مقدمه

در رده پستانداران، لقاح از نوع داخلی بوده و بعد از ورود اسپرم به دستگاه تناسلی موجود ماده، شروع به مهاجرت به‫سمت لوله‫های تخمک­بر نموده و بعد از مواجهه با تخمک، آن را بارور می­نمایند و سپس مراحل کلیواژ یا تسهیمات سلولی آغاز می­شود و تا مرحله تشکیل بلاستوسیست پیش می­رود و پس از خروج از پوشش شفاف زوناپلوسیدا که اطراف جنین را فرا گرفته، لانه­گزینی صورت می­گیرد و تکوین پیشرفته شروع می­شود (1). بلاستوسیست دارای دو نوع جمعیت سلولی می­باشد، توده سلولی داخلی  (Inner cell mass, ICM) که از جمله نشان‫گرهای اختصاصی آن، Oct4 بوده و ساختارهای جنینی و خارج جنینی را تشکیل می­دهد و تروفکتودرم (TE) که جفت مادر و جنین را ایجاد می­کند (1و2). در مراحل ابتدایی پیش از لانه گزینی شامل مراحل 2 سلولی و 4 سلولی، هر کدام از سلول­ها یا همان بلاستومرهای منفرد، دارای ظرفیت تکوینی همه­توان می‫باشند، به این معنی که قادر هستند تا در شرایط رشد و نموی مناسب، به تنهایی تکوین پیدا کرده و تبدیل به یک بلاستوسیست شوند (1). در سال 1959 طی یک مطالعه­ای نشان داده­ شد زمانی‫که بلاستومرهای منفرد مراحل 2 یا 4 سلولی در داخل پوشش زوناپلوسیدای خالی قرار داده شوند و سپس به رحم جاندار انتقال یابند، پس از چند روز، تشکیل بلاستوسیست و حتی لانه­گزینی مشاهده می‫شود (3). درصد بسیار پایینی از تولد نیز مشاهده شد که فقط حاصل از بلاستومرهای مرحله 2 سلولی بودند (16 درصد). مطالعه مشابه بر روی بلاستومرهای 4 سلولی و 8 سلولی موش صورت گرفت که مانند مطالعه قبل، فرایند لانه­گزینی قابل مشاهده بود اما در این مورد تولدی گزارش نشد (4). در بعضی از مطالعات دیگر بلاستومرهای مراحل 2 یا چند سلولی، با انواع همتای خود از یک فنوتیپ دیگر جفت می‫شدند و در این صورت تکوین جنین با موفقیت صورت می­گرفت و بازدهی تقریبا 70 درصدی نشان می­داد (5). در دو مطالعه اول، محققین اشاره به این واقعیت داشتند که بلاستوسیست‫های مشتق از بلاستومرهای منفرد، اندازه قطر کوچک‫تری نسبت به انواع مشتق از جنین­های کامل یا Intact دارند و بنابراین بلاستوسیست­های مشتق از بلاستومرهای منفرد تعداد سلول‫های کمتری دارند که این موضوع یکی از دلایل اصلی عدم تکوین کامل بلاستومرها تا تشکیل و تولد نوزاد معرفی شد. این در حالی است که در مطالعه Kelly این مساله وجود نداشت. در تایید این موضوع، به‫ترتیب بلاستومرهای منفرد جنین­های انسانی و موشی از مراحل مختلف جنینی، در شرایط آزمایشگاهی مورد مطالعه قرار گرفتند و مشاهده شد که هرچه بلاستومرها از جنین­های مراحل پیشرفته­تر جداسازی می‫شوند، در نتیجه تکوین، بلاستوسیست­های کوچک‫تری حاصل می­شود. در این دو مطالعه، انتظار می­رفت که شرایط مختلف کشت جنین شامل کشت گروهی جنین­ها یا کشت جنین در حجم­های مختلف محیط کشت نیز لحاظ شود، چون ثابت شده است که در کشت گروهی جنین­ها، عوامل ترشحی از سلول‫ها که مسیرهای سیگنالی مختلفی را فعال یا مهار می­کنند، در محیط تجمع یافته و باعث تکوین بهتر جنین­ها می­شوند (6 و7). به‫هر حال این پارامترها دور از نظر بوده­اند. از آن‫جایی‫که بازدهی تکوین بلاستوسیست از بلاستومرها 70 تا 80 درصد بوده­است که درصد نسبتا خوبی می­باشد، لذا بررسی چنین پارامتری نیز ضروری به‫نظر می‫رسید تا ابهامی باقی نماند.

