مقدمه

جمسیتابین (Gemcitabin) از جمله داروهای ضدسرطان می‏باشد که در درمان سرطان ریه سلول‫های غیر کوچک، کارسینومای پانکراس، تومورهای جامد، سرطان خون، سرطان مثانه، سرطانه سینه و سرطان تخمدان استفاده می‏شود (1،2). این دارو در مقادیر کم پس از فعال شدن توسط کیناز، با مهار آنزیم DNA پلیمراز سبب مهار سنتز DNA، (3) توقف چنگال همانندسازی در فاز S و نگه‫داری سلول‫ها در فاز G₁ می‏‫شود (4)، در حالی‏که در مقادیر بالا سبب توقف تمامی فازهای چرخه سلولی و در نهایت آپوپتوزیس می‫شود (5).

مطالعات مختلف تائید کننده اثرات مهاری این دارو در رشد و تکثیر سلول‫ها می‏باشند. به‏عنوان مثال اثر جمسیتابین به‏تنهایی و در ترکیب با پوشش لیپوزومی بر سلول‫های تیروئید آناپلاستیک انسانی نشان‏دهنده اثر سمیت این دارو پس از 48 و 72 ساعت انکوباسیون بود. نرخ مرگ و میر سلول‫ها پس از 72 ساعت، 6/4 و 9/7 برابر نسبت به نمونه‫های کنترل به‏ترتیب برای دارو و داروی لیپوزومی گزارش شد (6). در بررسی دیگر اثر جمسیتابین به‏تنهایی و در ترکیب با سورافنیب (یک مولتی کیناز مهاری) بر سلول های سرطانی NSCLC (PC-9 و A5490) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج MTT نشان دهنده عملکرد ضد تکثیری بر هر دو رده‏ی سلولی وابسته به غلظت سورافنیب و جمسیتابین بود. از طرفی حساسیت هر دو رده‫ی سلولی به سورافنیب و جمسیتابین یکسان ارزیابی شد. همین سلول‫ها پس از 72 ساعت تیمار با جمسیتابین و سورافنیب جهت بررسی تغییرات چرخه سلولی با فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفتند. سورافنیب سبب افزایش سلول‫ها در فاز G₀/G₁ شد در حالی‏که سلول‏های در معرض جمسیتابین در فاز S تجمع یافتند (8،7).

هورمون رشد انسانی یک پروتئین با اثرات پیشبرنده رشد است که اثرات خود را به‏صورت مستقیم از طریق گیرنده‏ها در بافت‏ها و یا از طریق تحریک ترشح سایر عوامل رشد می‏گذارد. هورمون رشد از هیپوفیز قدامی ترشح شده و  سپس وارد جریان خون می‫شود و به گیرنده‫های سطح سلول متصل و سبب فعال شدن مسیر GHR/JAK2 می‫شود. این هورمون دارای عملکردهای مختلفی از جمله ایجاد تعادل مثبت نیتروژن و سنتز پروتئین در سلول های عضلانی، بازجذب اسید آمینه به عضله‏ی اسکلتی و تنطیم رشد طولی استخوان‏ها می‏باشد (9،10).

اثرات بهبود دهنده هورمون رشد نیز همواره مورد علاقه محققان بوده و تحقیقات مختلفی در رابطه با اثرات این هورمون بر تکثیر سلول‫ها به‫عنوان عامل حفاظت کننده و کاهش دهنده اثرات عوامل تخریب‏گر صورت گرفته است. دانشمندان در دانشگاه UQ به ‏بررسی اثرات هورمون رشد بر رده سلولی BaFB2B2  بر پایه‏ی تکثیر گیرنده‏های سطح هورمون رشد پرداختند. نتایج نشان داد، این هورمون تاثیرات به‏سزایی در افزایش روند تکثیر دارد و در رده سلولی ذکر شده، حدود 6000 گیرنده در سطح هر سلول برای هورمون رشد وجود دارد (11). در مطالعه‏ای دیگر در رده سلولی Ba/F3 نیز مشخص شد که هورمون رشد انسانی درغلظت‏های 1 و 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر سبب تحریک تکثیر سلولی، بهبود زخم و افزایش مهاجرت سلولی می‫شود (12).

