نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
دانشکده علوم زیستی و بیوتکنولوژی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران
چکیده
هدف: در این مطالعه تاثیر Substance Pهموسیستئینه در حضور سیستئین بر میزان رشد سلولهای سرطانی PC12 بررسی و نتایج با نوع طبیعی آن مقایسه شد.
مواد و روشها: سلولها در محیط کشت RPMI-Glutamax حاوی FBS، 10 درصد کشت داده شدند و فعالیت متابولیکی آنها در حضور غلظتهای مختلف پپتید و سیستئین با استفاده از تست MTT ارزیابی شد. سپس تغییرات ریخت شناسی سلولها با استفاده از میکروسکوپ تمایز فازی مطالعه شد. بهمنظور بررسی تاثیر حفاظتی پپتید هموسیستئینه در برابر H2O2، سلولها بهمدت 3 ساعت در حضور H2O2 با غلظت 150 میکروگرم بر میلیلیتر تیمار شد و میزان تولید نیتریک اکسید آنها بهروش رنگ سنجی گریس مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: نتایج نشان میدهد که هر دو نوع Substance p، در همه غلظتهای انتخابی موجب افزایش رشد سلولها و کاهش میزان NO در برابر سمیت H2O2شده است. بهویژه در غلظت 6 تا 10 مولار میزان رشد در حضور پپتید هموسیستئینه و طبیعی بهترتیب 65/78 درصد و 55/38 درصد افزایش داشته است که نشان میدهد نوع هموسیستئینه 1/40 درصد بیشتر از نوع طبیعی منجر به افزایش رشد شده است و میزان NO بهترتیب 36 درصد و 14 درصد کاهش داشته است. بنابراین Substance P هموسیستئینه توانسته 22 درصد بیشتر از نوع طبیعی سلولهای سرطانی PC12 را در برابر سمیت پراکسید هیدروژن محافظت کند.
نتیجهگیری:SP-H در شرایط پاتولوژیک میتواند از طریق کاهش تولید نیتریک اکسید باعث افزایش رشد سلولهای سرطانی شده و روند پیشرفت بیماری را تسریع بخشد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Comparing the Effect of Homocysteinylated and Normal Forms of Substance P on the Proliferation of PC12 Cell-line in the Presence of Cysteine
نویسندگان [English]
- S Davoudmanesh
- MJ Mohammadian
Faculty of Bioscience and Biotechnology, Malek Ashtar University of Technology, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: In the present study, the effects of homocysteinylated and normal forms of substance P were investigated on the proliferation of PC12 cell-line in the presence of cysteine.
Material and methods: Cells were cultured in an RPMI-Glutamax medium containing 10% FBS and metabolic activity was assessed in the presence of different concentrations of peptide and cysteine using the MTT assay. Afterward, the morphological changes were determined using phase-contrast microscopy. In order to evaluate the protective effect of homocysteinylated peptide against H2O2, cells were treated with 150 µg/ml H2O2 for 3 h, and their nitric oxide production was assessed using the Griess colorimetric assay.
Results: findings showed that two forms of substance P, at selected concentrations, caused a significant increase in proliferation of PC12 cells and a decrease in the amount of NO production in response to H2O2 toxicity. At a concentration of 6-10 M, homocysteinylated and normal forms of substance P increased the rate of PC12 proliferation up to 78.65% and 38.55 % and decreased the levels of NO up to 36% and 14%, respectively. This indicates that homocysteinylated form of substance P is more potent ( than the normal form. The percentage of protection for homocysteinylated substance P was about 22% higher than the normal form.
Conclusion: It seems that homocysteinylated substance P can increase the growth rate of cancer cells and promote the disease course through the reduction in NO production in pathological conditions.