یکی دیگر­  از موضوعاتی که در مورد بلاستومرهای منفرد مطرح می­باشد، تولید سلول­های بنیادی جنینی است که مطالعات زیادی در این زمینه صورت گرفته است (8، 9، 10 و 11). تولید این سلول­ها در انسان با محدودیت­های زیادی از جمله مسائل اخلاقی مواجه بوده است (8، 9 و 10) زیرا با روش­های قدیمی، در مورد تمامی گونه­ها، یک بلاستوسیست کامل باید از بین رود تا یک رده از سلول­های بنیادی تولید شود (12) و عملا در مورد انسان شدنی و اخلاقی نیست. روش نوین تولید این سلول­ها، با استفاده از بلاستومرهای منفرد صورت می­گیرد که از مراحل دوسلولی به بعد قابل استفاده هستند و بلاستومرها تکثیر شده و بعد از ورود به مرحله تشکیل بلاستوسیست با اندازه کوچک، ICM آن سریع تکثیر شده و  ساختار گنبدی شکل ایجاد می­کند و بعد قابل پاساژ می­باشد (13 و 14). در مطالعه اخیری که در پژوهشگاه رویان تهران انجام شد، ترکیبی از کوچک مولکول­ها، شامل SB431542 و PD0325901 که به‫ترتیب مسیرهای سیگنال سلولی TGF-β و Erk1/2 را مهار می­کنند و هر دو تحت عنوان ترکیبات R2i (Royan dual inhibitors) به‫ معنی "مهارکننده­های دوگانه رویان" نامیده می­شوند (11) مورد استفاده قرار گرفت. با مهار این مسیرها تکثیر و پرتوانی سلول­ها تقویت شده و بازدهی تولید سلول­های بنیادی جنینی نیز افزایش می­یابد. در مطالعه‫ای که انجام شده است نیز نشان داده شد که مهارکننده­گان مطرح شده با مکانیزم متیلاسیون ژنوم و مهار ژن­های تمایزی عمل می‫کنند (15) همچنین در این مطالعه، بلاستوسیست­ها بعد از این‫که جراحی ایمنی شدند و ICM جدا سازی شد، بر روی سطح پوشیده شده با ژلاتین و بدون لایه سلولی تغذیه کننده در محیط کشت حاوی R2i انتقال داده ­شده و رده سلول­های بنیادی تولید شدند.

بر اساس مطالب فوق، ابتدا دو سوال مهم برای ما مطرح می­‫شود: اول این‫که آیا شرایط کشت اعم از حجم قطره­های کشت و تعداد سلول در حجم معین می­تواند بر کمیت و کیفیت تکوین بلاستومرهای منفرد به‫خصوص افزایش تعداد سلول­های تشکیل دهنده بلاستوسیست تاثیرگذار باشد و دوم اینکه آیا پتانسیل تکوینی بلاستومرهای 2 سلولی و 4 سلولی با یکدیکر تفاوت دارد. سپس قصد داریم به این سوال پاسخ بدهیم که آیا با استفاده از محیط حاوی R2i امکان تولید رده سلول­های بنیادی جنینی از بلاستومرهای منفرد بر روی سطح پوشیده شده با ژلاتین و بدون استفاده از لایه سلولی تغذیه کننده وجود دارد یا نه؟

مواد و روش‌ها

شرایط و آماده سازی موش­های ماده جهت تخمک گذاری به‫روش تزریق هورمون: نمونه حیوانی مورد استفاده در این مطالعه، موش نژاد NMRI می­باشد که از پژوهشگاه رویان تهران خریداری شدند. تمامی این موش‫ها طبق اصول و دستورالعمل­های اخلاقی حاکم بر مرکز نگه‫داری و آزمایشگاه حیوانات در پژوهشگاه رویان و دانشگاه خوارزمی نگه‫داری و تیمار شدند (کد اخلاق: IR.ACECR.REC.1396.002). موش‫های ماده 8 تا 10 هفته­ای طی تزریق هورمون‫های PMSG و HCG (Intervet, Belgium) آماده تخمک­گذاری می­شوند. تزریق هورمون اول برای تحریک تخمدان برای رشد فولیکول­ها بوده که در ساعت 12 ظهر انجام شد و دومی برای تخمک‫گذاری می­باشد که بعد از 48 ساعت تزریق شد (11). بلافاصله بعد از تزریق HCG، موش‫های ماده با موش‫های نر به‫صورت یک به یک جفت قرار داده شدند و صبح روز بعد تشکیل VP بررسی شد. موش‫هایی که از این نظر مثبت بودند به‫عنوان موش­های روز 5/0 حاملگی در نظر گرفته شدند و به‫ترتیب 24 ساعت و 36 ساعت بعد برای تهیه جنین­های 2 و 4 سلولی مورد استفاده قرار گرفتند.

