نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم وتحقیقات تهران، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، تهران، ایران
2 دانشگاه الزهرا، پژوهشکده زنان، گروه بیومدیکال، تهران، ایران
3 دانشگاه علوم پزشکی تهران، مرکز تحقیقات غدد درون ریز و متابولیسم، گروه مدلسازی مولکولی، تهران، ایران
4 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، دپارتمان ژنتیک پزشکی، تهران، ایران
چکیده
هدف: در مطالعه حاضر به بررسی امکان مفید بودن آستاگزانتین در مدل موشی بیماری MS، آنسفالومیلیت تجربی خود ایمن (EAE) پرداخته شده است.
مواد و روشها: بیماری EAE با استفاده از پپتید MOG35-55 و ادجوانت کامل فروند (CFU) در موشهای ماده C57BL/6 القا شد. موشها در گروه کنترل نرمال، گروه بیمار، گروه پیشگیری دریافت کننده آستاگزانتین 21 روز قبل از القا بیماری و گروه درمانی که پس از ایمونیزاسیون و با شروع علائم بیماری، آستاگزانتین را دریافت کردند، قرار گرفتند. هر گروه شامل 8 راس موش بود. مصرف آستاگزانتین تا 35 روز پس از ایمونیزاسیون ادامه یافت و هر روز بهمقدار 4/0 درصد وزن پلت مورد مصرف (حدود 400 میلیگرم) آستاگزانتین مصرف میشد. سپس میزان تکثیر سلولی بهوسیله آزمون MTT، میزان تولید اینترلوکین 6 و اینترلوکین یک بتا سرم خونی به وسیله ELISA سنجیده شد. علاوه بر این بافت های نخاع نیز بهمنظور ارزیابیهای ایمونوهیستوپاتولوژی مطالعه شدند.
نتایج: بر اساس نتایج بهدست آمده مصرف آستاگزانتین منجر به بروز پیامدهای بالینی و آسیب شناختی مناسبی شده بهطوریکه منجر به کاهش تولید سایتوکاینهای پیش التهابی IL1β ، IL6 شد (0001/0 (p <مطالعات ایمونوهیستوپاتولوژی نیز کاهش ارتشاح لکوسیتها را در بافت نخاع گروههای تجربی نشان دادند.
نتیجهگیری: در مجموع ممکن است که این رهیافت دارویی بهعنوان یک استراتژی سودمند در پیشگیری و درمان بیماری مالتیپل اسکلروز مطرح شد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Study of the preventive and therapeutic effects of astaxanthin carotinoids on Multiple Sclerosis (MS) Disease in C57BL/6 Mice
نویسندگان [English]
- S Bidaran 1
- P yaghmaie 1
- A Ahmadi 2
- A Ebrahim Habibi 3
- MH Sanati 4
1 Islamic Azad University, Science and Research Branch of Tehran, Faculty of Basic Sciences, Department of Biology, Tehran, Iran.
2 Al-Zahra University, Women's Research Center, Biomedical Group, Tehran, Iran.
3 Tehran University of Medical Sciences, Endocrine Research Center, Department of Molecular Modeling, Tehran, Iran.
4 National Institute of Genetics and Biotechnology, Department of Medical Genetics, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: In the present study, we examined the possibility of astaxanthin usage in the MS model of mice, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).
Material and methods: EAE disease was induced using MOG35-55 peptide and complete Freund adjuvant (CFU) in female C57BL/6 mice. Mice were divided into control, patient group (MS model, EAE), and prevention group, the group received astaxanthin for 21days before immunization, and astaxanthin treatment was initiated when mice showed the first symptoms of EAE. Each group consisted of 8 mice. The consumption of Astraxanthin was continued for 35 days, and each mouse received astaxanthin about 0.4% of the weight of used pellet (about 400 mg). Cell proliferation was measured by MTT, IL1β, but IL6 levels (proinflammatory cytokines) were measured by ELISA. In addition, the spinal cord tissues were also taken for immunohistopathological evaluations.
Results: Based on the results, the use of astaxanthin produced appropriate clinical and pathological outcomes, lead to decrement of IL1β, and IL6 proinflammatory cytokines (p < 0.0001) production. Immunohistopathologic studies also showed a decrease in leukocyte infiltration in the spinal cord of experimental groups.
Conclusion: Overall, this drug approach can be considered as a useful strategy in the prevention and treatment of multiple sclerosis.
کلیدواژهها [English]
- Astaxanthin
- experimental encephalomyelitis autoimmune
- proinflammatory cytokine
- multiple sclerosis
مقدمه
انسفالومیلیت تجربی خودایمن (EAE) بهعنوان مدل حیوانی بیماریMS (Multiple Sclerosis) در تحقیقات مورد استفاده قرار میگیرد. در بیماری MS و مدل تجربی آن (EAE)، پاسخ التهابی سلولهای TCD4+ خود واکنشگر اختصاصی به آنتی ژنهای میلین خودی عامل دمیلیناسیون سیستم اعصاب مرکزی و سبب ایجاد ناتوانیهای نورولوژیک در افراد محسوب میشود (1و2).
