نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
- دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک، تهران، ایران
چکیده
هدف: در این مطالعه به ارتباط سرطان سینه و پلیمورفیسم A/T 251 از ژن اینترلوکین 8، بهعنوان مارکر ژنتیکی در جمعیت زنان ایرانی با روش Tetra arms-PCR پرداخته شده است.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه شاهد-موردی، 50 زن مبتلا به سرطان سینه و 50 زن سالم بهعنوان گروه کنترل انتخاب شدند. بعد از استخراج DNA، تعیین ژنوتیپهای پلیمورفیسم 251 T/A از ژن IL-8 بهروش Tetra arms-PCR انجام شد.
نتایج: فراوانی ژنوتیپهای AA، AT و TT در گروه کنترل بهترتیب صفر درصد، 88 درصد و 12 درصد و در گروه بیمار بهترتیب 12 درصد، 54 درصد و 34 درصد بود. نتایج تفاوت معنی‌داری بین ژنوتیپهای AA، AT و TT در گروه کنترل و بیمار نشان نداد (05/0<p).
نتیجه گیری: در تحقیق حاضر بین فراوانی آللهای A و Tدر گروه بیمار و کنترل، تفاوت معنی‌داری وجود نداشت، بنابراین میتواند بیانگر این باشد که بین پلیمورفیسم 251 T/A از ژن IL-8 و سرطان سینه در جمعیت زنان ایرانی مورد مطالعه، ارتباطی وجود ندارد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Study of relation on breast cancer and A/T 251 polymorphism of IL-8 gene in Iranian female populations by Tetra Arms PCR
نویسندگان [English]
- E Siasi
- M gholami
- F Ashrafi
- Department of Genetics, Faculity of science, North Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: In this study, relationship between breast cancer and 251A/T polymorphism of IL-8 gene, as the genetic marker, was investigated in the Iranian females population by Tetra arms-PCR.
Materials and methods: In this case-control study, 50 women with breast cancer and 50 healthy women as control group were selected. After extraction of DNA, determination of IL-8 gene 251 A / T polymorphism genotypes was performed by Tetra arms-PCR.
Results: In the control group, frequency of AA, AT, and TT genotypes were 0%, 88% and 12%, respectively and them for case group were 12%, 54% and 34%, respectively. Result showed no significant difference between AA, AT and TT genotypes in the control and case groups (P ≤ 0.05).
Conclusions: In current research, there was no significant difference between A and T alleles in the control and case groups. Therefore, it indicated that there was not association between IL-8 gene 251 A/T polymorphism and breast cancer in the studied Iranian females population.
کلیدواژه‌ها [English]
- Breast cancer#IL
- 8 gene 251 A / T polymorphism#Tetra arms
- PCR technique
مقدمه
سرطان سینه در زنان یک مشکل اصلی بهداشت عمومی در سراسر جهان است. این بیماری دومین سرطان شایع در انسان (زن و مرد) و اولین سرطان شایع در زنان ایران و جهان است. سرطان پستان 23 درصد از تمام موارد سرطان جدید و 14 درصد از تمام موارد مرگ ناشی از سرطان را در سال 2012 بهخود اختصاص داده است (1). فاکتورهای خطر سرطان سینه عبارتند از: سابقه فامیلی سرطان سینه، وضعیت ژنتیکی، سابقه شخصی سرطان سینه، شکلگیری سلولهای غیر عادی در لوبولها یا غدد تولید کننده شیر در بافت سینه، حجم سینه، میزان هورمونهای اندوژن، سیکلهای قائدگی، حاملگی، شیر دادن به نوزاد، تراکم استخوان، فاکتورهای وابسته به شیوه زندگی مانند استفاده از هورمون پس از یائسگی، چاقی و اضافه وزن، فعالیت بدنی، رژیم غذایی، مصرف الکل و تنباکو، مصرف قرصهای ضد بارداری و سایر فاکتورهای خطرمانند تشعشعات، استفاده از داروهای خاص، آلودگیهای محیطی و شغلی و فاکتورهای ژنتیکی مرتبط با سرطان سینه (2 و 3). سرطان سینه یک بیماری بهشدت ناهمگن است که در اثر تاثیر متقابل عامل های خطر وراثتی و محیطی ایجاد میشود و به تجمع پیشرونده تغییرات ژنتیک و اپیژنتیک در سلولهای سرطان سینه منجر میشود. اگرچه شواهد اپیدمیولوژیک بر وجود عاملهای خطر ویژه (مانند سن، چاقی و مصرف الکل) تاکید دارد، وجود سابقه خانوادگی سرطان سینه، قویترین عامل خطر برای این بیماری به شمار میآید (4). اخیرا نقش سایتوکانها در سرطان مطرح شده است. سایتوکاینها گلیکوپروتئینهایی هستند که توسط سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی و سایر سلولها ترشح شده و بسیاری از اعمال این سلولها و سلولهای دیگر را میانجیگری میکنند (5). اخیرا گزارش شده است که در محل تومور میزان ترشح درونی بعضی سایتوکاینها در تعامل با سلولهای توموری کاهش مییابد و منجر به تضعیف سیستم ایمنی میشود و این مسئله منجر به گسترش تومور، متاستاز و بدخیم شدن تومور میشود (5). اهمیت مسیرهای سیگنالی گیرندههای اینترلوکین 8 و خود این کموکاین در ترویج پیشرفت سرطانهای بدخیم مشخص شده است (6 و 7). بسیاری از مطالعات نشان دادهاند که ژن اینترلوکین 8(IL-8) gene) Interlukin-8) بیان بالایی در سلولهای توموری دارند که اغلب در پاسخ به شیمی درمانی و یا فشارهای محیطی مانند هیپوکسی القا میشوند.