کلیدواژهها [English]
- Cancer cells
- Homocysteine
- PC12 cell line
- Substance P
در حال حاضر سرطان پس از بیماریهای قلبی-عروقی دومین عامل مرگ و میر در کشورهای پیشرفته میباشد (1, 2). عوامل مختلفی در افزایش رشد سلولهای سرطانی دخیل هستند که شناسایی آنها میتواند در جهت کنترل و ممانعت از پیشرفت بیماری موثر بوده و محققین را در راستای کشف اقدامات پیشگیرانه یاری دهد. پپتید Substance P(SP) به فرمول C63H98N18O13S یکی از اعضای خانوادهی نوروپپتیدهای Tachykinin است که متشکل از 11 باقیماندهی اسیدآمینهای (RPKPQQFFGLM) Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met-NH2 میباشد. SP عملکردهای فیزیولوژیکی متعددی در بدن داشته و در کنترل سیستم قلبی عروقی، انقباضات رودهای و کاهش فشار خون نقش دارد و همچنین با احساس درد و پاسخهای عصبی در ارتباط است. این پپتید توان و اختصاصیت بالایی دارد به گونهای که حتی با غلظتهای نانومولار بهخوبی در سطح سلولهای حاوی NK1 (Neurokinin1) (گیرندهی اختصاصی (SP جذب میشود (3-5). NK1، بین غشایی بوده و دارای 407 آمینواسید، با وزن مولکولی 58 کیلودالتون میباشد که 7 دمین بین غشایی هیدروفوب بههمراه 3 لوپ خارج سلولی و 3 لوپ داخل سلولی را تشکیل میدهند. لوپها جایگاههای عملکردی برای واکنش با G-پروتئینها دارند (3). فعال شدن NK1 توسط Substance P منجر به هیدرولیز فسفواینوزیتید هیدرولاز، تجمع کلسیم و فعالسازی MAPK (Phosphoinositide Hydrolysis) (6و7) شده و میتواند باعث تکثیر سلولهای توموری، رگزایی (Angiogenesis)، مهاجرت و متاستاز شود. بنابراین مسیر انتقال پیامSP / NK1، نقش مهمی در پیشرفت سرطان ایفا میکند به گونهای که تاکنون نقش SP بهعنوان میتوژن از طریق گیرنده NK-1 در چندین نوع از سرطانهای انسانی شامل آستروسیتوم، ملانوم، نوروبلاستوما، گلیوم، رتینوبلاستوما و همچنین پانکراس، حنجره، روده بزرگ، کارسینوم معده، لوسمی و سرطان سینه به اثبات رسیده است. همچنین تحقیقات نشان دادهاند در سرطان سینه انتقال پیامSP / NK1 موجب فعالسازی گیرندههای RTK (Receptor Tyrosine Kinases) مثل EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) شده و مقاومت دارویی را افزایش میدهد. بهعلاوه میزان بیان این پپتید و گیرندهاش NK1))، در سلولهای توموری نسبت به نمونههای سالم آنها و نیز برخی دیگر از بیماریها مثل افسردگی افزایش پیدا میکند. بنابراین امروزه طراحی آنتاگونیست مناسب که مانع از اتصال Substance Pبه NK1 شود در درمان سرطان بسیار مورد توجه قرار گرفته است (8-12). اما با این وجود هنوز نقاط مبهم زیادی در این رابطه وجود دارد و بسیاری از مکانیسمها ناشناخته هستند.
هموسیستئین (Hcy) با فرمول HSCH2CH2CH(NH2) CO2H مشتقی از اسیدآمینهی سیستئین بوده که طی حذف گروه متیل، در یک فرآیند چند مرحلهای، از متیونین تولید میشود (13). هایپرهموسیستئینمی یا افزایش سطح پلاسمایی هموسیستئین، که در بسیاری از جوامع شیوع دارد، نقص ژنتیکی مرتبط با متابولیسم اسیدآمینهی متیونین است که در برخی بیماریها مثل بعضی از سرطانها و افسردگی نیز دیده میشود. یکی از مسیرهایی که عمدتا در اثر افزایش سطح Hcy و در اختلال هایپرهموسیستئینمی اتفاق میافتد، متابولیزه شدن Hcy توسط آنزیم متیونین-tRNA-سنتتاز (MetRS) و ایجاد هموسیستئین تیولاکتون (tHcy)است که یک مشتق تیواستری میباشد (14). گروههای ε-آمینوی زنجیرهی جانبی آمینواسید لیزین در ساختار پروتئینها، تحت شرایط فیزیولوژیک و در حضورtHcy، و بهدلیل فعالیت بالای باند تیواستری آن، میتوانند بهراحتی و به صورت غیرآنزیمی و غیراختصاصی با اتصالی آمیدی و ایجاد پیوندی ایزوپپتیدی، طی فرآیندی به نام N-هموسیستئینی شدن، هموسیستئینه شوند (15). در نتیجه با افزایش سطح Substance P و هموسیستئین تیولاکتون در بدن امکان تشکیل substance p(lys-homocysteine) و بروز طبعات ناشی از آن وجود دارد.
هیپوکسی (Hypoxia ) شرایطی است که در آن سطح اکسیژن بافت کاهش مییابد و بهعنوان شرایط پاتوفیزیولوژیک ریزمحیط اطراف تومورهای جامد شناخته میشود. تحقیقات نشان میدهند که هیپوکسی یکی از دلایل پیشرفت سرطان است و میتواند منجر به شکلگیری تومورهای بدخیم شود به گونهای که امروزه توجه به این مسئله در درمان سرطان بسیار اهمیت پیدا کرده و اثرات آن در پاسخ به رادیوتراپی و شیمیدرمانی نیز مورد مطالعه قرار گرفته است. مکانیسم مرتبط با این اثرات مربوط به فاکتور القاکنندهی هیپوکسی (HIF) (Hypoxia-Inducible Factor (HIF) Family Of Transcription Factors ) است که از خانوادهی فاکتورهای رونویسی است و در شرایط هیپوکسی حاد یا مزمن میتواند منجر به افزایش رونویسی ژنهای هدف شود. این فاکتور یک عامل تنظیم کنندهی بسیاری از فرآیندهای مهم سلولی مثل آپوپتوزیس، تکثیر سلولی، رگزایی و متابولیسم گلوکز است. بنابراین، هیپوکسی، بیثباتی ژنتیکی، تشکیل سلولهای خونی و متابولیسم بیهوازی را افزایش میدهد. فشار خون بالا، افزایش فشار مایع بینابینی (Interstitial Fluid Pressure)، گلوکز پایین و غلظت بالای لاکتات ناشی از غلبهی متابولیسم بیهوازی، باعث کاهش pH خارج سلولی در بافتهای تومور( اسیدوز تومور) میشود (16و17).