هورمون رشد منجر به پیشبرد چرخه‫ی سلولی و کاهش تعداد سلول‏های مانا در فازهای G₀/G₁ می‏شود. همچنین مطالعات بسیاری نشان داده است که میزان گیرنده‏های این هورمون در سطح سلول‏های سالم حدود 5 برابر سلول‏های سرطانی می‫باشد. از سوی دیگر مشخص شده است که برخی از سلول‏های سرطانی در فاز G₀ هستند و این نوع عمدتا سبب متاستاز شدیدی و تشدید بیماری می‏شوند، در حالی‏که کمتر تحت تاثیر اثرات مهاری داروهای شیمی درمانی قرار می‏گیرند. به‏همین دلیل برخی پیشنهاد می‏کنند که به‏دلیل اثرات تحریکی هورمون رشد جهت پیشبرد چرخه سلولی و تاثیرات اثبات شده آن در خروج سلول‫ها از فاز G₀، بهتر است جهت افزایش اثر بخشی داروهای شیمی درمانی از هورمون رشد به‏عنوان داروی تکمیلی در روند درمان بیماران استفاده شد (13،14).

هدف از این مطالعه بررسی اثر تکثیری و چرخه سلولی هورمون رشد انسانی و جمسیتابین بر سلول‏های فیبروبلاستی به‏تنهایی و در ترکیب با یکدیگر می باشد. این قبیل مطالعات کمک شایانی در زمینه بهبود اثرات جانبی داروهای ضدسرطانی در بیماران می‏نماید.

مواد و روش‌ها

آزمون MTTو تیمار سلو‫‫‫ل‫ها با هورمون رشد و جمسیتابین: روش MTT یک روش رنگ سنجی است که بر اساس احیا و شکسته شدن کریستال‏های زرد رنگ تترازولیوم توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز و تشکیل کریستال‏های آبی رنگ نامحلول انجام می‏شود. در طی زمان انکوباسیون MTT، توسط سیستم سوکسینات دهیدروژناز سلول‏ها که یکی از آنزیم‏های چرخه‏ی تنفسی میتوکندری‏هاست احیا می‏شود. احیا و شکسته شدن این حلقه موجب تولید کریستال‏های آبی رنگ فورمازان می‏شود که در زیر میکروسکوپ به‏راحتی قابل تشخیص هستند. میزان رنگ تولید شده در 492 نانومتر با تعداد سلول‏های زنده رابطه‏ی مستقیم دارد.

کشت سلول‫های فیبروبلاست در محیط کشت DMEM  (Gibco)  با FBS 10درصد در انکوباتور با CO₂، 5 درصد و رطوبت 90 درصد و دمای 37 درجه سانتی‫گراد انجام شد.

