهای حامل گیرنده‌ی G-CSF شده و بهطور اختصاصی سبب مرگ سلولهای سرطانی از جمله سرطان میلوئیدی حاد می‌شود. پروتئین DT389GCSF، اولین بار توسط چادویک در سال 1993 مورد مطالعه قرار گرفت. در آن تحقیق، توکسین دیفتری با توالی ناقص 486 آمینواسیدی به توالی کامل مربوط بهG-CSF ، از طریق رابط پپتیدی HATPL متصل شده بود. وزن مولکولی پروتئینDT486GCSF، حدود 70 کیلو دالتون بود که در دمای 30 درجه سانتیگراد تولید و پس از خالص‌سازی، در معرض بلاست‌های AML با گیرنده‌ی G-CSF، با غلظت بالای 6-10 مولار اثر سمیت نشان داد و سبب مرگ سلولی شد (19). در تحقیق حاضر، پروتئین DT389GCSF با در نظر گرفتن ساختار ایمونوتوکسین تجاری شده‌ی اونتاک (DT389IL-2)، توکسین دیفتری دارای 389 ریشه‌ی آمینواسیدی است که از طریق رابط پپتیدی SG4SM به توالی کامل G-CSF اتصال یافته است و وزن مولکولی آن 63 کیلو دالتون می باشد (8, 9, 11). طی مطالعه‌ی گذشته توسط گروه تحقیقاتی پژوهش حاضر بر روی پروتئین تلفیقی DT389GCSF، پیش بینی ساختاری آن در محیط رایانه با استفاده از نرم افزارهای مرتبط، انجام گرفت. صحت ساختار پروتئین DT389GCSF، از نظر خصوصیات صورت بندی و عملکردی، تایید شد (9). همچنین در تحقیق دیگر، پس از بیان پروتئین DT389GCSF به فرم اینکلوژن بادی در دمای 37 درجه سانتیگراد و خالص‌سازی آن از طریق شستشوی 3 مرحله‌ای با بافر تریس 50 میلیمولار حاوی اوره‌ی 3 مولار، بازتاخوردگی فرم اینکلوژن‌بادی پروتئین FSCG983TD در حضور سیستئین 52 مولار انجام گرفت. توسط فلوئورسانس نشر ذاتی، طیف‌سنجی دورنگ‌نمایی دورانی، عملکرد نوکلئازی بخش توکسینی و همچنین ارزیابی سمیت با آزمون TTM، پروتئین تولیدی مورد ارزیابی ساختاری و عملکردی قرار گرفت . نتایج بیانگر کسب ساختار و عملکرد مناسب FSCD983TD پس از مرحله‌ی بازتاخوردگی بود )01(.
یک مرحله‌ی گلوگاهی در طراحی زیست داروها که در باکتری E. coli تظاهر می‌یابند، بحث عملکرد پروتئین تولیدی است که البته عملکرد صحیح هر پروتئینی در گروی داشتن ساختار صحیح آن است. در سیتوپلاسم E. coli به دلیل اینکه پروتئین‌ها بیان بالایی دارند و شرایط مناسبی برای تاخوردگی صحیح آنها وجود ندارد بهصورت ذرات نامحلول بهنام اینکلوژن‌بادی در می‌آیند. بهدلیل اینکه پروتئین حالتهای تاخورده‌ی ناصحیح دارد نمیتواند فعالیت بیولوژیکی داشته باشد و بازتاخوردگی صحیح پروتئین بهراحتی میسر نمی‌باشد. در نتیجه ممکن است در طی مراحل بازتاخوردگی با گونههای دیگر پروتئین از جمله تجمعات پروتئینی و اشکال غیرطبیعی پروتئین همراه باشد. بنابراین به‌دست‌آوردن پروتئین با تاخوردگی صحیح طی روند بازتاخوردگی در شرایط خارج بدنی (in vitro) مشکل بوده و بازده پایینی دارد (20, 21). در پژوهشی، بازده بازتاخوردگی فرم اینکلوژن‌بادی GCSF به فرم فعال، 30 درصد عنوان شده است (22). همچنین در مطالعه‌ی دیگر، طی انجام مراحل زمانبر و طولانی و مشکل و پرهزینه، بهمنظور بازتاخوردگی ایمونوتوکسین DT389IL2، میزان زیادی از پروتئین به تجمعات پروتئینی و اشکال غیرفعال پروتئین تبدیل شده بود (23). بهمنظور حذف مراحل زمانبر و پرهزینه‌ی بازتاخوردگی و افزایش بازده تولید پروتئین نوترکیب با ساختار و فعالیت بیولوژیکی صحیح، می‌توان از کشت باکتری در دمای پایین بهره برد. در این روش با پایین آوردن دمای کشت، سرعت بیان پروتئین توسط سلول باکتریایی کاهش یافته بهگونهای که پروتئین برای تاخوردگی صحیح فرصت پیدا می‌کند (5, 8, 18, 24).
