در حال حاضر سرطان پس از بیماری­های قلبی-عروقی دومین عامل مرگ و میر در کشورهای پیشرفته می‫باشد (1, 2). عوامل مختلفی در افزایش رشد سلول­های سرطانی دخیل هستند که شناسایی آن‫ها می­تواند در جهت کنترل و ممانعت از پیشرفت بیماری موثر بوده و محققین را در راستای کشف اقدامات پیشگیرانه یاری دهد. پپتید Substance P(SP) به فرمول C63H98N18O13S یکی از اعضای خانواده‌ی نوروپپتیدهای Tachykinin است که متشکل از 11 باقی­مانده‌ی اسیدآمینه‌ای (RPKPQQFFGLM) Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met-NH2 می‌باشد.  SP عملکردهای فیزیولوژیکی متعددی در بدن داشته و در کنترل سیستم قلبی عروقی، انقباضات روده­ای و کاهش فشار خون نقش دارد و همچنین با احساس درد و پاسخ‌‌های عصبی در ارتباط است. این پپتید توان و اختصاصیت بالایی دارد به گونه‌ای که حتی با غلظت­های نانومولار به‫خوبی در سطح سلول­های حاوی NK1 (Neurokinin1) (گیرنده‫ی اختصاصی (SP جذب می­شود (3-5). NK1‫، بین غشایی بوده و دارای 407 آمینواسید، با وزن مولکولی 58 کیلودالتون می­باشد که 7 دمین بین غشایی هیدروفوب به‫همراه 3 لوپ خارج سلولی و 3 لوپ داخل سلولی را تشکیل می­دهند. لوپ­ها جایگاه­های عملکردی برای واکنش با G-پروتئین­ها دارند (3). فعال شدن NK1 توسط Substance P منجر به هیدرولیز فسفواینوزیتید هیدرولاز، تجمع کلسیم و فعال‫سازی MAPK (Phosphoinositide Hydrolysis) (6و7) شده و می­تواند باعث تکثیر سلول‫های توموری، رگزایی (Angiogenesis)،  مهاجرت و متاستاز ­شود. بنابراین مسیر انتقال پیامSP / NK1، نقش مهمی در پیشرفت سرطان ایفا ­می­کند به گونه­ای که تاکنون نقش SP به‫عنوان میتوژن از طریق گیرنده NK-1 در چندین نوع از سرطان‫های انسانی شامل آستروسیتوم، ملانوم، نوروبلاستوما، گلیوم، رتینوبلاستوما و همچنین پانکراس، حنجره، روده بزرگ، کارسینوم معده، لوسمی و سرطان سینه به اثبات رسیده است.  همچنین تحقیقات نشان داده­اند در سرطان سینه انتقال پیامSP / NK1 موجب فعال‫سازی گیرنده­های RTK (Receptor Tyrosine Kinases) مثل EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) شده و مقاومت دارویی را افزایش می­دهد. به‫علاوه میزان بیان این پپتید و گیرنده­اش NK1))، در سلول­های توموری نسبت به نمونه­های سالم آن‫ها و نیز برخی دیگر از بیماری­ها مثل افسردگی افزایش پیدا می‫کند. بنابراین امروزه طراحی آنتاگونیست مناسب که مانع از اتصال Substance Pبه NK1  شود در درمان سرطان بسیار مورد توجه قرار گرفته است (8-12). اما با این وجود هنوز نقاط مبهم زیادی در این رابطه وجود دارد و بسیاری از مکانیسم­ها ناشناخته هستند.