تهیه جنین­های 2 و 4 سلولی و جدا سازی بلاستومرها: بعد از نخاعی کردن موش‫ها، اویداکت­ها خارج شده و توسط سرنگ انسولین و با سرسوزن G:30 فلاش شده و جنین­ها جمع آوری شدند (11). برای جابه‫جایی جنین­ها در محیط، از پیپت دهانی استفاده شد که از چندین بخش تشکیل می‫شود شامل یک پیپت پاستور شیشه­ای که انتهای آن توسط شعله کشیده شده و به‫صورت مجرای موئینه شکل می­گیرد و یک شیلنگ نازک به آن وصل است که به‫واسطه یک فیلتر 2/0 با نیروی دم و بازدم ملایم می­توان جنین­ها را جابه‫جا کرد. جنین­ها بعد از این‫که در قطره­های PBS شست و شو داده شدند، به قطره آنزیم پروتئاز E انتقال پیدا کردند تا پوشش زوناپلوسیدا هضم شود. در مرحله بعد، جنین­های فاقد زوناپلوسیدا، به‫وسیله پیپت پاستور با نوک موئینه و تنگ شده با شعله، پیپتاژ شده و بلاستومرها از هم جدا شدند.

کشت بلاستومرها در گروه‫های مختلف با شرایط متفاوت  

 بلاستومرها در محیط کشت T6 (16) که یک محیط استاندارد برای جنین می­باشد، کشت داده شدند. این محیط حاوی مکمل­های مهم شامل: اسیدهای آمینه ضروری (EAA، Sigma)، اسید‫های آمینه غیر ضروری ( NEAA, Sigma)، گلوتامین (L-GLn, Sigma) و سرم جنین گاوی (BSA, Sigma) می­باشد. در قدم اول تعیین حجم بهینه کشت مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مرحله، تاثیر حجم‫های 1 و 5 میکرولیتری با یکدیگر مقایسه شد که در هر قطره، یک  بلاستومر جدا شده از جنین 2 سلولی قرار گرفت و به‫مدت 3 روز در انکوباتور کشت داده شد. در مرحله بعد، بر اساس نتایج به‫دست آمده، حجم 1میکرولیتری انتخاب شد و بلاستومرها در سه گروه کشت داده شدند. گروه اول کشت منفرد در قطره، گروه دوم کشت گروهی در قطره (دو بلاستومر در قطره) و گروه سوم هم کشتی با جنین (یک بلاستومر با یک جنین کامل یا Intact در قطره) بود. در یک گروه هم یک جنین کامل یا Intact در قطره 1 میکرولیتری کشت داده شد که به‫عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شد تا بقیه گروه­ها نسبت به آن مقایسه شوند. قطره­ها در پلیت مخصوص کشت باکتری قرار داده شده که روی آن‫ها روغن مخصوص به‫نام Mineral oil ریخته شد تا هم مانع نفوذ آلودگی شود و هم از تبخیر قطره­ها جلوگیری نماید. تمام گروه­ها در 40 تکرار تکنیکی و 3 تکرار بیولوژیک انجام شدند. گروه­های کشت در انکوباتور قرار داده شدند تا بعد از 3 روز، تکوین و تشکیل بلاستوسیست بررسی شود. بررسی کمی این مرحله از کار بر اساس درصد بلاستوسیست­های تکوین یافته از بلاستومرها در گروه­های مختلف بیان شد. در مرحله بعدی، ارزیابی کیفیت بلاستوسیست­ها بر اساس میزان بیان Oct4 ارزیابی شد. این ارزیابی براساس شمارش سلول­های ناحیه ICM و TE مشخص شد. برای انجام آزمون رنگ‫آمیزی ایمونوفلئوروسنت، از روش­های استاندارد استفاده شد. به‫منظور ایجاد رنگ زمینه، هسته تمامی سلول­ها با DAPI (Sigma) رنگ آمیزی شد. آنتی­بادی‫های استفاده شده شامل آنتی بادی اولیه  Rat anti-mouse Oct4 (Abcam) و آنتی‫بادی ثانویه Donkey anti-rat (Abcam) می­باشند. 

کشت بلاستوسیست­ها برای تولید سلول­های ES، بدون استفاده از سلول‫های تغذیه­کننده: بلاستوسیست‫های تکوین یافته، به ظروف کشت پوشانده شده با ژلاتین (Sigma) (که با غلظت 1/0 درصد به‫مدت 15 دقیقه انجام شد) و حاوی محیط کشت ویژه سلول­های ES انتقال داده شدند. این محیط کشت، از محیط­های پایه   (Gibco) DMEM-F12 و (Gibco) Neuro Basal  با نسبت 1:1 تشکیل شده است. همچنین شامل مکمل­های (Sigma)NEAA (1X)  ، (Sigma) L-Glutamin (1X)، (Gibco) B27 (1X) ، (Gibco) N2 (1X) ، Mouse Lif (Royan-bio-tech)، BSA (Sigma)، ترکیبات R2i شامل (Sigma)  SB431542 (10µM) و (Sigma)PD0325901 (1µM)  می­باشد. این محیط همچنین تحت عنوان محیط N2B27 نامیده می­شود.