NO درون سلولی، ﺗﻮﺳــﻂ آﻧــﺰﻳﻢهایی ﻛــﻪ ﻧﻴﺘﺮﻳــﻚ اﻛﺴﻴﺪ ﺳﻨﺘﺎز (NOS) (Nitric Oxide Synthase) ﻧﺎﻣﻴﺪه ﻣﻲﺷﻮند ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻣﻲﮔـﺮدد .ﺳـﻪ ﻓــﺮم اﺻــﻠﻲ از اﻳــﻦ آﻧــﺰﻳﻢ وﺟــﻮد دارد. NOS ﻋﺼــﺒﻲnNOS) )، NOS اﻧـــﺪوﺗﻠﻴﺎل(eNOS) و NOS اﻟﻘﺎﻳﻲ (iNOS) که در ﭘﺎﺳﺦ ﺑﻪ ﻣﺤﺮکﻫﺎ ﺑﻴﺎن ﻣـﻲشوند. هر سه ایزوفرم در ﺳﻴﺘﻮﭘﻼﺳﻢ وﺟﻮد دارند. ﺑﻪ ﺗﺎزﮔﻲ NOS ﻣﻴﺘﻮﻛﻨــﺪرﻳﺎﻳﻲ (mNOS) نیز ﻛﺸــﻒ ﺷــﺪه ﻛــﻪ ﻣﻨﺤﺼــرا درﻣﻴﺘﻮﻛﻨﺪری وﺟﻮد دارد. ﻫﻤﻪ آﻧﺰﻳﻢﻫﺎی NOS ﺑﻪﺻﻮرت ﻫﻤﻮداﻳﻤﺮ ﻋﻤﻞ ﻣﻲﻛﻨﻨﺪ. آنﻫﺎ ﻧﻴﺘﺮﻳﻚ اﻛﺴﻴﺪ را ﻃـﻲ دو مرحله اکسیداسیون آمینواسید L- آرژﻧﻴﻦ ﺑﻪ L- ﺳﻴﺘﺮوﻟﻴﻦ وNO ، از ﻃﺮﻳﻖ ﺗﺮﻛﻴﺐ واﺳﻂ N-ﻫﻴﺪروﻛﺴﻲ L- آرژﻧﻴﻦ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻣﻲﻛﻨﻨﺪ. عملکرد NO عمدتا از طریق چرخهی وابسته به cGMP (Cyclic Guanosine Monophosphate) است و گزارش شده است که NO نیز در صورتیکه بهمیزان کم در سلول تولید شود بهعنوان یک مبدل پیام عمل کرده و بر بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی مانند تنظیم جریان خون، هوموستاز آهن و انتقال نورونی تاثیر میگذارد. اما در سطح بالا باعث تخریب DNA و آپوپتوزیس میشود (18و19).
ردهی سلولی PC12 نوعی سلول سرطانی بوده که از فئوکروموسایتومای موش صحرایی جدا میشود. این سلول در محیط کشت رشد نموده و میتواند ویژگیهای سلولهای عصبی را نشان دهد (20و21)، همچنین دارای گیرندهی اختصاصی Substance P یعنی NK1 در سطح خود میباشد (22).
در این تحقیق، بهمنظور شبیه سازی ریزمحیط احیا و هیپوکسی اطراف سلولهای سرطانی از سیستئین بهعنوان یک مادهی احیاء کننده در غلظتی که برای سلولها سمی نیست(23)، استفاده شده است و تاثیر Substance P هموسیستئینه و طبیعی در حضور سیستئین بر میزان رشد سلولهای سرطانی PC12 بررسی شد. در ادامه تغییرات ریخت شناسی سلول PC12 تحت تاثیر هر دو نوع پپتید و میزان تولید NO در برابر سمیت پراکسید هیدروژن مورد مطالعه قرار گرفت. H2O2 میتواند به DNA هسته و DNA میتوکندری هر دو آسیب رسانده، موجب افزایش بیان مولکولهای چسبندهی سلولی شده، فعالیت P53 و دیگر فاکتورهای رونویسی که باعث مرگ سلول سرطانی میشوند را افزایش دهد (24و25).
مواد و روشها
سلولهای PC12 از انستیتو پاستور تهران تهیه شد. مواد مورد نیاز کشت سلولی (شامل پنی سیلین-استرپتومایسین، سرم جنین گاوی و گلوتامین) از شرکت Gibco، فلاسکها و میکروپلیتها از شرکت پارس آزمون، سیستئین از شرکت Sigma و مواد مورد نیاز برای واکنش گریس (Griess Reaction) از شرکت Promega خریداری شدند.
سلولها در محیط کشت RPMI(Gibco) 1640 حاوی NaHCO3 و HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid ) Mm) 10) بههمراه سرم جنین گاوی FBS (Fetal Bovine Serum)) 10 درصد (W/V) که سیستم کمپلمان آن با گرما غیرفعال شده، گلوتامکس (Glutamax(dipeptide L-alanyl-L-glutamine)) 1 درصد (V/V) و آنتی بیوتیک 1 درصد (V/V) درون فلاسک کشت سلول T-25 (NUNC) در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد حاوی CO25 درصد، 95 درصد هوا و رطوبت کافی کشت داده شدند. پس از 48 ساعت محیط کشت قدیمی با محیط کشت تازه تعویض شد. هنگامی که سلولها، 70 تا 80 درصد از کف فلاسک را فرا گرفتند، پاساژ سلولها با استفاده از محلول Trypsin-EDTA (200 Unit/ml)، انجام گرفت و با پاساژ دادن سلولها در فاز لگاریتمی رشد نگهداری شدند (16).
