فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران مرکزی، گروه زیست شناسی تهران، ایران.

چکیده

هدف: نانوذرات نقره یکی از مهم‫ترین نانو مواد تجاری محسوب می‏شود. از سوی دیگر سرطان یکی از چالش‏های بزرگ و پیچیده‫ای است که بشر با آن دست و پنجه نرم می‏کند و راه‏های رسیدن برای جلوگیری یا درمان آن بسیار مهم و ضروری است. بر این اساس در این مطالعه به ‏بررسی اثر سمیت نانو ذرات نقره سنتز شده به‏روش زیستی بر روی سرطان کولون (HT29) و ارزیابی بیان ژن ماتریکس متالوپروتئیناز 9 (MMP9) پرداخته شد.
مواد و روشها: در این مطالعه، سنتز نانو ذرات نقره با استفاده از احیای یون‏های نقره انجام گرفت و با کمک میکروسکوپ الکترونی عبوری مشخصه‏یابی شد. اثرات سمیت سلولی نانوذرات نقره بروی رده سلولی سرطانی کولون HT29 با روش رنگ‫سنجی  MTT مورد بررسی قرار گرفت. همچنین، در این مطالعه با استفاده از روش real time PCR  به ‏ارزیابی میزان بیان ژن MMP9 پرداخته شد.
نتایج: نتایج مشخصه یابی TEM  نشان داد که نانوذرات اغلب شکل کروی داشته و میانگین اندازه آن‫ها 22 نانومتر می‏باشند. نتایج نشان داد که نانوذرات نقره اثر کشندگی وابسته به‏دوز و زمان داشته و میزان بقای سلول‫ها را به‏طور معنی‏داری کاهش می‏دهند (001/0p <). همچنین بین اختلاف غلظت‏ها رابطه معنی‏داری دیده شد. بیان ژن MMP9  در سلول‏های سرطانیHT29  تیمار شده با نانوذرات نقره  به‏میزان 679 ٠٠/٠ ±٤٨٩٧/٠ (001/0p <) نسبت به نمونه شاهد کاهش نشان داد.
 نتیجهگیری: نتایج این مطالعه نشان داد که نانوذرات سنتز شده به‫روش سبز می‏تواند راه‏کار امیدوارکننده ای در درمان سرطان روده بزرگ مورد توجه قرار گیرد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Evaluation of metalloproteinase matrix MMP9 gene expression and effect of silver nanoparticles toward Colon cancer cell line (HT29)

نویسندگان [English]

  • B Hassani Derakhshandeh
  • SA Sadat Shandiz
  • M Abbasi

Department of Biology, Central Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

چکیده [English]

Aim: In this study, the toxicity effect of silver nanoparticles on colon cancer (HT29) was measured and evaluate the expression of the matrix metalloproteinase 9 (MMP9) genes.
Material and methods: In this study, the synthesized AgNPs were characterized by the transmission electron microscopy (TEM) analysis. The cytotoxicity effect of silver nanoparticles against the HT29 cell lines was investigated using MTT assay. Also, MMP9 gene expression was measured using real time PCR technique.
Results: The TEM result showed that the fabricated AgNPs were mostly spherical in shape and having an average diameter of 22 nm. The results revealed that AgNPs significantly decreased the viability of cells in dose-and time dependent manner (p < 0.001). Also, there was a significant relationship between the differences in concentrations. MMP9 gene expression levels in HT29 cells were decreased to 0.4897 ± 0.00679 (p < 0.001) compared with the control group.
Conclusion: According to the results, the green fabricated AgNPs can be considered as a promising strategy for the treatment of colon cancer.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Silver nanoparticles
  • Matrix metalloproteinase 9
  • Colon Cancer
  • HT29
  • Toxicity