پاساژ سلول­های بنیادی جنینی تولید شده: برای پاساژ یا انتقال سلول­های بنیادی جنینی، ابتدا محیط روی سلول‫ها را کشیده و بعد به‫مدت 2 دقیقه با بافر PBS شست­وشو داده شدند. بعد PBS کشیده شده و آنزیم Trypsin-EDTA (Gibco) با غلظت x1 اضافه شد تا سلول­ها  از سطح جدا شوند. در مرحله بعد برای خنثی سازی اثر آنزیم، محیط حاوی FBS (Gibco) به آن اضافه شد و بعد به‫وسیله محیط اصلی N2B27 به حجم رسید تا بین ظروف کشت پوشانده شده با ژلاتین تقسیم شود.

القای تمایز به دودمان­های اکتودرمی، مزودرمی و اندودرمی در شرایط in vitro: روش‫های القای تمایز در سلول­های ES، طبق مطالعه اخیر صورت گرفت (11).  ابتدا سلول‫ها در پاساژهای بین 10 تا 15 با تاثیر آنزیم از ظرف کشت جدا شدند و پس از شمارش به‫وسیله لام نئوبار، به غلظت 800 سلول بر میلی­لیتر، در محیط تمایزی سلول‫های بنیادی جنینی موشی با روش قطره معلق به‫مدت 3 روز در انکوباتور قرار داده شدند تا سلول­ها تجمع یافته و اجسام شبه جنینی (Embryoid bodies) تشکیل شود. محیط تمایزی DMED-High Glucose حاوی (1%)L-Glutamin، NEAA (1 درصد) و FBS (15 درصد) بود. برای تمایز اکتودرمی-عصبی در روز سوم تمایز، اجسام شبه جنینی وارد محیط تازه حاوی رتینوئیک اسید (2 میکرومولار) می­شوند. در این‫حالت، کشت به‫صورت سوسپانسیونی در داخل ظروف کشت باکتری انجام شد و تجمعات سلولی در محیط به‫صورت شناور و معلق بودند. اجسام جنینی که در این محیط به سرنوشت عصبی القا می­شوند، تا 7 روز در این محیط، کشت داده شدند و هر دو روز یک­بار نصف محیط تجدید شد. سپس تجمعات سلولی القا شده بعد از 7 روز به ظروف 4 خانه پوشیده شده با ژلاتین منتقل می­شوند تا سلول­ها گسترش یافته و استطاله­های خود را نشان دهند. برای تمایز مزودرمی (عضله قلبی)، تجمعات سلولی یا اجسام شبه جنینی، با روش فوق تولید شدند با این تفاوت که در محیط تمایزی از همان ابتدا از اسید آسکوربیک با غلظت 1/0 میکرومولار استفاده شد. در روز سوم، تجمعات سلولی به‫داخل ظروف کشت باکتری و در همان محیط کشت انتقال پیدا کردند و 3 روز دیگر در این محیط کشت داده شدند. بعد تجمعات سلولی به ظروف کشت 4 خانه پوشیده شده با ژلاتین و در محیط کشت تمایزی انتقال پیدا کردند. 1 تا 5 روز دیگر تجمعات چسبیده و تپنده و ضربان‫دار قابل مشاهده بودند. برای انجام تمایز اندودرمی، از محیط N2B27 بدون R2i و Lif برای تولید تجمعات سلولی یا اجسام شبه­ جنینی استفاده شد. بعد از 3 تا 4 روز، Activin A نیز به‫میزان 50 نانوگرم در میلی­لیتر به محیط اضافه ­شد و به‫مدت 5 روز با همین ترکیب فرایند کشت ادامه پیدا کرد. سپس اجسام شبه جنینی القا شده به ظروف کشت 4 خانه پوشیده شده با ژلاتین محتوای همان نوع محیط کشت انتقال پیدا کردند. بعد از 72 ساعت سلول­های اندودرمی با ظاهر ویژه خود مشخص بودند.

تمایز در شرایط In vivo؛ تشکیل تراتوما: برای این‫کار، سلول­ها بعد از تیمار آنزیمی و جدا شدن از سطح ظرف کشت، به تعداد 10 میلیون، در ناحیه زیر پوست پشتی موش Nude که سیستم ایمنی آن کاملا از کار افتاده تزریق شد (4). بعد از 20 روز در ناحیه مذکور، توده­ای به‫شکل برآمدگی زیر پوست تحت عنوان تراتوما تشکیل شد. بافت تراتوما از زیر پوست خارج شده و بعد از آماده سازی، برش‫گیری و رنگ‫آمیزی به‫روش هماتوکسیلین-ائوزین بر روی لام، زیر میکروسکوپ بررسی شد.