پپتیدهای Substance P با خلوص(HPLC) 84/96 درصد و وزن مولکولی 63/1347 gr/molو substance p(lys-homocysteine) با خلوص (HPLC) 92/95 درصد و وزن مولکولی 82/1463 gr/mol توسط شرکت ProteoGenix SAS فرانسه تهیه شدند .
فعالیت متابولیکی سلولهای انکوبه شده در حضور غلظتهای مختلف از پپتید و سیستئین با استفاده از تست MTT (MTT assay) مورد ارزیابی قرار گرفت.
در این روش مقداری از MTT (MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)) زرد رنگ که وارد سلولهای زنده میشود، توسط آنزیم دهیدروژناز این سلولها احیا میشود و رسوب بنفش رنگی ایجاد میکند که بهروش اسپکتروسکوپی قابل اندازهگیری است. برای تهیهی استوک MTT، 5 میلیگرم از این ترکیب در 1 میلیلیتر بافر نمکی فسفات حل شد. بههر چاهک از ظروف کشت 96 خانهای 10000 سلول در 200 میکرولیتر محیط کشت اضافه شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون سلولها به مدت 48 ساعت با غلظتهای مختلف پپتید (از غلظت 4-10 مولار تا 10-10 مولار) و سیستئین بهمیزان 4-10×5 میکرومولار تیمار شدند. سپس محیط کشت رویی خارج و 5 میکرولیتر از استوکMTT به هر چاهک اضافه شد. پس از چهار ساعت نگهداری در انکوباتور 37 درجه بهدنبال خروج محیط رویی واکنش، با اضافه کردن 100 میکرو لیتر DMSO متوقف شد. این محلول باعث حل شدن بلورهای فرمازان (Formazan) شده و درجات متفاتی از شدت رنگ بنفش تا سفید ایجاد میکند که این شدت رنگ معیاری از تعداد سلولهای زنده در محیط است. سپس میزان جذب نوری خانهها بهوسیله دستگاه الایزاریدر در طول موج 570 نانومتر اندازه گیری شد و توان حیاتی سلولهای تیمار شده نسبت به سلولهای شاهد (کنترل) محاسبه شد. نتایج حاصل بهصورت درصد مقادیر حاصل از کنترل بیان شد.
بررسی مورفولوژیکی سلولها: برای اینمنظور تصویر سلولهایی که بهمدت 48 ساعت با غلظتهای مختلف از پپتیدهای SP-H و SP(از غلظت 4-10 مولار تا 10-10 مولار) و سیستئین بهمیزان 4-10×5 میکرومولار تیمار شده اند، سلولهای شاهد که فاقد پپتید میباشد و کنترل منفی که حاوی سلول و محیط کشت بههمراه محلول تریتون (Triton-X100) X-100 4 درصد است توسط میکروسکوپ تمایز فازی (26) (Zeiss آلمان) با بزرگنمایی200 برابر بهدست آمد. لازم بهذکر است که بهدلیل زیاد بودن تعداد تصاویر حاصله از بین سلولهایی که با غلظتهای مختلف پپتیدی تیمار شده بودند، یک مورد (غلظتی که در آن بیشترین تاثیر دیده میشود) بهعنوان نمونه گزارش شد.
سنجش سمیت القا شده با H2O2. سپس بهمنظور بررسی اثر حفاظتی پپتید هموسیستئینه در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از پراکسیدهیدروژن، از H2O2 بهعنوان عامل القا کنندهی مرگ سلولی استفاده شد تا میزان رشد سلولها درحضور و عدم حضور یک عامل القا کنندهی مرگ سلولی نیز مورد بررسی قرار گیرد. بدین منظور بههر چاهک از ظروف کشت 96 خانه ای حدود 7000 سلول در 200 ماکرولیتر محیط کشت اضافه شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون، سلولها بهمدت 24 ساعت نیز با غلظتهای مختلف از H2O2 تیمار شدند و IC50 (half maximal inhibitory concentration) با استفاده از تست MTT تعیین شد.
اندازهگیری میزان تولید نیتریک اکسید درون سلولی. دراین آزمایش جهت تعیین میزان نیتریک اکسید تولید شده در سلول، از محلول گریس (19و27) با حساسیتpmol) 125) mM 5/2 نیترات (در آب دیونیزه یا آب مقطر) (Sensitivity: 2.5mM (125pmol) nitrite (deionized, distilled water) and Catalog Number: G2930) استفاده شد. روش گریس مبتنی بر اندازهگیری غیر مستقیم نیتریک اکسید است. نیتریک اکسید یک مولکول بهشدت ناپایدار بوده و نیمه عمر کوتاهی دارد، به ایندلیل اندازهگیری مستقیم آن نسبتا مشکل است اما این ماده سریعا به متابولیتهایی همچون نیتریت و یا نیترات تبدیل میشود که پایدار و قابل اندازهگیری بوده و سنجش آنها یک تخمین قابل اطمینان از برون ده نیتریک اکساید در محیط in vivo فراهم میآورد.