میزان LC₅₀ داروی جمسیتابین ( (Ireland, Actavis در مطالعات اولیه به‫طور تقریب 150میکروگرم بر میلی‫لیتر تعیین شد.  جهت انجام آزمون MTT ابتدا سلول‏ها (100000 سلول) در پلیت‏های 96 خانه‏ای کشت شدند و پس از چسبیدن سلول‫ها، محیط کشت با محیط جدید حاوی هورمون رشد (Genotropin®) )با غلظت‏های مختلف (10، 20، 40، 60، 80، 120، 160، 240، 300، 360 و 400 نانوگرم بر میلی‫لیتر) جایگزین و تیمار به‏مدت 24 و 48 ساعت انجام شد. آزمایش‫های جمسیتابین نیز به‏همین ترتیب با غلظت‏های  (1، 5، 10، 50، 100 نانوگرم بر میلی‫لیتر) صورت پذیرفت. در آزمایش‫ها که هر دو عامل تیمار شدند. غلظت های مرتبط با جمسیتابین مطابق موارد ذکر شده در فوق در سه سری افزوده شد. دسته اول به‏عنوان کنترل و دسته دوم با غلظت 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر و سوم با غلظت 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر هورمون رشد انسانی تیمار شدند  )انتخاب دو غلظت از هورمون رشد انسانی پس از انجام آزمایش‫های اولیه بر هورمون رشد به‏تنهایی و تعیین غلظت مناسب صورت گرفت تا از پیچیدگی آزمایش‫ها جلوگیری شود). پس از گذشت زمان‏های مورد نظر، به‏هر چاهک 10 میکرولیتر محلولMTT  (غلظتmg/ml  5) (Sigma, USA) اضافه شد. پس از 4 ساعت محیط روئی خارج و با DMSO  (Merck,USA) جایگزین شد. در نهایت جذب نمونه‏ها در 492 نانومتر در دستگاه الایزا ریدرStat Fax-2100 model) Spain ) قرائت شد (15). توان زیستی سلول‏های تیمار شده با دارو (در هر غلظت از دارو) به‏شکل نسبت درصد جذب نوری فورمازان تولیدی در نمونه در مقایسه با میزان جذب نوری فورمازان تولیدی در کنترل (سلول‫های بدون تیمار دارویی) تعیین و در یک منحنی دوبعدی ترسیم شد. نمونه کنترل شامل سلول‏ها به‏همراه محیط کشت بود.

آنالیز نمونه‏ها با استفاده از فلوسایتومتری: جهت آنالیز سلول‏ها با روش فلوسایتومتری لازم است سلول‏ها کاملا به‏صورت تک تک باشند. به ‏این ‏معنی که هیچکدام به‏هم نچسبیده باشند. سلول‏های فیبروبلاست از دید کشت سلولی، در رده سلول‏های چسبان قرار می‏گیرند. برای به‏کارگیری روش فلوسایتومتری در این گونه سلول‏ها، نخست می‏بایست آن‫ها را از کف فلاسک دارای محیط کشت جدا کرد و آنگاه با پیپتاژ شدید با کمترین آسیب به سلول‏ها آن‫ها را به‏صورت تک در آورد. سلول‫های رنگ‫آمیزی شده برای آنالیز به‏درون کووت‫های ویژهای ریخته شده، درون دستگاه جای می‏گیرند.

پروپیدیوم یداید رنگدانه‫ای می‏باشد که قادر به برهم کنش با DNA سلول‫های مرده می‫باشد و از این خاصیت می‏توان با استفاده از فلوسایتومتری به درصد سلول‫های مرده پی برد. چرا که این DNA سلول‫ها با پرویدیوم یداید برهم کنش داده و از خود نور فلورسانس تابش می‏کنند. در این تحقیق، با به‏کارگیری PI و دستگاه فلوسایتومتر محتوای DNA سلولی سنجیده شد و از روی این محتوا و با توجه به نمودار به‫دست آمده توسط نرم افزار مخصوص درصد سلول‫ها در فازهای مختلف چرخه سلولی حاصل شد (16). ابتدا در هر چاهک از پلیت‫های شش تائی 5/0 میلیون سلول به‏مدت 48 ساعت در محیط کشت، کشت داده شد. سپس محیط پیشین با محیط جدید حاوی FBS 1 درصد جایگزین شد و غلظت‫های موثر هورمون رشد و داروی جمسیتابین به‏هر چاهک اضافه شد و تیمار به‏مدت 48 ساعت ادامه یافت. در نمونه‏های کنترل هورمون رشد و جمسیتابین افزوده نشد. غلظت‏های تیمار به‏شرح زیر بود:

هورمون رشد 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 150میکروگرم بر میلی‫لیتر،  هورمون رشد 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر+ جمسیتابین 150میکروگرم بر میلی‫لیتر، هورمون رشد 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 400 میکروگرم بر میلی‫لیتر، هورمون رشد 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر + جمسیتابین 400 میکروگرم بر میلی‫لیتر.