بررسی بیان نشانگرهای اختصاصی به‫وسیله روش ایمونوسیتوشیمی: انجام این تکنیک بر اساس روش­های استاندارد گزارش شده در مقالات صورت گرفت (11،15). آنتی­بادی‫های اولیه که در این مطالعه استفاده شدند عبارت‫اند از: (Santacruz)anti-Oct4، (Santacruz) anti-Nanog، (Abcam) anti-sox2، (Abcam) anti-GFAP، (Abcam)anti-Faxa2 و (Abcam)anti-Nkx2.5. آنتی­بادی­های ثانویه نیز عبارت­اند از: Alexa fluor 488 donkey anti-mouse immunoglobulin G (Abcam) و Alexa fluor 568 goat anti-mouse immunoglobulin M (Abcam). برای ایجاد رنگ زمینه، هسته تمام سلول­ها با رنگ فلئورسنت DAPI (Sigma) رنگ­آمیزی شد و زیر میکروسکوپ فلئورسنس (Olympus) مشاهده شد.

ارزیابی بیان ژن در سطح mRNA: در این مرحله از کار، ابتدا توسط محلول Trizol، RNA کل سلول­ها استخراج شد و جهت دو رشته­ای کردن نمونه­های RNA و ساختن cDNA از کیت استفاده شد (Fermentase). پرایمرهای اختصاصی به‫صورت آنلاین و در سایت https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ طراحی شدند که در جدول1 نشان داده شده ­است. جهت بررسی وجود mRNA های مورد نظر، از روش واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) استفاده شد که تمام اصول آن بر اساس مطالعات اخیر صورت گرفت (9و4). در نهایت برای ارزیابی نهایی، محصولات PCR بر روی ژل آگار با غلضت 1 درصد الکتروفورز شده و سپس به‫کمک GelRed (Sinagene) رشته­های DNA ظاهر شده و باندهای تشکیل شده برای بیان ژن­های اختصاصی اکتودرمی، اندودرمی و مزودرمی مورد ارزیابی قرار گرفتند.

جدول1: پرایمرهای Forward و Reverse برای نشانگرهای مختلف جهت بررسی بیان ژن در سطح mRNA

آنالیز داده­ها

تصاویر مربوط به بلاستوسیست­ها توسط میکروسکوپ نوری یا فلئورسنس معکوس شرکت Olympus گرفته شد. دوربین و نرم­افزار استفاده شده مربوط به‫همین میکروسکوپ، نسخه DP2-BSW بود که قطر بلاستوسیست­ها توسط آن اندازه­گیری شد. آنالیز داده­های به‫دست آمده به‫وسیله نرم افزار Spss16 و با روش ANOVA دوطرفه برای آنالیزهای دو متغیره و یک‫طرفه برای آنالیزهای تک متغیره صورت گرفت. جهت مشخص نمودن تفاوت بین گروه­های مختلف با یکدیگر، از تست Tukey به‫عنوان Post hoc استفاده شد. برای مقایسه داده‫ها به‫صورت دو به دو، آزمون (t) مورد استفاده قرار گرفت.  

نتایج

حجم 1 میکرولیتری به‫عنوان حجم بهینه برای کشت بلاستومرها

در این بخش از مطالعه، دو حجم 1 و 5 میکرولیتر با محیط کشت T6 مورد آزمون قرار گرفتند. محیط T6 یکی از محیط­های استاندارد برای کشت جنین می­باشد. برای این مرحله از کار،  بلاستومرهای جدا شده از جنین­های 2 سلولی استفاده شدند که در هر کدام از قطره‫های گروه­های

1 و 5 میکرولیتری، 1 عدد بلاستومر قرار داده شد (40n= ). نتایج حاصل نشان داد که تعداد بلاستومرهایی که در قطره‫های 1 میکرولیتری به بلاستوسیست تکوین پیدا کرده بودند [(5/32 درصد) 40/13] حدودا 2 برابر قطره­های 5 میکرولیتری بودند [ (15 درصد)40/6] و نسبت به‫دست آمده برابر 1/2 بود (05/0p<، شکل1). بنابراین حجم 1 میکرولیتری به‫عنوان حجم بهینه برای ادامه بررسی­ها مورد استفاده قرار گرفت.

شکل1: تاثیر حجم کشت بر روند تکوین بلاستومرها. بلاستومرهای جدا شده از جنین­های 2 سلولی در دو حجم 1 و 5 میکرولیتری در هر گروه به تعداد 40 عدد کشت داده شدند. بلاستوسیست­های حاصل در حجم 1 میکرولیتری، 1/2 برابر حجم 5 میکرولیتری بودند. این بررسی در سه تکرار بیولوژیک صورت گرفت و آنالیز آماری با استفاده از آزمون (t) انجام شد  و داده‫ها به‫صورت Mean±SD نمایش داده شده است. 05/0*p<.