بهمنظور انجام تست ابتدا منحنی استاندارد رسم شد سپس سلولهایی که قبلا با پپتیدها بهمدت 24 ساعت تیمار شده بودند بهمنظور القای آپوپتوزیس، در معرض H2O2 با غلظت150 ماکرومولار بهمدت 3 ساعت قرار گرفتند. سپس 50 میکرولیتر از هر نمونه بهصورت 3 بار تکرار در هر چاهک از پلیت 96 خانهای ریخته شد و محلول گریس اضافه شد. برای اضافه کردن محلول گریس مراحل زیر انجام شد: ابتدا 50 میکرولیتـر محلول سـولفانیل آمید (Sulfanilamide Solution (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid)) روی نمونهها ریخته شد و بهمدت 10 دقیقـه در دمای اتاق و دور از نور انکوباسیون انجام شد، سپس 50 میکرولیتر محلول اتیلیندیآمیـد دی هیدروکلریـد (NEDSolution (0.1% N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride in water)) اضـافه شد و مجددا بهمدت 10 دقیقـه در دمای اتاق و دور از نور انکوباسیون صورت گرفت و رنـگ حاصـل در طـول مـوج 540 نـانومتر خوانـده شد. آنگاه جـذب نمونـههـا بـا جـذب اسـتاندارد (0 تـا 100 میکرومولار نیترات سدیم) مقایسه و میزان نیتریک اکسید تولید شده در مایع رویی کشت سلولی اندازه گیری شد.
آنالیز آماری
در این مطالعه، تمام آزمایشها بهصورت سه بار تکرار انجام شد. بــرای تجزیــه و تحلیــل آمــاری از برنامــه نــرم افــزاری) Statistical Package For Social Science (SPSS Statistics (Version 23)استفاده شد و نتایج بهصورت میانگین± انحراف معیار ) Mean ± (Standard Derivation (SD) گزارش شد. اختلاف آماری بین گروههای کنترل و تیمار شده با استفاده از آزمون t-test مورد ارزیابی قرار گرفت و 05/0p< از نظر آماری معنیدار تلقی شد (28).
نتایج
اثر غلظتهای مختلف از پپتید Substance P و substance p(lys-homocysteine) بر توان حیاتی سلولهای .PC12
بقای سلولهای PC12بعد از 48 ساعت تیمار کردن با غلظتهای مختلف از پپتید Substance P و substance p(lys-homocysteine) توسط تست MTT سنجیده و نتایج حاصل در شکل 1 آورده شده است.
شکل 1: اثر غلظتهای مختلف از پپتید Substance P و substance p(lys-homocysteine)در حضور سیستئین بر توان حیاتی سلولهای PC12 بعد از 48 ساعت تیمار کردن. نمونهها شامل سلول و محیط کشت به همراه غلظتهای مختلف پپتید (از غلظت 4-10 مولار تا 10-10 مولار) و سیستئین بهمیزان 4-10×5 میکرو مولار، شاهد (control) که تنها حاوی سلول، سیستئین و محیط کشت است و فاقد پپتید میباشد و چاهک حاوی سلول و محیط کشت که بههمراه تریتون (tri) 4 درصد بهمدت 2 ساعت تیمار شده است. تمام دادهها بهصورت میانگین± انحراف معیار نمایش داده شدهاند و 05 /0p<* و 0001 /0p<**، 00001 /0p<*** در مقایسه با گروه شاهد.
میزان افزایش رشد سلولهای PC12 نسبت به گروه شاهد در جدول 1 آمده است. ضمناً از اینجا به بعد بهمنظور ساده تر شدن، ترکیبات Cys+Substance P ، Cys+ substance p(lys-homocysteine) به اختصار و بهترتیب بهصورت (SP-H)+C و S+C نشان داده میشوند.
جدول1: درصد افزایش رشد سلولهای PC12 در نمونههای حاوی پپتید نسبت به گروه شاهد
غلظت نمونههای مختلف از پپتید(مولار) |
(SP-H)+C |
S+C |
|
|
9/39 |
75/28 |
|
5-10 |
67/46 |
32 |
|
6-10 |
65/78 |
55/38 |
|
7-10 |
42/53 |
65/33 |
|
8-10 |
175/47 |
5/27 |
|
9-10 |
5/27 |
25/26 |
|
10-10 |
25/25 |
07/25 |
همانطور که در جدول 1 دیده میشود بهطور کلی هر 2 ترکیب بهطور معنیداری (05/0p<) موجب افزایش رشد سلولها شدهاند اما روند این افزایش به گونهای میباشد که از غلظت 4-10 مولار تا 6-10 مولار رشد سلولها بهطور معنیدار(05/0p<) بیشتر شده است به نحوی که میزان افزایش رشد با افزودن: (SP-H)+C از 9/39 درصد نسبت به گروه شاهد به 65/78 درصد، SP)+C ) از 75/28 درصد نسبت به گروه شاهد به 55/38 درصد رسیده است. اما از غلظتهای 6-10 مولار تا 10-10 مولار روند افزایش رشد بهطور معنیداری (05/0p<) کمتر شده است بهنحوی که میزان افزایش رشد در مجاورت: (SP-H)+C از 65/78 درصد نسبت به گروه شاهد به 25/25 درصد، SP)+C) از 55/38 درصد نسبت به گروه شاهد به 07/25 درصد رسیده است. حداکثر میزان افزایش رشد در هر یک از گروهها مربوط به غلظت 6-10 مولار میباشد. کمترین میزان رشد نیز در چاهک محتوی تریتون دیده شد زیرا تریتون روی رشد اثر منفی داشته و باعث از بین بردن سلولها میشود.