نتایج مطالعات بر روی مدل حیوانی EAE نشان داده است با انتقال سلولهای Th1 فعال شده اختصاصی میلین به موشهای سالم، سبب ابتلا به EAE میشود و سلولهای TCD4+ نفوذ یافته در سیستم عصبی مرکزی سبب افزایش تولید سایتوکاینهای سلولهای Th1 میشوند (3). سایتوکاینهای سلولهای Th1 نیز سبب فعال شدن ماکروفاژها، در نتیجه تخریب میلین و آسیب به الیگودندروسیتها میشود. ماکروفاژها و سلولهای میکروگلیا فعال شده انواعی از سایتوکاینها از قبیل IL-6 و IL-1 را ترشح میکنند که مقادیر بالای این سایتوکاینها ممکن است باعث آسیب رساندن به سایر الیگودندروسیتها و نورونها شود (4).
درمانهای رایج این بیماری عمدتا شامل یکسری داروهای سرکوب یا تعدیل کننده سیستم ایمنی می باشد که علاوه بر عوارض جانبی ناخواسته در دراز مدت با پیشرفت بیماری، کارایی درمانی خود را تا حدود زیادی از دست میدهند. از میان استراتژیهای درمانی که تا به حال برای بیماری MS معرفی شدهاند درمانهای غیرتهاجمی مانند استفاده از داروهای آنتیاکسیدانت قدرتمند، جایگاه بزرگی را بهخود اختصاص داده است. آستاگزانتین بهعنوان یک ترکیب محلول در چربی میتواند بهطور موثر از سد خونی مغزی عبور کند. همچنین یک ماده مغذی سالم بدون اثر سمیت میباشد (5). آستاگزانتین بهعلت خاصیت آنتیاکسیدانتی قوی در حفاظت ترکیبات سلولی در مقابل آسیب اکسایشی و در تنظیم بیان ژن، القا ارتباطات سلول – سلول و سلامت سلول نقش دارند (6). آستاگزانتین بهمیزان بیشتری نسبت به سایر ترکیبات کاروتنوئیدی آزاد شدن فاکتورهای ایمنی مانند IL-10 و TNF-α و تولید آنتیبادیهای IgM را افزایش میدهد. دلیل اهمیت مطالعه درباره اثرات سودمند آستاگزانتین این است که این کاروتنوئید حتی در شرایط التهابی خفیف قادر است پاسخ ایمنی قابل توجهی ایجاد نماید (7). مطالعات پیشین نشان داد تنشهای اکسایشی آسیب زننده به سیستم عصبی، بیماریهای عصبی را ایجاد مینماید و در مقابل تغذیه با آنتیاکسیدانتها احتمال خطر این بیماریها را کاهش میدهد اثرات محافظتی آستاگزانتین مرتبط با ساختار منحصر به فرد آستاگزانتین و نحوه قرارگیری آن و تاثیر بر ساختار غشا سلول و عملکرد آن است، از طرفی دیگر خواص آنتیاکسیداتیو و ضدالتهابی آن سبب شده است کاندیدای مناسبی برای کاهش آسیبهای مزمن و حاد تخریب نورونی و درمان بیماریهای عصبی و محافظت از سلولهای عصبی محسوب شود. بهخصوص که بطور گسترده و با صرف هزینه پائین از جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس، مخمر فافیا رودوزیما و ... میتوان آن را استخراج کرد (10-8).
گزارشها نشان میدهد در پاسخ به آسیب وارده به سیستم عصبی مرکزی، اینترلوکین 1 بتا (IL-1β) و اینترلوکین 6 (IL-6) افزایش میآبد. در مطالعه بر روی موشهای ماده تحت درمان با آستاگزانتین کاهش سطح سرمی IL-1β مشاهده شده است (11).
مطالعه حاضر با هدف ارزیابی اثر آنتیاکسیدانتی آستاگزانتین در تعدیل پاسخ التهابی لنفوسیتهای T خود واکنشگر و بررسی اثرات پیشگیرانه و درمانی آستاگزانتین در مدل حیوانی بیماری MS (EAE) شکل گرفته است. در مطالعه پیشرو القا دمیلیناسیون بهروش EAE و تاثیرگذاری آستاگزانتین بهصورت پیش درمان و درمان بر میزان سطوح سایتوکاینهای پیش التهابی IL-6 و IL-1β در سرم خون مورد بررسی قرار گرفت این تحقیق در آزمایشگاه تحقیقاتی بیومدیکال دانشگاه الزهرا و آزمایشگاه تحقیقاتی مجتمع زکریا رازی دانشگاه علوم تحقیقات تهران انجام گرفته است.