افزایش بیشتر بیان ژنIL-8 در سلولهای توموری اهمیت بالایی در بقای این نوع تومورها از طریق نقش گیرندههای ژنهای CXCR2,CXCR1 (Subfamily of chemokines receptors 1, 2 genes)در سلولهای سرطانی، سلولهای اندوتلیال و نوتروفیلها و تومورهای مرتبط با ماکروفاژها دارند (8). اهمیت اینترلوکین 8 در ارتباط با مدولاسیون بین انواع مختلف سلولهای موجود در تومور و میکرو محیطها است (6). در رابطه با اثر اینترلوکین 8 و سرطان سینه مطالعات نشان داده اند که بین پتانسیل متاستیک سلولهای سرطان سینه و میزان بیان ژن IL-8 ارتباط معنی‌داری وجود دارد. بر اساس این مطالعات، مشخص شده است که خطوط سلولی با متاستاز بالا بیان ژنIL-8بیشتری نسبت به سلولهایی با متاستاز پایین دارند. این امر میتواند ناشی از تغییرات اپی ژنتیک مانند الگوی متیلاسیون نابهجا در ژن IL-8 باشد که ممکن است مسئول این میزان تفاوت در سلولهای متاستاتیک با سایر سلولها باشد (9). مطالعات اخیر نشان داده است که بین پلیمورفیسم در ژنهای IL-8و CXCR2با افزایش ریسک ابتلا به سرطان سینه در جمعیتهای مختلف از جمله در جمعیت زنان چینی ارتباط وجود دارد (10 و 11 و 12 و 13). بر حسب مطالعات بالینی، سطح سرمی این اینترلوکین در سرم بیماران مبتلا به سرطان سینه نسبت به افراد سالم بیشتر بوده است. بهخصوص بیمارانی که در مرحله پیشرفت بیماری بودند. بهنظر میرسد، پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی در ژنهای سایتوکاینی مهم بوده و در میزان بیان این ژنها و فعالیت سلولها اثر میگذارند. پلیمورفیسمی که در منطقه 251 پروموتور ژن IL-8قرار گرفته است نقش مهمی در تولید اینترلوکین 8 یا بیان پروتئین آن، هم در محیط درون ارگانیسم زنده و هم در محیط آزمایشگاهی دارد. در مطالعات گذشته مشخص شده است که پلیمورفیسم 251 A/T از ژن IL-8 در جمعیتهای گوناگون با خطر ابتلا به تومور سرطانهای مختلف در ارتباط است (10 و 11 و 14 و 15 و 16 و 17). بهمنظور بررسی اختصاصیتر ارتباط این پلیمورفیسم با سرطان سینه در جمعیت زنان ایرانی و با توجه به اهمیت شیوع سرطان سینه و راههای تشخیص و پیش اگهی آن، در این تحقیق بهبررسی ارتباط بین پلیمورفیسم A/T 251از ژن IL-8 (بهعنوان یک مارکر ژنتیکی) با سرطان سینه، و بهجای روش PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment length Polymorphism) که روش رایج و هزینهبر در تشخیص پلیمورفیسمها میباشد از تکنیک اقتصادیترPCR Tetra arms ، پرداخته شده است.
مواد و روش‌ها
نوع مطالعه و جامعه آماری: در این مطالعه بهصورت موردی- شاهدی از دو گروه بیمار و کنترل، با اخذ رضایت نامه کتبی نمونهگیری انجام شد. تعداد 50 خانم مبتلا به سرطان سینه که بهوسیله معاینه پزشک متخصص زنان و زایمان و انجام سونوگرافی و ماموگرافی بیمار تشخیص داده شدند، انتخاب شدند و گروه کنترل 50 نفر از زنان سالم با سن مشابه افراد گروه بیمار بودند. حجم نمونه بر اساس فرمول محاسبه حجم نمونه فرمول کوکران محاسبه شد.در این محاسبه با سطح خطای ۵ درصد، 50 نمونه بیمار و 50 نمونه گروه کنترل، تخمین زده شد.
روش نمونهگیری: میزان 5 سی سی از خون افراد گروه بیمار و افراد کنترل سالم در لولههای Venoject آماده با حجم 5 میلیلیتر (کمپانی graner/UK)، که حاوی مقدارمشخص 1 میلیلیتر از ضدانعقاد سیترات سدیم (بهدلیل ترکیب با کلسیم خون و داشتن اثر ضد انعقادی بر خون و همچنین کمترین اثر روی فاکتورهای بیوشیمیایی خون استفاده شد) و با درپوشهای بود، جمعآوری شد. پس از انجام نمونهگیری و تا زمان رسیدن به آزمایشگاه نمونههای گرفته شده در جعبه حاوی یخهای پک شده نگهداری شدند.
استخراج DNA از نمونههای خون: پس از انتقال خون حاوی سیترات سدیم به آزمایشگاه، ژنوم هر یک از نمونهها با استفاده از روش استخراج DNA با استفاده از کیت Cinnapure جداسازی شد. قابل ذکر است که پس از استخراج DNA نمونههای مذکور در دمای 40- تا 70- درجه سانتیگراد نگهداری شدند .
کیفیت و کمیت سنجی DNA استخراج شده
الکتروفورز بر روی آگارز 2 درصد: برای اطمینان از کیفیت سنجی DNA خالص شده، 3 میکرولیتر از DNA بر روی ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز شد. (بهدلیل اینکه باند محصول استخراج DNA با توجه به طول ژنوم در زمان کافی با ولتاژ مناسب در روی ژل مشخص گردد از ژل 2 درصد استفاده شد).