 هموسیستئین  (Hcy) با فرمول HSCH2CH2CH(NH2) CO2H مشتقی از اسیدآمینه‌ی سیستئین بوده که طی حذف گروه متیل، در یک فرآیند چند مرحله‌ای، از متیونین تولید می‌شود (13). هایپرهموسیستئینمی یا افزایش سطح پلاسمایی هموسیستئین، که در بسیاری از جوامع شیوع دارد، نقص ژنتیکی مرتبط با متابولیسم اسیدآمینه‌ی متیونین است که در برخی بیماری­ها مثل بعضی از سرطان­ها و افسردگی نیز دیده می­شود. یکی از مسیرهایی که عمدتا در اثر افزایش سطح Hcy و در اختلال‌‌ هایپرهموسیستئینمی اتفاق می‌افتد،  متابولیزه شدن Hcy توسط آنزیم متیونین-tRNA-سنتتاز (MetRS) و ایجاد هموسیستئین تیولاکتون  (tHcy)است که یک مشتق تیواستری می‌باشد (14). گروه­های ε-آمینوی زنجیره‌ی جانبی آمینواسید لیزین در ساختار پروتئین‌‌ها، تحت شرایط فیزیولوژیک و در حضورtHcy، و به‫دلیل فعالیت بالای باند تیواستری آن، می‌توانند به‫راحتی و به صورت غیر­­آنزیمی و غیر­اختصاصی با اتصالی آمیدی و ایجاد پیوندی ایزوپپتیدی، طی فرآیندی به نام N-هموسیستئینی شدن، هموسیستئینه شوند (15). در نتیجه با افزایش سطح Substance P و هموسیستئین تیولاکتون در بدن امکان تشکیل substance p(lys-homocysteine)  و بروز طبعات ناشی از آن وجود دارد.

هیپوکسی (Hypoxia ) شرایطی است که در آن سطح اکسیژن بافت کاهش می­یابد و به‫عنوان شرایط پاتوفیزیولوژیک ریزمحیط اطراف تومورهای جامد شناخته می­شود. تحقیقات نشان می­دهند که هیپوکسی یکی از دلایل پیشرفت سرطان است و می­تواند منجر به شکل‫گیری تومورهای بدخیم شود به گونه‫ای که امروزه توجه به این مسئله در درمان سرطان بسیار اهمیت پیدا کرده و اثرات آن در پاسخ به رادیوتراپی و شیمی­درمانی نیز مورد مطالعه قرار گرفته است. مکانیسم مرتبط با این اثرات مربوط به فاکتور القاکننده­ی هیپوکسی (HIF) (Hypoxia-Inducible Factor (HIF) Family Of Transcription Factors ) است که از خانواده‫ی فاکتورهای رونویسی است و در شرایط هیپوکسی حاد یا مزمن می­تواند منجر به افزایش رونویسی ژن­های هدف شود. این فاکتور یک عامل تنظیم کننده­ی بسیاری از فرآیندهای مهم سلولی مثل آپوپتوزیس، تکثیر سلولی، رگزایی و متابولیسم گلوکز است. بنابراین، هیپوکسی، بی‫ثباتی ژنتیکی، تشکیل سلول­های خونی و متابولیسم بی­هوازی را افزایش می­دهد. فشار خون بالا، افزایش فشار مایع بینابینی (Interstitial Fluid Pressure)، گلوکز پایین و غلظت بالای لاکتات ناشی از غلبه­ی متابولیسم بی­هوازی، باعث کاهش pH خارج سلولی در بافت­های تومور( اسیدوز تومور) می­شود (16و17).