مواد و روشها
تحقیق حاضر بهروش تجربی و جامعه مورد بررسی شامل 32 سر موش ماده C57BL/6 در محدوده سنی6 الی 8 هفتهای از انستیتو پاستور تهران با میانگین وزنی(mean±SD) 46/0.± 62/17 گرم تهیه شد و در شرایط نور و رطوبت و دمای اپتیموم و مناسب در حیوانخانه دانشگاه علوم تحقیقات تهران نگهداری شدند. پروتکل این تحقیق براساس قوانین بین المللی در مورد حیوانات آزمایشگاهی انجام شد. جهت القا بیماری EAE 200 میکروگرم پپتید MOG35-55 (شرکت Peptron, South Korea) حل شده در 100 میکرولیتر بافر فسفات سدیم (PBS) و 100 میکرولیتر ادجوانت فروند کامل (شرکت Sigma، آمریکا) بهصورت زیر جلدی در ناحیه پشتی - کمری بههر موش تزریق شد. سپس 400 نانوگرم پرتوسیس توکسین بهمنظور افزایش نفوذپذیری سد خونی-مغزی (شرکت Sigma، آمریکا) در حجم 300 میکرولیتر (PBS) حل شده و در روزهای صفر و 48 ساعت بعد از ایمونیزاسیون بهصورت داخل صفاقی تجویز شد (12). آستاگزانتین مصرف شده توسط بخش بیومدیکال دانشگاه الزهرا از جلبک Haematococcus pluvialis استخراج شده بود. بهطور متوسط موشهای C57BL/6 روزانه حدود 4/0 درصد خوراک مصرفی (پلت) (حدود mg/kg 400) آستاگزانتین دریافت میکردند و پلتها در این مقدار آستاگزانتین غلطانیده میشد (13و14).
مصرف آستاگزانتین مطابق با گروهبندی زیر صورت پذیرفت و کلیه درمانها تا 35 روز (5 هفته) پس از القا بیماری ادامه یافت: گروه کنترل سالم: گروهی که بیمار نشدند و آب و غذای معمولی دریافت کردند و هیچ دارویی دریافت نکردند، گروه بیمار (EAE): گروهی که بیمار شدند ولی دارو (آستاگزانتین) دریافت نکردند، گروه تجربی پیشگیری: 21 روز (سه هفته) قبل از القا بیماری و ایمونیزاسیون آستاگزانتین دریافت کردند و گروه تجربی درمانی: موشها بعد از القا بیماری و با ارائه اولین علائم بیماری، آستاگزانتین را همراه با پلت مصرفی روزانه دریافت کردند.
بررسی روند تغییرات وزن و شدت علائم کلینیکی بهصورت روزانه صورت گرفت. جهت ارزیابی شدت بیماری از سیستم نمرهدهی هفتگانه مطابق جدول1 استفاده شد.
جدول1: علائم کلینیکی و درجه شدت بیماری در موش مدل MS (EAE)
علائم و پیآمدها |
درجه شدت بیماری |
عدم بروز بیماری |
صفر |
شلی دم |
یک |
فلج شدن دم |
دو |
اختلال در راه رفتن |
سه |
فلجی یک پا |
چهار |
فلجی دو پا |
پنج |
فلجی چهار دست و پا |
شش |
مرگ |
هفت |
پنج هفته بعد از القا بیماری (روز سی و پنجم پس از ایمونیزاسیون با پپتید MOG35-55) موشها تحت بیهوشی عمیق قرار گرفتند (کتامین mg/Kg 100 و زایلازین mg/Kg10 داخل صفاقی ip). و از قلب آنها خون گرفته شد. نمونههای خونی گرفته شده در دستگاه سانتریفوژ یخچالدار 10 دقیقه در g 200 قرار داده شد تا سرم آن برای تکنیک الایزا جدا شود. بهمنظور تعیین سطح سایتوکاین اینترلوکین 1 بتا (IL-1ß) و IL-6 در سرم بهترتیب از کیت الایزا (Abcam، آمریکا) و (eBioscience, Inc., USA). مطابق با پروتکل شرکت سازنده استفاده شد. برای هر نمونه دو خانه (کنترل سالم، گروه بیمار و گروههای تجربی) در نظر گرفته شد و یک جفت خانه بهعنوان شاهد Blank و هفت جفت خانه نیز برای نمونه استاندارد در نظر گرفته شد. نتایج در طول موج 450 نانومتر توسط ELISA Reader خوانده شد. دادهها بعد از تهیه نمودار استاندارد، برای تعیین غلظت سایتوکاین مورد ارزیابی قرار گرفت
میزان تکثیر سلولهای ایمنی با متد MTT ارزیابی شد. بههمین منظور پنج هفته بعد از القا بیماری موشها و پس از بیهوشی عمیق. بدون اتلاف وقت طحال موشها تحت شرایط استریل خارج و بعد از قطعه شدن در ml2 محیط کشت RPMI-1640 حاوی 10 درصد، FBS له شده و جهت تهیه سوسپانسیون سلولی از توری سیمی به قطر 2/0 میلی متر عبور داده شدند. بهمدت 10 دقیقه درg 200 سوسپانسیون سلولی سانتریفیوژ شد. بهمنظور حذف گویچههای سرخ، به رسوب سلولی 5 میلیلیتر بافر لیز کننده افزوده شد. بعد از 5 دقیقه ضمن افزودن 10 میلیلیتر محیط کشت نمونهها بار دیگر سانتریفیوژ تکرار شد. رسوب سلولی در محیط کشت RPMI-1640 حاوی 10 درصد FBS بهصورت سوسپانسیون در آورده شد. پس از فرآیند شمارش سلولها بهوسیله روش رنگآمیزی با تریپان بلو، سوسپانسیونی حاوی cell/ml106×1 تهیه شد و μl 100 از آن در هر یک از چاهکهای پلیت 96 خانهای ته تخت ریخته شد. برای هر نمونه سه تکرار بدون حضور پادگن و سه تکرار در حضور µg/ml 50 میکرولیتر بر میلیلیتر از پپتید 35-55 MOG در نظر گرفته شد. به عنوان بلانک نیز در سه چاهک از محیط کشت RPMI-1640 استفاده شد.بعد از 72 ساعت گرم خانهگذاری در انکوباتور حاوی 5 درصد CO2 بههر چاهک μl 25 محلول MTT (mg/ml 5 در PBS) افزوده شده، به مدت 4 ساعت دیگر گرم خانهگذاری شد. در این مدت احیا ماده MTT توسط سلولهای زنده و در حال تکثیر سبب تشکیل کریستالهای فورمازون گردید که با افزودن 100میکرولیتر DMSO به صورت محلول درآمد. شدت رنگ در طول موج 490 نانومتر تعیین و شاخص تحریک به صورت زیر محاسبه شد.