سلول‏ها پس از سپری شدن مدت زمان لازم تریپسینه شدند. به رسوب سلولی 500 میکرولیتر PBS افزوده شد و

به سوسپانسیون حاصل اتانول 70 درصد اضافه شد.

سلول‏ها،  سپس با رنگ پروپیدیوم یدید (PI) رنگ آمیزی و با دستگاه فلوسایتومتری (بکتون دیکینـسون(Dickinson-Becton) )، آنالیز شدند وDNA  سلولی سنجیده شـد. از سنجش DNA می‏توان تعداد سلولها در مراحل گوناگون را به‏دست آورد که معیاری جهت پی بـردن به‏طول چرخه سلولی و تغییرات آن می‏باشد. داده های حاصل ازدستگاه با نرم افزار Flowj آنالیز می‏شدند.

آزمون خراش:در هر چاهک از پلیت های شش تائی 5/0 میلیون سلول به‏همراه محیط کشت و FBS 10 درصد اضافه شد. پس از سپری شدن 24 ساعت با سر اسکالپر به‏صورت قطری خراشی در تمامی چاهک‏ها ایجاد شد. سپس سلول‏های با بافر PBS شستشو داده شدند و سلول‏ها با محیط (حاوی FBS 1 درصد) حاوی غلظت‏های 80 و 160 میکروگرم بر میلی‫لیتر هورمون رشد و 200 میکروگرم بر میلی‫لیتر دارو تیمار شدند و یک خانه به‏عنوان کنترل بدون دارو در نظر گرفته شد. سپس  هر از نمونه‏ها در زمان صفر و پس از تیمار 24 ساعت با دوربین عکس‫برداری شد. به‏طور کلی میزان بسته شدن خراش به‏صورت کیفی با پوشاندن محل خراش توسط سلول‏ها بررسی شد (17).

آنالیز آماری

 تمامی آزمایشات با سه بار تکرار بـه انجـام رسـید و داده‏های گزارش شده، نشان دهنده میانگین این سه با افـزایش و کـاهش انحراف معیار است. جهت محاسبه میانگین، انحراف معیار و ضریب همبستگی از نـرم افـزار SPSS  استفاده شد که داده‫های با مقادیر احتمال 05/0>p معنی‏دار در نظر گرفته شد.

نتایج

تاثیر هورمون رشد انسانی بر روند تکثیر سلو‫ل‫ها با استفاده از روش رنگ سنجی MTT

در این پژوهش نیز به‏منظور انجام این روش مطابق آنچه در مواد و روش‫ها ذکر شد سلول‏ها با هورمون رشد انسانی در غلظت‏های ذکر شده تیمار شدند و میزان بقا سلول‏ها اندازه‫گیری شد. نتایج در شکل 1 نشان داده شده است. همان‏گونه که در شکل 1 دیده می‏شود به‏طور کلی می‏توان گفت با افزایش غلظت هورمون رشد تا مقادیر   400 نانو‫گرم بر میلی‏لیتر رشد سلول‏ها نیز افزایش می‏یابد. در زمان 24 ساعت این هورمون تا  غلظت 60 نانو گرم بر میلی‏لیتر تاثیر چندانی بر میزان تکثیر سلول‫ها ندارد (05/0<p). اما پس از این میزان تکثیر سلولی متناسب با غلظت هورمون دیده می‏شود (01/0>p). مقادیر کم هورمون (کمتر از50 نانو گرم بر میلی‏لیتر) در زمان 48 ساعت تاثیر خود بر تکثیر سلولی را القا می‏نمایند. با توجه به‏این‫که میزان FBS محیط 1 درصد بود، بنابراین می‏توان گفت تنها عامل تحریک کننده تکثیر هورمون رشد می‏باشد. با توجه به‏نتایج می‏توان گفت غلظت‫های تاثیر گذار از 80 تا 400 نانو گرم بر میلی‏لیتر می‏باشد و بهترین زمان تاثیر برای این شرایط 48 ساعت می‏باشد. آزمایش‫ها تا 72 ساعت و 96 ساعت نیز انجام شد که رشد سلول‫ها در این زمان‫ها به‏علت کمبود محیط و فضا جهت تکثیر متوقف شده بود. بنابراین سایر آزمایشات در زمان 48 ساعت و در دو غلظت 80 و 160 نانو‫گرم بر میلی‏لیتر صورت گرفت.