مقدمه

دانش نانوفناوری در قرن حاضر علم و زندگی روزمره انسان را تحت تاثیر قرار داده است (1و2). این دانش شاخه‏های مختلف زیست فناوری و علوم زیستی، پزشکی، شیمی، فیزیک، الکترونیک و علم مواد را شامل می‏شود و به‏دلیل شکستن محدودیت ها و قابلیت استفاده از نانوذرات در کاربردهای صنعتی، پزشکی و الکترونیک مانند کاتالیزور و درمان سرطان توجه بسیاری را به‏خود جلب کرده است (3). به‏طوری‏که یکی از جنبه‏های مهم در نانوفناوری سنتز نانومواد با اندازه، ویژگی های شیمیایی و ابعاد قابل کنترل در زیست شناسی است. در چند سال اخیر، تحقیقات برروی سنتز نانوذرات با واسطه‏ی گیاهان (سنتز سبز)، به‏سبب مزیت‏های بیشتر این روش نسبت به روش‏های دیگر بیولوژیکی، در حال پیشرفت می‏باشد. از مهم‏ترین مزایای سنتز سبز نانوذرات نسبت به روش‏های بیولوژیکی ، عدم نیاز به فرآیند پرزحمت و هزینه‏ی نگه‏داری کشت‏های سلولی و قابلیت استفاده‏ی این روش در مقیاس بزرگ و صنعتی می‏باشد. به‏علاوه گزارش شده که نانوذرات سنتز شده با استفاده از عصاره گیاهی، توسط لایه نازکی از مواد آلی داخل عصاره احاطه شده و بنابراین پایداری و ثبات این مواد تا 4 هفته بعد از سنتز حفظ می‏شود. در حالی‏که این زمان در روش‏های شیمیایی بسیار کوتاه بوده و نانوذرات پس از مدتی دوباره دور هم تجمع یافته و دیگر خواص ویژه خود را ندارند (4). در ﺑﻴﻦ اﻧﻮاع ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻧﺎﻧﻮذرات، ﻧﺎﻧﻮذرات ﻧﻘﺮه از ﻓﻮاﻳﺪ ﮔﺴﺘﺮده‏اى در زﻣﻴنه‏های ﻧﺎﻧﻮﻓﻨﺎورى، زﻳﺴﺖ ﻧﺎﻧﻮﻓﻨﺎورى و ﭘﺰﺷﻜﻰ ﺑﺮﺧﻮردارند. ﻧﺎﻧﻮذرات ﻧﻘﺮه داراى ﻛﺎرﺑﺮدﻫﺎى ﺑﺎﻟﻘﻮه اى در ﻋﺮصه‏ی ﻋﻠﻮم ﭘﺎﻳﻪ زﻧﺪﮔﻰ ﺑﺸﺮ به ویژه در ﭘﺰﺷﻜﻰ، ﺷﻴﻤﻰﻣﻮاد ﻏﺬاﻳﻰ، ﻋﻠﻢ ﭘﺰﺷﻜﻰ ﻗﺎﻧﻮﻧﻰ، ﻛﺸﺎورزى و ﻟﻮازم آراﻳﺸﻰ اﺳﺖ (5). در اﻳﻦ ﻣﻴﺎن، ﻣﻄﺎﻟﻌﺎت ﺑﻴﺎﻧﮕﺮ آن اﺳﺖ ﻛﻪ ﻧﺎﻧﻮذرات ﻧﻘﺮه اﺛﺮات ﺑﻴﺸﺘﺮى در ﺑﺮاﺑﺮ ﺑﺎﻛﺘری‏ها و ویروس‏ها از ﺧﻮد ﻧﺸﺎن می‏دﻫﻨﺪ (6).