= شاخص تحریک
جهت مطالعات نوروپاتولوژیک با رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی نیز پس از بیهوشی موشها بهصورت داخل صفاقی ip با کتامین و زایلازین به نسبت 3:1 اقدام به برداشتن نخاع کرده، نخاع را وارد فالکونهای مناسب حجمی حاوی فرمالین 10 درصد نموده و سپس جهت آبگیری و قالبگیری با پارافین و برشگیری آماده نموده، سپس بهمنظور پارافینزدایی و آبگیری در گزیلن و بعد الکل قرار داده میشود، لامها بهمدت 15 دقیقه در بافر سیترات و ماکروویو قرار گرفتند، سپس جهت بلاک فعالیت پراکسیداز اندوژنز از محلول H2O2 در متانول استفاده میشود (سوبسترای اختصاصی). آنتیبادی CD4 کنژوگه بهعنوان Ab اولیه(Primary Ab) به اسلایدهای درون هر جار اضافه میشود. سپس لامها آبگیری و در الکل 95 و 100 درصد قرارگرفته و با گزیلن تمیز و لامل بر روی لام چسبانده میشود. جهت بررسی ارتشاح التهابی، تعداد CD4 های ارتشاح یافته رنگآمیزی شده با آنتیبادی CD4 در نخاع، در سه مقطع برای هر نمونه شمرده و میانگین هر یک محاسبه شد. تصاویر با میکروسکوپ Olympus BX51 و دوربین Olympus DP70 و نرمافزار Olysia Bioreport software version 3.2 مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت.
آنالیز آماری
بررسیهای آماری در محیط نرم افزاری SPSS ویراست 21 انجام شد، برای ترسیم نمودارها از نرم افزار Microsoft Excel نسخه 2010 استفاده شد. دادهها بهصورت Mean±SEM گزارش شد. جهت مقایسه میانگین شدت بیماری از روش غیرپارامتریک Mann Whitney-U و جهت مقایسه میانگین وزن، میزان تکثیر لنفوسیتها، سطح سایتوکاینها و تعداد سلولهای لکوسیتی ارتشاح یافته در بافت نخاع از آزمون آنالیز واریانس یکطرفه و Tukey’s test استفاده شد. در تمام بررسی ها p
نتایج
بررسی تغییرات میانگین وزن در بین گروههای تحت مطالعه نشان داد که میانگین وزن گروه EAE پس از ایمونیزاسیون نسبت به گروههای دریافت کننده آستاگزانتین کاهش چشمگیری داشته است. در گروه درمانی دریافت کننده آستاگزانتین پس از ایمونیزاسیون اندکی کاهش وزن مشاهده میشود ولی پس از مدت کوتاهی افزایش وزن در موشهای گروه دریافت کننده آستاگزانتین مشاهده میشود. این افزایش وزن در تمامی گروهای دریافت کننده آستاگزانتین (هم پیشگیری و هم درمانی) مانند گروه سالم طبیعی نسبت به تغییرات میانگین وزن بدن در موشهای گروه EAE بدون درمان اختلاف معنیداری در سطح 0001/0>p را نشان میدهد (نمودار 1).
نمودار 1: تغییرات میانگین وزنی بدن: میانگین وزن بدن در گروه کنترل طبیعی و گروههای تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمان) آفزایش معنیداری نسبت به گروه بیمار EAE نشان میدهند (***P<0.0001, n=8)
نتایج میانگین شدت بیماری نشان میدهد شدت علائم بالینی در طول مدت مطالعه در گروههای دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمان) نسبت به گروه بیمار EAE کاهش معنیداری داشته است (0001/0(p< میانگین شدت بیماری در گروه پیشگیری که سه هفته قبل از ایمونیزاسیون آستاگزانتین مصرف کرده بودند نسبت به گروه درمانی در سطح 001/0>p کاهش یافته بود (نمودار2).
نمودار2: تغییرات میانگین شدت علائم بیماری پس از القا EAE: میانگین شدت بیماری در تمامی گروههای تجربی (پیشگیری و درمان) نسبت به گروه موشهای بیمار (EAE) کاهش معنیداری یافته است (***p<0.0001) . همچنین میانگین شدت علائم بیماری در گروه درمانی در مقایسه با گروه پیشگیری افزایش معنیداری یافته است(††p<0.001) ( * ارائه دهنده اختلاف معنیدار با گروه EAE و † نشان دهنده اختلاف معنیدار با گروه پیشگیری )
میزان بروز و شیوع بیماری در گروه بیمار بدون درمان EAE و گروه درمانی از روز یازدهم پس از ایمونیزاسیون شروع شد. در گروه پیشگیری که از 3 هفته قبل از ایمونیزاسیون آستاگزانتین دریافت کرده بودند اولین علائم بالینی خفیف و از روز 32 ام پس از القای بیماری قابل مشاهده بود.