NO درون سلولی، ﺗﻮﺳــﻂ آﻧــﺰﻳﻢ­هایی ﻛــﻪ ﻧﻴﺘﺮﻳــﻚ اﻛﺴﻴﺪ ﺳﻨﺘﺎز (NOS) (Nitric Oxide Synthase) ﻧﺎﻣﻴﺪه ﻣﻲﺷﻮند ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻣﻲﮔـﺮدد .ﺳـﻪ  ﻓــﺮم اﺻــﻠﻲ از اﻳــﻦ آﻧــﺰﻳﻢ وﺟــﻮد دارد. NOS ﻋﺼــﺒﻲnNOS) )،  NOS  اﻧـــﺪوﺗﻠﻴﺎل(eNOS) و NOS اﻟﻘﺎﻳﻲ (iNOS) که در ﭘﺎﺳﺦ ﺑﻪ ﻣﺤﺮک­ﻫﺎ ﺑﻴﺎن ﻣـﻲ‫شوند. هر سه ایزوفرم در ﺳﻴﺘﻮﭘﻼﺳﻢ وﺟﻮد دارند. ﺑﻪ ﺗﺎزﮔﻲ NOS ﻣﻴﺘﻮﻛﻨــﺪرﻳﺎﻳﻲ (mNOS) نیز ﻛﺸــﻒ ﺷــﺪه ﻛــﻪ ﻣﻨﺤﺼــرا درﻣﻴﺘﻮﻛﻨﺪری وﺟﻮد دارد. ﻫﻤﻪ آﻧﺰﻳﻢﻫﺎی NOS ﺑﻪ‫ﺻﻮرت ﻫﻤﻮداﻳﻤﺮ ﻋﻤﻞ ﻣﻲﻛﻨﻨﺪ. آنﻫﺎ ﻧﻴﺘﺮﻳﻚ اﻛﺴﻴﺪ را ﻃـﻲ دو مرحله اکسیداسیون آمینواسید L- آرژﻧﻴﻦ ﺑﻪ L- ﺳﻴﺘﺮوﻟﻴﻦ وNO ، از ﻃﺮﻳﻖ ﺗﺮﻛﻴﺐ واﺳﻂ N-ﻫﻴﺪروﻛﺴﻲ L- آرژﻧﻴﻦ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻣﻲﻛﻨﻨﺪ. عملکرد NO  عمدتا از طریق چرخه­ی وابسته به cGMP (Cyclic Guanosine Monophosphate) است و گزارش شده است که NO نیز در صورتی‫که به‫میزان کم در سلول تولید شود به‫عنوان یک مبدل پیام عمل کرده و بر بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی مانند تنظیم جریان خون، هوموستاز آهن و انتقال نورونی تاثیر می­گذارد. اما در سطح بالا باعث تخریب DNA و آپوپتوزیس می­شود (18و19).

 رده­ی سلولی PC12 نوعی سلول سرطانی بوده که از فئوکروموسایتومای موش صحرایی جدا می­شود. این سلول در محیط کشت رشد نموده و می­تواند ویژگی­های سلول‫های عصبی را نشان دهد (20و21)، همچنین دارای گیرنده‫ی اختصاصی Substance P یعنی NK1 در سطح خود می­باشد (22).

در این تحقیق، به‫منظور شبیه سازی ریزمحیط احیا و هیپوکسی اطراف سلول­های سرطانی از سیستئین به‫عنوان یک ماده­ی احیاء کننده در غلظتی که برای سلول­ها سمی نیست(23)، استفاده شده است و تاثیر Substance P هموسیستئینه و طبیعی در حضور سیستئین بر میزان رشد سلول­های سرطانی PC12 بررسی شد. در ادامه تغییرات ریخت شناسی سلول PC12 تحت تاثیر هر دو نوع پپتید و میزان تولید NO در برابر سمیت پراکسید هیدروژن مورد مطالعه قرار گرفت.  H₂O₂ می­تواند به DNA هسته و DNA میتوکندری هر دو آسیب رسانده، موجب افزایش بیان مولکول­های چسبنده­ی سلولی شده، فعالیت P53 و دیگر فاکتور­های رونویسی که باعث مرگ سلول سرطانی می­شوند را افزایش ­دهد (24و25).

مواد و روش‌ها

سلول­های PC12 از انستیتو پاستور تهران تهیه شد. مواد مورد نیاز کشت سلولی (شامل پنی سیلین-استرپتومایسین، سرم جنین گاوی و گلوتامین) از شرکت Gibco، فلاسک­ها و میکروپلیت­ها از شرکت پارس آزمون، سیستئین از شرکت Sigma و مواد مورد نیاز برای واکنش گریس (Griess Reaction) از شرکت Promega خریداری شدند.