سرطان بیماری بسیار پیچیده‏ای است که اغلب با به‏هم خوردن و از تنظیم خارج شدن تنظیمات هومئوستاتیک داخل و بین سلولی شروع می‏شود. در مراحل پیشرفته سرطان و متاستاز آن، بر هم خورن مسیرهای مولکولی، هضم ترکیبات ماتریکس سلولی و بر هم‫کنش سلول مهاجم با بافت هدف برای جایگزینی آن و متاستاز به بافت جدید لازم است (7). روش‏های درمانی فعلی برای سرطان عبارتند از شیمی درمانی، پرتودرمانی و جراحی می‏باشد. با این‫حال، این روش‫ها، ویژگی خاصی در مورد سرطان ندارند. بسیاری از محققین متوجه شده‏اند که ترکیبی از دو یا سه روش درمان اغلب نتایج درمانی موثر و بهتری نسبت به یک روش واحد تنها دارد. این در حالی است که در بیشتر موارد سلول‏های سالم نیز دچار مرگ می‏شوند و می‏تواند عوارض جانبی در بیمار به‏همراه داشته باشد. بنابراین نیاز به جستجو در شیوه‏های نوین درمانی برای کنترل سرطان ضروری می‏باشد. پیشرفت سرطان به‏طور بسیار شدیدی بقای بیمار را به‏خطر می‏اندازد و راهکارهای درمانی را با شکست مواجه می‏کند. برای تهاجم سلول‏های سرطانی، سلول‏های اپیتلیال باید به داخل بافت پایه نفوذ کنند و سد بستره خارج سلولی را از بین ببرند. در این مرحله، آنزیم‏های پروتئاز دارای نقش بسیار مهمی دارند که با هضم بستره خارج سلولی و ترکیبات آن باعث تسهیل متاستاز سلول های سرطانی به بافت‏های دیگر می‏شوند (7). تاکنون، به‫خوبی روشن شده است که سلول‏های توموری نسبت به سلول‫های سالم میزان پروتئاز بیش تری تولید می‏کنند و ارتباط مثبت بین میزان تهاجم سلول ها و سطح پروتئاز آن‏ها هم در مدل‏های تومور آزمایشگاهی و هم در تومورهای بالینی انسانی به اثبات رسیده است (8).  نقش کلی پروتئازها و به‏خصوص ماتریکس متالوپروتئینازها (MMPs) در متاستاز و  تهاجم سلول‏های توموری کاملا اثبات شده و مشخص شده که این آنزیم‫ها با تسهیل شکستن اتصالات بافت پیوندی و هضم ترکیبات ماتریکس خارج  سلولی به این فرآیند کمک می‏کنند (9). ماتریکس متالوپروتئینازها، خانواده‏ای از آنزیم‏های پروتئولتیک هستند که در هضم بسیاری از ترکیبات ماتریکس خارج سلولی و بافت غشا پایه ایفای نقش می‏کنند و از این لحاظ در فرآیندهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی دارای اهمیت هستند. از بین این گروه MMP-9 تنها عضو این خانواده است که به‏خاطر دارا بودن ساختار سه تائی فیبرونکتین قادر به اتصال و هضم کلاژن به‏عنوان مهم‫ترین ترکیب غشای پایه است و از این نظر تغییرات بیانی این ژن می‏تواند در سرطانی شدن سلول‏ها ومتاستاز سلول ها نقش مهمی داشته باشد (10) .بر این اساس در این مطالعه به ‏بررسی اثر سمیت نانو ذرات نقره سنتز شده به‏روش زیستی بر روی سرطان کلون (HT29) و ارزیابی بیان ژن ماتریکس متالوپروتئیناز 9 (MMP9) پرداخته شد.

 

مواد و روش‌ها

سنتز نانوذرات نقره: در این مطالعه تجربی سنتز نانو ذرات نقره از روش رسوب‏گذاری با احیای یون‏های نقره طبق روش کار مقاله‏ای که قبلا گزارش شده بود (11)، انجام گرفت. به‏منظور بیوسنتز نانو ذرات نقره، با افزودن 6 میلی‫لیتر از حجم عصاره آبی برگ گیاه اکالیپتوس به 100 میلی‫لیتر نیترات نقره (مرک، آلمان) با غلظت 01/0 میلی‫مولار تحت شرایط همزدن و دمای آزمایشگاه در مدت زمان یک ساعت از زمان واکنش انجام گرفت. بیوسنتز نانوذرات نقره با تغییر رنگ واکنش مشاهده شد. به‏منظور شستشو و خالص سازی نانوذرات، مخلوط حاصل سه بار با آب مقطر درrpm  13000 دور بر دقیقه به‏مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شدند. به‏منظور  مشخصه یابی،  دو تا سه قطره از نانوذرات نقره سنتز شده را سونیکه نموده و بر روی توری مسی پوشش داده شده با کربن قرار داده  و بعد از خشک شدن، تصویر آن با کمک میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) تهیه شد.

