مقدمه

دانش نانوفناوری در قرن حاضر علم و زندگی روزمره انسان را تحت تاثیر قرار داده است (1و2). این دانش شاخه‏های مختلف زیست فناوری و علوم زیستی، پزشکی، شیمی، فیزیک، الکترونیک و علم مواد را شامل می‏شود و به‏دلیل شکستن محدودیت ها و قابلیت استفاده از نانوذرات در کاربردهای صنعتی، پزشکی و الکترونیک مانند کاتالیزور و درمان سرطان توجه بسیاری را به‏خود جلب کرده است (3). به‏طوری‏که یکی از جنبه‏های مهم در نانوفناوری سنتز نانومواد با اندازه، ویژگی های شیمیایی و ابعاد قابل کنترل در زیست شناسی است. در چند سال اخیر، تحقیقات برروی سنتز نانوذرات با واسطه‏ی گیاهان (سنتز سبز)، به‏سبب مزیت‏های بیشتر این روش نسبت به روش‏های دیگر بیولوژیکی، در حال پیشرفت می‏باشد. از مهم‏ترین مزایای سنتز سبز نانوذرات نسبت به روش‏های بیولوژیکی ، عدم نیاز به فرآیند پرزحمت و هزینه‏ی نگه‏داری کشت‏های سلولی و قابلیت استفاده‏ی این روش در مقیاس بزرگ و صنعتی می‏باشد. به‏علاوه گزارش شده که نانوذرات سنتز شده با استفاده از عصاره گیاهی، توسط لایه نازکی از مواد آلی داخل عصاره احاطه شده و بنابراین پایداری و ثبات این مواد تا 4 هفته بعد از سنتز حفظ می‏شود. در حالی‏که این زمان در روش‏های شیمیایی بسیار کوتاه بوده و نانوذرات پس از مدتی دوباره دور هم تجمع یافته و دیگر خواص ویژه خود را ندارند (4). در ﺑﻴﻦ اﻧﻮاع ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻧﺎﻧﻮذرات، ﻧﺎﻧﻮذرات ﻧﻘﺮه از ﻓﻮاﻳﺪ ﮔﺴﺘﺮده‏اى در زﻣﻴنه‏های ﻧﺎﻧﻮﻓﻨﺎورى، زﻳﺴﺖ ﻧﺎﻧﻮﻓﻨﺎورى و ﭘﺰﺷﻜﻰ ﺑﺮﺧﻮردارند. ﻧﺎﻧﻮذرات ﻧﻘﺮه داراى ﻛﺎرﺑﺮدﻫﺎى ﺑﺎﻟﻘﻮه اى در ﻋﺮصه‏ی ﻋﻠﻮم ﭘﺎﻳﻪ زﻧﺪﮔﻰ ﺑﺸﺮ به ویژه در ﭘﺰﺷﻜﻰ، ﺷﻴﻤﻰﻣﻮاد ﻏﺬاﻳﻰ، ﻋﻠﻢ ﭘﺰﺷﻜﻰ ﻗﺎﻧﻮﻧﻰ، ﻛﺸﺎورزى و ﻟﻮازم آراﻳﺸﻰ اﺳﺖ (5). در اﻳﻦ ﻣﻴﺎن، ﻣﻄﺎﻟﻌﺎت ﺑﻴﺎﻧﮕﺮ آن اﺳﺖ ﻛﻪ ﻧﺎﻧﻮذرات ﻧﻘﺮه اﺛﺮات ﺑﻴﺸﺘﺮى در ﺑﺮاﺑﺮ ﺑﺎﻛﺘری‏ها و ویروس‏ها از ﺧﻮد ﻧﺸﺎن می‏دﻫﻨﺪ (6).