سلول­ها در محیط کشت RPMI(Gibco) 1640 حاوی NaHCO3 و HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid ) Mm) 10) به‫همراه سرم جنین گاوی FBS (Fetal Bovine Serum)) 10 درصد (W/V) که سیستم کمپلمان آن با گرما غیرفعال شده، گلوتامکس (Glutamax(dipeptide L-alanyl-L-glutamine))  1 درصد (V/V) و آنتی بیوتیک 1 درصد (V/V) درون فلاسک کشت سلول T-25 (NUNC) در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی­گراد حاوی  CO₂5 درصد، 95 درصد هوا و رطوبت کافی کشت داده شدند. پس از 48 ساعت محیط کشت قدیمی با محیط کشت تازه تعویض شد. هنگامی که سلول­ها، 70 تا 80 درصد از کف فلاسک را فرا گرفتند، پاساژ سلول­ها با استفاده از محلول Trypsin-EDTA (200 Unit/ml)، انجام گرفت و با پاساژ دادن سلول­ها در فاز لگاریتمی رشد نگهداری شدند (16).

 پپتید­های Substance P  با خلوص(HPLC)  84/96 درصد و وزن مولکولی 63/1347  gr/molو  substance p(lys-homocysteine)  با خلوص (HPLC)  92/95 درصد و وزن مولکولی 82/1463 gr/mol  توسط شرکت ProteoGenix SAS فرانسه تهیه شدند .

فعالیت متابولیکی سلول­های انکوبه شده در حضور غلظت‫های مختلف از پپتید و سیستئین با استفاده از تست MTT (MTT assay) مورد ارزیابی قرار گرفت.

در این روش مقداری از MTT (MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)) زرد رنگ که وارد سلول‫های زنده می­شود، توسط آنزیم دهیدروژناز این سلول­ها احیا  می­شود و رسوب بنفش رنگی ایجاد می­کند که به‫روش اسپکتروسکوپی قابل اندازه‫گیری است. برای تهیه­ی استوک MTT، 5 میلی­گرم از این ترکیب در 1 میلی‫لیتر بافر نمکی فسفات حل شد. به‫هر چاهک از ظروف کشت 96 خانه‫ای 10000 سلول در 200 میکرولیتر محیط کشت اضافه شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون سلول­ها به مدت 48 ساعت با غلظت­های مختلف پپتید (از غلظت ^4-10  مولار تا ^10-10 مولار) و سیستئین به‫میزان ^4-10×5 میکرومولار تیمار شدند. سپس محیط کشت رویی خارج و 5 میکرولیتر از استوکMTT به هر چاهک اضافه شد. پس از چهار ساعت نگه‫داری در انکوباتور 37 درجه به‫دنبال خروج محیط رویی واکنش، با اضافه کردن 100 میکرو لیتر DMSO متوقف شد. این محلول باعث حل شدن بلورهای فرمازان (Formazan) شده و درجات متفاتی از شدت رنگ بنفش تا سفید ایجاد می­کند که این شدت رنگ معیاری از تعداد سلول­های زنده در محیط است. سپس میزان جذب نوری خانه­ها به‫وسیله دستگاه الایزاریدر در طول موج 570 نانومتر اندازه گیری شد و توان حیاتی سلول­های تیمار شده نسبت به سلول­های شاهد (کنترل) محاسبه شد. نتایج حاصل به‫صورت درصد مقادیر حاصل از کنترل بیان شد.

بررسی مورفولوژیکی سلول­ها: برای این‫منظور تصویر سلول­هایی که به‫مدت 48 ساعت با غلظت‫های مختلف از پپتیدهای SP-H و SP(از غلظت ^4-10  مولار تا ^10-10 مولار) و سیستئین به‫میزان  ^4-10×5 میکرومولار تیمار شده اند، سلول­های شاهد که فاقد پپتید می­باشد و کنترل منفی که حاوی سلول و محیط کشت به‫همراه محلول تریتون (Triton-X100)  X-100 4 درصد است توسط میکروسکوپ تمایز فازی (26) (Zeiss آلمان) با بزرگنمایی200 برابر به‫دست آمد. لازم به‫ذکر است که به‫دلیل زیاد بودن تعداد تصاویر حاصله از بین سلول­هایی که با غلظت­های مختلف پپتیدی تیمار شده بودند، یک مورد (غلظتی که در آن بیشترین تاثیر دیده می­شود)  به‫عنوان نمونه گزارش شد.