تکوین بلاستومرهای جدا شده از جنین­های 2 و 4 سلولی در شرایط مختلف کشت

در این مرحله، بلاستومرها در سه گروه کشت منفرد، کشت گروهی و هم­کشتی با جنین مورد بررسی قرار گرفتند (شکل2 الف). نتایج نشان داد که  بلاستومرهای جدا شده از جنین­های 2 و 4 سلولی، در گروه­های هم­کشتی جنین و کشت گروهی، نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی داری نشان نمی­دهند اما در مقایسه با کشت منفرد، نتیجه بهتری نشان می­دهند که تفاوت بین آن‫ها معنی‫دار بود (05/0p<)، برای هر گروه، n=40) و نتایج مربوط به این ارزیابی در شکل نشان داده شده است (شکل2 ب و ج).

شکل2: کشت بلاستومرهای منفرد در شرایط مختلف. بلاستومرهای 2 و 4 سلولی در شرایط مختلف کشت داده شدند که شامل حالت منفرد (یک بلاستومردر قطره 1 میکرولیتری)، کشت گروهی (دو بلاستومر در قطره 1میکرولیتری) و هم­کشتی با جنین (یک بلاستومر و یک جنین2 یا 4 سلولی در قطره 1 میکرولیتری) بود (الف). در هر کدام از گروه­ها 40 عدد بلاستومر کشت داده شدند و این بررسی در سه تکرار صورت گرفت. قطره‫های حاوی جنین‫های 2 یا 4 سلولی نیز به‫عنوان گروه کنترل برای آنالیز آماری در نظر گرفته شدند. نتایج به‫صورت Mean±SD نمایش داده شد. تفاوت بین گروه‫های مختلف به‫وسیله تست Tukey مشخص شده و حروف کوچک انگلیسی نشان دهنده اختلاف بین گروه­ها می­باشندکه عبارت­اند از: گروه 2 سلولی (ب) a,b : 05/0p<  ؛ گروه 4 سلولی (ج)،  05/0p<  a,b: ،  01/0p<  a,c: . خط مقیاس: µm50

مقایسه ظرفیت تکوینی بلاستومرهای جداشده از جنین­های 2 سلولی و 4 سلولی

مانی­که تمام داده‫های فوق برای بلاستومرهای 2 سلولی و 4 سلولی در.وضعیت­های مختلف کشت، با آزمون (t) با یکدیگر مقایسه شدند، مشخص شد که بلاستومرهای 2 سلولی به‫طور معنی‫داری در مقایسه با بلاستومرهای 4 سلولی ظرفیت تکوینی بالایی دارند (شکل3 الف). در مرحله بعد، بلاستومرهای جفت جنین 2 سلولی و 4 تایی جنین 4 سلولی بر اساس قطر بلاستوسیست­های حاصل، مورد ارزیابی قرار گرفتند و مشخص شد که هر دو بلاستومر­ مربوط به جنین­های 2 سلولی که هردو در یک قطره کشت قرار داده شدند، ظرفیت تکوینی یکسانی نشان دادند یعنی بلاستوسیست­های مشتق از آن‫ها قطر مساوی داشتند (1/4 ± 6/89، 40=n ) که نسبت به بلاستوسیست­های کنترل تفاوت معنی­داری نشان ندادند (1/3 ± 5/98، 5/0p<، 40=n). این در حالی است که چهار بلاستومر از یک جنین 4 سلولی پس از تکوین به بلاستوسیست، به‫صورت دو جفت با اندازه قطر متفاوت و معنی‫داری بوده و نسبت به کنترل نیز کمتر بوده و تفاوت معنی‫داری نشان دادند (8/3 ± 2/69 و 5/4 ± 1/32 ؛ 5/0p<، 40=n). (شکل3 ب،ج).