تعیین غلظت DNA استخراج شده با استفاده از دستگاه نانودراپ: پس از استخراج DNA بهمنظور ارزیابی کمیت و کیفیت DNA و آگاهی از غلظت و درجه خلوص آن، از دستگاه نانو دراپ استفاده شد. 1 میکرولیتر از DNA استخراج شده در دستگاه قرار داده شد و جذب نوری آن در طول موجهای مختلف خوانده شد.
واکنشTetra Arms PCR: برای انجام واکنش Tetra Arms PCR از پرایمرهای اختصاصی شامل 1 جفت پرایمر خارجی و 2 پرایمر داخلی برای هر یک از اللهای غالب و مغلوب پلیمورفیسم A/T 251 ژن IL-8، که در جدول 1 آورده شده است، استفاده شد. همچنین مواد مورد نیاز برای واکنش PCR و برنامه دستگاه بهترتیب در جدولهای 2 و 3 آورده شده است.
جدول 1: توالی و مشخصات آغازگرهای مورد استفاده برای انجام واکنش PCRTetra arms(18)
|
|
طول محصول PCR (bp) |
توالی پرایمر |
نام ژن |
|
|
169 |
TGTAATCCCAGCAGTTTGGGAGGT
|
Forward inner primer (T allele) |
|
|
228 |
CTCATCTTTTCATTATGTCAGAG |
Reverse inner primer (A allele) |
|
|
349 |
CATGATAGCATCTGTAATTAACTG |
Forward outer primer (5’–3’) |
|
|
349 |
CACAATTTGGTGAATTATCAAA |
Reverse outer primer (5’–3’) |
جدول 2: مواد مورد نیاز جهت انجام PCR (حجم 20 میکرولیتر)
|
محتویات واکنش
|
حجم (میکرولیتر) |
غلظت |
|
Master Mix PCR 1X |
10 |
5/1 میلیمول/ MgCl2 |
|
Forward Primer |
1 |
10 پیکومول |
|
Reverse Primer |
1 |
10 پیکومول |
|
Sterile water |
5 |
- |
|
DNA |
3 |
200 نانوگرم |
جدول 3: برنامه دمایی دستگاه PCR
|
مراحل |
زمان |
دما ( درجه سانتی گراد)
|
|
واسرشتگی اولیه |
10 دقیقه |
95 |
|
واسرشتگی |
30 ثانیه |
95 |
|
اتصال |
40 ثانیه |
57 |
|
گسترش |
60 ثانیه |
72 |
|
گسترش نهایی |
10 دقیقه |
72 |
- تعداد چرخه ها 35 سیکل بود.
ارزیابی محصول PCR: برای ارزیابی محصول PCR، مقدار 5 میکرولیتر از محصول PCR، همزمان با شناساگر زیستی (bp 50) برروی ژل آگاروز 2 درصد (با توجه بهطول باند محصولات PCR و رویت مناسب باندها روی ژل) الکتروفورز شد. برای رنگآمیزی، بهجای استفاده از رنگ اتیدیوم بروماید و جلوگیری از اثرات سمی و زیان آور آن، از رنگ DNA safe شرکت سینا کلون استفاده شد (1 میکرولیتر بهازای هر 5 میکرولیتر نمونه). سپس جهت مشاهده باندها ژل در دستگاه UV-Doc قرار داده شد و عکسبرداری شد. قابل ذکر است باندهای مربوط به تکثیر Outer، bp 349 و دو آلل T و A بهترتیب با bp 169 و bp 228 مورد نظر بودند. همچنین برای هر سری از نمونهها یک کنترل مثبت که از قبل با انجام سکانس تایید شده بود و از یک نمونه کنترل منفی، همراه یک مارکر bp 50 استفاده شد .
تایید صحت نتایج ژنوتایپینگ: برای صحت عملکرد روش و بهمنظور تعیین سکانس و تایید محصول PCR چندین نمونه از هموزیگوتهای غالب و هموزیگوتهای مغلوب و هتروزیگوتها انتخاب شدند و بهوسیله کیت سینا کلون خالصسازی شدند. سپس با ارسال به شرکت تکاپوزیست تعیین توالی شدند و در نهایت بلاست انجام گرفت.
آنالیز آماری
بهمنظور آنالیز آماری دادهها از نسخه 20 نرم آفزار SPSS و آزمون های ضریب همبستگی، T- test مستقل، آنوا و مجذور کای استفاده شد. p valueکمتر از 05/0 در نتایج، معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
نمونه گیری و اطلاعات بیماران
برای انجام این پژوهش حدود 50 نمونه خون بیمار و 50 نمونه خون افراد سالم جمعآوری شد و استخراج DNA از نمونهها انجام شد. رده سنی افراد بین 30 تا 60 سال بود. میانگین سنی برای گروه بیمار 16/44 و برای گروه نرمال 23/40 محاسبه شد که در دو گروه تقریبا یکسان بود. طبق نتایج حاصل 44 درصد افراد در مرحله دو بیماری و تنها 10 درصد آنها در مرحله حاد بیماری (مرحله چهار) قرار داشتند (نمودار 1).