سنجش سمیت القا شده با H₂O₂. سپس به‫منظور بررسی اثر حفاظتی پپتید هموسیستئینه در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از پراکسیدهیدروژن، از H₂O₂ به‫عنوان عامل القا کننده­ی مرگ سلولی استفاده شد تا میزان رشد سلول­ها درحضور و عدم حضور یک عامل القا کننده­ی مرگ سلولی نیز مورد بررسی قرار گیرد. بدین منظور به‫هر چاهک از ظروف کشت 96 خانه ای حدود 7000 سلول در 200 ماکرولیتر محیط کشت اضافه شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون، سلول­ها به‫مدت 24 ساعت نیز با غلظت­های مختلف از H₂O₂ تیمار شدند و IC50 (half maximal inhibitory concentration) با استفاده از تست MTT تعیین شد.

 اندازه‫گیری میزان تولید نیتریک اکسید درون سلولی. دراین آزمایش جهت تعیین میزان نیتریک اکسید تولید شده در سلول­، از محلول گریس (19و27) با حساسیتpmol) 125) mM 5/2 نیترات (در آب دیونیزه یا آب مقطر) (Sensitivity: 2.5mM (125pmol) nitrite (deionized, distilled water) and Catalog Number: G2930) استفاده شد. روش گریس مبتنی بر اندازه­گیری غیر مستقیم نیتریک اکسید است. نیتریک اکسید یک مولکول به‫شدت ناپایدار بوده و نیمه عمر کوتاهی دارد، به این‫دلیل اندازه‫گیری مستقیم آن نسبتا مشکل است اما این ماده سریعا به متابولیت­هایی همچون نیتریت و یا نیترات تبدیل می­شود که پایدار و قابل اندازه‫گیری بوده و سنجش آن‫ها یک تخمین قابل اطمینان از برون ده نیتریک اکساید در محیط in vivo  فراهم می­آورد.

به‫منظور انجام تست ابتدا منحنی استاندارد رسم شد سپس سلول­هایی که قبلا با پپتیدها به‫مدت 24 ساعت تیمار شده بودند به‫منظور القای آپوپتوزیس، در معرض H2O2 با غلظت150 ماکرومولار به‫مدت 3 ساعت قرار گرفتند. سپس 50 میکرولیتر از هر نمونه به‫صورت 3 بار تکرار در هر چاهک از پلیت 96 خانه‫ای ریخته شد و محلول گریس اضافه شد. برای اضافه کردن محلول گریس مراحل زیر انجام شد: ابتدا 50 میکرولیتـر محلول سـولفانیل آمید (Sulfanilamide Solution (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid)) روی نمونه­ها ریخته شد و به‫مدت 10 دقیقـه در دمای اتاق و دور از نور انکوباسیون انجام شد، سپس 50 میکرولیتر محلول اتیلین­دی­آمیـد دی هیدروکلریـد (NEDSolution (0.1% N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride in water))  اضـافه شد و مجددا به‫مدت 10 دقیقـه در دمای اتاق و دور از نور انکوباسیون صورت گرفت و رنـگ حاصـل در طـول مـوج 540 نـانومتر خوانـده شد. آنگاه جـذب نمونـه­هـا بـا جـذب اسـتاندارد (0 تـا 100 میکرومولار نیترات سدیم) مقایسه و میزان نیتریک اکسید تولید شده در مایع رویی کشت سلولی اندازه گیری شد.

آنالیز آماری

در این مطالعه، تمام آزمایش­ها به‫صورت سه بار تکرار انجام شد. بــرای تجزیــه و تحلیــل آمــاری از برنامــه نــرم افــزاری) Statistical Package For Social  Science (SPSS Statistics (Version 23)استفاده شد و نتایج به‫صورت میانگین± انحراف معیار ) Mean ± (Standard Derivation (SD)  گزارش شد. اختلاف آماری بین گروه­های کنترل و تیمار شده با استفاده از آزمون t-test مورد ارزیابی قرار گرفت و 05/0p< از نظر آماری معنی‫دار تلقی شد (28).