ش

شکل3: مقایسه ظرفیت تکوینی بلاستومرها. الف) مقایسه درصد بلاستوسیست­های تکوین یافته از بلاستومرهای 2 سلولی و 4 سلولی. ب، ج) مقایسه قطر بلاستوسیست­های مشتق از بلاستومرهای جفت جنین 2 سلولی و چهارتایی جنین 4 سلولی. بلاستومرهای 4 سلولی از نظر اندازه دو جفت می­باشند (P1 , P2) در حالی که بلاستومرهای جفت 2 سلولی تفاوتی باهم نداشتند.نتایج به صورت Mean±SD نمایش داده شد. 05/0*p<،   01/0**p<. خط مقیاس: µm50

بررسی کیفیت بلاستوسیست­ها بر اساس تعداد سلول­های تشکیل دهنده ICM و TE

تعداد سلول­ها در بلاستوسیست­های تکوین یافته براساس رنگ آمیزی هسته سلول و نیز مارکر اختصاصی سلول­های ICM شمارش شد. در این حالت هسته تمام سلول­ها با DAPI که رنگ فلئورسنت آبی می­باشد مشخص شد. درحالی‫که نشان­گر اختصاصی بخش ICM یعنی OCT4، هم با رنگ آبی DAPI و هم با رنگ فلئورسنت سبز (FITC) مشخص بودند (شکل4 الف). در این فرایند، 4 پارامتر مورد نظر بود که عبارتند از: تعداد کل سلول­ها (TCN)، سلول‫های TE، سلول­های ICM و نسبت تعداد سلولهای ICM بر سلول­های TE (ICM:TE). با توجه به آزمایشات انجام شده مشاهده گردید که TCN در بلاستوسیست­های مشتق از بلاستومرهای 2 سلولی و 4 سلولی در تمام شرایط کشت نسبت به گروه کنترل یا همان جنین­های Intact کاهش معنی­داری نشان داد. تعداد سلول­های ICM و TE در گروه 4 سلولی و فقط TE در گروه 2 سلولی در تمامی شرایط کشت نسبت به گروه کنترل کاهش نشان دادند، این در حالی است که در گروه 2 سلولی، تعداد سلول­های ICM حاصل از کشت بلاستومرهای منفرد در حالت کشت گروهی و هم­کشتی با جنین، کاهش معنی‫داری نشان نداد ولی در حالت کشت منفرد کاهش معنی­داری نشان داد (شکل4ب و ج).

شکل4: بررسی بیان نشانگر Oct4 و شمارش سلول. Oct4 نشانگر اختصاصی ناحیه ICM در بلاستوسیست می­باشد که به‫روش ایمنی رنگ‫آمیزی شد و سلولهای مثبت نسبت به تمام سلول­ها شمارش شدند (الف). پارامترهای مورد نظر شامل TCN (جمعیت کل سلول­ها)، سلول­های ICM، سلول­های TE ب) و نیز نسبت ICM به TE (TCM:TE) (ج).نتایج به‫صورت Mean±SD نمایش داده شد. (د) تفاوت در نسبت تعداد سلول­های ICM به TE برای هر گروه در مقایسه با گروه جنین­های Intact. و نیز  05/0*p<، 01/0**p<، 001/0***p<. خط مقیاس: µm50

 در بررسی پارامتر ICM:TE، مشاهده شد که بلاستوسیست­های مشتق از بلاستومرهای2 و 4 سلولی که در شرایط منفرد کشت داده شده بودند و نیز بلاستوسیست‫های مشتق از هم­کشتی بلاستومرهای 4 سلولی با جنین نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی‫داری نشان دادند (05/0*p< ، 01/0**p<، 001/0 ***p<) (شکل 4 د). تفاوت بین بقیه گروه‫ها نسبت به‫یکدیگر نیز در این شکل نشان داده شده­است.

تولید سلول­های ES بر روی سطح پوشیده شده با ژلاتین

در مرحله بعد برای نشان دادن اینکه بلاستوسیست­ها دارای کیفیت و عملکرد برای کاربرد را دارند، جهت تولید رده سلول­های ES مورد استفاده قرار گرفتند. بعد از انتقال بلاستوسیست­ها به محیط کشت اختصاصی ESC در ظروف پوشانده شده با ژلاتین، مشاهده شد که بعد از 5 روز، به سطح ظروف چسبیدند و سلول­های TE به‫طور کامل بر روی سطح گسترده شدند اما سلول­های ناحیه ICM، به‫صورت تجمعات گنبدی شکل قابل تشخیص بودند (شکل5).

شکل5: تولید رده سلول­های بنیادی جنینی از بلاستوسیست­های مشتق از بلاستومرها. الف) مقایسه تکوین بلاستومرهای منفرد در محیط­ T6 و T6+R2i. آنالیز داده‫ها به‫وسیله آزمون (t) صورت گرفت. p

این سلول­ها بعد از اولین پاساژ، در محیط گسترده شده و تمام سطح ظرف کشت را پوشاندند (شکل5). درصد بلاستوسیست­های مشتق از بلاستومرهای 2 سلولی، 4 سلولی و جنین­های 2 سلولی به‫عنوان گروه کنترل به ترتیب برابر بود با 63، 27 و 90 (جدول2). بعد از این‫که بلاستوسیست­ها به محیط کشت اختصاصی سلول­های ES منتقل شدند، درصد بلاستوسیست­هایی که برون­رشدOut growth) ) نشان داده­ بودند به‫ترتیب فوق برابر بودند با3/58، 40 و 100 (جدول2)  و از این تعداد نیز به‫ترتیب 100، 75 و 100 درصد موارد تبدیل به سلول­های ES شدند (جدول2).