شکل 1:تاثیر هورمون رشد انسانی نوترکیب با استفاده از آزمون MTT برسلول­های فیبروبلاست در زمان­های مختلف.

بررسی تاثیر داروی جمسیتابین و هورمون رشد با استفاده از روش MTT

با توجه به مشخص شدن قدرت تکثیر هورمون رشد انسانی در غلظت‫های بالاتر از 80 نانو گرم بر میلی‏لیتر، در مرحله بعد تصمیم بر آن شد که از داروی جمسیتابین به‏صورت همزمان با هورمون رشد نیز استفاده شد. هدف از انجام این آزمایش این بود که مشخص گردد استفاده از هورمون رشد انسانی تا چه میزان می‫تواند تاثیرات سو، جانبی داروهای شیمی درمانی را کاهش دهد. بدین منظور ابتدا سلول‫های فیبروبلاست با غلظت‏های مختلف جمسیتابین تیمار شد تا تاثیر دارو در زمینه مهار رشد سلول‫های طبیعی اثبات شد. نتایج در شکل 2 نشان داده شده است. همان‫طور که در این شکل دیده می شود با افزایش غلظت جمسیتابین میزان رشد سلول‫ها کاهش می‫یابد و افزایش غلظت این دارو تا حد زیادی سبب مرگ سلول‫ها نیز می‫شود. با افزایش غلظت دارو از200 نانوگرم بر میلی‫لیتر تاثیرات کشندگی چندان افزایش معنی‫داری نداشته اند (05/0<p).

در مرحله بعد تاثیر هورمون رشد انسانی در غلظت های  160 نانوگرم بر میلی‫لیتر  و 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر در کشت همزمان با جمسیتابین با استفاده از روش MTT مورد بررسی قرار گرفت. همانگونه که در شکل 2 دیده می‫شود هورمون رشد توانسته است میزان مرگ و میر ناشی از داروی جمسیتابین را کاهش دهد. در این زمینه غلظت 160 نانوگرم بر میلی‫لیتر هورمون رشد تاثیرات شاخص‫تری اعمال نموده است.

شکل 2: تاثیر داروی جمسیتابین به‫تنهایی و در حضور هورمون رشد با غلظت­های 160 و 80 نانوگرم بر میلی‫لیتر با استفاده از آزمون MTT برسلول­های فیبروبلاست در غلظت­های مختلف.

آزمون خراش

در این بخش جهت انجام آزمون خراش از غلظت‫های 80 و 160 نانوگرم بر میلی‏لیتر هورمون رشد و دارو در غلظت 200 نانوگرم بر میلی‏لیتر به‏عنوان غلظت میانی استفاده شد. یک نمونه نیز تحت تاثیر دارو به‏تنهایی قرار گرفت. سپس از هر نمونه در محل خراش در لحظه صفر و 24 ساعت بعد از خراش با دوربین متصل به میکروسکوپ عکس‫برداری شد. مهاجرت سلولی به‏درون فضای خراش در ساعت‏های مذکور با کاهش فاصله میان دو لبه تعیین شد. به‏طور کلی میزان بسته شدن خراش به صورت کیفی مشاهده گردید. نتایج در شکل 3 نشان داده شده است.

شکل 3:  آزمون خراش سلولی A) نمونه کنترل B) نمونه جمسیتابین با غلظت 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر C) نمونه جمسیتابین با غلظت 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر میکروگرم بر میلی‏لیتر و هورمون رشد با غلظت80 نانوگرم بر میلی‏لیتر  D) نمونه جمسیتابین با غلظت 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر و هورمون رشد با غلظت 160 نانوگرم بر میلی‏لیتر

نتایج نشان دهنده‏ی آن است که پس از 24 ساعت سلول‫ها که در پاساژ دوم بودند در هر دو غلظت هورمون رشد مهاجرت را نشان دادند. اما سلول‫ها در معرض جمسیتابین مهاجرتی نداشته‏اند. میزان مهاجرت سلولی با افزایش غلظت هورمون رشد افزایش یافته بود.