نتایج

اثر غلظت­های مختلف از پپتید Substance P و substance p(lys-homocysteine) بر توان حیاتی سلول­های .PC12

بقای سلول­های  PC12بعد از 48 ساعت تیمار کردن با غلظت­های مختلف از پپتید Substance P و substance p(lys-homocysteine) توسط تست MTT سنجیده و نتایج حاصل در شکل 1 آورده شده است.

شکل 1: اثر غلظت­های مختلف از پپتید Substance P و  substance p(lys-homocysteine)در حضور سیستئین بر توان حیاتی سلول­های PC12 بعد از 48 ساعت تیمار کردن. نمونه­ها شامل سلول و محیط کشت به همراه غلظت­های مختلف پپتید (از غلظت 4-10 مولار  تا 10-10 مولار) و سیستئین به‫میزان ^4-10×5 میکرو مولار، شاهد (control) که تنها حاوی سلول، سیستئین و محیط کشت است و فاقد پپتید می­باشد و چاهک حاوی سلول و محیط کشت که به‫همراه تریتون (tri) 4 درصد به‫مدت 2 ساعت تیمار شده است. تمام داده­ها به‫صورت میانگین± انحراف معیار نمایش داده شده­اند و 05 /0p<* و 0001 /0p<**، 00001 /0p<*** در مقایسه با گروه شاهد.

میزان افزایش رشد سلول­های PC12 نسبت به گروه شاهد در جدول 1 آمده است. ضمناً از اینجا به بعد به‫منظور ساده تر شدن، ترکیبات Cys+Substance P ، Cys+ substance p(lys-homocysteine) به اختصار و به‫ترتیب به‫صورت  (SP-H)+C و S+C نشان داده می‫شوند.

جدول1: درصد افزایش رشد سلول­های PC12 در نمونه­های حاوی پپتید نسبت به گروه شاهد

همان‫طور که در جدول 1 دیده می­شود به‫طور کلی هر 2 ترکیب به‫طور معنی­داری (05/0p<) موجب افزایش رشد سلول­ها شده­اند اما روند این افزایش به گونه­ای می­باشد که از غلظت ^4-10 مولار تا ^6-10 مولار رشد سلول­ها به‫طور معنی­دار(05/0p<) بیشتر شده است به نحوی که میزان افزایش رشد با افزودن: (SP-H)+C از 9/39  درصد نسبت به گروه شاهد به 65/78 درصد، SP)+C ) از 75/28 درصد نسبت به گروه شاهد به 55/38 درصد رسیده است. اما از غلظت­های ^6-10 مولار تا ^10-10 مولار روند افزایش رشد به‫طور معنی‫داری (05/0p<) کمتر شده است به‫نحوی که میزان افزایش رشد در مجاورت: (SP-H)+C از 65/78 درصد نسبت به گروه شاهد به 25/25 درصد، SP)+C) از 55/38 درصد نسبت به گروه شاهد به 07/25 درصد رسیده است. حداکثر میزان افزایش رشد در هر یک از گروه­ها مربوط به غلظت ^6-10 مولار می­باشد. کمترین میزان رشد نیز در چاهک محتوی تریتون دیده شد زیرا تریتون روی رشد اثر منفی داشته و باعث از بین بردن سلول­ها می­شود.

بررسی تغییرات مورفولوژیکی سلول­های PC12 در اثر تاُثیر نمونه­های مختلف پپتیدی

به‫منظور بررسی کیفی تغییرات مورفولوژیکی در اثر تاثیر نمونه­های مختلف پپتیدی به‫عنوان نمونه غلظت ^6-10 مولار از پپتیدها که در آن غلظت بیشترین تاثیر دیده می­شود انتخاب و تصویر سلول­های مواجه یافته با این غلظت از پپتیدهای  (SP-H)+C و SP)+C)، سلول­های شاهد که فاقد پپتید می­باشد و سلول­هایی که حاوی محلول تریتون (tri)4 درصد است در شکل 2 آورده شده است.