نمودار 1:مرحله بیماری بر حسب درصد برای 50 بیمار مبتلا به سرطان سینه
نتایج استخراج DNA
نتایج جذب نوری DNA توسط دستگاه نانودراپ
نتایج جذب نوری DNAهای استخراج شده، توسط دستگاه نانودراپ خوانده شد. نمونههایی که نسبت جذب نوری 260 به 280 نانومتر بین 1.8 تا 2 را داشتند، برای ادامه کار مناسب تشخیص داده شدند.
نتایج الکتروفورز DNA استخراجی بر ژل آگارز
بهمنظور اطمینان از صحت DNA استخراج شده و کیفیت آن پس از استخراج DNA حاصل بر ژل 2 درصد آگارز الکتروفورز شد (شکل 1).
شکل 1: DNA استخراج شده بر ژل 2% آگارز، خانه 1: مارکر مولکولی bp 100 ، خانه 2 و 3: دو نمونه DNA .
نتایج ژنوتیپ با روش Tetra-Arms PCR
ژنوتایپ پلیمورفیسم 251T/A از ژن IL-8، 50 بیمار مبتلا به سرطان سینه و 50 نمونه سالم توسط تکنیک Tetra Primer Arms PCR انجام و سپس ژنوتایپ افراد بر اساس الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگارز مشخص شد. افراد هتروزیگوت با قطعات به طول bp169 و bp228 بههمراه باند کنترل bp439 مشخص شدند. در صورتی که افراد هموزیگوت موتان با الل A قطعه bp 228 و افراد هموزیگوت وحشی با الل T قطعه bp 169 ، را روی ژل الکتروفورز 2 درصد نشان دادند (شکل 2).
تعیین توالی یابی به جهت تایید محصول حاصل از Tetra-Arms PCR
در مطالعه حاضر بهمنظور تایید محصول PCR از هر یک از حالتهای هموزیگوت غالب و مغلوب و هتروزیگوت بههمراه پرایمرها، جهت سکانس به شرکت تکاپو زیست ارسال شد. سپس نتایج توسط نرم افزار Mega آنالیز و
|
شکل 2: محصول Tetra Primer Arms PCR پلیمورفیسم 251 T/A از ژن IL-8، برروی ژل 2 درصدآگارز. خانه 1: مارکر مولکولی bp 100، خانه2: نمونه کنترل مثبت و خانه 3: نمونه کنترل منفی، خانه های 4، 9، 14 و 15: نمونههای افراد هتروزیگوت (AT) ( bp 349، bp 228، bp 169)، خانههای 5، 6 و 7: نمونه های افراد هموزیگوت (AA) ( bp 349، bp 228)، خانههای 8، 10، 11، 12 و 13: نمونههای افراد هموزیگوت (TT) (bp 349، bp 169). |
|
15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 |
بلاست شد تا حالتهای هموزیگوت غالب و مغلوب و هتروزیگوت تایید شوند. در شکل 3 و 4 و 5 نتایج سکانس سه نمونه از بیماران آورده شده است. شکل 3 (هتروزیگوتAT )، شکل4 (هموزیگوت غالب TT) و شکل 5 (هموزیگوت مغلوب AA) میباشد که با بلاست مورد تایید قرار گرفت.
AATGTTTATGCCATTAAAGAAATCATCCATGATCTTGTTCTAACACCTGCCACTCTAGTACTATATCTGTCACATGGTACTATGATAAAGTTATCTAGAAATAAAAAAGCATACATTTGATAATTCACCAAATTGTGA
Homo sapiens gene for LUCT/interleukin-8, complete cds
Sequence ID: D14283.1 Length: 3296 Number of Matches: 1
Range 1: 1022 to 1155
|
Score |
Expect |
Identities |
Gaps |
Strand |
|
235 bits(127) |
9e-60 |
132/134(99%) |
2/134(1%) |
Plus/Plus |
Query 6 TTATGCCATT-AAAG-AAATCATCCATGATCTTGTTCTAACACCTGCCACTCTAGTACTA 63
|||||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1022 TTATGCCATTAAAAGAAAATCATCCATGATCTTGTTCTAACACCTGCCACTCTAGTACTA 1081
Query 64 TATCTGTCACATGGTACTATGATAAAGTTATCTAGAAATAAAAAAGCATACATTTGATAA 123
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1082 TATCTGTCACATGGTACTATGATAAAGTTATCTAGAAATAAAAAAGCATACATTTGATAA 1141
Query 124 TTCACCAAATTGTG 137
||||||||||||||
Sbjct 1142 TTCACCAAATTGTG 1155
شکل 3: نمونه فرد هتروزیگوت AT
TATGTTATGCCATTAAAGAAATCATCCATGATCTTGTTCTAACACCTGCCACTCTAGTACTATATCTGTCACATGGTACTATGATAAAGTTATCTAGAAATAAAAAAGCATACATTTGATAATTCACCAAATTGTGA
Homo sapiens gene for LUCT/interleukin-8, complete cds
Sequence ID: D14283.1 Length: 3296 Number of Matches: 1
Range 1: 1022 to 1155
|
Score |
Expect |
Identities |
Gaps |
Strand |
|
235 bits(127) |
9e-60 |
132/134(99%) |
2/134(1%) |
Plus/Plus |
Query 6 TTATGCCATT-AAAG-AAATCATCCATGATCTTGTTCTAACACCTGCCACTCTAGTACTA 63
|||||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1022 TTATGCCATTAAAAGAAAATCATCCATGATCTTGTTCTAACACCTGCCACTCTAGTACTA 1081
Query 64 TATCTGTCACATGGTACTATGATAAAGTTATCTAGAAATAAAAAAGCATACATTTGATAA 123