بررسی تغییرات مورفولوژیکی سلولهای PC12 در اثر تاُثیر نمونههای مختلف پپتیدی
بهمنظور بررسی کیفی تغییرات مورفولوژیکی در اثر تاثیر نمونههای مختلف پپتیدی بهعنوان نمونه غلظت 6-10 مولار از پپتیدها که در آن غلظت بیشترین تاثیر دیده میشود انتخاب و تصویر سلولهای مواجه یافته با این غلظت از پپتیدهای (SP-H)+C و SP)+C)، سلولهای شاهد که فاقد پپتید میباشد و سلولهایی که حاوی محلول تریتون (tri)4 درصد است در شکل 2 آورده شده است.
شکل2: تغییرات مورفولوژیکی سلولها: A سلولهای شاهد ، B سلولهای حاوی (S+C) 6-10 مولار، C سلولهای حاوی (H+C) 6- 10مولار D سلولهای حاوی محلول تریتون
همانطور که در شکل 2 مشخص است سلولهای حاوی پپتید هیچگونه تغییر مورفولوژیکی مشخصی نسبت به سلولهای شاهد نداشتند اما سلولهایی که با تریتون مواجه داشتند تحت تاثیر تریتون تغییر شکل واضحی داشته اند به گونهای که از فرم دوکی شکل و چسبنده خارج شده، پاهای کاذب خود را از دست داده و به فرم دایرهای و تحلیل رفته تبدیل شدهاند، محتوای سلولی برخی از آنها نیز به بیرون ریخته و روی سطح محیط کشت شناور باقی ماندهاند.
سنجش سمیت القا شده با H2O2
سپس بهمنظور القای استرس اکسیداتیو از H2O2 بهعنوان اکسیدان استفاده شد تا اثر محافظتی نمونههای پپتیدی فوق الذکر در برابر تغییر اعمال شده در ریز محیط مورد بررسی شود. ابتدا غلظتی از H2O2 که در آن نیمی از توان حیاتی سلولهای PC12 کاهش مییابد توسط تست MTT تعیین شد و سپس به بررسی تست NO در غلظت بهدست آمده پرداخته شد.
شکل3: اثر غلظتهای مختلف پراکسیدهیدروژن بر توان حیاتی سلولهای PC12 بعد از 24 ساعت تیمار کردن. نمونهها شامل سلول و محیط کشت بههمراه غلظتهای مختلف پراکسیدهیدروژن (از غلظتg/ml µ400 تا g/ml µ1/3)، شاهد (control) که تنها حاوی سلول و محیط کشت است و فاقد H2O2 میباشد. تمام دادهها بهصورت میانگین± انحراف معیار نمایش داده شدهاند و 05 /0p<* و 0001 /0p<**، 00001 /0p<***، 000001 /0p<**** در مقایسه با گروه شاهد.
همانطور که از شکل 3 مشخص است غلظت g/ml µ 150 از H2O2بر توان حیاتی سلولهای PC12 اثر مهاری داشته و میتواند نیمی از آنها را بعد از 24 ساعت تیمار کردن از بین ببرد.
اندازهگیری میزان تولید نیتریک اکسید درون سلولی
در نمودار زیر میزان نیتریک اکسید تولید شده توسط نمونههای انتخابی از سلولها در حضور و عدم حضور H2O2 نشان داده شده است.
شکل4: تست :NO بررسی مقایسهای میزان نیتریک اکسید تولید شده از نمونههای انتخابی در حضور و عدم حضور H2O2. چاهکها محتوی سلول و محیط کشت هستند بههمراه غلظتهای 6-10 یا 7-10 مولار از نمونههای مختلف پپتیدی که نیمی از چاهکها بهمدت 3 ساعت با H2O2 (150 ماکرومولار) تیمار شدند، گروه شاهد (CG)که تنها حاوی سلول، سیستئین و محیط کشت است و کنترل منفی (NC) که حاوی سلول، سیستئین، محیط کشت و H2O2 است. تمام دادهها بهصورت میانگین± انحراف معیار نمایش داده شدهاند و001 /0p<*، 0001/0p<** و 00001/0p<*** در مقایسه با گروه کنترل مثبت و 00001 /0 ,*p< 000001 /0 **p< و 0000001 /0***p< در مقایسه با گروه کنترل منفی.