روش MTT: در روش MTT به‏بررسی زنده ماندن یا عدم زنده ماندن سلول‏ها در چرخه‏ی تنفسی میتوکندریایی پرداخته شد. برای این منظور رده‏‌ی سلولی HT29 از انستیتو پاستور ایران تهیه شد و در محیط کشت RPMI1640 مکمل شده با ١٠ درصد سرم FBS کشت داده شدند. سلول‏های  HT29برای مطالعات       in vitro در مورد سرطان کولون سودمند می‏باشد، زیرا این رده سلولی چندین مشخصه‏ی اپی‫تلیوم پستانداران را داراست. علاوه ‏بر این، در هنگام رشد در شرایط in vitro، این رده سلولی توانایی تشکیل توده و رشد به‏صورت لایه‏ای را دارا می باشد. سپس، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در یک اتمسفر مرطوب با غلظت ٥ درصد CO2 در فلاسک کشت سلولی نگه‏داری شدند. سلول‏ها از فلاسک جمع‏آوری شدند و پس از افزودن محیط کشت، سوسپانسیون سلولی به‫هر خانه از پلیت 96 خانه‏ای با حجم 100 میلی‫لیتر از سوسپانسیون سلولی و میزان 10 هزار سلول منتقل شد و در شرایط کشت انکوبه شد. پس از گذشت 24 ساعت، محیط کشت تخلیه شد و نانوذرات نقره با غلظت‌‏های 2/31، 5/62، 125، 250 و 500 میکروگرم بر میلی‫لیتر به‏هر چاهک اضافه شد. گروه شاهد در این تست، چاهک‫های حاوی سلول‏های تیمار نشده در نظر گرفته شد. پس از پایان انکوباسیون، مقدار 10 میکرولیتر رنگ MTT (نمک تترازولیوم) با غلظت 5 میلی­گرم بر میلی­لیتر در تاریکی به‏هر چاهک افزوده شد و انکوباسیون به‏مدت 4 ساعت انجام گرفت. سپس به‏هر چاهک، مقدار 100 میکرولیتر دی‏متیل‏سولفوکساید Dimethyl Sulfoxide (DMSO) اضافه شد. جذب نوری نمونه ها با کمک دستگاه قرائت گر الایزا و در طول موج 570 نانومتر ثبت شد. نتایج برحسب درصد سلول‫های زنده تیمار شده نسبت به تیمار نشده، از رابطه‏ی زیر محاسبه شد:

100´(جذب نوری سلول‏های تیمار نشده/جذب نوری سلول‏های تیمار شده با نانوذرات)= درصد سلول‏های زنده

Real time PCR: به‏منظور انجام real time PCR، استخراج RNA و سنتز cDNA انجام گرفت. استخراج RNA های کل سلول از کیت (Transgen Biotech ER101-01) استفاده شد و تمامی مراحل طبق دستورالعمل کیت انجام شد. جهت سنتز cDNA نیز از کیت (Transgen BiotechAE301-02) استفاده شد و تمام مراحل طبق دستورالعمل کیت انجام گرفت. برای این منظور ،1 میکروگرم از  RNAبه میکروتیوب عاری از RNase وارد نموده و 1 میکرولیتر آنزیم DNaseI و 1 میکرولیتر بافر این آنزیم به آن اضافه گردید و در دمای 37 درجه سانتی‫گراد به‏مدت 30 دقیقه انکوبه شد. در نهایت جهت غیر فعال کردن آنزیم DNaseI، 1 میکرولیتر از محلول EDTA 50 mM به آن افزوده شد و در دمای 65 درجه سانتی‫گراد به‏مدت 10 دقیقه قرار گرفت. به‏منظور بررسی میزان بیان ژن‏های مورد نظر، تکنیک real time PCR با روش SYBR Green و با استفاده از کیت شرکت تاکارا (PrimeScriptTM RT Reagent Kit با کمک دستگاه   ABIساخت کشور امریکا انجام شد. واکنش Real Time PCR  با هدف به‫دست آوردن سیکل آستانه )چرخه‏ای که در آن، سیگنال فلئورسنت دریافتی، از سیگنال زمینه بیشتر شود)  و میزان تغییرات بیان ژن‏ها انجام گرفت. مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش شامل 1 میکرولیتر cDNA (50 نانوگرم)، 2 میکرولیتر پرایمر (200 نانومولار)، مسترمیکس سایبرگرین 10 میکرولیتر و آب دیونیزه 7 میکرولیتر بود. برنامه دمایی- زمانی دستگاه به‏صورت95 درجه سانتی‏گراد به‏مدت ده دقیقه، 95 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 15 ثانیه (دناتوراسیون موجود در چرخه)، 60 درجه سانتی‏گراد به‏مدت یک دقیقه( جهت اتصال پرایمر) و 72 درجه سانتی‏گراد جهت ساخت رشته انتهایی انجام گرفت. واکنش real time PCR را برای هر نمونه سه بار تکرار انجام گرفت. علاوه براین، گروه کنترل منفی تست(NTC)  آماده شد که در آن تمام مواد به‏غیر از الگو (cDNA) افزوده شد. در مرحله بعد آنالیز نتایج Real Time PCR با استفاده از روش Ct ∆∆ طبق فرمول‏های زیر صورت گرفت:

∆Ct=Ct target-Ctreference

∆∆Ct = ∆Ct T - ∆Ct C     RQ=2 -∆∆Ct

در این فرمول CtT∆ اختلاف بین سیکل‏های آستانه ژن هدف و شاهد داخلی در نمونه مورد آزمون وCt control∆ نیز اختلاف میان سیکل‏های آستانه ژن هدف و شاهد داخلی در نمونه کنترل می‏باشد. این روش کارایی پرایمرها را کامل در نظر گرفته، به ‏این‏صورت که میزان محصول در تمام سیکل‏ها دو برابر می باشد.

روش توصیف و تجزیه تحلیل داده‏ها: به‏منظور تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم افزار SPSS نسخه ١٩ استفاده شد و جهت تعیین اختلاف معنی‌داری بین میانگین تیمارهای به‏کار گرفته شده از تجزیه واریانس(ANOVA) و بر اساس 05/0p<  محاسبه شد.

 

نتایج

تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری نانوذرات نقره سنتز شده با عصاره گیاه در شکل 1 نشان داده شده است.

 

 

شکل1: تصویر میکروسکوپی الکترونی گذاره (TEM) از نانوذرات نقره استفاده شده در این مطالعه

 

با توجه به نتایج میکروگراف الکترونی نانوذرات نقره مشخص شد که میانگین اندازه آن‫ها 22 نانومتر بوده و غالبا به‏شکل کروی دیده می‏شوند. بررسی میزان بقا سلولی با استفاده از روش MTT نشان داد که نانوذرات نقره ، تکثیر سلول‏های HT29 را به‏صورت وابسته به‏دوز و زمان در 24 ساعت کاهش می‏دهند (شکل 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: درصد بقای سلول‏های  HT29در برابر غلظت‏های مختلف نانوذرات نقره  در مدت زمان 24 ساعت; نتایج به‏صورت درصد بقا در مقایسه با نمونه‏های شاهد گزارش شده است (*:05/0­p<­، **، 01/0p<، *** 001/0p< : n=3). (غلظت‏ها بر حسب میکرو گرم در میلی‏لیتر می‏باشند)

 

 

 

به‏طوری‏که بیشترین مهار تکثیر در غلظت 500 میکروگرم در میلی‏لیتر بوده که از لحاظ آماری معنی‏دار بود (001/0p<). این درحالی بود که غلظت  2/31 میکروگرم در میلی‫لیتر نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی‏داری را نشان نداده و از نظر آماری معنی‏دار نبوده است. تغییرات ریخت‫شناسی سلول‏های تیمار شده با غلظت‫های مختلف نانوذرات نقره نیز انجام گرفت. همان‏طور که در شکل 3 مشخص است، در غلظت‏های بالاتر، سلول‏ها یکپارچگی غشایی آن‏ها از بین رفته و به‏سمت واکوئله شدن پیش رفته‏اند که از نشانه‏های مرگ سلولی می‏باشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل3: تغییرات ریخت شناسی سلول‫های سرطان کولون HT29 در پلیت‫های گروه کنترل (a) غلظت‫های 5/62 (b)، 125 (c) 250 (d) و 500 (e) میکروگرم بر میلی لیتر تیمار شده با نانوذرات نقره. همان‫طور که مشخص است، در غلظت‫های بالاتر، سلول‫ها یکپارچگی غشایی آن‫ها از بین رفته و به‫سمت واکوئله شدن پیش رفته‫اند که از نشانه‫های مرگ سلولی می‫باشد.