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1082 TATCTGTCACATGGTACTATGATAAAGTTATCTAGAAATAAAAAAGCATACATTTGATAA 1141
Query 124 TTCACCAAATTGTG 137
||||||||||||||
Sbjct 1142 TTCACCAAATTGTG 1155
شکل 4: نمونه فرد هموزیگوت غالبTT
AATGTTTATGCCATTAAAGAAATCATCCATGATCTTGTTCTAACACCTGCCACTCTAGTACTATATCTGTCACATGGTACTATGATAAAGTTATCTAGAAATAAAAAAGCATACATTTGATAATTCACCAAATTGTGA
Homo sapiens gene for LUCT/interleukin-8, complete cds
Sequence ID: D14283.1 Length: 3296 Number of Matches: 1
Range 1: 1022 to 1155
|
Score |
Expect |
Identities |
Gaps |
Strand |
|
235 bits(127) |
9e-60 |
132/134(99%) |
2/134(1%) |
Plus/Plus |
Query 6 TTATGCCATT-AAAG-AAATCATCCATGATCTTGTTCTAACACCTGCCACTCTAGTACTA 63
|||||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1022 TTATGCCATTAAAAGAAAATCATCCATGATCTTGTTCTAACACCTGCCACTCTAGTACTA 1081
Query 64 TATCTGTCACATGGTACTATGATAAAGTTATCTAGAAATAAAAAAGCATACATTTGATAA 123
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1082 TATCTGTCACATGGTACTATGATAAAGTTATCTAGAAATAAAAAAGCATACATTTGATAA 1141
Query 124 TTCACCAAATTGTG 137
||||||||||||||
Sbjct 1142 TTCACCAAATTGTG 1155
شکل 5: نمونه فرد هموزیگوت مغلوب AA
نتایج آماری
تعداد گروه بیماران و افراد سالم و فراوانی اللها در این دو گروه در جدول 4 آورده شده است. نتایج نشان داد فراوانی الل Aو الل T در گروه بیمار بهترتیب 39 و 61 درصد و در گروه کنترل بهترتیب 44 و 56 درصد بود و از نظر آماری تفاوت معنی‌داری بین فراوانی اللهای A و T در گروه بیمار و کنترل مشاهده نشد (05/0<p).
جدول 4: مقایسه ژنوتایپ و فراوانی الل های پلیمورفیسم 251 T/A از ژن IL-8درگروه بیمار و کنترل
|
ژنوتایپ |
گروه سالم تعداد=50 |
گروه بیمار تعداد=50 |
الل |
فراوانی الل ها در گروه سالم |
فراوانی الل ها در گروه بیمار |
P-value
بین الل T و A |
|
TT |
6 (12%) |
17 (34%) |
T |
28 56% |
30 61% |
|
|
TA |
44 (88%) |
27 (54%) |
|
|
|
68/0 |
|
AA |
0 (0%) |
6 (12%) |
A |
22 44% |
20 39% |
|
بحث
سرطان سینه شایع ترین سرطان در زنان است. علیرغم پیشرفتهای چشمگیر در درمان، حدود 25 درصد بیماران مبتلا به سرطان سینه سالانه جان خود را بهعلت این بیماری از دست میدهند (19). چنانکه این سرطان عامل 4/21 درصد از کل بدخیمیها و شایعترین سرطان در زنان ایرانی است و فاکتورهای محیطی متعدد، تغییرات سوماتیک مانند موتاسیون در آنکوژنها، ژنهای سرکوب کننده تومور و پلی مورفیسمهای ژنتیکی از عوامل بهوجود آورنده آن هستند (20 و 21). نتایج بسیاری از مطالعات حاکی از آن است که پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی با ایجاد تغییراتی که در توالی DNA ایجاد میکنند، میتواند استعداد ابتلا به سرطان را افزایش دهند. تعداد محدودی از مطالعات اپیدمیولوژیک به ارزیابی ارتباط بین پلیمورفیسم 251 T/A از ژن IL-8و ریسک سرطان سینه پرداختهاند (10 و 12 و 13). این پلیمورفیسم که در منطقه 251 پروموتور ژن IL-8قرار گرفته است نقش مهمی در تولید اینترلوکین 8 دارد و مشخص شده است که این پلیمورفیسم در جمعیتهای گوناگون با ایجاد تومور و متاستاز در سرطانهای مختلف مرتبط است (10 و 11 و 14 و 15 و 16 و 17). بنابراین این مطالعه با هدف
بررسی پلیمورفیسم 251 A/T ژن IL-8در جامعه زنان ایرانی مبتلا به سرطان سینه انجام شد. همچنین بهجای روشهای پر هزینه بر در تشخیص پلیمورفیسمها در این تحقیق از تکنیک Tetra arms PCR استفاده شده است.نتایج مطالعه حاضر نشان داد در گروه کنترل توزیع ژنوتیپ پلیمورفیسم 251 T/A از ژن IL-8برای ژنوتیپ های AA، AT و TT بهترتیب صفر درصد، 88 درصد و 12 درصد بود. همچنین توزیع ژنوتیپ در گروه بیمار بهترتیب 12 درصد، 54 درصد و 34 درصد بود. همچنین بیشتر افراد مورد بررسی، در مرحله 3 و 4 بیماری دارای ژنوتیپ TA و AAبودند. بهعبارتی دیگر با حضور ژنوتیپ های هتروزیگوت و هموزیگوت مغلوب این پلیمورفیسم در ژن IL-8 میتوان، عوامل تعیین پیش آگهی سیر بیماری و عاقبت بالینی سرطان سینه را پیشگویی نمود.