نتایج تست MTT حاکی از کاهش معنیدار تکثیر لنفوسیتی در گروههای پیشگیری و درمانی موشهای دریافت کننده آستاگزانتین در مقایسه با گروه EAE بدون درمان، در پی تحریک مجدد لنفوسیتهای طحال با پپتید MOG در محیط کشت میباشد. این اختلاف معنیدار در تمامی گروههای تجربی پیشگیری و درمانی نسبت به گروه EAE در سطح 0001/0> p مشاهده شد. همچنین کاهش معنیدار تکثیر لنفوسیتی در گروه پیشگیری در مقایسه با گروه درمانی در سطح 0001/0>p دیده شد. مقادیر تکثیر لنفوسیتها بوسیله شاخص تحریکی ارائه شده است (نمودار 3).
نمودار3: بررسی میزان تکثیر لنفوسیتها با روش MTT 35 روز پس از القا EAE: میزان تکثیر لنفوسیتها که بهوسیله Proliferation index ارائه میشود در تمامی گروههای تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمان) نسبت به گروه موشهای بیمار (EAE) کاهش معنیداری در سطح p
سطوح سرمی سایتوکاین IL-1β در گروههای پیشگیری و تحت درمان که آستاگزانتین دریافت کرده بودند در قیاس با سطح سرمی IL-1β در گروه EAE کاهش معنیداری یافته است (0001/0>(p. سطح سرمی سایتوکاین IL-1β در گروه درمانی در قیاس با گروه کنترل سالم افزایش
معنیداری یافته )05/0(p<، همچنین سطح سرمی سایتوکاین IL-1β در گروه درمانی نیز نسبت به گروه پیشگیری در سطح 001/0>p افزایش یافته است. و سطح سرمی IL-1β در گروه EAE نیز نسبت به گروه کنترل سالم افزایش معنیداری را نشان میدهد )0001/0(p< (نمودار4) .
نمودار 4: بررسی مقایسهای سطح سرمی سایتوکاین پیش التهابی IL-1β:در موشهای C57BL/6، 35 روز پس از القا EAE: سطح IL-1β در تمامی گروههای تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمان) در مقایسه با سطح IL-1β در گروه EAE کاهش معنیداری را در سطح p
سطوح سرمی سایتوکاین IL-6 در گروههای پیشگیری و درمانی دریافت کننده آستاگزانتین کاهش معنیداری نسبت به گروه EAE نشان میدهد )0001/0(p
نمودار 5: بررسی مقایسهای سطح سرمی اینترلوکین پیش التهابی IL-6:در موشهای C57BL/6، 35 روز پس از القا EAE: سطح اینترلوکین IL-6 در موشهای گروه پیشگیری و درمانی نسبت به گروه بیمار EAE کاهش معنیدار یافته است (0.0001 (***p< سطح IL-6 در گروه درمانی نیز نسبت به گروه پیشگیری افزایش معنیداری یافته است (††p<0.001) . سطح سایتوکاین IL-6 در گروه بیمار EAE و گروه درمانی نسبت به گروه موشهای سالم افزایش معنیداری یافته اند (0.0001 (##P<0.001, ###p< ( * ارائه دهنده اختلاف معنیدار با گروه بیمار EAE و # نشان دهنده اختلاف معنیدار با گروه کنترل سالم طبیعی، † نشان دهنده اختلاف معنیدار با گروه پیشگیری، n=8).
میزان ارتشاح CD4 در مقاطع نخاع گروه پیشگیری در قیاس با گروه بیمار EAE کاهش چشمگیری یافته است (شکل1) (p<0.0001).
گروهها |
مقاطع نخاع |
بیمار (EAE) |
|
پیشگیری |
|
درمانی |
|
شکل 1: مطالعات ایمونوهیستوشیمی اثرات پیشگیرانه و درمانی آستاگزانتین بر بافت نخاعی موش ماده C57BL/6 مدل EAE: تصاویر بالا رنگآمیزی ایمونوهیستوشیمیایی بافت نخاع با آنتیبادی CD4 بر علیه مولکولهای سطحی سلول CD4 را ارائه میدهد. رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی نشان داد که زیرمجموعه های لنفوسیتی بهداخل نخاع موش القا شده EAE نفوذ کرده اند ولی. مصرف آستاگزانتین در گروههای تجربی باعث کاهش دانسیته CD4 در نخاع موشهای گروه پیشگیری و درمانی (بهخصوص موشهای گروه پیشگیری) در مقایسه با موشهای بیمار EAE شده است. پیکانها سلولهای احتمالی CD4 رنگ آمیزی شده با آنتیبادی CD4 را نشان میدهند اطراف این سلولها هاله قهوهای رنگ مشاهده میشود (بزرگنمایی ×100)
نفوذ CD4 در مقاطع بافت نخاعی گروه درمانی نیز در سطح p
CD4+ در مقاطع بافت نخاع گروه پیشگیری نسبت به گروه درمانی در سطح p
نمودار 6. تعداد CD4+ ارتشاح یافته در بافت نخاع موشهای گروه بیمار (EAE) و گروههای تجربی دریافت کننده آستاگزانتین: در تمامی گروههای تجربی دریافت کننده آستاگزانتین(پیشگیری و درمان) ارتشاح CD4+ کاهش چشمگیری نسبت به گروه EAE نشان میدهند (*p<0.05,***p<0.0001) و تعداد CD4+ در بافت نخاعی موشهای گروه پیشگیری نیز نسبت به گروه درمانی کاهش معنیداری در سطح P
بحث
تاکنون مطالعات بالینی درک توسعه یافتهای از پاتوفیزیولوژی MS ارائه داده است. پاسخها و واکنشهای التهابی متفاوتی در پاتوژنز این بیماری گزارش شده است، واکنش آنتی بادیها، دمیلینه شدن آکسونها و اثرات سلولهای CD4+ در خود ایمنی سیستم عصبی مرکزی مشاهده شدهاند. با استفاده از مدلهای تجربی ثابت شد سلولهای CD4+ موجب آسیب در سیستم عصبی مرکزی میشود و نقش سایتوکاینهای التهابی قابل مشاهده میباشد (15).