شکل2: تغییرات مورفولوژیکی سلول­ها: A سلول­های شاهد ، B سلول­های حاوی (S+C)  ^6-10 مولار، C سلول­های حاوی (H+C)  ^6- 10مولار D سلول­های حاوی محلول تریتون

همان‫طور که در شکل 2 مشخص است سلول­های حاوی پپتید هیچ‫گونه تغییر مورفولوژیکی مشخصی نسبت به سلول­های شاهد نداشتند اما سلول­هایی که با تریتون مواجه داشتند تحت تاثیر تریتون تغییر شکل واضحی داشته اند به گونه‫ای که از فرم دوکی شکل و چسبنده خارج شده، پاهای کاذب خود را از دست داده و به فرم دایره­ا­­ی و تحلیل رفته تبدیل شده­ا­ند، محتوای سلولی برخی از آن­ها نیز به بیرون ریخته و روی سطح محیط کشت شناور باقی مانده­اند. 

سنجش سمیت القا شده با H₂O₂

سپس به‫­منظور القای استرس اکسیداتیو از H₂O₂ به‫عنوان اکسیدان استفاده شد تا اثر محافظتی نمونه­های پپتیدی فوق الذکر در برابر تغییر اعمال شده در ریز محیط مورد بررسی شود. ابتدا غلظتی از H₂O₂ که در آن نیمی از توان حیاتی سلول­های PC12 کاهش می­یابد توسط تست MTT تعیین شد و سپس به بررسی تست NO در غلظت به‫دست آمده پرداخته شد.

شکل3: اثر غلظت­های مختلف پراکسید­هیدروژن بر توان حیاتی سلول­های PC12 بعد از 24 ساعت تیمار کردن. نمونه­ها شامل سلول و محیط کشت به‫همراه غلظت­های مختلف پراکسید­هیدروژن (از غلظتg/ml µ400 تا g/ml µ1/3)، شاهد (control) که تنها حاوی سلول و محیط کشت است و فاقد H₂O₂  می­باشد. تمام داده­ها به‫صورت میانگین± انحراف معیار نمایش داده شده­اند و 05 /0p<* و 0001 /0p<**، 00001 /0p<***، 000001 /0p<**** در مقایسه با گروه شاهد.

همان‫طور که از شکل 3 مشخص است غلظت g/ml µ 150 از  H₂O₂بر توان حیاتی سلول­های PC12  اثر مهاری داشته و می‫تواند نیمی از آن‫ها را بعد از 24 ساعت تیمار کردن از بین ببرد.

اندازه­گیری میزان تولید نیتریک اکسید درون سلولی

در نمودار زیر میزان نیتریک اکسید تولید شده توسط نمونه­های انتخابی از سلول­ها در حضور و عدم حضور H₂O₂ نشان داده شده است.

شکل4: تست :NO بررسی مقایسه­ای میزان نیتریک اکسید تولید شده از نمونه­های انتخابی در حضور و عدم حضور H₂O₂. چاهک­ها محتوی سلول و محیط کشت هستند به‫همراه غلظت­های ^6-10 یا ^7-10 مولار از نمونه­های مختلف پپتیدی که نیمی از چاهک­ها به‫مدت 3 ساعت با H²O² (150 ماکرومولار) تیمار شدند، گروه شاهد  (CG)که تنها حاوی سلول، سیستئین و محیط کشت است و کنترل منفی (NC) که حاوی سلول، سیستئین، محیط کشت و H₂O₂ است. تمام داده­ها به‫صورت  میانگین± انحراف معیار نمایش داده شده­اند و001 /0p<*، 0001/0p<**  و  00001/0p<*** در مقایسه با گروه کنترل مثبت و 00001 /0 ,*p< 000001 /0 **p< و 0000001 /0***p< در مقایسه با گروه کنترل منفی.

جدول2: درصد کاهش تولید NO درون سلولیِ نمونه­های انتخابی (شامل سلول، سیستئین و محیط کشت به همراه غلظت­های ^6-10 یا ^7-10 مولار پپتید) در حضور H₂O₂ نسبت به کنترل منفی (حاوی  H₂O₂و بدون پپتید) و عدم حضور H₂O₂  نسبت به گروه شاهد (فاقد H₂O₂و بدون پپتید)