با توجه به شیوع سرطان سینه در زنان و تهدید بیماران، شناسایی پلیمورفیسم ژن IL-8 هم بهعنوان یک مارکر ژنتیکی و هم در تشخیص این بیماری و مهار آن، با جلوگیری از پیشرفت سرطان سینه میتواند موثر باشد. بر اساس نتایج مطالعات اخیر که در جمعیت زنان چینی انجام شده است مشخص شده است که بین پلیمورفیسم 251 A/T ژن IL-8با ابتلا به سرطان سینه ارتباط وجود دارد (12 و 13). مطالعات صورت گرفته در سالهای اخیر نقش اینترلوکینها را در سرطان سینه ثابت کردهاند که سطوح بالای سایتوکاینهای التهابی در سرم و بافتهای توموری سرطان سینه مشاهده شده است. بالا بودن برخی از این سایتوکاینها در سرم بیماران مبتلا به سرطان با پیشرفت مرحله بیماری و تهاجم سلولهای سرطانی و ایجاد متاستاز مرتبط است (9 و 12 و 13و 22). مطالعات نشان دادهاند که پیشرفت و توسعه چندین گونه از سرطان سینه با وضعیت التهاب و تولید نامنظم و نامناسب کموکاینها بهویژه اینترلوکین 8 همراه است که بهنظر میرسد یکی از مراحل حیاتی در ایجاد متاستاز در سلولهای سرطانی باشد (23). تحقیقات قبلی حاکی از این است که اینترلوکین 8 نه تنها یک عامل در فعال کردن مسیرهای تکثیری سلولهای سرطانی است بلکه مسیرهای آپوپتیک را نیز کنترل می کند. به این علت کاهش بیان ژن IL-8 به وسیله سلول های توموری، می تواند سبب تحریک گیرندههای کموکاینی و در نتیجه تخریب عملکرد نوتروفیلها و ماکروفاژها در سرکوب التهابات گردد (24). همچنین تغییر بیان ژن IL-8 بهواسطه وجود این پلیمورفیسم که در ناحیه پروموتری ژن قرار دارد سبب آنژیوژنز و در نتیجه ایجاد متاستاز و بدخیمیهای توموری خصوصا در سلولهای سینه شده که میتواند بهطور مستقیم با ایجاد سرطان سینه مرتبط باشد (13). اینترلوکین 8 یکی از مهمترین سایتوکاینهای تنظیم کننده است که دارای عملکرد مرکزی در شروع و تنظیم پاسخهای ایمنی سلولی است. اینترلوکین 8 در ماکروفاژها و فیبروبلاستهای مشتق شده از سلولهای بینابینی بیان میشود و بهعنوان یک میانجی مشتق شده از ماکروفاژ آنژیوژنز شناخته شده است. این سایتوکاین یک فاکتور کموتاکتیک بوده که میتواند سلولهای سفید خون را فعال کند (25). همچنین در طیف مختلفی از بیماریها مانند پسوریازیس، آرتریت روماتوئید، فیبروز ریویو برخی نئوپلاسمها نقش این اینترلوکین ثابت شده است. مطالعات متعددی نشان داده اند که اینترلوکین 8 یک عامل ترویج دهنده آنژیوژنز (رگزایی) است و بهطور مستقیم و یا غیر مستقیم عامل تکثیر سلولهای توموری و شکلگیری رگهای خونی جدید از طریق گیرنده سطحی عروق توموری سلولهای اندوتلیال هستند و در نتیجه میتوانند در رشد تومور و متاستاز موثر باشند (12 و 13 و 26). زانگ و همکاران (12) در یک مطالعه پژوهشی مشخص نمودند اینترلوکین 8 بهعنوان یکی از اعضای خانواده کموکاین ها میتواند در تنظیم التهابات و پروسههای سیستم ایمنی نقش اساسی داشته باشد. انان با روش PCR-RFLP پلیمورفیسمهایی از ژن اینترلوکین 8 از جمله پلیمورفیسم 251 T/A را بررسی نمودند. نتایج آنان نشان داد بین این پلیمورفیسم و ایجاد سرطان سینه در جمعیت زنان چینی ارتباط معنی‌داری وجود دارد. همچنین هی و همکارانش (13) در خصوص پلیمورفیسمهای ژن اینترلوکین 8 و ارتباط آنها با ایجاد سرطان سینه در جمعیت زنان چینی مطالعهایی را انجام دادند. تحقیق انان مشخص نمود که چندین پلیمورفیسم از جمله پلیمورفیسم 251 T/A از ژن IL-8 در افزایش ریسک ابتلا به سرطان سینه در بین زنان چینی موثر است. اسنوز و همکاران (27) در یک مطالعه مورد–شاهدی به بررسی تنوع ژنتیکی در ژن IL-8 همراه با افزایش خطر و پیش آگهی ضعیف سرطان سینه پرداختند. آنها در این مطالعه 308 بیمار غیر مرتبط با سرطان سینه و 236 فرد سالم را با روشAS پلیمراز بررسی کردند. نتیجه مطالعه نشان داد که پلیمورفیسم در پروموتر ژن IL-8 بهعنوان فاکتور ریسک یا خطر برای سرطان سینه میباشد. انواع مختلف سایتوکاینها نقشهای گوناگونی را در شروع یا تکثیر سرطان ایفا میکنند و میتوانند از یکطرف زمینه را برای بروز و حتی تکثیر و متاستاز سرطان فراهم کنند و از طرف دیگر از طریق آثار ضدالتهابی و ضدتوموری، ازپیشرفت و توسعه سرطان جلوگیری کنند (28). سنوزی و همکاران (8)در یک مطالعه مورد – شاهدی به بررسی اثر ترکیبی پلیمورفیسم ژن IL-8و CXCR2 در استعداد ابتلا به سرطان سینه وپرخاشگری (تهاجم) پرداختند در آن مطالعه 409 بیمار تونسی غیر مرتبط با سرطان سینه و 301 فرد سالم را با روش AS پلیمراز مورد بررسی قرار دادند. نتیجه این مطالعه نشان داد که پلیمورفیسم در ژن IL-8و CXCR2 با افزایش سرطان سینه، و همچنین پیشرفت بیماری همراه است. مطالعات متعددی نشان دادند که بین پلیمورفیسم ژن IL-8 و بیماریهای انسانی رابطه وجود دارد و همه آنها بر نقش پلیمورفیسم 251 T/A از ژن IL-8 که بر بالادست سایت آغاز رونویسی قرار دارد، متمرکز شدهاند. همچنین در این مقالات مطرح شده است که وجود این پلیمورفیسم علاوه بر اینکه نقش مهمی در پیشرفت بیماری سرطان سینه ایفا میکند میتواند در پیش آگهی سرطان کولورکتال، سرطان پروستات و معده نیز نقش داشته باشد (29). هوانگ و همکاران (28)، گزارش نمودند پلیمورفیسم فوق با ژنوتیپ هتروزیگوت و هموزیگوت مغلوب در افراد مبتلا به سرطان سینه و در مرحله حاد این بیماری ارتباط دارد.