در مطالعه پیش رو آستاگزانتین بهعنوان یک آنتیاکسیدانت قدرتمند در نظر گرفته شده است که از گسترش بیماری EAE بهعنوان مدل مورد مطالعه MS جلوگیری کرده است. طبق گزارشات ثبت شده کاروتنوئید آستاگزانتین دارای فعالیت آنتیاکسیدانتی بسیار قوی میباشد (16) و بر روی سلامتی انسان تاثیر بهسزایی داشته و از اهمیت ویژهای برخوردار است، چراکه بر خلاف دیگر آنتیاکسیدانتها، آستاگزانتین مواد اکسیدانتی مضر برای بدن تولید نمیکند (5). با مطالعه ساختار آستاگزانتین میتوان فعالیت آنتیاکسیدانتی، ضدالتهابی و مدولاتوری سیستم ایمنی این مولکول را توجیه کرد. آستاگزانتین میتواند از سد خونی-مغزی عبور کرده و سبب استحکام غشا سلولی شود (17). مولکول آستاگزانتین دارای گروه کتونی و هیدروکسیلی بوده که در دو انتهای مولکول آستاگزانتین قرار دارد و به زنجیره پلیان (پیوند دوگانه) در مرکز مولکول مزدوج شده است. گروههای هیدروکسیلی در بخش لیپیدی غشا دو لایهای نفوذ کرده و در ناحیه مجاور به بخش لیپیدی در فاز مایع قرار میگیرند، در نتیجه منجر به کاهش سیالیت غشا شده و یکپارچگی و تمامیت غشا و متعاقب آن، ساختار و عملکرد غشا حفظ میشود. حضور آستاگزانتین و نفوذ آن در BBB بهخصوص پیش از القا بیماری EAE، این استحکام و حفظ یکپارچگی و تمامیت غشا را تشدید نموده، در نتیجه نفوذ سلولهای ایمنی به داخل CNS کاهش مییابد (18و5).
در این مطالعه ما اثرات پیشگیرانه و درمانی آستاگزانتین را بر روی علائم نورولوژیکی و شدت بیماری و نقش حفاظتی آن در سطح مولکولی و ایمونوهیستوشیمی را بررسی شد. گروههای تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمانی) نسبت به گروه بیمار کاهش وزن اندکی را بعد از القا بیماری ارائه دادند. همچنین شدت بیماری در هر دو گروه تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمانی) نسبت به گروه EAE کاهش معنیداری یافته بود. از طرفی مصرف آستاگزانتین در گروههای تجربی (پیشگیری و درمانی) سبب کاهش سطوح سایتوکاینهای پیشالتهابی اینترلوکین یک بتا (IL-1β) و اینترلوکین 6 (IL-6) در سرم خون موشهای القا شده EAE شده است. شدت بیماری و سطوح سایتوکاینهای پیشالتهابی IL-1β و IL-6 در سرم خون موشهای گروه پیشگیری نسبت به گروه درمانی کاهش معنیداری یافته بود. میزان تکثیر لنفوسیتها که بهوسیله Proliferation index ارائه میشود نیز در گروههای تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (پیشگیری و درمانی) در قیاس با گروه بیمار EAE کاهش یافته بود و مقادیر تکثیر لنفوسیتها در گروه پیشگیری نیز اختلاف معنیداری نسبت به گروه درمانی نشان داد. مطالعات ایمونوهیستوشیمی بافت نخاع نیز کاهش نفوذ سلولهای ایمنی و ارتشاح لنفوسیت TCD4 را در هر دو گروه تجربی پیشگیری و درمانی نسبت به گروه EAE به نمایش گذاشت و این کاهش نفوذ CD4+ در بافت نخاعی گروه پیشگیری نسبت به گروه درمانی چشمگیر بوده است، در صورتیکه توقع میرفت در طی روند التهـاب، نفوذپذیری سد خونی-مغزی افزایـش یافتـه باشد.