 

 

 

تغییر در بیان ژن MMP9 در سلول‏های HT29 تیمار شده با نانوذرات نقره با استفاده از روش real Time PCR بعد از 24 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. نسبت بیان ژن MMP9 به ژن مرجع در رده سلولی تیمار شده

 

به‏میزان 006/0±8497/0 کاهش یافت که نشان دهنده تاثیر مثبت این نانوذرات در کاهش بیان ژن MMP9 می‏باشد (شکل 4).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4: میزان بیان ژن MMP9 نسبت به گروه کنترل:  نسبت بیان ژن MMP9  به ژن مرجع GAPDH در رده سلولی سرطان روده بزرگ تیمار شده به‫میزان 4897/0 کاهش طی 24 ساعت مشاهده شد.

 

 

بحث

امروزه مرکز توجه مطالعات سرطان بررسی عوامل سرطان با ضریب بالاتر و قابلیت پذیرش بیشتر برای بیماران می‏باشد. در این میان نانوذرات دارویی چشم انداز درمانی گسترده‏ای با کاهش سمیت از خود نشان داده‏اند (12و13). توسعه نانوذرات نقره به‫عنوان عامل ضد سرطان و ضد میکروبی در کانون توجه پژوهشگران قرار گرفته است. در سال‏های اخیر راه‫کاری ساده،  مقرون به‏صرفه و سازگار با محیط زیست برای سنتز نانوذرات نقره با استفاده از عصاره گیاهان مطرح شده است. به‫نظر می‫رسد که مولکول‏های زیستی موجود در عصاره‏های گیاهی مانند فنل، فلاونوئیدها و ترپونوئید نقش موثری در احیای یون‏های نقره به‏شکل نانوذرات نقره بازی می‏کنند (14و 15). به‏منظور سنتز نانوذرات فلزی، احیاکننده‏های مختلف شیمیایی در حلال‫های متفاوت طی پژوهش‏های اخیر گزارش شده است. کاربرد ترکیبات دارای منشا گیاهی کانون توجه فراونی در سال‏های اخیر بوده است. تاکنون از

 

 

 

عصاره‏های گیاهان مختلف جهت سنتز نانوذرات نقره استفاده شده و اثرات زیستی آن‫ها مورد بررسی قرار گرفته است. خاتمی و همکارانش (16) اثرات ضد سرطانی نانوذرات نقره سنتز شده بـا اسـتفاده از عصـاره هسـته خرمـا روی سلول‏های سرطانی رده7- MCF به‏طور معنی‫داری انجام می‏گیرد. در این مطالعه تحلیلی غلظت نانوذرات نقره افزایش و میزان ماندگاری سلولی به‏طور معنـی‫داری کـاهش یافـته بود که سمیت وابسته به غلظت را در رده سلولی مورد مطالعه نشان دادند.

ماتا و همکاران)17( اثرات ضد سرطانی عصاره‏ی برگ گیاه Abutilon indicum را در رده سلولی سرطان روده بزرگ انسان (COLO 205) و نرمال کلیه (MDCK) مورد ارزیابی قرار دادند. نتایج پژوهش آن‏ها نشان دادکه نانوذرات نقره علاوه بر مهار وابسته به غلظت، منجر به تغییرات مورفولوژی مانند تغییرات در غشای سلول‏ها و تراکم کروماتین‏ها شده که این تغییرات باعث القای مرگ برنامه ریزی شده (آپوپتوزیس) در این رده‏ی سرطانی می‏شود.

در تحقیق حاضر، اثرات نانوذرات نقره سنتز شده به‏روش زیستی برروی تکثیر سلول سرطانی روده  (HT29)با انجام آنالیز سمیت سلولی MTT در طی 24 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که اثر کشندگی سلول‏ها بستگی به‫زمان و غلظت نانوذرات دارد. همچنین، در مطالعه حاضر تصویر به‫دست آمده از میکروسکوپ TEM اندازه ذرات را در محدوده 1 تا 25 نانومتر گزارش داد. طیف میکروسکوپ الکترونی عبوری که حاکی از سنتز نانوذرات، با تحقیقات ویلیامز و کارتر (18) مبنی بر اثبات سنتز نانوذرات با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری مطابقت دارد.