بههمین منظور، در مطالعه‌ی حاضر، پروتئین DT389GCSF در شرایط آزمایشگاهی در سویه‌ی بیانی E. coli BL21(DE3) حاوی پلاسمید نوترکیب pET-DT389GCSF در دمای 28 درجه سانتیگراد تحت تاثیر ماده القاگر IPTG، 1 میلی مولار قرار گرفت. نتایج حاصل از SDS-PAGE، بیانگر بیان مناسب (در حدود 12 درصد) ایمونوتوکسین نوترکیب بود. پروتئین نوترکیب بیان شده بهصورت محلول، بهدلیل دارا بودن توالی 6 آمینواسید هیستیدینی در انتهای N-ترمینال، بهروش کروماتوگرافی تمایلی نیکل تخلیص شد و توسط روش الکتروفورز پلیآکریلآمید و با استفاده از نرم افزار Image J خلوص تقریبی 80 درصدی پروتئین محاسبه شد. سنجش سمیت ایمونوتوکسین نوترکیب بر روی رده سلولی HL-60 که نوعی سلول لوکمیای انسانی است و حاوی گیرنده‌ی G-CSF است، انجام گرفت و میزان مرگ و میر سلول با آزمون MTT مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفت. نتایج بیانگر این مطلب بود که با افزایش غلظت DT389GCSF، میزان جذب در 570 نانومتر کاهش یافت. که این امر بیانگر کاهش در تعداد سلولهای زنده می باشد. بررسی داده های حاصل از سنجش زیستی نشان داد که میزان 600 میکروگرم بیشترین سمیت را داشته و میزان IC50 (غلظت مورد نیاز DT389GCSF، برای کشته شدن 50 درصد سلولهای HL-60) برابر 000019/0±00017/0 مولار محاسبه و تخمین زده شد. نتایج حاصله بیانگر این مطلب است که فرم محلول این ایمونوتوکسین دارای ساختار صحیح و عملکرد مناسب می‌باشد.
نتیجهگیری
در نتیجه با بیان پروتئین DT389GCSF بهشکل محلول، می‌توان با رفع مشکلات زیر هزینه‌های تولید را بهحداقل رساند:
(1) بازتاخوردگی صحیح فرم غیرفعال اینکلوژن‌بادی پروتئین‌های نوترکیب بیان شده در پروکاریوتها، بهراحتی میسر نیست.
(2) امکان تشکیل گونههای دیگر پروتئین از جمله تجمعات پروتئینی (آگریگاسیون) و اشکال غیرفعال پروتئین در طی مراحل بازتاخوردگی وجود دارد.
(3) مراحل پایین‌دستی بازتاخوردگی و اوره‌زدایی فرم اینکلوژن‌بادی منجر به از دست رفتن مقادیر زیادی از پروتئین طی این مراحل شده و باعث صرف زمان و هزینه زیادی می‌شود.
تشکر و قدردانی
نویسندگان برخود لازم می‌دانند از دانشگاه صنعتی مالک اشتر برای حمایتهای مالی جهت انجام این پژوهش تشکر نمایند.
)