سرطان بیماری بسیار پیچیده‏ای است که اغلب با به‏هم خوردن و از تنظیم خارج شدن تنظیمات هومئوستاتیک داخل و بین سلولی شروع می‏شود. در مراحل پیشرفته سرطان و متاستاز آن، بر هم خورن مسیرهای مولکولی، هضم ترکیبات ماتریکس سلولی و بر هم‫کنش سلول مهاجم با بافت هدف برای جایگزینی آن و متاستاز به بافت جدید لازم است (7). روش‏های درمانی فعلی برای سرطان عبارتند از شیمی درمانی، پرتودرمانی و جراحی می‏باشد. با این‫حال، این روش‫ها، ویژگی خاصی در مورد سرطان ندارند. بسیاری از محققین متوجه شده‏اند که ترکیبی از دو یا سه روش درمان اغلب نتایج درمانی موثر و بهتری نسبت به یک روش واحد تنها دارد. این در حالی است که در بیشتر موارد سلول‏های سالم نیز دچار مرگ می‏شوند و می‏تواند عوارض جانبی در بیمار به‏همراه داشته باشد. بنابراین نیاز به جستجو در شیوه‏های نوین درمانی برای کنترل سرطان ضروری می‏باشد. پیشرفت سرطان به‏طور بسیار شدیدی بقای بیمار را به‏خطر می‏اندازد و راهکارهای درمانی را با شکست مواجه می‏کند. برای تهاجم سلول‏های سرطانی، سلول‏های اپیتلیال باید به داخل بافت پایه نفوذ کنند و سد بستره خارج سلولی را از بین ببرند. در این مرحله، آنزیم‏های پروتئاز دارای نقش بسیار مهمی دارند که با هضم بستره خارج سلولی و ترکیبات آن باعث تسهیل متاستاز سلول های سرطانی به بافت‏های دیگر می‏شوند (7). تاکنون، به‫خوبی روشن شده است که سلول‏های توموری نسبت به سلول‫های سالم میزان پروتئاز بیش تری تولید می‏کنند و ارتباط مثبت بین میزان تهاجم سلول ها و سطح پروتئاز آن‏ها هم در مدل‏های تومور آزمایشگاهی و هم در تومورهای بالینی انسانی به اثبات رسیده است (8).  نقش کلی پروتئازها و به‏خصوص ماتریکس متالوپروتئینازها (MMPs) در متاستاز و  تهاجم سلول‏های توموری کاملا اثبات شده و مشخص شده که این آنزیم‫ها با تسهیل شکستن اتصالات بافت پیوندی و هضم ترکیبات ماتریکس خارج  سلولی به این فرآیند کمک می‏کنند (9). ماتریکس متالوپروتئینازها، خانواده‏ای از آنزیم‏های پروتئولتیک هستند که در هضم بسیاری از ترکیبات ماتریکس خارج سلولی و بافت غشا پایه ایفای نقش می‏کنند و از این لحاظ در فرآیندهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی دارای اهمیت هستند. از بین این گروه MMP-9 تنها عضو این خانواده است که به‏خاطر دارا بودن ساختار سه تائی فیبرونکتین قادر به اتصال و هضم کلاژن به‏عنوان مهم‫ترین ترکیب غشای پایه است و از این نظر تغییرات بیانی این ژن می‏تواند در سرطانی شدن سلول‏ها ومتاستاز سلول ها نقش مهمی داشته باشد (10) .بر این اساس در این مطالعه به ‏بررسی اثر سمیت نانو ذرات نقره سنتز شده به‏روش زیستی بر روی سرطان کلون (HT29) و ارزیابی بیان ژن ماتریکس متالوپروتئیناز 9 (MMP9) پرداخته شد.

مواد و روش‌ها

سنتز نانوذرات نقره: در این مطالعه تجربی سنتز نانو ذرات نقره از روش رسوب‏گذاری با احیای یون‏های نقره طبق روش کار مقاله‏ای که قبلا گزارش شده بود (11)، انجام گرفت. به‏منظور بیوسنتز نانو ذرات نقره، با افزودن 6 میلی‫لیتر از حجم عصاره آبی برگ گیاه اکالیپتوس به 100 میلی‫لیتر نیترات نقره (مرک، آلمان) با غلظت 01/0 میلی‫مولار تحت شرایط همزدن و دمای آزمایشگاه در مدت زمان یک ساعت از زمان واکنش انجام گرفت. بیوسنتز نانوذرات نقره با تغییر رنگ واکنش مشاهده شد. به‏منظور شستشو و خالص سازی نانوذرات، مخلوط حاصل سه بار با آب مقطر درrpm  13000 دور بر دقیقه به‏مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شدند. به‏منظور  مشخصه یابی،  دو تا سه قطره از نانوذرات نقره سنتز شده را سونیکه نموده و بر روی توری مسی پوشش داده شده با کربن قرار داده  و بعد از خشک شدن، تصویر آن با کمک میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) تهیه شد.