امروزه جستجوی مارکرها برای ردیابی و پیگیری وضعیت درمان در افراد سرطانی، برای دانشمندان به‏عنوان یک هدف مطرح است. در مطالعات گذشته مشخص شده است که یکی از این نشانگرهای قابل توجه، MMP9 می‏باشد که در بیماران سرطانی افزایش می‏یابد. تاکنون مطالعه‏ای در زمینه ارزیابی بیان ژن MMP9 با تیمار نانوذرات نقره سنتز شده به‏روش سبز انجام نگرفته است. اگر چه سودمندی MMP-9 به‏عنوان یک نشانگر تشخیصی در این بیماران به‏اثبات رسیده است، ولی در چندین پژوهش که میزان این آنزیم را در سرم و پلاسمای خون بیماران اندازه گرفته‏اند، نتایج غیرهمسانی گزارش شده بود (19). همچنین، در مطالعه ای که در سال 2016 انجام شد، ارتباط معنی‏داری بین MMP های 2 و 9 با Basal cell carcinoma مشاهده شده بود. همچنین مطالعاتی به رابطه‏ی بین این دو  MMPو بدخیمی‏های حنجره و تخمدان نیز اشاره نموده‏اند (20-22) در مطالعات گذشته، ترشح بیش از حد متالوپروتئینازهای مخاطی در بیماری التهابی روده مشخص شده است. براساس مطالعه Baugh و همکاران (23) افزایش ترشح ماتریکس پروتئیناز 1،2،3و9 به‏طور واضح در مخاط ملتهب بیماران مبتلا به کولیت نسبت به نواحی سالم مشاهده شده است. از آنجایی‏که تغییرات بافت‫ها بیشتر بازتاب تغییرات آنزیمی مایعات بدن است، اندازه‫گیری میزان ماتریکس متالوپروتئینازها در خون و ادرار، ابزاری مناسب برای بررسی تغییرات اتفاق افتاده در بافت‏ها شناخته شده است و کیت‏های تجاری زیادی مانند کیت‏های الایزا برای بررسی اختصاصی میزان این آنزیم‏ها در خون و ادرار تهیه شده است. در بین اعضای این خانواده، MMP-9 تنها عضوی است که قابلیت هضم ژلاتین را که یکی از مهم‏ترین ترکیبات بافت غشای پایه است، دارد و تاکنون به‏عنوان یک مارکر سرطانی امید بخش برای بررسی وضعیت بیماران و پیشگیری از چندین سرطان شناخته شده است (24). افزایش میزان این آنزیم در پلاسما یا سرم بیماران در بسیاری از سرطان‏ها ازجمله: سرطان‏های پستان، روده، ریه، سر و گردن و معده گزارش شده است.

 

نتیجه­گیری

نتایج حاصله از این تحقیق نشان داد اثر کشندگی نانوذرات نقره برروی سلول‫ها بستگی به‏غلظت و زمان دارد. همچنین، ارزیابی بیان ژن MMP9 با انجام تست real time PCR در سطحmRNA  نشان داد که نانوذرات نقره منجر به کاهش معنادار در میزان بیان این ژن می‏شوند. بنابراین، استفاده  از این نانوذرات می‏تواند در مهار متاستاز سرطان روده بزرگ مورد توجه قرار گیرد.

 

تشکر و قدردانی

این مقاله حاصل پایان نامه نویسند اول است. بدین‏ وسیله از  شرکت دانش بنیان جاوید بیوتک و تمامی افرادی که در انجام این پروژه همکاری داشته اند، قدردانی می‏‫شود.

1. Senapati S, Syed A, Moeez S, Kumar A, et al. Intracellular synthesis of gold nanoparticles using alga Tetraselmis kochinensis. Mat Let. 2012; 79: 116-118.
 