مطالعات چرخه سلولی با استفاده از فلوسایتومتری

برای نمایش شمار سلول‏ها در مراحل گوناگون چرخه سلولی باید هیستوگرام پروفایل DNA نسبت به شمار سلول‫هـای رنگ آمیزی شده با پروپیدیوم یدید را رسم نمود (شکل4). در این نمودار دو قله وجود دارد. از آنجاکه بیشتر سلول‏ها در مراحل G₀ و G₁ هستند پس قله

‏

نخست که بیشینه‏ای را در شـمار سلول‏ها نشان می‏دهد، نشان‏دهنده این مرحله از چرخه سلولی است.

شکل 4:هیستوگرام طبیعی DNA که سلول‫ها در اتانول فیکس شده‫اند و با پروپیدیوم یدید رنگ آمیزی شده‫اند.

قله دوم که کوتاه‫تر از قله پیشین است، سلول‏هایی را کـه در مراحل G₂ و M هستند نمایش می‏دهد. بخشی از نمودار که در میان این دو جـای مـی‏گیـرد نـشان دهنـده مرحلـه S می‏باشد (18).

نتایج حاصل از نمودارهای هیستوگرامی فلوسایتومتری در جدول 1 آورده شده است. مطابق نتایج موجود در جدول، هورمون رشد در غلظت‏های 80 نانوگرم بر میلی‏لیتر و 160 نانوگرم بر میلی‏لیتر بر سلول‫های فیبرو‫بلاست‏ به‏ترتیب باعث کاهش حدودا 23/3 و 54/2 درصدی این سلول‫ها در فازG₁  نسبت به کنترل شد (05/0>p). اعمال هورمون رشد در همین غلظت‏ها بر سلول‏‏های فیبرو‫بلاست به‫ترتیب باعث افزایش 97/4 و 14/2 درصدی سلول‏ها در فاز S می‏شد (05/0>p). این تغییرات در غلظت 160 نانوگرم بر میلی‏لیتر هورمون رشد نسبت به غلظت 80 نانوگرم بر میلی‏لیتر بیشتر می‏باشد. نتایج مربوط به فازG₂  در غلظت 160 نانوگرم بر میلی‏لیتر هورمون رشد نشان‏دهنده افزایش 03/2 درصدی این سلول‫ها نسبت به کنترل می‏باشد (05/0>p).

اما در غلظت 80 نانوگرم بر میلی‏لیتر اختلاف معنی‫داری نسبت به کنترل حاصل نشد. داروی جمسیتابین نیز در غلظت‏های 150، 200 و 400 میکروگرم بر میلی‏لیتر اعمال شد، نتایج فلوسایتومتری در فاز G₁ تغییرات شدیدی را در حضور دارو نسبت به نمونه کنترل نشان داد و سبب افزایش تعداد سلول‏ها در فاز G₁ به‏صورت وابسته به دوز در این فاز نسبت به نمونه کنترل شد (05/0>p). از طرفی نتایج مربوط به فازS  در همین غلظت‏ها نشان دهنده کاهش قابل ملاحظه سلول‏ها در فاز S نسبت به کنترل می‏باشد (05/0>p). نتایج مربوط به فاز G2 در غلظت 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر داروی جمسیتابین اختلاف معنی‏داری با کنترل نشان نداد، اما در غلظت‏های 200 و 400 میکروگرم بر میلی‏لیتر کاهش معنی‏داری را نشان داد (05/0>p).

جدول 1: درصد سلول­های فیبروبلاست در مراحـل گونـاگون چرخـه سلولی پس از تیمـار بـا جمسیتابین و هورمون رشد انسانی.