بنابراین مروری بر مطالعات انجام شده در خصوص پلیمورفیسم 251 T/A از ژن IL-8که میتواند درایجاد بسیاری از سرطانها از جمله سرطان سینه در جمعیت زنان آسیایی موثر باشد، لزوم مطالعه حاضر را که بررسی ارتباط پلیمورفیسم مذکور با سرطان سینه در جمعیت زنان ایرانی، بهعنوان جمعیتی از زنان اسیایی، مشخص مینماید و همچنین لزوم استفاده از روش Tetra arms PCR در مقایسه با روش PCR-RFLP، که روش دقیق و مقرون بهصرفهتری میباشد را توجیه مینماید.
نتیجهگیری
سرطان سینه بهعنوان یکی از فراوانترین سرطانها و علت اصلی مرگ و میر در بین زنان سراسر جهان و زنان ایرانی محسوب میگردد. فاکتورهای متعددی از جمله انواع فاکتورهای محیطی، وزن بدن، فاکتورهای مرتبط با سبک زندگی همچون مصرف الکل، عدم فعالیت فیزیکی و مصرف سیگار و نیز مهمترین مورد فاکتورهای ژنتیکی افراد در ایجاد تومورهای سرطان سینه نقش مهمی دارند. نتایج مطالعات نشان میدهد سایتوکاینهای متعددی از جمله IL-8 نقش مهمی در ایجاد التهاب و رگزایی در نسوج و در نتیجه ایجاد و تشدید سرطانها ایفا میکند. این مطالعات بر نقش پلیمورفیسمهای ژن IL-8و ارتباط آن با انواع سرطان در جمعیتهای مختلف پرداختهاند. بنابراین این مطالعه با هدف بررسی پلیمورفیسم 251 A/T ژن IL-8در جامعه زنان ایرانی مبتلا به سرطان سینه انجام شد و نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد
بیشتر افراد مورد بررسی، در مرحله 3 و 4 بیماری، دارای ژنوتیپهای هتروزیگوت و هموزیگوت مغلوب این پلیمورفیسم در ژن IL-8بودند و این امر میتواند، توجیه کننده این باشد که پلیمورفیسم مذکور نقش مهمی در پیش آگهی و حتی تشخیص در بیماری سرطان پستان داراست و توصیه میشود در مطالعات بعدی تعداد افراد بیشتری از جمعیتهای مختلف زنان ایرانی مورد مطالعه قرار گیرند.
تشکر و قدردانی
از کلیه مسئولین محترم در دانشکده علوم زیستی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال و مسئولان محترم آزمایشگاه پاسارگارد بهخصوص آقای دکتر امینی که در انجام کارهای آزمایشگاهی این تحقیق کمال همکاری را مبذول فرمودهاند، سپاسگزاری و تشکر میشود.
al. Night-shift work and risk of breast cancer: a systematic review and
meta-analysis. Breast cancer research and treatment.2013; 138(1): 291-301.##Sharma GN, Dave R, Sanadya J, Sharma P, et al. Various
types and management of breast cancer: An overview. Journal of advanced
pharmaceutical technology and research. 2010; 1(2): 109-26. #Perou CM, Borresen-Dale AL.
Systems biology and genomics of breast cancer. Cold Spring Harbor perspectives in
biology. 2011; 3(2): a003293##Antoniou
AC, Easton DF. Models of genetic susceptibility to breast cancer. Oncogene.