در واکنشهای التهابی سطح سایتوکاینهای التهابی در سرم خون افزایش مییابد مطالعات پیشین نقش IL-1β و IL-6 را در تشدید علائم و بروز ضایعات در بیماری MS به اثبات رسانیدهاند (20و19). طی تحقیقاتی که بر روی موش مدل MS انجام شد، به نقش موثر IL-6 اشاره شد، بهطوریکه آنتیبادیهای مخصوص IL-6 در کاهش اثرات EAE در موش موثر بوده و انتقال سیگنال از طریق باند شدن با گیرنده IL6 در غشا سلول امکانپذیر میباشد (19).
نقش IL-1β بهعنوان سایتوکاین پیشالتهابی که توسط مونوسیت و ماکروفاژها و سلولهای B و T و در CNS در طول القا EAE، تنظیـم میشـود ثابت شـده اسـت و همچنین سـبـب آپـوپتوزیـس سـلولهای عصبی میشـود (21). آستاگزانتین همچنین بهوسیله اثر تنظیم کنندگی و کاهندگی بر سایتوکاینهای التهابی سبب حفظ یکپارچگی و تمامیت سد خونی مغزی میشود و مانع نفوذ سلولهای ایمنی به CNS میشود. از طرفی سایتوکاینها به مانند سایر پروتئینهای سیگنالی، نقش مهمی در تنظیم پاسخ ایمنی در مدل EAE بر عهده دارند (22). مشخص شده است سایتوکاینهای Th1 در پیشرفت بیماری نقش داشته است (23). نتایج مطالعهای در شرایط in vitro نشان میدهد که آستاگزانتین پاسخ سلولهای ایمنی لنفوسیتی و تولید سایتوکاینهای Th1 را تنظیم و تعدیل میکند (24).
گزارشهای دیگری حاکی از افزایش تولید IL-6 در مرحله پیشرفت و گسترش بیماری MS بوده است (25) که بهوسیله اثر تخریبی بر BBB ، باعث دمیلینه شدن و التهاب عصبی میشود (26) .مطالعات Ying و همکاران (10) نشان میدهد که آستاگزانتین بهسهولت از سد خونی مغزی عبور کرده و این امر سبب میشود این کاروتنوئید بتواند سیستم اعصاب مرکزی را در برابر آسیبهای مزمن و حاد تخریب نورونی محافظت کند. بهنظر میرسد فعالیتهای آنتیاکسیدانتی و ضدالتهابی و سایر اثرات بیولوژیک بالقوه آستاگزانتین در محافظت نورونی نقش داشته باشند. در واکنش به آسیبهای وارد بر سیستم عصبی، سطح برخی از سایتوکاینهای التهابی در خون افزایش مییابد و چندین واکنش دفاعی مانند فعال شدن محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- آدرنال رخ میدهد. Balietti و همکاران (27) اثر آستاگزانتین را در روند پیری وابسته به جنسیت بررسی کردند و گزارش کردند پس از مصرف آستاگزانتین، سایتوکاینهای ضد التهابی باعث توقف عملکرد عوامل التهابی میشود. این عوامل نقش مهمی در بروز پاسخهای التهابی و ایمنی دارد بهطوریکه در موشهای دریافت کننده آستاگزانتین میزان IL-1β در هر دو ناحیه مغزی و مخچهای کاهش معنیداری یافته است.
گزارشهای فوقالذکر با یافتههای بهدست آمده از این مطالعه مطابقت داشته بطوریکه سطوح سایتوکاینهای التهابی IL-1β و IL-6 در گروه EAE افزایش یافته و در گروههای دریافت کننده آستاگزانتین میزان سطح این سایتوکاینهای التهابی کاهش یافت. مشاهدات Zhou و همکاران (28)، تاثیر آستاگزانتین بر افسردگی ناشی از دیابت را در موشهای مدل دیابت ارائه و گزارش کردند آستاگزانتین بیان IL-1β و IL-6 در هیپوکامپ را کاهش داده است. مکانیسم عمل آستاگزانتین بر روی مهار التهاب بوده و از این طریق میتوانند نورونهای هیپوکامپ و آمیگدال و هیپوتالاموس را در برابر آسیب هایپرگلایسمیک محافظت نماید.
در مطالعات ایمونوهیستوشیمی تحقیق پیشرو در گروههای تجربی دریافت کننده آستاگزانتین میزان ارتشاح سلولهای التهابی CD4+ به بافت نخاعی نسبت به گروه بیمار کاهش چشمگیری یافت. این امر بهخصوص در گروه پیشگیری نمود واضحی داشت.
یکی از مکانیسمهای پیشنهادی جهت تاثیر آستاگزانتین بر روی رشد و تمایز سلولهای عصبی و نوروژنز اشاره بر تنظیم سیگنال ERK میباشد. سیگنال ERK بر MAPKs (Mitogen-activated protein kinase) (پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن) تاثیر گذاشته و از آنجاکه MAPKs در واکنشهای سلولی نسبت به سایتوکاینهای التهابی مداخله کرده در نهـایت منجـر به تنـظیم عملکـرد سـلولی، بیان ژن، تکـثیر ، تمایز و بقـا سـلولی و آپوپتـوزیـس میشود (29). آستاگزانتین همچنین با سرکوب گونههای اکسیژن فعال (ROS)، القا کننده بیان هستهای NF-κB، سبب کاهش تولید سایتوکاینهای التهابی میشود (30). مکانیسم مهم دیگر، نفوذ آستاگزانتین در سد خونی-مغزی و ایجاد استحکام و حفظ یکپارچگی و تمامیت غشا میباشد در نتیجه منجر به کاهش نفوذ سلولهای ایمنی بهداخل سیستم اعصاب مرکزی میشود (18و5).