جدول2: درصد کاهش تولید NO درون سلولیِ نمونههای انتخابی (شامل سلول، سیستئین و محیط کشت به همراه غلظتهای 6-10 یا 7-10 مولار پپتید) در حضور H2O2 نسبت به کنترل منفی (حاوی H2O2و بدون پپتید) و عدم حضور H2O2 نسبت به گروه شاهد (فاقد H2O2و بدون پپتید)
غلظت نمونههای مختلف از پپتید (مولار) |
درصد کاهش تولید NO در حضور H2O2 |
درصد کاهش تولید NO در عدم حضور H2O2 |
(SP-H)+C6-10 |
36 |
49 |
7-10(SP-H)+C |
24 |
32 |
SP+C6-10 |
14 |
22 |
SP+C7-10 |
5 |
17 |
چنانچه در جدول 2 مشاهده میشود در حضور و عدم حضور H2O2 هر دو ترکیب بهطور معنیداری (05/0p<) موجب کاهش تولید NO درون سلولی شدهاند و این کاهش بهنحوی است که در شرایط عدم وجود پراکسید هیدروژن، در غلظت 6-10 مولار، پپتید هموسیستئینه توانسنته 27 درصد بیشتر از پپتید طبیعی منجر به کاهش تولید NO شود و در غلظت 7-10 مولار نیز پپتید هموسیستئینه توانسنته 15 درصد بیشتر از پپتید طبیعی تولید NO را کاهش دهد و شدت تاثیر هموسیستئینه شدن Substance p در میزان تولید NO به گونه ای بوده است که حتی در شرایطی که یک عامل مهار کنندهی رشد مثل H2O2 نیز در محیط وجود داشته باشد توانسته بهخوبی منجر به کاهش درصد تولید NO شود چنانچه در حضور H2O2 در غلظت 6-10 مولار، پپتید هموسیستئینه 22 درصد بیشتر از پپتید طبیعی منجر به کاهش تولید NO شده است و در غلظت 7-10 مولار 19 درصد بیشتر از پپتید طبیعی تولید NO را کاهش داده است.
بحث
یکی از انواع گونههای فعال اکسیژن (ROS)، پراکسید هیدروژن است که بسته به غلظت آن در درون سلول، در بسیاری از مسیرهای انتقال پیام و تصمیمات سلولی دخیل است.
در سلولهای سرطانی بهدلایل مختلفی چون فعالیت متابولیک بالا، مسیرهای انتقال پیام، اختلال عملکرد میتوکندری، فعال شدن آنکوژنها سطح ROS افزایش مییابد. گرچه سلولهای سرطانی قادر هستند
واکنشهای سازگاری ایجاد کنند تا بتوانند فنوتیپهای بدخیم خود را حفظ کنند، با این حال هنگامی که تعادل مجدد سلولهای سرطانی شدیدا مختل میشود، در اثر استرس اکسیداتیو حاصله خسارات فراوانی به بار میآید که نهایتا میتواند با فعال کردن مسیرآپوپتوز و یا نکروزه کردن سلولها منجر به مرگ سلول شود. (24، 25، 29، 30)
یکی دیگر از انواع ROS نیتریک اکسید است. غلظت فیزیولوژیک واقعی NO در سلولها بسیار پایین است (20 تا 100 نانومولار) است. وقتی غلظت نیتریک اکسید در سلول کم باشد، اثرات موافق با تومور اتفاق میافتد که شامل: تکثیر، رگزایی، تهاجم، متاستاز و سرکوب آپوپتوز میباشند و در غلظتهای بالا اثرات ضد توموری و مرگ سلولی اتفاق میافتد که شامل آسیب DNA، استرس اکسیداتیو/ نیتروزاتیو (Oxidative/ Nitrosative Stress )، سمیت سلولی و آپوپتوزیس است. مطالعات متعددی این اثر وابسته به غلظت را روی سلولهای مختلف نشان دادهاند. به عنوان مثال در سلولهای PC12 به خوبی نشان داده شده است که غلظت پایینNO و اهدا کنندهی NO (DETA) (NO donors (Diethylenetriamine Nitric Oxide Adduct) بهطور قابل توجهی باعث تحریک تکثیر شدهاند در حالی که غلظت بالا (200 تا600 نانومتر NO) مانع از تکثیر شده است. این روند درسلولهای کراتینوسیت (Keratinocytes )، هپاتو کارسینوما (Hepatocellular Carcinoma)، لوسمی انسانی(HL-60) (Human Leukemia (HL-60)) نیز دیده شد و افزایشiNOS یکی از شاخصهای تشخیص تومور در سلولهای گلیوبلاستوما (Glioblastoma) است. همچنین یافتههای محققین نشان میدهد که آپوپتوز ناشی از NO در سلولهای PC12 به فعالیت p53 بستگی دارد و مستقیما شامل رونویسی ژن آپوپتوزیس، فعالسازی کاسپاز (Caspaseactivation)، دپلیمریزاسیون غشا میتوکندری و تقسیم هسته ای DNA میشود (19و30).
پراکسیدهیدروژن یکی از عوامل افزایشNO درون سلول است زیرا آنزیم iNOS قادر است L-Arg را توسط H2O2 اکسید کرده و منجر به تولیدNO شود. از طرفی علاوه بر این که افزایش غلظت H2O2 و NO هر دو برای سلول سمی است از واکنش آنها با هم امکان تشکیل پراکسی نیتریت به وجود میآید که بسیار سمیتر است و موجب آسیب شدیدتر به سلولهای تومور میشود (31).