2. Prasad TN, Kambala VSR, Naidu R. Phyconanotechnology: synthesis of silver nanoparticles using brown marine algae Cystophora moniliformis and their characterisation.  J. Applied phycol. 2013; 25(1): 177-182.
3. Cai F, Li J, Sun J, Ji Y. Biosynthesis of gold nanoparticles by biosorption using Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1.  Chem. Engin J. 2011; 75(1): 70-75.
4. Song JY, Jang HK, Kim BS. Biological synthesis of gold nanoparticles using Magnolia kobus and Diopyros kaki leaf extracts. Process. Biochem. 2009; 44(10): 1133-1138.
5. Vanaja M, Annadurai G. Coleus aromaticus leaf extract mediated synthesis of silver nanoparticles and its bactericidal activity. Applied Nanosci. 2013; 3(3): 217-223.
6. Rekha A, Arya V. Biological synthesis of silver nanoparticles from aqueous extract of endophytic fungus Aspergillus terrus and its antibacterial activity. Int J Nanomater Biostruc. 2013; 2: 35-39.
7. Crowe DL, Tsang KJ, Shemirani B. Jun N-Terminal Kinase 1 Mediates Transcriptional Induction of Matrix Metal loproteinase 9 Expression. Neoplasia. 2001; 3(1): 27-32.
8. Gruss C, Herlyn M. Role of cadherins and matrixins in melanoma. Curr. Opinion. in Oncology. 2001; 13(2): 117-123.
9. Egeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer. 2002; 2(3): 161-174.
10. Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Res. 2003; 92(8): 827-839.
11. Shandiz SAS, Shafiee Ardestani M, Shahbazzadeh D, Assadi A, et al. Novel imatinib-loaded silver nanoparticles for enhanced apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2017; 45(6):1082-1091.
12. Abbai R, Mathiyalagan R, Markus J, Kim YJ, et al. Green synthesis of multifunctional silver and gold nanoparticles from the oriental herbal adaptogen: Siberian ginseng. Int J Nanomed. 2016; 11: 3131-3143.
13. Wan G, Ruan L, Yin Y, Yang T, et al. Effects of silver nanoparticles in combination with antibiotics on the resistant bacteria Acinetobacter baumannii. Int J Nanomed. 2016; 11: 3789-3800.
14. Devi J, Bhimba B. Anticancer Activity of Silver Nanoparticles Synthesized by the Seaweed Ulva lactuca In vitro. Sci Rep. 2012; 1(4): 242.
15. Salehi S, Shandiz SAS, Ghanbar F, Darvish MR, et al. Phytosynthesis of silver nanoparticles using Artemisia marschalliana Sprengel aerial part extract and assessment of their antioxidant, anticancer, and antibacterial properties. Int J Nanomed. 2016; 11: 1835-1846.
16. Khatami M, Kharazi S, Kishani Farahani Z, Azizi H, et al. The anti-cancer effect of octagon and spherical silver nanoparticles on MCF-7 breast cancer cell line. Tehran Univ Med J. 2017; 75(1):72-76.
17. Mata R, Nakkala JR, Sadras SR. Biogenic silver nanoparticles from Abutilon indicum: Their antioxidant, antibacterial and cytotoxic effects in vitro. Colloid Surface B. 2015; 128: 276-86.
18. Williams DB, Carter CB. X-ray Spectrometry. Transmission Electron Microscopy. 2009; 581-603.
19. Kirman I, Jain S, Cekic V, Belizon A, et al. Altered Plasma matrix metalloproteinase-9/tissue metallpproteinase metalloproteinase 1 concentration during the early postoperative period in patients with colorectal cancer. Surg Endosc. 2006; 20(3): 482-486.
20. Emara M, Cheung PY, Grabowski K, Sawicki G, et al. Serum levels of matrix metalloproteinase-2 and-9 and conventional tumor markers (CEA and CA 19-9) in patients with colorectal and gastric cancers. Clin Chem Lab Med.  2009; 47(8): 993-1000.
21. Ławicki S, Zajkowska M, Głażewska EK, Będkowska GE. et al. Plasma levels and diagnostic utility of VEGF, MMP-9, and TIMP-1 in the diagnosis of patients with breast cancer. Onco Targets Ther. 2016; 9: 911-919.
22. Yulius S, Asroel HA, Aboet A, Zaluchu FJBMJ. Correlation of Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) expression and bone destruction in Chronic Suppurative Otitis Media (CSOM) patients with cholesteatoma at Adam Malik General Hospital Medan-Indonesia.  Bali Med J. 2018; 7: 195-200.
23. Baugh MD, Perry MJ, Hollander AP, Davies DR, et al. Matrix metalloproteinase levels are elevated in inflammatory bowel disease.  Gastroenterology. 1999; 117(4): 814-822.
24. Zucker S, Hymowitz M, Conner C, Zarrabi HM,  et al. Measurement of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in blood and tissues: clinical and experimental applications. Ann NY Acad Sci. 1999; 878: 212-227.