آستاگزانتین به سهولت از سد خونی-مغزی عبور کرده و سیستم اعصاب مرکزی را در برابر آسیبهای مزمن و حاد تخریب سلولهای عصبی محافظت میکند. همه این مکانیسمها و فعالیتهای آنتیاکسیدانتی و ضدالتهابی آستاگزانتین در محافظت نورونی نقش بهسزایی خواهد داشت (10).
در مطالعه کنونی نیز کاهش سطح IL-1β، IL-6 در گروههای تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (گروههای پیشگیری و درمانی) در مقایسه با گروه موشهای EAE بدون درمان منعکس کننده اثرات آستاگزانتین بر حفظ یکپارچگی سد خونی-مغزی است که مانع پیشرفت التهاب و کاهش آن میشود. تکثیر سلولهای لنفوسیتی که بهوسیله شاخص تحریکی ارائه شده است در تمامی گروههای تجربی دریافت کننده آستاگزانتین (گروههای پیشگیری و درمانی) در قیاس با گروه موشهای EAE بدون درمان کاهش یافته است.
اگرچه تاکنون مکانیسم عملکرد گیرندههای مداخله کننده در این زمینه به اثبات نرسیده است اما نقش تحریک سلولهای ایمنی لنفوسیتی در این زمینه کاملا مبرهن و واضح میباشد. در واقع توانایی آستاگزانتین در تنظیم کاهشی، تکثیر لنفوسیتهای T تحریک شده با
در مطالعه مشابه دیگری ارزیابی و مقایسه سایتوکاینهای التهابی و ضدالتهابی بهدست آمده از کشت سلولهای طحال موشهای مدل MS پیش درمان شده با آستاگزانتین نشان داد که روند التهاب کاهش یافته است(31).
با توجه به مطالب فوق میتوان اثرات کاهش شدت التهاب ناشی از تجویز آستاگزانتین را در موشهای مدلEAE، در گروههای پیشگیری و درمانی، به نحوه عملکرد آستاگزانتین بهمنظور حفظ تمامیت و یکپارچگی غشا در سد خونی مغزی سیستم عصبی مرکزی و اثرات آنتیاکسیدانتی و ضدالتهابی آن نسبت داد. تاثیر آستاگزانتین در ایجاد کاهش سیالیت غشا و حفظ یکپارچگی و تمامیت غشا و حفظ ساختار و عملکرد صحیح غشا و حضور آستاگزانتین و نفوذ آن در سد خونی-مغزی بهخصوص پیش از القا بیماری EAE، سبب شده است علائم و شدت بیماری در گروه پیشگیری تخفیف یافته، در نتیجه نفوذ سلولهای التهابی بهداخل سیستم اعصاب مرکزی در این گروه نسبت به گروه درمانی کاهش یافته و اثرات بهبود دهندگی بهوضوح مشاهده میشود.
با توجه به دادههای بهدست آمده و مدارک میتوان امیدوار بود آستاگزانتین بهعنوان یک مکمل خوراکی نقش موثری در پیشگیری، التیام و کاهش التهاب و تخریب نورونی ناشی از ابتلا به بیماری مالتیپل اسکلروزیس داشته باشد.
نتیجه گیری
آستاگزانتین بهعنوان یک فاکتور آنتیاکسیدانتی، ضدالتهابی قوی، بدون اثر سمی و بهعنوان یک ترکیب محلول در چربی قادر است بهطور موثر از سد خونی مغزی عبور کند. سایتوکاینها مانند بعضی پروتئینهای
پروتئین MOG35-55 که یک فاکتور مهم در پاتوژنز بیماری است را کاهش میدهد (24).
سیگنالی، نقش مهمی در تنظیم و تعدیل پاسخ ایمنی در مدل MS (EAE) بر عهده دارند.
آستاگزانتین با تاثیر تنظیم کنندگی و کاهندگی بر سطوح سایتوکاینهای التهابی سبب حفظ یکپارچگی و تمامیت سد خونی مغزی شده و مانع نفوذ سلولهای ایمنی به سیستم اعصاب مرکزی میشود علیرغم مشاهده کاهش سطح سایتوکاینهای التهابی و کاهش ارتشاح CD4+ در بافت نخاع موشهای دریافت کننده آستاگزانتین بهخصوص در گروه پیشگیری، مصرف مکملی یا دارویی آستاگزانتین جهت پیشگیری و درمان بیماری MS و کاهش اثرات التهابی و تخریبی بر سیستم اعصاب مرکزی مطالعه کلینیکی بیشتری را میطلبد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان این مقاله بدین وسیله از جناب آقای دکتر توانگر پاتوبیولوژیست و عضو هیات علمی علوم پزشکی تهران که در مطالعات بخش هیستوپاتولوژی و ایمونوهیستوپاتولوژی صمیمانه راهنمایی و همراهی فرمودند و همچنین از بخش بیومدیکال دانشگاه الزهرا و مجتمع زکریای رازی دانشگاه علوم تحقیقات تهران قدردانی و سپاسگزاری مینمایند.