لذا در صورتی که تاثیر نمونههای مورد مطالعه بر رشد سلولهای سرطانی مثبت باشد، میتوان از H2O2 برای ایجاد استرس اکسیداتیو استفاده کرد (32) و میزان تولید NO در برابر سمیت پراکسید هیدروژن را نیز مورد مطالعه قرار داد تا مشخص شود که آیا نمونههای مورد مطالعه میتوانند سلول را در برابر سمیت پراکسید هیدروژن در غلظتی که برای سلول سمی و کشنده است نیز محافظت کند. سنجش توان حیاتی سلولها با استفاده از تست MTT نشان داد که در حضور سیستئین، پپتید SP باعث افزایش رشد سلولهای PC12 میشود و هموسیستئینه شدن این پپتید باعث افزایش بیشتر رشد این سلولها خصوصاً در غلظت 1میکرومولار میشود به نحوی که همان طور که در شکل 2 دیده میشود، به لحاظ کیفی هیچ گونه تغییر مورفولوژیکی (26) مشخصی بین سلولهایی که در معرض SP+C و SP-H+C قرار گرفتهاند با سلولهایی که در معرض آنها قرار نداشتهاند وجود ندارد. مطالعات محققین نشان میدهد که SP با مکانیسمهای مختلفی میتواند از طریق گیرنده NK1 باعث افزایش رشد سلول شود. بهعنوان مثال فعالسازی مسیر MAPK و تحریک میتوز در سلولهای استروما (U-373MG Astrocytoma Cell Line) (29)، کاهش آپوپتوزیس از طریق مسیر انتقال پیام Akt در سلولهای کاردیومیوسیت (Cardiomyocytes) موش و افزایش تکثیر و کاهش آپوپتوزیس از طریق فعال شدن مسیر Akt / GSK-3β (Human Retinal Pigment Epithelium Cell Line) درسلولهای RPE (Human Retinal Pigment Epithelium Cell Line) چشم که باعث نجات سلولها از مرگ القا شده توسط اکسیدان H2O2 شده است (33). نتایج حاصل از اندازهگیری میزان تولید نیتریک اکسید درون سلولی با استفاده از تست NO در حضور و عدم حضور (g/mlµ150) H2O2 در شکل 4 نیز به خوبی نشان میدهد که بهطور کلی میزان تولید NO در سلولهایی که در معرض (g/mlµ150) H2O2 و سیستئین همراه با پپتیدهای SP و SP-H بودهاند از سلولهای کنترل منفی که حاوی (g/mlµ150) H2O2 بوده اما با نمونههای پپتیدی و سیستئین تیمار نشده بودند کمتر میباشد و این کاهش معنیدار، در میزان تولید NO در سلولهایی که در معرض سیستئین و پپتیدهای SP و SP-H بودهاند نسبت به سلولهای کنترل مثبت که فاقد H2O2 بوده و با نمونههای پپتیدی و سیستئین هم تیمار نشده بودند مشاهده میشود. بنابراین حضورSP+C و SP-H+C باعث کاهش میزان تولید NO در سلولهای PC12 شده است. البته مکانیسم مولکولی که مسبب این کاهش است تاکنون گزارش نشده است (34). اما از آنجاییکه NOS1 و NOS3 غلظت نانومولار NO را برای دورههای بسیار کوتاه مدت (ثانیه / دقیقه) تولید میکنند و NOS2 غلظت میکرومولار NO را برای دورههای زمانی طولانی (ساعت و روز) تولید میکند و نقش موثرتری در سرطان دارد (19)، همچنین گزارش شده است که افزایش بیش از حد NO درون سلولی خود اثر منفی بر تولید بیشتر آن دارد (35)، بهنظر میرسد نمونههای پپتیدی قادر خواهند بود با یک بازخورد منفی در مهار و یا کاهش بیان این آنزیم تاثیرگذار باشند. همچنین چنانچه از جدول 2 مشخص است کهSP-H+C تأثیر بیشتری در تولید NO نسبت به SP+C دارد. این امر میتواند نشان دهنده این موضوع باشد که در برخی بیماریها مثل سرطان که میزان SP و هموسیستئین خون افزایش مییابد، تشکیلSP-H میتواند از طریق کاهش تولید نیتریک اکسید درون سلولی و حفاظت در برابر استرس اکسیداتیو باعث افزایش رشد بیشتر سلولهای سرطانی شده و روند پیشرفت سرطان را سرعت بخشد.
نتیجهگیری
بنابراین با توجه به اینکه در درمان سرطان یکی از روشهای پیشنهادی استفاده از آنتاگونیستهای Substance P میباشد در طراحی آن بایستی این نکته مورد توجه قرار گیرد که آنتاگونیست طراحی شده علاوه بر ممانعت از فعال سازی NK1، مانع از هموسیستئینه شدن SP در خون نیز شود.
تشکر و قدردانی
از حمایتهای ﮔﺮوه بیوفیزیک و بیوشیمی بخش فناوری زیستی دانشگاه صنعتی مالک اشتر در انجام این پروژه ﺻﻤﻴﻤﺎﻧﻪﻗﺪرداﻧﻲ ﻣﻲﺷﻮد.