2006; 25(43): 5898-5905. Oncogene. 2006; 25(43): 5898-5905.Oncogene. 2006;
25(43): 5898-5905 Oncogene. 2006; 25(43): 5898-5905##Vacchelli E, Aranda F, Bloy N, Buqu A, et al. Trial
watch:immunostimulatorycytokines in cancer therapy. Oncoimmunology. 2014; 3(6):
290-94##Singh JK, Simões BM, Howell SJ,
Farnie G, et al. Recent advances reveal IL-8 signaling as a potential key to
targeting breast cancer stem cells. Breast Cancer Research. 2013; 15(4); 21##Chia CY, Kumari U, Casey P. Breast cancer cell invasion
mediated by Gα12 signaling involves expression of interleukins-6 and−8, and
matrix metalloproteinase-2. Journal of molecular signaling. 2014; 9(1): 6.##Snoussi
K, Mahfoudh W, Bouaouina N, Fekih M , et al. Combined effects of IL-8 and CXCR2
gene polymorphisms on breast cancer susceptibility and aggressiveness
.Biomedicine Cancer. 2010; (10): 283.##Lin1 Y. Identification of interleukin-8
as estrogen receptor-regulated factor involved in breast cancer invasion and
angiogenesis by protein arrays. Publication of the international union Against Cancer (uicc). International Journal
of Cancer. 2004; (109): 507–515 . ##Huang
Q, Wang C, Qiu LJ, Shao F, et al. IL-8-251A>T polymorphism is associated
with breast cancer risk:a meta-analysis. Journal of Cancer Research Clinical Oncology.
2011; 137(3): 1147–1150.##Taheri M, Hashemi M, Eskandari-Nasab E, Fazaeli A, et
al. Association of 607 C/A Polymorphism
of IL-18 Gene (rs1946518) with Breast Cancer Risk in Zahedan, Southeast Iran.
Prague Medical Report. 2012; 113(3): 217-222 ##Zhang J, Han X, Sun
Sh. IL-8 -251A/T and +781C/T polymorphisms were associated with risk of breast
cancer in a Chinese population. International Journal of Clinical
Express Pathology. 2017; 10(7): 7443-7450## He Y,
SunSh, Liu Y,Tian K. Association of IL-8 genetic polymorphisms
and breast cancer risk in a Chinese population. Biomedical Research. 2017; 28
(18): 7892-7898##Xiuyu C, Weihan H, BeiZh, Ni D, et al. Genotyping of IL-8-251
T > A yields prognostic information in patients with gastric carcinoma.
Biomarkers.2013; 18(7): 559-564.## Chen Y, Yang Y, Liu S, Zhu S, et al.
Association between interleukin 8− 251 A/T and+ 781 C/T polymorphisms and
osteosarcoma risk in Chinese population: a case–control study. Tumor Biology.
2016; 37(5): 6191-6196##Wang Z, Gao ZM, Huang HB, Sun LS, et al. Association of
IL-8 gene promoter -251 A/T and IL-18 gene promoter-137 G/C polymorphisms with
head and neck cancer risk: a comprehensive meta-analysis. Dovepress. 2018; 10:
2589-2604.##Jessica C, Alwadris TT, Prasetyo SR, Puspitawati R, et al.
Association of interleukin 8 -251 A/T gene polymorphism with periodontitis in
Indonesia. Journal of Physics. 2018; 1025: 1-5.##Matheson
MC, Ellis JA, Raven J, Walters
EH, et al. Association of IL8, CXCR2 and TNF-alpha
polymorphisms and airway disease. Journal of HumanGenethology. 2006; 51(3): 196-203.##Richie RC, Swanson JO. Breast Cancer: A Review of the
Literature. Journal of Insurance
Medicine. 2003; 35(2): 85-101.## Harirchi I, Karbakhsh M, Kashefi A, Momtahen A
J. Breast cancer in Iran: results of a multi-center study. Asian pacific journal
of cancer prevention. 2004; 5(1): 24-27.## Mousavi SM, Montazeri A, Mohagheghi
MA, Jarrahi AM, et al. Breast cancer in Iran: an epidemiological review. Breast
Journal. 2007; 13(4): 383-91.## De Andres PJ, Illera JC, Caceres S, Diez L, et
al. Increased levels of interleukins 8 and 10 as findings of canine
inflammatory mammary cancer. Veterinary Immunology and Immunopathology. 2013;
152(3-4): 245-51.##Vogel CF, Li W, Wu D, Miller JK, et al. Interaction of aryl
hydrocarbon receptor and NF-κB subunit RelB in breast cancer is associated with
interleukin-8 overexpression. Archives of
Biochemistry and Biophysics.
2014; 512(1): 78-86.##Agha-Alinejad H, Haftchenari SH, MatinHomaei H. Effect of
a Period of Endurance Training on Serum Il-8 Concentration and Tumor Volume in
Breast Cancer Bearing Mice. Iranian Journal of Endocrinology and Metabolism.
2014; 16(1): 26-32.## Strieter RM, Kunkel
SL, Elner VM, Martonyi CL, et al. Interleukin-8.A corneal factor that induces
neovascularization. American Journal of Pathology.1992; 141(6): 1279-1284.##Wu S, Lu S, Tao H, Zhang L, et al .Correlation of Polymorphism of IL-8 and MMP-7
with Occurrenceand Lymph Node Metastasis of Early Stage Cervical Cancer. Journal of Huazhong University of Science
Technology. 2011; 31(1): 114-119.##Snoussi K, Mahfoudh W, Bouaouina N, Ahmed SB,
et al. Genetic Variation in IL-8
Associated with Increased Risk and Poor Prognosis of Breast Carcinoma. American
Society for Histocompatibility and Immunogenetics. Human Immunology. 2006; 9(67): 13-21## Huang J, Li X, Hilf R, Bambara RA, et al.
Molecular basis of therapeutic strategies for breast cancer. Current Drug
Targets-Immune, Endocrine and Metabolic Disorders. 2005;
5(4): 379-396.## Vairaktaris E,
Serefoglou Z, Yapijakis C. High gene expression of matrix metalloproteinase-7
is associated with early stages of oral cancer. Anticancer Research. 2007;
27(4B):2493-2498.
)