جدول2: درصد بلاستوسیست­های تکوین یافته از بلاستومرها و سلول­های بنیادی جنینی تولید شده

*BL: blastocyst

بیان نشانگرهای اختصاصی سلول­های ES

سلول­های بنیادی جنینی همچنین تحت عنوان سلول­های بنیادی پرتوان نامیده می­شوند که ویژگی­های بیان ژنی مختص خود را دارند. از جمله این ژن­ها که در این مطالعه نیز بیان آن‫ها در سطح پروتئین مورد ارزیابی قرار گرفته­ است شامل Oct4، Nanog و Sox2 هستند و در شکل 6 الف، نتیجه رنگ­آمیزی به‫روش ایمونوسیتوشیمی این نشانگرهای پروتئینی داخل هسته­ای نشان داده شده است که به‫واسطه رنگ­های فلئورسنتی قرمر (Alexa Flour 568) و سبز (Alexa Fluor 488) مشخص می­باشند. دیگر نشانگر اختصاصی سلول­های بنیادی پرتوان، آلکالین فسفاتاز(ALP) می­باشد که نتیجه رنگ­آمیزی آن نیز مثبت بود (شکل6 ب). 

شکل6: بررسی بیان نشانگرهای پرتوانی در سلول­های ES. الف) نشانگرهای Oct4، Nanog و Sox2 جزو عوامل رونویسی داخل هسته­ای می­باشند که به‫روش ایمونوسیتوشیمی و با مواد فلئورسنت سبز(Alexa Flour 488) و قرمز (Alexa Flour 568) کونژوگه شده با آنتی­بادی، رنگ‫آمیزی شدند. رنگ آبی فلئورسنت اختصاصی برای هسته سلول­، به‫وسیله DAPI برای رنگ­آمیزی زمینه استفاده شد. ب) الکالین­فسفاتاز یکی دیگر از نشانگرهای اختصاصی در این سلول­ها می­باشد که با استفاده از کیت مخصوص رنگ‫آمیزی شده و به‫رنگ ارغوانی مشخص می­باشد. خط مقیاس: mµ50

بیان نشانگرهای تمایزی پس از القای تمایز در سلول‫های ES در شرایط in vivo

سلول­های ES بعد از القای تمایز به دودمان­های اکتودرمی، اندودرمی و مزودرمی، از نظر مورفولوژی و بیان نشانگرهای تمایزی مورد ارزیابی قرار گرفتند و با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی، نشانگرهای اختصاصی برای این سلول­ها به‫ترتیب فوق شامل GFAP، Foxa2 وNkx2.5 رنگ­آمیزی شدند و همگی با رنگ فلئورسنت­ سبز (Alexa Fluor 488) مشخص می­باشند (شکل7 الف). برای ارزیابی بیان ژن در سطح mRNA، از روش RT-PCR نیز استفاده شد که نشانگرهای gfap و S100β (برای آستروسیت)، T و Gata4 (برای مزودرم) و ژن­های Foxa2 و αFP (برای اندودرم) برای این منظور مورد بررسی قرار گرفتند (شکل7 ب).

شکل7: بررسی ظرفیت تمایزی سلول­های ES. الف) نشانگرهای GFAP، Foxa2 و Nkx2.5 به‫ترتیب برای دودمان­های اکتودرمی-عصبی، اندودرمی و مزودرمی-قلبی مورد بررسی قرار گرفتند که  با ماده فلئورسنت سبز (Alexa Flour 488) کونژوگه شده با آنتی­بادی، رنگ آمیزی شده و در شکل، مشخص می­باشند. رنگ آبی فلئورسنت اختصاصی برای هسته سلول­، به‫وسیله DAPI برای رنگ­آمیزی زمینه استفاده شد. ب) بیان ژن‫های ویژه تمایزی برای سه دودمان اصلی جنینی در سطح mRNA  مورد ارزیابی قرار گرفتند. Gfap و S100β برای آستروسیت (اکتودرم)، Foxa2 و αFP برای اندودرم و Gata4 و T برای پیش ساز عضله قلبی (مزودرم) مورد نظر بودند. Gapdh به‫عنوان کنترل داخلی ارزیابی شد. U: غیر تمایز یافته، D: تمایز یافته. ج) الکالین­فسفاتاز یکی دیگر از نشانگرهای اختصاصی در این سلول­ها می­باشد که با استفاده از کیت مخصوص رنگ آمیزی شده و به‫رنگ ارغوانی مشخص می‫باشد. خط مقیاس: mµ50