روش MTT: در روش MTT به‏بررسی زنده ماندن یا عدم زنده ماندن سلول‏ها در چرخه‏ی تنفسی میتوکندریایی پرداخته شد. برای این منظور رده‏‌ی سلولی HT29 از انستیتو پاستور ایران تهیه شد و در محیط کشت RPMI1640 مکمل شده با ١٠ درصد سرم FBS کشت داده شدند. سلول‏های  HT29برای مطالعات       in vitro در مورد سرطان کولون سودمند می‏باشد، زیرا این رده سلولی چندین مشخصه‏ی اپی‫تلیوم پستانداران را داراست. علاوه ‏بر این، در هنگام رشد در شرایط in vitro، این رده سلولی توانایی تشکیل توده و رشد به‏صورت لایه‏ای را دارا می باشد. سپس، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در یک اتمسفر مرطوب با غلظت ٥ درصد CO₂ در فلاسک کشت سلولی نگه‏داری شدند. سلول‏ها از فلاسک جمع‏آوری شدند و پس از افزودن محیط کشت، سوسپانسیون سلولی به‫هر خانه از پلیت 96 خانه‏ای با حجم 100 میلی‫لیتر از سوسپانسیون سلولی و میزان 10 هزار سلول منتقل شد و در شرایط کشت انکوبه شد. پس از گذشت 24 ساعت، محیط کشت تخلیه شد و نانوذرات نقره با غلظت‌‏های 2/31، 5/62، 125، 250 و 500 میکروگرم بر میلی‫لیتر به‏هر چاهک اضافه شد. گروه شاهد در این تست، چاهک‫های حاوی سلول‏های تیمار نشده در نظر گرفته شد. پس از پایان انکوباسیون، مقدار 10 میکرولیتر رنگ MTT (نمک تترازولیوم) با غلظت 5 میلی­گرم بر میلی­لیتر در تاریکی به‏هر چاهک افزوده شد و انکوباسیون به‏مدت 4 ساعت انجام گرفت. سپس به‏هر چاهک، مقدار 100 میکرولیتر دی‏متیل‏سولفوکساید Dimethyl Sulfoxide (DMSO) اضافه شد. جذب نوری نمونه ها با کمک دستگاه قرائت گر الایزا و در طول موج 570 نانومتر ثبت شد. نتایج برحسب درصد سلول‫های زنده تیمار شده نسبت به تیمار نشده، از رابطه‏ی زیر محاسبه شد:

100´(جذب نوری سلول‏های تیمار نشده/جذب نوری سلول‏های تیمار شده با نانوذرات)= درصد سلول‏های زنده

Real time PCR: به‏منظور انجام real time PCR، استخراج RNA و سنتز cDNA انجام گرفت. استخراج RNA های کل سلول از کیت (Transgen Biotech ER101-01) استفاده شد و تمامی مراحل طبق دستورالعمل کیت انجام شد. جهت سنتز cDNA نیز از کیت (Transgen BiotechAE301-02) استفاده شد و تمام مراحل طبق دستورالعمل کیت انجام گرفت. برای این منظور ،1 میکروگرم از  RNAبه میکروتیوب عاری از RNase وارد نموده و 1 میکرولیتر آنزیم DNaseI و 1 میکرولیتر بافر این آنزیم به آن اضافه گردید و در دمای 37 درجه سانتی‫گراد به‏مدت 30 دقیقه انکوبه شد. در نهایت جهت غیر فعال کردن آنزیم DNaseI، 1 میکرولیتر از محلول EDTA 50 mM به آن افزوده شد و در دمای 65 درجه سانتی‫گراد به‏مدت 10 دقیقه قرار گرفت. به‏منظور بررسی میزان بیان ژن‏های مورد نظر، تکنیک real time PCR با روش SYBR Green و با استفاده از کیت شرکت تاکارا (PrimeScriptTM RT Reagent Kit با کمک دستگاه   ABIساخت کشور امریکا انجام شد. واکنش Real Time PCR  با هدف به‫دست آوردن سیکل آستانه )چرخه‏ای که در آن، سیگنال فلئورسنت دریافتی، از سیگنال زمینه بیشتر شود)  و میزان تغییرات بیان ژن‏ها انجام گرفت. مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش شامل 1 میکرولیتر cDNA (50 نانوگرم)، 2 میکرولیتر پرایمر (200 نانومولار)، مسترمیکس سایبرگرین 10 میکرولیتر و آب دیونیزه 7 میکرولیتر بود. برنامه دمایی- زمانی دستگاه به‏صورت95 درجه سانتی‏گراد به‏مدت ده دقیقه، 95 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 15 ثانیه (دناتوراسیون موجود در چرخه)، 60 درجه سانتی‏گراد به‏مدت یک دقیقه( جهت اتصال پرایمر) و 72 درجه سانتی‏گراد جهت ساخت رشته انتهایی انجام گرفت. واکنش real time PCR را برای هر نمونه سه بار تکرار انجام گرفت. علاوه براین، گروه کنترل منفی تست(NTC)  آماده شد که در آن تمام مواد به‏غیر از الگو (cDNA) افزوده شد. در مرحله بعد آنالیز نتایج Real Time PCR با استفاده از روش Ct ∆∆ طبق فرمول‏های زیر صورت گرفت:

∆Ct=Ct _target-Ct_reference

∆∆Ct = ∆Ct T - ∆Ct C     RQ=2 ^-∆∆Ct

در این فرمول CtT∆ اختلاف بین سیکل‏های آستانه ژن هدف و شاهد داخلی در نمونه مورد آزمون وCt control∆ نیز اختلاف میان سیکل‏های آستانه ژن هدف و شاهد داخلی در نمونه کنترل می‏باشد. این روش کارایی پرایمرها را کامل در نظر گرفته، به ‏این‏صورت که میزان محصول در تمام سیکل‏ها دو برابر می باشد.

روش توصیف و تجزیه تحلیل داده‏ها: به‏منظور تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم افزار SPSS نسخه ١٩ استفاده شد و جهت تعیین اختلاف معنی‌داری بین میانگین تیمارهای به‏کار گرفته شده از تجزیه واریانس(ANOVA) و بر اساس 05/0p<  محاسبه شد.

نتایج

تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری نانوذرات نقره سنتز شده با عصاره گیاه در شکل 1 نشان داده شده است.

شکل1: تصویر میکروسکوپی الکترونی گذاره (TEM) از نانوذرات نقره استفاده شده در این مطالعه

با توجه به نتایج میکروگراف الکترونی نانوذرات نقره مشخص شد که میانگین اندازه آن‫ها 22 نانومتر بوده و غالبا به‏شکل کروی دیده می‏شوند. بررسی میزان بقا سلولی با استفاده از روش MTT نشان داد که نانوذرات نقره ، تکثیر سلول‏های HT29 را به‏صورت وابسته به‏دوز و زمان در 24 ساعت کاهش می‏دهند (شکل 2).

شکل 2: درصد بقای سلول‏های  HT29در برابر غلظت‏های مختلف نانوذرات نقره  در مدت زمان 24 ساعت; نتایج به‏صورت درصد بقا در مقایسه با نمونه‏های شاهد گزارش شده است (*:05/0­p<­، **، 01/0p<، *** 001/0p< : n=3). (غلظت‏ها بر حسب میکرو گرم در میلی‏لیتر می‏باشند)

به‏طوری‏که بیشترین مهار تکثیر در غلظت 500 میکروگرم در میلی‏لیتر بوده که از لحاظ آماری معنی‏دار بود (001/0p<). این درحالی بود که غلظت  2/31 میکروگرم در میلی‫لیتر نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی‏داری را نشان نداده و از نظر آماری معنی‏دار نبوده است. تغییرات ریخت‫شناسی سلول‏های تیمار شده با غلظت‫های مختلف نانوذرات نقره نیز انجام گرفت. همان‏طور که در شکل 3 مشخص است، در غلظت‏های بالاتر، سلول‏ها یکپارچگی غشایی آن‏ها از بین رفته و به‏سمت واکوئله شدن پیش رفته‏اند که از نشانه‏های مرگ سلولی می‏باشد.

شکل3: تغییرات ریخت شناسی سلول‫های سرطان کولون HT29 در پلیت‫های گروه کنترل (a) غلظت‫های 5/62 (b)، 125 (c) 250 (d) و 500 (e) میکروگرم بر میلی لیتر تیمار شده با نانوذرات نقره. همان‫طور که مشخص است، در غلظت‫های بالاتر، سلول‫ها یکپارچگی غشایی آن‫ها از بین رفته و به‫سمت واکوئله شدن پیش رفته‫اند که از نشانه‫های مرگ سلولی می‫باشد.

تغییر در بیان ژن MMP9 در سلول‏های HT29 تیمار شده با نانوذرات نقره با استفاده از روش real Time PCR بعد از 24 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. نسبت بیان ژن MMP9 به ژن مرجع در رده سلولی تیمار شده

به‏میزان 006/0±8497/0 کاهش یافت که نشان دهنده تاثیر مثبت این نانوذرات در کاهش بیان ژن MMP9 می‏باشد (شکل 4).

شکل 4: میزان بیان ژن MMP9 نسبت به گروه کنترل:  نسبت بیان ژن MMP9  به ژن مرجع GAPDH در رده سلولی سرطان روده بزرگ تیمار شده به‫میزان 4897/0 کاهش طی 24 ساعت مشاهده شد.